本发明涉及一种制备、分离和纯化异构体(-)-降龙涎醚(ambrox)的方法。更具体地，本发明涉及通过生物转化制备(-)-降龙涎醚的方法，以及从反应混合物中回收和纯化其的方法。
ambrofixtm是具有通式(i)的对映异构体纯化合物(-)-降龙涎醚的具有知识产权的givaudan商品名。
ambrofixtm是香料成分调和中非常重要的分子。其在所有香水应用中提供高度强大、高度实质性和高度稳定的琥珀味特征。可从givaudan获得的ambrofixtm是用于获得正宗的龙涎气味特征的最合适的材料。
目前，ambrofixtm由天然来源的原料合成产生。某些原料的可获得性和质量取决于气候条件以及社会经济因素。此外，由于原料可能以中等产率从自然资源中萃取，所以它们的供应价格很可能越来越使得在工业规模上使用它们不经济。因此，如果ambrofixtm的商业性工业供应继续以合理的成本获得，则需要更具成本效益的能够实现工业化的生产和纯化方法。
ambrofixtm的工业上规模化的生物技术路线将是有吸引力的，因为其可能不如完全合成程序复杂，污染性更小。
尝试生物转化以提供(-)-降龙涎醚的潜在有用的底物是高法呢醇。neumann等(biol.chem.hoppe-seyler第367卷第723-726页(1986))在他们的开创性论文中论述了使用角鲨烯-何帕烯环化酶(squalenehopenecyclase，shc)在酶促催化下将高法呢醇转化为(-)-降龙涎醚的可行性。所用的高法呢醇是该分子的四种几何异构体的混合物。在这四种异构体中，只有7e,3e几何异构体(使用常规命名法)可被环化，所需(-)-降龙涎醚的产率非常低。
jp2009-60799(kao)公开了一种合成方法，其中shc作用于高法呢醇底物以产生(-)-降龙涎醚。该底物是所有四种几何异构体((3z,7z；3e,7z；3z,7e；和3e,7e)的混合物。该文献仅公开了从含有shc的高法呢醇萃取物中制备(-)-降龙涎醚。将高法呢醇混合物转化为(-)-降龙涎醚及其9-表立体异构体，纯化可通过蒸馏或通过柱层析进行。kao没有描述其中使用产shc的完整微生物将高法呢醇转化为(-)-降龙涎醚的方法，此外，其未提供与通过这种方法(所述方法可以以嗅觉纯的形式产生(-)-降龙涎醚)获得的复杂反应混合物的下游加工相关的任何技术教导。
根据本申请人的知识，现有技术没有描述任何可行的可工业规模化的方法，所述方法涉及高法呢醇的shc催化的生物转化，从而以嗅觉纯的形式提供(-)-降龙涎醚。
此外，如果要在工业规模上实现高法呢醇的生物转化，则应该有高纯度3e,7e-高法呢醇的具有成本效益的来源可供利用。然而，尽管在文献中已描述了高法呢醇的合成途径(见例如us2013/0273619)，但是根据本申请人的知识，目前没有纯7e,3e-高法呢醇的具有成本效益的工业规模来源可供利用。
仍然需要提供生成有价值的香料成分(-)-降龙涎醚的经济上可行并且可工业规模化的途径。
在共同未决的专利申请pct/ep2014/072891(作为wo2015/059293公布)和pct2014/ep/072882(作为wo2015/059290公布)中，本申请人描述了制备富含7e,3e几何异构体的7e,3e/z-高法呢醇混合物的高效方法。从β-法呢烯制备7e,3e/z-高法呢醇混合物，并且该原料中所含的异构体信息得到保留，使得在7-位处的高法呢醇双键以e-构型固定。然而，即使这种精细的化学物质仍然会导致3e/z异构体混合物。纯的7e,3e-高法呢醇在合成上仍然具有挑战性，并且可能只能通过经济上不利的异构体混合物的纯化来实现。
令人惊奇的是，本申请人已经发现，7e,3e/z-高法呢醇混合物可以进行生物转化过程，通过该过程，高法呢醇混合物在表达酶(特别是角鲨烯-何帕烯环化酶(shc)生物催化剂)的重组微生物存在的情况下被酶促环化，所述角鲨烯-何帕烯环化酶(shc)生物催化剂能够将高法呢醇生物转化成(-)-降龙涎醚，产生反应混合物，能够通过令人惊讶地容易的下游加工以嗅觉纯的形式从中分离(-)-降龙涎醚。
在本发明的一个方面，提供了高法呢醇的酶促催化环化以提供包含(-)-降龙涎醚的反应混合物，其中所述高法呢醇包含高法呢醇的7e,3e/z-几何异构体的混合物，并且其中在产生该酶的重组微生物(更特别地产生该酶的完整重组微生物)存在的情况下进行该反应。
在本发明的一个实施方案中，在能够将高法呢醇生物转化成(-)-降龙涎醚的shc生物催化剂存在的情况下进行环化反应。
shc生物催化剂是野生型酶或变体酶，或是表达编码shc酶的基因的微生物，优选重组大肠杆菌(e.coli)微生物。shc生物催化剂可以以任何形式使用，诸如但不限于纯化的shc酶、含有shc酶的粗萃取物或固定化shc酶(例如固定在载体上)，或者生物催化剂可以是已经产生或正在产生shc酶的微生物，诸如完整的重组全细胞和/或碎裂细胞或含有shc酶的膜级分。
在本发明的一个具体实施方案中，高法呢醇混合物富含7e,3e-几何异构体。
在一个更具体的实施方案中，高法呢醇混合物为按重量计至少55/45的7e,3e/7e,3z。
在一个更具体的实施方案中，高法呢醇混合物为按重量计至少70/30的7e,3e/7e,3z。
在更具体的实施方案中，高法呢醇混合物为按重量计至少80/20的7e,3e/7e,3z。
在一个更具体的实施方案中，高法呢醇混合物为按重量计至少90/10的7e,3e/7e,3z。
在一个更具体的实施方案中，高法呢醇混合物为按重量计至少95/5的7e,3e/7e,3z。
在本发明的一个具体实施方案中，高法呢醇混合物由7e,3e/z-几何异构体组成，并且没有其它高法呢醇的几何异构体。
本领域技术人员理解，与高法呢醇结合使用的术语7e、7z、3e或3z分别用于指高法呢醇的7位和3位的双键取向。7e,3e-高法呢醇化合物具有cas号459-89-2，而7e,3z-高法呢醇化合物具有cas号138152-06-4。术语7e,3e/z-高法呢醇的使用是指所述化合物的混合物。
在根据本发明的方法获得在环化反应中可用作底物的高法呢醇混合物的方法示于上文提及的共同未决的申请pct/ep2014/072891(作为wo2015/059293公布)和pct2014/ep/072882(作为wo2015/059290公布)，所述申请通过引用整体并入本文。一般来说，它们描述了通过使用n-烷基-n-亚硝基脲的有机溶液将法呢烯(更具体地α-法呢烯和/或β-法呢烯)转化成其相应的环丙烷化的法呢烯衍生物来进行的高法呢醇混合物的合成。所述环丙基化衍生物然后在布朗斯台德酸存在的情况下进行开环和重排反应，得到对7e,3e几何异构体具有选择性的高法呢醇混合物。使用法呢烯作为原料是特别优选的，因为其确保了高法呢醇的7位处的双键的e-构象固定。
形成本发明的具体实施方案的特定反应条件示于共同未决的申请中以及下文的实施例中，在此无需更多阐述。
提供含有(-)-降龙涎醚的反应混合物的高法呢醇的环化由角鲨烯-何帕烯环化酶(shc)催化。shc可以是野生型酶(例如，seqidno.1)或其变体(例如，seqidno.2或seqidno.4)。shc可以从酸热脂环酸芽孢杆菌(alicyclobacillusacidocaldarius)、嗜酸芽孢杆菌(bacillusacidocaldarius)、运动发酵单胞菌(zymomonasmobilis)或慢生型大豆根瘤菌(bradyrhizobiumjaponicum)(如us20120135477a1的实施例3b中所示)获得。
