用于非清髓性预处理的组合物和方法与流程

本申请要求2015年4月6日提交的美国临时申请号62/143,642、2015年9月17日提交的美国临时申请号62/220,204、2015年9月21日提交的美国临时申请号62/221,595和2015年10月9日提交的美国临时申请号62/239,573的利益，所述临时申请的全部教示通过参考并入本文。

背景技术：

造血干细胞移植(HSCT)主要适用于治疗恶性肿瘤，并且在植入之前需要预处理(condition)对象的组织(例如骨髓组织)。HSCT适应症和血红蛋白病包括例如镰状细胞贫血、β地中海贫血、范科尼贫血、威斯科特-奥尔德里奇综合征、腺苷脱氨酶SCID(ADA SCID)、异染性脑白质营养不良和HIV/AIDS；随着基因编辑技术的进步，所述适应症的名单将继续扩展。在某些情况下，被移植的细胞的20％的植入可能缓和或治愈所述疾病。

当前的包括例如辐射(例如全身辐射或TBI)和DNA烷化剂/修饰剂的非靶向预处理方法，对多种器官系统、造血和非造血细胞和造血微环境具有高毒性。这些严苛的预处理方案有效地杀死宿主对象的免疫和巢(niche)细胞并且不利地影响多种器官系统，常常引起危及生命的并发症。

为了充分认识HSCT的治愈潜力，开发避免不想要的毒性的温和预处理方案是必不可少的。需要可用于预处理对象的组织(例如骨髓组织)，同时减轻不想要的毒性并最小化严重不利反应的发生的新的、优选地非清髓性的组合物和方法。还需要可以选择性去除靶组织中的内源造血干细胞群的新疗法，同时最小化或消除这些疗法对非靶细胞和组织例如血小板、白细胞和红细胞的影响。还需要用于鉴定可以选择性耗减(deplete)或去除内源造血干细胞群的药剂的测定法和方法。

技术实现要素：

本文公开了可用于去除所选细胞群和预处理对象的组织以备植入或移植的方法和组合物，以及鉴定可用于预处理对象的组织以备植入或移植的候选药剂的测定法和方法。在某些实施方式中，本文公开的方法和组合物是非清髓性的。还公开了例如通过靶向一种或多种标志物(例如细胞表面CD45或CD117标志物)以使毒素被内化，将所述毒素递送到细胞的方法；这些方法可用于有效地预处理对象以备植入或移植(例如预处理人类对象以备造血干细胞移植)。

有利的是，本文公开的方法、测定法和组合物不引起通常与传统预处理方法例如辐射相伴的毒性。例如，相对于传统预处理方案，在某些实施方式中，本文公开的组合物和方法不引起嗜中性粒细胞减少症、血小板减少症和/或贫血，但还能产生与治疗相关的稳定的混合性嵌合。这些组合物和方法可以例如用于在受影响的对象中校正、治愈或以其他方式改善一种或多种疾病(例如本文公开的方法和组合物可用于校正或治愈HIV、AIDS或血红蛋白病例如镰状细胞贫血和范科尼贫血)。

在某些实施方式中，本文公开了预处理对象或对象的靶组织以备植入的方法，这些方法包括通过向所述对象给药有效量的与毒素偶联(例如功能性偶联)的药剂，选择性耗减或去除所述对象的靶组织中的内源干细胞(例如造血干细胞)或祖细胞群；其中所述毒素被所述内源干细胞群内化，由此耗减或去除所述靶组织中的内源干细胞群并预处理所述对象以备移植的细胞或细胞群的植入。在某些实施方式中，所述药剂选自抗体和配体。

本文还公开了将干细胞植入到对象中的方法，这些方法包括：(a)向所述对象给药有效量的与毒素偶联的药剂，其中所述毒素被内源干细胞(例如造血干细胞)或祖细胞群内化，由此选择性耗减或去除所述对象的靶组织中的内源干细胞群；以及(b)将干细胞群给药到所述对象的靶组织，其中被给药的干细胞群植入到所述对象的靶组织中。

在某些情况下，本文还公开了在对象中治疗干细胞障碍的方法，这些方法包括：(a)向所述对象给药有效量的与毒素偶联(例如功能性偶联)的药剂，其中所述毒素被所述对象的靶组织中的内源干细胞(例如造血干细胞)或祖细胞群内化，由此耗减或去除所述对象的