然而，还可使用本领域通常已知的技术通过重组手段生产所述酶。
关于酶的生产所使用的术语“重组”是指通过重组dna技术产生的(即从由编码所需酶的外源dna构建体转化的细胞产生的)酶。因此，术语“重组dna”包括被插入载体中、整合至自主复制的质粒或病毒中，或整合至原核生物或真核生物的基因组dna(或同源细胞的基因组，在除天然染色体外的位置处)中的重组dna。
核酸分子与允许在原核和/或真核宿主细胞中表达的表达调控序列有效连接。如本文中所用，“有效连接”是指整合至遗传构建体中，使得表达控制序列有效地控制目标编码序列的表达。上述转录/翻译调控元件包括但不限于诱导型和非诱导型、组成型、受细胞周期调节的、代谢调节的启动子、增强子、操纵子、沉默子、阻遏物和本领域技术人员已知的并且驱动或以其它方式调控基因表达的其它元件。此类调控元件包括但不限于指导组成型表达或允许诱导型表达等的调控元件，例如cup-1启动子、所应用的tet-阻遏物(例如在tet-on或tet-off系统中使用的)、lac系统、trp系统调控元件。作为实例，异丙基β-d-1-硫代吡喃半乳糖苷(iptg)在100μm至1.0mm浓度范围内是蛋白质表达的有效诱导剂。该化合物是异乳糖(allolactose，一种触发lac操纵子转录的乳糖代谢产物)的分子模拟物，因此其用于在基因处于lac操纵子的控制之下时诱导蛋白质表达。
类似地，核酸分子可形成编码另外的多肽序列(例如，用作标志物或报告物的序列)的杂合基因的一部分。标志物和报告基因的实例包括β-内酰胺酶、氯霉素乙酰转移酶(cat)、腺苷脱氨酶(ada)、氨基糖苷磷酸转移酶、二氢叶酸还原酶(dhfr)、潮霉素-b-磷酸转移酶(hph)、胸苷激酶(tk)、lacz(编码β-半乳糖苷酶)和黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶(xgprt)。与本公开实践相关的许多标准程序一样，本领域技术人员将了解另外的有用试剂，例如可充当标志物或报告物的功能的其它序列。
重组多核苷酸可编码shc酶，诸如野生型shc或其变体，其可被插入用于表达和任选纯化的载体中。一种类型的载体是代表连接另外dna区段的环状双链dna环的质粒。某些载体可控制与它们功能连接的基因的表达。这些载体称为“表达载体”。通常适于dna重组技术的表达载体是质粒类型。通常，表达载体包含基因，诸如野生型shc或其变体。在本说明书中，术语“质粒”和“载体”可互换使用，因为质粒是最常用的载体。
此类载体可包括dna序列，其包括但不限于并不天然存在于宿主细胞中的dna序列，通常不被转录成rna或翻译成蛋白质(“表达”)的dna序列以及期望引入至非重组宿主的其它基因或dna序列。应当理解，通常通过稳定引入一个或多个重组基因来增强重组宿主的基因组。然而，也可在本公开的范围内使用自主或复制型质粒或载体。此外，本公开还可使用低拷贝数(例如单拷贝)或高拷贝数质粒或载体来实施。
在一个优选实施方案中，本公开的载体包含质粒、噬菌粒、噬菌体、粘粒、人造细菌和人造酵母染色体、敲除或敲入构建体、合成核酸序列或盒，并且可以以线性多核苷酸、质粒、巨大质粒、合成或人造染色体(诸如植物、细菌、哺乳动物或酵母人造染色体)的形式产生亚组。
优选地，在引入载体后，由引入的多核苷酸编码的蛋白质在细胞内产生。可将多种基因底物引入质粒。质粒通常是标准克隆载体，例如细菌多拷贝质粒。可将底物引入相同或不同的质粒中。通常使用具有不同类型的选择标记的至少两种不同类型的质粒来允许选择含有至少两种类型载体的细胞。
通常，细菌或酵母细胞可用本领域公知的任一种或多种以下核苷酸序列来进行转化。对于体内重组，要与基因组或其它基因重组的基因用于使用标准转化技术转化宿主。在一个合适的实施方案中，提供复制起点的dna包括在构建体中。复制起点可以由本领域技术人员来适当选择。根据基因的性质，如果基因或基因组中已经存在本身可作为复制起点起作用的序列，则可能不需要补充的复制起点。
当此类dna已经被引入细胞内部时，细菌或酵母细胞可被外源或异源dna转化。转化的dna可以整合或不整合，即共价连接到细胞的基因组中。例如，在原核生物和酵母中，可在附加型元件诸如质粒上保持转化dna。对于真核细胞，稳定转化的细胞是其中转染的dna已经整合至染色体中以使其通过染色体复制由子细胞遗传的细胞。这种稳定性通过真核细胞建立由含有转化dna的子细胞的群体组成的细胞系或克隆的能力来证明。
一般来说，引入的dna最初不存在于作为dna的受体的宿主中，但从给定的宿主分离dna区段、随后将该dna的一个或多个额外拷贝引入同一宿主以例如增加基因产物的产生或改变基因的表达模式也在本公开的范围之内。在一些情况下，引入的dna将通过例如同源重组或定点诱变来修饰或甚至替代内源基因或dna序列。合适的重组宿主包括微生物、植物细胞和植物。
本发明还表征重组宿主。术语“重组宿主”(也称为“遗传修饰的宿主细胞”或“转基因细胞”)表示包含异源核酸或其基因组已由至少一个整合的dna序列增强的宿主细胞。本公开的宿主细胞可被如上所述的多核苷酸或载体进行遗传工程改造。
可用于本公开目的的宿主细胞包括但不限于原核细胞诸如细菌(例如，大肠杆菌和枯草芽孢杆菌(b.subtilis))，其可以用例如含有本公开的多核苷酸分子的重组噬菌体dna、质粒dna、细菌人造染色体或粘粒dna表达载体转化；简单的真核细胞如酵母(例如，酵母属和毕赤酵母属)，其可以用例如含有本公开的多核苷酸分子的重组酵母表达载体转化。取决于宿主细胞和用于引入本公开的多核苷酸的相应载体，多核苷酸可以整合至例如染色体或线粒体dna中，或者可以染色体外(例如通过附加体)维持，或者可以仅短暂地包含在细胞中。
如本文中所用，术语“细胞”，特别是提及遗传工程和将一个或多个基因或组装的基因簇引入细胞时，或生产细胞，被理解为指任何原核或真核细胞。预期原核和真核宿主细胞均根据本公开来使用，包括细菌宿主细胞诸如大肠杆菌或芽孢杆菌属的种、酵母宿主细胞诸如酿酒酵母、昆虫宿主细胞诸如草地夜蛾或人宿主细胞，如像hela和jurkat细胞。
具体地，细胞是真核细胞，优选真菌、哺乳动物或植物细胞或原核细胞。合适的真核细胞包括例如但不限于哺乳动物细胞、酵母细胞或昆虫细胞(包括sf9)、两栖动物细胞(包括黑色素细胞)或包括秀丽隐杆线虫(caenorhabditiselegans)的细胞的蠕虫细胞。合适的哺乳动物细胞包括例如但不限于cos细胞(包括cos-1和cos-7)、cho细胞、hek293细胞、hek293t细胞、hek293t-rextm细胞或其它可转染的真核细胞系。合适的细菌细胞包括但不限于大肠杆菌。
优选地，可以使用原核生物，诸如大肠杆菌、芽孢杆菌属、链霉菌属，或者哺乳动物细胞，如hela细胞或jurkat细胞，或者植物细胞，如拟南芥。
优选地，细胞是曲霉菌属的种(aspergillussp)或真菌细胞，优选地，其可选自酵母属、假丝酵母属、克鲁维酵母属、汉逊酵母属、裂殖酵母属、耶氏酵母属、毕赤酵母属和曲霉菌属。
优选地，大肠杆菌宿主细胞是被工业和监管机构认可的大肠杆菌宿主细胞(包括但不限于大肠杆菌k12宿主细胞或如实施例中所示范的大肠杆菌bl21宿主细胞)。
与本公开一起使用的一种优选宿主细胞是大肠杆菌，其可以如本文所述重组制备。因此，重组宿主可以是重组大肠杆菌宿主细胞。存在可用于大肠杆菌的突变体文库、质粒、详细的代谢计算机模型和其它信息，从而允许合理设计各种模块来增加产物产率。可使用与上文针对酵母菌属所描述的方法类似的方法来制备重组大肠杆菌微生物。
在一个实施方案中，重组大肠杆菌微生物包含编码shc基因或其功能等同物/同源物(包括但不限于其变体、同源突变体、衍生物或片段)的核苷酸序列。
与本公开一起使用的另一种优选宿主细胞是酿酒酵母，其是合成生物学中广泛使用的基础生物。因此，重组宿主可以是酿酒酵母。存在可用于酿酒酵母的突变体文库、质粒、详细的代谢计算机模型和其它信息，从而允许合理设计各种模块来增加产物产率。用于制备重组酿酒酵母微生物的方法是已知的。
以常规方式进行细胞的培养。培养基含有碳源、至少一种氮源和无机盐，并向其中添加维生素。该培养基的成分可以是通常用于培养目标微生物物种的成分。
本方法中使用的碳源包括可由重组宿主细胞代谢以促进生长和/或产生(-)-降龙涎醚的任何分子。合适的碳源的实例包括但不限于蔗糖(例如，如在糖蜜中发现的)、果糖、木糖、甘油、葡萄糖、纤维素、淀粉、纤维二糖或其它含葡萄糖的聚合物。
在使用酵母作为宿主的实施方案中，例如碳源诸如蔗糖、果糖、木糖、乙醇、甘油和葡萄糖是合适的。可在整个培养期间给宿主生物提供碳源，或者，可将生物体在另一种能量来源例如蛋白质存在的情况下生长一段时间，然后仅在分批补料阶段提供碳源。
用于本公开的方法的重组宿主细胞微生物的适用性可使用熟知方法通过简单测试程序来确定。例如，可将待测试的微生物在通常用于增殖微生物的ph、温度和通气条件下在丰富培养基(例如，lb-培养基、bacto-胰蛋白胨酵母萃取物培养基、营养培养基等)中进行增殖。一旦选定了产生所需生物转化产物的重组微生物(即重组宿主细胞)，则产物通常通过合适的表达系统和发酵(例如通过细胞培养中的微生物生产)由生产宿主细胞系大规模产生。
在本公开的一个实施方案中，将成分明确的基本培养基诸如m9a用于细胞培养。m9a培养基的组分包括：14g/lkh2po4、16g/lk2hpo4、1g/lna3citrate.2h2o、7.5g/l(nh4)2so4、0.25g/lmgso4.7h2o、0.015g/lcacl2.2h2o、5g/l葡萄糖和1.25g/l酵母萃取物)。
在本公开的另一个实施方案中，使用富含营养物的培养基诸如lb(luria-bertani)。lb的组分包括：10g/l胰蛋白胨，5g/l酵母萃取物，5g/lnacl)。
矿质培养基和m9矿物培养基的其它实例公开于例如us6524831b2和us2003/0092143a1中。
可通过分批、分批补料或连续法或其组合来生长重组微生物。通常，将重组微生物在合适的营养源(例如碳源)存在的情况下，在确定的温度下于发酵罐中生长所需的时期，以将高法呢醇生物转化成所需量的(-)-降龙涎醚in。
可以以任何合适的方式，例如通过分批培养或分批补料培养来培养重组宿主细胞。如本文中所用，术语“分批培养”是其中在培养过程中既不添加也不撤出培养基的培养方法。如本文中所用，术语“分批补料”是指其中在培养过程中添加培养基但不撤出培养基的培养方法。
本公开的一个实施方案提供了在细胞系统中产生(-)-降龙涎醚的方法，其包括在合适的条件下在细胞系统中产生野生型shc或其变体，将高法呢醇添加至细胞系统中，使用在细胞系统中产生的shc或变体将高法呢醇转化为(-)-降龙涎醚，从细胞系统收集(-)-降龙涎醚并从系统分离(-)-降龙涎醚。其它核苷酸序列的表达可用于增强该方法。生物转化方法可包括在细胞系统中另外表达其它核苷酸序列。其它核苷酸序列的表达可能增强用于制备(-)-降龙涎醚的生物转化途径。
本公开的另外一个实施方案是制备(-)-降龙涎醚的生物转化方法，其包含生长包含野生型shc或变体基因的宿主细胞，在宿主细胞中产生野生型shc或变体酶，将高法呢醇(例如eeh)添加至宿主细胞，在适合促进高法呢醇转化成降龙涎醚的ph、温度和增溶剂的条件下孵育宿主细胞，并收集(-)-降龙涎醚。在宿主细胞中产生野生型shc或变体酶提供了当在合适的反应条件下将高法呢醇添加至宿主细胞中时制备(-)-降龙涎醚的方法。可通过向反应混合物中添加更多的生物催化剂和sds来提高实现的转化。
可以以多种方式培养重组宿主细胞微生物，以便以合适的量提供表达野生型shc或变体酶的细胞用于随后的生物转化步骤。由于适用于生物转化步骤的微生物变化广泛(例如，酵母、细菌和真菌)，因此培养条件当然要根据每种物种的具体要求进行调整，这些条件是公知的并且在文献中有记载。用于生长重组宿主细胞微生物的细胞的任何现有技术已知的方法可用于产生可在本公开的随后生物转化步骤中使用的细胞。通常，将细胞生长至特定的密度(可作为光密度(od)测量)以产生足够的生物质用于生物转化反应。选择的培养条件不仅影响获得的细胞数量(生物量)，而且培养条件的质量也影响生物质变成生物催化剂的机制。表达野生型shc或变体基因并产生野生型shc或变体酶的重组宿主细胞微生物被称为生物催化剂，其适合用于生物转化反应。在一些实施方案中，生物催化剂是产生野生型shc或变体酶的重组全细胞，或者其可呈悬浮液或固定化形式。
在一个实施方案中，以足够的量产生生物催化剂(以产生足够的生物质)，收获和洗涤(和任选地储存(例如冷冻或冻干))所述生物催化剂，然后进行生物转化步骤。
在另一个实施方案中，以足够量产生细胞(以产生足够的生物催化剂)，然后调整反应条件，而无需收获和洗涤用于生物转化反应的生物催化剂。该一步(或“一锅”)法是有利的，因为其简化了过程，同时降低了成本。用于生长细胞的培养基也适用于生物转化反应，条件是调整反应条件以有利于生物转化反应。
在提供高法呢醇原料向(-)-降龙涎醚转化的时间、温度、ph和增溶剂的条件下进行本公开的生物转化法。对于shc变体酶，反应混合物的ph可以在4至8，优选为5至6.5，更优选4.8至6.0的范围内，对于野生型shc酶，所述ph在约ph5.0至约ph7.0的范围内，并且可通过向反应混合物中添加缓冲液来维持。用于该目的的示例性缓冲液是柠檬酸缓冲液。优选的温度为约15℃至约45℃，优选约20℃至约40℃，尽管对于嗜热生物，尤其是当使用来自嗜热微生物的野生型酶时，温度可更高，高达55℃。可使温度保持恒定，或者可在生物转化过程中改变温度。
本申请人已证明在生物转化反应中包含增溶剂(例如表面活性剂、去垢剂、溶解度增强剂、水可混溶的有机溶剂等)可能是有用的。表面活性剂的实例包括但不限于tritonx-100、吐温80、牛磺脱氧胆酸、牛磺脱氧胆酸钠、十二烷基硫酸钠(sds)和/或月桂基硫酸钠(sls)。
本申请人已从其它不太有用的增溶剂长列表中选择并鉴定了sds作为特别有用的增溶剂。特别地，本申请人将sds鉴定为在高法呢醇至(-)-降龙涎醚的生物转化反应的反应速率和产量方面比例如tritonx-100显著更好的增溶剂。
不希望受理论束缚，使用sds与重组微生物宿主细胞可能是有利的，因为sds可以有利地与宿主细胞膜相互作用，以使shc酶(其是膜结合型酶)更容易接近高法呢醇底物。此外，在反应混合物中以合适的水平包含sds可改善乳剂(水中的高法呢醇)的性质和/或促进高法呢醇底物对宿主细胞内的shc酶的接近，同时防止破坏(例如野生型shc或变体酶的变性/失活)。
生物转化反应中使用的增溶剂(例如sds)的浓度受生物质用量和底物(eeh)浓度影响。也就是说，增溶剂(例如，sds)浓度、生物质用量和底物(eeh)浓度之间存在一定程度的相互依赖性。举例来说，随着高法呢醇底物的浓度增加，需要足够量的生物催化剂和增溶剂(例如sds)来进行有效的生物转化反应。如果例如增溶剂(例如sds)的浓度太低，则可观察到亚最佳高法呢醇转化。另一方面，如果例如增溶剂(例如sds)的浓度太高，则可能存在生物催化剂受到完整微生物细胞的破坏和/或shc/hac酶的变性/失活影响的风险。
在生物质的量和底物(eeh)浓度的背景下选择适当浓度的sds在技术人员的知识范围内。举例来说，技术人员可使用预测模型来确定合适的sds、底物(eeh)和生物质浓度。
野生型shc酶的生物转化反应的温度为约45-60℃，优选为55℃。
野生型shc酶的生物转化反应的ph范围为约5.0-7.0，更优选约5.6至约6.2，甚至更优选约6.0。
shc变体酶的生物转化反应的温度为约34℃至约50℃，优选约35℃。
shc变体酶的生物转化反应的ph为约4.8-6.4，优选约5.2-6.0。
优选地，生物转化反应中使用的增溶剂是sds。
当生物催化剂比eeh高法呢醇的比率为约2:1时，[sds]/[细胞]比率在约10:1-20:1，优选约15:1-18:1的范围内，优选为约16:1。
当高法呢醇浓度为约125g/leeh并且催化剂浓度为250g/l(对应于约175(650nm)的od)时，shc变体酶的生物转化反应中的sds浓度在约1-2％的范围内，优选在约1.4-1.7％的范围内，甚至更优选约1.5％。
生物催化剂比eeh高法呢醇底物的比率在约0.5:1至2:1的范围内，在一些实施方案中为2:1，优选约1:1或0.5:1。
在一些实施方案中，使用向其中添加高法呢醇底物的生物催化剂产生(-)-降龙涎醚。通过使用已知的方式(例如蠕动泵、输注注射器等)进料来添加底物是可能的。高法呢醇是一种油溶性化合物，以油形式提供。鉴于生物催化剂存在于水相中，当将高法呢醇添加至生物转化反应混合物中时，生物转化反应可以被认为是两相系统。即使存在增溶剂(例如sds)也是如此。
在下文所述的实施例中公开了合适的生物转化方法的进一步细节。
根据本发明的生物转化方法产生含有所需(-)-降龙涎醚以及许多副产物的反应混合物。更特别地，反应混合物除了(-)-降龙涎醚以外还含有副产物的复合混合物，包括根据式(ii)的(-)-降龙涎醚新构型异构体，以及根据式(iii)和(iv)的(-)-降龙涎醚已知立体异构体，
本申请人认为，虽然不打算受任何特定理论的束缚，式(ii)化合物是通过高法呢醇的7e,3z-几何异构体的环化形成的。其已被描述为实际上无臭的，检测阈值>500ng/l。
如上所述，本申请人认为式(ii)化合物是新型分子，因此，该化合物形成本发明的另一方面。
由化合物(ii)组成或包含其的香料成分和香料组合物以及含有其的香味制品形成本发明的另外方面。
式(ii)的化合物在香料应用(诸如精细香料或功能香料组合物诸如个人护理、家庭护理和织物护理组合物)中作为香料成分的用途，形成本发明的另外的方面。
(-)-降龙涎醚和嗅觉可接受量的化合物(ii)的混合物形成本发明的另一方面。
如本文中所用，关于式(ii)的化合物或任何另外的副产物(iii)或(iv)，或实际上可能作为杂质存在于根据本发明的方法形成的(-)-降龙涎醚中的任何材料的术语“嗅觉可接受量”被理解为意指所述化合物或物质以低于其气味检测阈值的量，或者以其不会以影响(-)-降龙涎醚(-)的嗅觉特征的方式贡献其嗅觉特征的量存在于(-)-降龙涎醚的混合物中。含有嗅觉可接受量的任何此类化合物或材料的(-)-降龙涎醚可被熟练的调香师鉴定为具有(-)-降龙涎醚的商品级(诸如通过合成方法-香紫苏醇获得的ambrofixtm，可从givaudan获得的)的气味特征。
在本发明的优选实施方案中，反应混合物不含或基本上不含未反应的高法呢醇。
本申请人发现，高法呢醇是(-)-降龙涎醚以及生物转化过程的前述副产物的强大溶剂。因此，在可观量的高法呢醇存在的情况下，(-)-降龙涎醚和副产物保持一起溶解在粗制的极难处理的混合物中，从中分开并最终以嗅觉纯形式分离(-)-降龙涎醚比较难、费时、并且成本高。发现降低与(-)-降龙涎醚和化合物(ii)、(iii)和(iv)混合的未反应的高法呢醇的水平显著有利于(-)-降龙涎醚的下游加工和分离/纯化。
如本领域技术人员将理解的，下游加工是制备通过生物转化过程形成的有用化合物的关键操作。作为化合物合成的一部分，其可影响化合物的物理性质。在通过生物技术方法制备香料成分的情况下，期望目标化合物可以以嗅觉纯的形式从反应混合物中分离，以使目标化合物的所需气味特征不会由于可能存在于发酵培养基或生物催化剂中的污染物和副产物的复杂混合物的气味所毁坏。
因此，本发明在其另一方面提供了从包含化合物(ii)、(iii)和(iv)的一种或多种的反应混合物中分离和纯化(-)-降龙涎醚的方法。
在本发明的另一方面，提供了改善或增强(-)-降龙涎醚的气味的方法，其包括从含有化合物(ii)、(iii)和(iv)的一种或多种的反应混合物中分离和纯化(-)-降龙涎醚的步骤。
分离和纯化形式的(-)-降龙涎醚不含化合物(ii)、(iii)或(iv)的任一种，或者如果其确实含有任何所述化合物，则每种化合物应当以嗅觉可接受的量存在。
从生物转化方法(诸如本文中上述的方法)获得的反应混合物通常包含含有粗制的(-)-降龙涎醚和副产物(ii)、(iii)和(iv)中的一种或多种以及细胞材料和/或其碎片的固相；和包含水和/或任何未反应的高法呢醇的一个或多个液相。
可通过过滤或离心将固相与所述液相分离。此外，通过选择具有适当孔径的过滤器，还可实现粗制(-)-降龙涎醚与细胞材料和/或碎屑的分离。一旦将粗制(-)-降龙涎醚与细胞材料和/或其碎片分离开，就可将其进行洗涤，然后经历进一步的后续处理程序以从化合物(ii)、(iii)和(iv)分离(-)-降龙涎醚。
或者，代替过滤或离心，可将反应混合物加温至高于(-)-降龙涎醚的熔点的温度，由此(-)-降龙涎醚在含有细胞材料和碎片的水相之上形成油相。任选地，为了确保(-)-降龙涎醚的完全回收，含水和细胞材料可用与水不混溶的有机溶剂(诸如甲苯)洗涤，以除去可能已夹带进水相中的任何残留(-)-降龙涎醚，可将这些洗出物与油相合并。此后可通过蒸发将油相浓缩，得到包含(-)-降龙涎醚和化合物(ii)、(iii)和(iv)中的一种或多种的粗制混合物，然后将该混合物经历进一步后续处理以分离和纯化(-)-降龙涎醚。
在另一个实施方案中，不加温反应混合物以形成含(-)-降龙涎醚油相，而代之以用合适的与水不混溶的有机溶剂(例如甲苯)萃取反应混合物以形成含有(-)-降龙涎醚和化合物(ii)、(iii)和(iv)中的一种或多种的有机相，可将其与含有细胞材料和碎片的水相分离。可通过蒸发浓缩有机相，得到包含(-)-降龙涎醚和化合物(ii)、(iii)和(iv)中的一种或多种的粗制混合物，可将其经历进一步的后续处理程序以分离和纯化(-)-降龙涎醚。
在另一种替代方法中，可蒸汽蒸馏反应混合物以从细胞材料和碎片中移取馏出物。可将馏出物收集为双相混合物，然后将双相混合物中包含(-)-降龙涎醚和化合物(ii)、(iii)和(iv)中的一种或多种的油相与水相分离，然后将所述油相经历进一步的后续处理程序以分离和纯化(-)-降龙涎醚。
在本发明的一个具体实施方案中，所述分离和纯化(-)-降龙涎醚的方法包括从含有化合物(ii)、(iii)或(iv)中的一种或多种的混合物中选择性结晶(-)-降龙涎醚的步骤。
术语“选择性结晶”是指这样的工艺步骤，通过该工艺步骤使(-)-降龙涎醚从溶剂中结晶，同时化合物(ii)、(iii)和(iv)仍然保持溶解在结晶溶剂中，由此分离的晶体材料只含有(-)-降龙涎醚，或者如果其含有化合物(ii)、(iii)或(iv)的任一种，则达到它们仅以嗅觉可接受的量存在的程度。
结晶可以在合适的有机溶剂中进行。溶剂的选择基于以下考虑，诸如在室温和高温下或在沸腾溶剂中的溶解度差异；以及大量可在冷溶剂中回收的晶体的需要。通常，将待分离的化合物溶于相对极性的溶剂中，然后加入相对较少极性的溶剂以使溶解的化合物达到其溶解度极限，从而其开始结晶。另外，在工业工艺中，成本和处理安全的问题也是相关的。合适的溶剂包括但不限于甲醇、丙酮、石油醚、己烷、叔丁基甲基醚、thf和乙酸乙酯。优选的溶剂包括甲苯或乙醇。也可以使用溶剂对。
在本发明的一个特别优选的实施方案中，通过将含有(-)-降龙涎醚和化合物(ii)、(iii)和(iv)中的一种或多种的混合物溶解在温乙醇中，以及通过将非溶剂诸如水缓慢加入至冷却的乙醇溶液中来使(-)-降龙涎醚选择性结晶，由此进行选择性结晶。
考虑到(-)-降龙涎醚和副产物化合物(ii)、(iii)和(iv)(其分别是(-)-降龙涎醚的构型异构体和两种立体异构体)的密切结构关系，很明显的是，(-)-降龙涎醚可从这种混合物中选择性结晶，从而以嗅觉纯的形式和高产率提供(-)-降龙涎醚。技术人员会合理地预期这些化合物将与(-)-降龙涎醚共结晶，使得下游处理更加复杂、耗时和昂贵，实际情况并非如此。
其中(-)-降龙涎醚可以通过结晶从含有化合物(ii)、(iii)和/或(iv)的混合物中分离出来的出人意料的容易方式代表了本发明的特别有利方面。
(-)-降龙涎醚可以通过结晶分离的容易性可与以下观察形成鲜明对比：由于(-)-降龙涎醚与副产物(ii)、(iii)和(iv)有非常相似的沸点，通过其它纯化技术，诸如通过蒸馏，不能以如此容易的方式和如此高的产率从含有(ii)、(iii)和/或(iv)的混合物的混合物中回收(-)-降龙涎醚。
如关于(-)-降龙涎醚所使用的，术语“嗅觉纯”旨在表示(-)-降龙涎醚不含化合物(ii)、(iii)或(iv)或者反应混合物中发现的任何其它材料，或者如果此类化合物或材料应该存在，则它们以嗅觉可接受的量存在，如该术语在本文中所定义的一样。
在本发明的一个实施方案中，以嗅觉纯的形式存在的(-)-降龙涎醚含有按重量计小于5％的化合物(ii)、(iii)或(iv)中的任一种。
在更具体的实施方案中，以嗅觉纯的形式存在的(-)-降龙涎醚含有小于按重量计4％、小于按重量计3％、小于按重量计2％、小于按重量计1％、小于按重量计0.9％、小于按重量计0.8％、小于按重量计0.7％、小于按重量计0.6％、小于按重量计0.5％、小于按重量计0.4％、小于按重量计0.3％、小于按重量计0.2％、小于按重量计0.1％或小于按重量计0.05％的化合物(ii)，(iii)或(iv)的每一种。
通过选择性结晶从化合物(ii)、(iii)和/或(iv)的混合物分离(-)-降龙涎醚的质量可受从其分离(-)-降龙涎醚的混合物的组成影响。更特别地，当混合物中(-)-降龙涎醚与另外的化合物(ii)、(iii)和(iv)的重量比为大于70:30，更特别地80:20，更特别地90:10，仍更特别地95:5，仍更特别地97:3时，通过结晶从化合物(ii)、(iii)和/或(iv)的混合物中分离的(-)-降龙涎醚的质量得到改善。
此外，通过结晶分离(-)-降龙涎醚的质量可能受从其分离(-)-降龙涎醚的混合物中存在的未反应的高法呢醇的量影响。更特别地，当基于从其结晶(-)-降龙涎醚的混合物的重量，未反应的高法呢醇的水平低于按重量计30％，更特别地低于按重量计20％，更特别地低于按重量计10％，更特别地低于按重量计5％，以及仍更特别地低于按重量计3％，仍更特别地低于按重量计2％，和更特别地仍低于按重量计1％时，分离质量得到改善。
优选地，在本发明的生物转化方法中使用的试剂和反应条件是使得反应以100％的高法呢醇转化或基本上如此地进行的试剂和条件，因此在反应混合物中不留下未反应的高法呢醇。然而，如果存在未反应的高法呢醇，尽管在经济上是不利的，但例如可通过蒸馏将其从(-)-降龙涎醚和其它副产物中分离出来。
因此，在本发明的一个具体实施方案中，提供了从包含化合物(ii)、(iii)和(iv)的一种或多种的混合物中分离和纯化(-)-降龙涎醚的方法，该混合物不含或基本上不含高法呢醇。
在一个更具体的实施方案中，从包含化合物(ii)、(iii)和(iv)中的一种或多种、并且不含或基本上不含高法呢醇的混合物中分离和纯化(-)-降龙涎醚，是通过(-)-降龙涎醚的选择性结晶来实现的。
根据本发明的方法获得的(-)-降龙涎醚是以嗅觉纯的形式获得的。嗅觉纯的(-)-降龙涎醚形成本发明的另一方面。
(-)-降龙涎醚晶体形式形成本发明的另一方面。
可将根据本发明的方法形成的(-)-降龙涎醚与一种或多种另外的香料成分混合以形成香料组合物，其用于香料应用，包括用于精细香料，以及用于消费品诸如个人护理、织物护理和家庭护理应用。
因此，本发明在其另一方面提供了包含(-)-降龙涎醚和至少一种其它香料成分的香料组合物，其中所述香料组合物含有嗅觉可接受量的化合物(ii)、(iii)或(iv)中的一种或多种。
将参考以下实施例进一步说明本发明。
实施例
实施例1：
高法呢醇的制备
一般分析条件：
非极性gc/ms：50℃/2分钟，20℃/分钟200℃，35℃/分钟270℃。利用hp7890a系列gc系统的gc/msagilent5975cmsd。非极性柱：来自sge的bpx5，5％苯基95％二甲基聚硅氧烷0.22mm×0.25mm×12m。载气：氦气。注射器温度：230℃。分流1:50。流速：1.0ml/分钟。传输线：250℃。ms-quadrupol：106℃。ms-源：230℃。
a)在thf中制备mnu
在搅拌下将尿素(175g，2.9mol)和盐酸甲胺(198g，2.9mol)在水(400ml)中的溶液在回流(105℃)下加热3.5小时。在40℃下，加入溶解在水(200ml)中的nano2(101g,1.45mol)。15分钟后，加入thf(1000ml)，得到透明的2-相混合物。在0-5℃下加入浓h2so4(110g,1.1mol)并在1.5小时内搅拌。在0-5℃进行另外0.5小时后，在25℃下分离两个透明相。将有机相(a)(1065ml，理论上为1.35m)在0-5℃下储存几天，或立即转入环丙烷化反应器。
相分离后，水相用thf(2×1l)萃取两次。这得到1100mlb相和1075ml的c相。a相在后续的环丙烷化反应中得到51％的最终烯烃至环丙烷的转化，b相得到<0.5％的环丙烷，c相不产生可检测的转化。我们得出结论，在第一相分离后，>99％的mnu被萃取。因此，通常在用浓的koh水溶液和乙酸处理后，在第一相分离(从有机相a)后，弃除水相。
b)使用mnu在thf中制备e-δ-法呢烯
将thf中的1.35mn-甲基-n-亚硝基脲(136ml，184mmol)在0℃下滴加至0-5℃下的e-β-法呢烯(cas18794-84-8)(25g，122mmol)和koh水溶液(50ml，40％)的快速搅拌混合物中。在加入4ml的mnu溶液后，加入预溶解在0.5ml二氯甲烷中的pd(acac)2(7.4mg，0.024mmol，0.02％)。在0-5℃下在4小时中添加剩余的mnu溶液。该阶段的gc显示28％的未转化的e-β-法呢烯，65％的所需单环丙烷(如上所示)和3％的双环丙烷化合物5。在25℃下进行16小时后，在0-5℃下添加乙酸(100ml)，然后加入叔丁基甲基醚(250ml)。相分离后，将有机相用2mhcl(250ml)洗涤，水相用叔丁基甲基醚(250ml)萃取。合并的有机层用水(2×100ml)、10％naoh水溶液(2×100ml)和水(2×100ml)洗涤，经mgso4干燥，过滤并浓缩，得到26.9g浅黄色液体，其含有9％的e-β-法呢烯、82％的所需单环丙烷化合物和6％的双环丙烷化副产物。
可以通过蒸馏纯化进一步分离所需的化合物。
加入1gk2co3(1g)并在40-60mbar下在30cm钢卷曲柱上进行蒸馏，在135-145℃下得到147g单环丙烷化合物(68％corr)。合并级分，得到92g100％纯度的单环丙烷化合物。
e-δ法呢烯的分析数据：
1h-nmr(cdcl3,400mhz):5.1(2m,2h),4.6(2h),2.2(2h),2.1(4h),2.0(2h),1.7(s,3h),1.6(2s,6h),1.3(1h),0.6(2h),0.45(2h)ppm.13c-nmr(cdcl3,400mhz):150.9(s),135.1(s),131.2(s),124.4(d),124.1(d),106.0(t),39.7(t),35.9(t),26.7(t),25.7(q),17.7(q),16.0(d),6.0(t)ppm.gc/ms:218(2％,m+),203(5％,[m-15]+),175(11％),147(31％),134(15％),133(20％),121(12％),107(55％),95(16％),93(30％),91(20％),82(11％),81(33％),79(42％),69(100％),67(22％),55(20％),53(21％),41(75％).ir(film):3081(w),2967(m),2915(m),2854(m),1642(m),1439(m),1377(m),1107(w),1047(w),1018(m),875(s),819(m),629(w).针对c16h26的分析计算值：c,88.00；h,12.00。实测值：c,87.80；h,12.01。
c)(7e)-4,8,12-三甲基十三碳-3,7,11-三烯-1-醇((7e)-高法呢醇)的制备
将压力管中的(e)-(6,10-二甲基十一烷-1,5,9-三烯-2-基)环丙烷(e-δ法呢烯)(1g，4.6mmol)、十二烷(0.2g，1.15mmol，内部标准)和l-(+)-酒石酸(1g，6.9mmol)的混合物在150℃搅拌加热。在18小时和完全转化(根据gc)后，将混合物倒入水(50ml)和甲苯(50ml)中。分离各相，水相用甲苯(50ml)萃取。合并的有机层用浓na2co3(50ml)和浓nacl(2x50ml)洗涤，经mgso4干燥，过滤并减压蒸发，得到棕色树脂(1.35g)，将其与30％koh水溶液(4.3ml)混合，并在25℃下搅拌2小时。gc分析显示，根据内标形成96％(7e)-4,8,12-三甲基十三碳-3,7,11-三烯-1-醇。e/z比为68:22。e-异构体的分析数据与文献中的分析数据一致，见例如p.kocienski,s.wadmanj.org.chem.54,1215(1989)。
实施例2
shc质粒制备和生物催化剂生产
shc质粒制备
将编码酸热脂环酸芽孢杆菌(alicyclobacillusacidocaldarius)角鲨烯何帕烯环化酶(aacshc)(genbankm73834，swissprotp33247)的基因插入质粒pet-28a(+)中，其中其处于iptg诱导型t7启动子的控制下，用于在大肠杆菌中产生蛋白质。使用标准热休克转化方案将质粒转化至大肠杆菌菌株bl21(de3)中。
锥形瓶培养
对于蛋白质生产，使用富培养基(lb培养基)或基本培养基。m9是基本培养基的一个例子，其已被成功应用。
培养基制备
如下制备用于350ml培养物的按默认选择的基本培养基：向35ml柠檬酸/磷酸盐原液(133g/lkh2po4，40g/l(nh4)2hpo4，17g/g柠檬酸h2o，ph调节至6.3)中加入307mlh2o，根据需要用32％naoh将ph调节至6.8。在高压灭菌后，添加0.850ml50％mgso4、0.035ml微量元素溶液(组成见下一部分)溶液、0.035ml硫胺素溶液和7ml20％葡萄糖。
shc生物催化剂生产(生物催化剂生产)
小规模生物催化剂生产(野生型shc或shc变体)，从包含shc产生质粒的大肠杆菌菌株bl21(de3)的预培养物接种350ml培养物(补充有50μg/ml卡那霉素的培养基)。在37℃下，在恒定搅拌(250rpm)下将细胞生长至约0.5(od650nm)的光密度。
然后通过加入iptg至300μm的浓度，随后恒定振荡下孵育另外5-6小时来诱导蛋白质产生。最终通过离心收集所得生物质，用50mmtris-hcl缓冲液(ph7.5)洗涤。将细胞在4℃或-20℃下以沉淀形式储存直至进一步使用。通常从1升培养物中获得2.5至4克细胞(湿重)，与所用培养基无关。
在750mlinforsht反应器中制备并运行发酵。向发酵容器中添加168ml去离子水。反应容器装配有所有必需的探针(po2、ph、取样、消泡剂)、c+n进料和氢氧化钠瓶并进行高压灭菌。高压灭菌后，将以下成分加入到反应器中：
20ml10倍的磷酸/柠檬酸缓冲液
14ml50％葡萄糖
0.53mlmgso4溶液
2ml(nh4)2so4溶液
0.020ml微量元素溶液
0.400ml硫胺素溶液
0.200ml卡那霉素原液
反应条件设定如下：ph＝6.95，po2＝40％，t＝30℃，以300rpm搅拌。级联：rpm设置点为300，最小300，最大1000，流动l/分钟设置点0.1，最小0，最大0.6。消泡剂控制：1:9。
将发酵罐从种子培养物接种至od650nm为0.4-0.5。将该种子培养物在37℃，220rpm下于lb培养基(+卡那霉素)中培养8小时。发酵首先以分批模式运行11.5小时，然后利用在灭菌后向其中添加：17.5ml(nh4)2so4溶液、1.8mlmgso4溶液、0.018ml微量元素溶液、0.360ml硫胺素溶液，0.180ml卡那霉素原液的进料溶液(灭菌的葡萄糖溶液(143mlh2o+35g葡萄糖)开始c+n进料。进料以约4.2ml/h的恒定流速运行。外部进行葡萄糖和nh4+测量以评估c-和n-源在培养中的可用性。通常葡萄糖水平保持在非常低的水平。
将培养物生长总共约25小时，在此期间它们通常达到40-45的od650nm。然后通过在发酵罐中添加iptg至约1mm的终浓度(分次添加iptg或在3-4小时的时期中使用输注注射器)，将温度设定为40℃，将po2设定为20％来开始shc生产。shc生产的诱导在40℃持续16小时。在诱导结束时，通过离心收集细胞，用0.1m柠檬酸/柠檬酸钠缓冲液(ph5.4)洗涤，并在4℃或-20℃下以沉淀块储存，直至进一步使用。
结果ia
一般来说，与富培养基相比，当使用基本培养基时，所有其它条件都不变，生产的生物催化剂的比活性更高。
在30或37℃下成功进行了诱导。注意到，当在40-43℃下进行诱导时，获得了较高比活性的生物催化剂。
结果ib
下表1显示两个实例在诱导开始和诱导结束时的培养体积、光密度和细胞量以及收集的生物质的量(湿重)。
表1
接种时0d600nm：0.45(实施例1)和0.40(实施例2)。起始体积：205毫升
野生型shc氨基酸序列(seqidno.1)(genbankm73834，swissprotp33247)
maeqlveapayartldraveyllscqkdegywwgpllsnvtmeaeyvllchildrvdrdrmekirryllheqredgtwalypggppdldttieayvalkyigmsrdeepmqkalrfiqsqggiessrvftrmwlalvgeypwekvpmvppeimflgkrmplniyefgswaratvvalsivmsrqpvfplperarvpelyetdvpprrrgakggggwifdaldralhgyqklsvhpfrraaeiraldwllerqagdgswggiqppwfyalialkildmtqhpafikgweglelygveldyggwmfqasispvwdtglavlalraaglpadhdrlvkagewlldrqitvpgdwavkrpnlkpggfafqfdnvyypdvddtavvvwalntlrlpderrrrdamtkgfrwivgmqssnggwgaydvdntsdlpnhipfcdfgevtdppsedvtahvlecfgsfgyddawkvirraveylkreqkpdgswfgrwgvnylygtgavvsalkavgidtrepyiqkaldwveqhqnpdggwgedcrsyedpayagkgastpsqtawalmaliaggraeseaarrgvqylvetqrpdggwdepyytgtgfpgdfylgytmyrhvfptlalgrykqaierr
变体f601yshc氨基酸序列(seqidno.2)-相对于seqidno.1的变体
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变体f605wshc核苷酸序列(seqidno.3)
atggctgagcagttggtggaagcgccggcctacgcgcggacgctggatcgcgcggtggagtatctcctctcctgccaaaaggacgaaggctactggtgggggccgcttctgagcaacgtcacgatggaagcggagtacgtcctcttgtgccacattctcgatcgcgtcgatcgggatcgcatggagaagatccggcggtacctgttgcacgagcagcgcgaggacggcacgtgggccctgtacccgggtgggccgccggacctcgacacgaccatcgaggcgtacgtcgcgctcaagtatatcggcatgtcgcgcgacgaggagccgatgcagaaggcgctccggttcattcagagccagggcgggatcgagtcgtcgcgcgtgttcacgcggatgtggctggcgctggtgggagaatatccgtgggagaaggtgcccatggtcccgccggagatcatgttcctcggcaagcgcatgccgctcaacatctacgagtttggctcgtgggctcgggcgaccgtcgtggcgctctcgattgtgatgagccgccagccggtgttcccgctgcccgagcgggcgcgcgtgcccgagctgtacgagaccgacgtgcctccgcgccggcgcggtgccaagggagggggtgggtggatcttcgacgcgctcgaccgggcgctgcacgggtatcagaagctgtcggtgcacccgttccgccgcgcggccgagatccgcgccttggactggttgctcgagcgccaggccggagacggcagctggggcgggattcagccgccttggttttacgcgctcatcgcgctcaagattctcgacatgacgcagcatccggcgttcatcaagggctgggaaggtctagagctgtacggcgtggagctggattacggaggatggatgtttcaggcttccatctcgccggtgtgggacacgggcctcgccgtgctcgcgctgcgcgctgcggggcttccggccgatcacgaccgcttggtcaaggcgggcgagtggctgttggaccggcagatcacggttccgggcgactgggcggtgaagcgcccgaacctcaagccgggcgggttcgcgttccagttcgacaacgtgtactacccggacgtggacgacacggccgtcgtggtgtgggcgctcaacaccctgcgcttgccggacgagcgccgcaggcgggacgccatgacgaagggattccgctggattgtcggcatgcagagctcgaacggcggttggggcgcctacgacgtcgacaacacgagcgatctcccgaaccacatcccgttctgcgacttcggcgaagtgaccgatccgccgtcagaggacgtcaccgcccacgtgctcgagtgtttcggcagcttcgggtacgatgacgcctggaaggtcatccggcgcgcggtggaatatctcaagcgggagcagaagccggacggcagctggttcggtcgttggggcgtcaattacctctacggcacgggcgcggtggtgtcggcgctgaaggcggtcgggatcgacacgcgcgagccgtacattcaaaaggcgctcgactgggtcgagcagcatcagaacccggacggcggctggggcgaggactgccgctcgtacgaggatccggcgtacgcgggtaagggcgcgagcaccccgtcgcagacggcctgggcgctgatggcgctcatcgcgggcggcagggcggagtccgaggccgcgcgccgcggcgtgcaatacctcgtggagacgcagcgcccggacggcggctgggatgagccgtactacaccggcacgggcttcccaggggattggtacctcggctacaccatgtaccgccacgtgtttccgacgctcgcgctcggccgctacaagcaagccatcgagcgcaggtga
变体f605wshc氨基酸序列(seqidno.4)-相对于seqidno.1的变体
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实施例3
7e，3e/z-高法呢醇混合物的生物转化
使用以下反应条件进行生物转化：
使用高法呢醇底物(其为86∶14的7e，3e∶7e，3z的混合物)、250g/1细胞(根据实施例2的方法(发酵)形成的)和1.55％sds，在含有146g/1总高法呢醇的inforsht750ml发酵罐中于0.1m柠檬酸/柠檬酸钠缓冲液ph5.4中运行反应(150.1g总体积)。反应在35℃、持续搅拌(900rpm)下进行，使用10至40％柠檬酸水溶液进行ph控制。
对反应混合物经历如下面实施例4中所示的分离和纯化步骤。
实施例4
下游处理程序
将从7e，3e/z-高法呢醇(86∶143e∶3z)的生物转化形成的反应混合物经历蒸汽蒸馏。收集馏出物作为双相混合物。保留有机相并弃去水相。通过gc分析有机相的组成，结果示于下表2中(见“粗制”)。
然后将有机相浓缩至干。然后将乙醇添加至粗制干燥产物中，并将混合物加温直至产物溶解。在室温下缓慢加入水，(-)-降龙涎醚在于冰浴中偶尔搅拌和冷却下结晶。
表1显示了结晶产物的gc分析结果。数据显示(-)-降龙涎醚的强烈富集，在结晶样品中实际上没有发现副产物(a)、(b)或(c)。
应当注意，在表2中，“a”、“b”和“c”分别指化合物(ii)、化合物(iv)和化合物(iii)。“ezh”和“eeh”分别是指7e，3z-高法呢醇和7e，3e-高法呢醇。
表1
实施例5
反应液的固相的萃取：
鉴于(-)-降龙涎醚不溶于水，并且在低于约75℃下不是液体，对于使用与水混溶的溶剂(例如乙醇)和与水不混溶的溶剂(例如甲苯)从生物转化的固相中萃取产物，这些性质被认为是可能的优点。
将200ml反应液离心以将固体从液(水)相中分离出来(sorvallgs3，5000rpm，10分钟，10℃)。这将约80ml固体沉淀块与约120ml液相分离。mtbe萃取后水相的分析(气相色谱)显示，其含有不超过约0.3％的最初存在于200ml反应液中的(-)-降龙涎醚。使用甲苯和乙醇99％从固相萃取(-)-降龙涎醚。
甲苯萃取：
将80ml固相用45ml甲苯萃取(约1/2固相体积，剧烈摇动30s，离心(sorvallgs3，5000rpm，10分钟，10℃)6次。用gc分析溶剂相的(-)-降龙涎醚含量。利用代表初始全反应液体积(200ml)的1.35倍或固相体积的3.4倍的总甲苯体积进行6次萃取来萃取超过99.5％的最初存在于反应液中的(-)-降龙涎醚。
乙醇萃取：
用160ml(2体积)乙醇99％萃取80ml固相(inforsmultiforsht，35℃，1000rpm，30分钟)，然后离心。(-)-降龙涎醚在萃取过程中没有结晶。4次洗涤(总共640ml乙醇，即初始全反应液体积的3.2倍或固相体积的8倍)后，回收了约99％的最初存在于反应液中的(-)-降龙涎醚。在第一萃取步骤中需要足够的乙醇来防止(-)-降龙涎醚结晶(乙醇中的溶解度)。当在第一萃取步骤中仅使用1或1/2体积的固相时，获得难以处理的粘性糊状物，并且(-)-降龙涎醚在离心过程中以针状结晶在沉淀块上。温度似乎不是造成此结晶的因素(在室温和约35℃-40℃下测试萃取和离心)。
乙醇相中的(-)-降龙涎醚浓度以及液相的乙醇/水比(固相的残留水分)似乎是晶体形成的原因。然而，注意到有可能将乙醇的体积减少至1体积的固相。
由于(-)-降龙涎醚在室温下不处于液相，因此其与生物质分离，可用有机溶剂(例如与水混溶的溶剂(例如乙醇)或与水不混溶的溶剂(例如甲苯))萃取。将(-)-降龙涎醚分离至反应混合物的固相中的离心步骤是有利的，因为其降低萃取(-)-降龙涎醚所需的溶剂量。
实施例6
感官分析
目的：对在原材料和结晶材料中形成的(-)-降龙涎醚和化合物(ii)、(iii)和(iv)进行感官分析。
e,e-高法呢醇的生物转化产生(-)-降龙涎醚和化合物(iv)。
e,z-高法呢醇的生物转化产生大环醚化合物(ii)和epi-降龙涎醚化合物(iii)。
(-)-降龙涎醚的粗制混合物包含分别以87.1wt％、2.8wt％、2.5wt％和7.6wt％的量存在的所需(-)-降龙涎醚、化合物(ii)、(iii)和(iv)。
当粗制混合物选择性结晶(实验室规模)时，结晶的材料与粗制混合物具有相同的成分，但它们分别以99.1wt％、0.1wt％、0.1wt％和0.7wt％的量存在。
感官分析结果如下：
(-)-降龙涎醚：气味阈值0.2ng/l。
化合物(iv)：弱，isoe，木味，gc检测阈值5-10ng。
化合物(ii)：“无臭的”(gc-阈值>500ng)。
化合物(iii)：gc-阈值为(-)-降龙涎醚的约10倍(约2ng)。
3种副产物(化合物ii、iii和iv)的感官分析表明比(-)-降龙涎醚的气味更弱。事实上，epi-降龙涎醚(化合物iii)气味比(-)-降龙涎醚弱约10倍，表明其基本上是无臭的。
实施例7
通过蒸汽萃取回收降龙涎醚
粗制(蒸气萃取的)和结晶的(-)-降龙涎醚的所得纯度
ee:ez-高法呢醇86:14的生物转化提供了通过蒸汽萃取的反应混合物。将蒸汽馏出物收集为双相混合物。保留有机相并弃去水相。通过gc分析有机相的组成，结果如下表所示(见“粗制的”)。然后将有机相浓缩至干。然后将乙醇添加至粗制干燥产物中，并将混合物加温直至产物溶解。在室温下缓慢加入水，(-)-降龙涎醚在冰浴中在偶尔搅拌和冷却下结晶。
列表数据还显示了蒸汽萃取/蒸馏步骤(“粗制的”)后获得的产物和结晶产物((-)-降龙涎醚)的gc分析结果。表中“ezh”和“eeh”分别是指(3z,7e)-高法呢醇和7e,3e-高法呢醇。
下面的列表数据表明特定原料(eeh:ezh86:14)使用wtshc酶或shc衍生物产生了所需的终产物(-)-降龙涎醚和副产物(ii、iv和iii)的非常特异的混合物。选择性结晶的数据显示(-)降龙涎醚的强烈富集，在结晶样品中几乎没有发现副产物(ii)、(iv)或(iii)。因此，该ee:ez混合物提供了嗅觉纯的(-)-降龙涎醚产物，其以相对直接且成本有效的方式选择性地结晶。
表：显示结晶产物的gc分析结果
蒸馏萃取/过滤是用于分离(-)-降龙涎醚的环境友好方法，因为其通过生物催化剂的相关失活提供了(-)-降龙涎醚的方便无溶剂分离。
可使用本领域技术人员已知的方法，使用溶剂从整个反应混合物(例如使用与水不混溶的溶剂或通过蒸汽萃取/蒸馏或通过过滤)或从固相(例如使用与水混溶的溶剂)萃取使用生物转化反应产生的(-)-降龙涎醚。
序列表
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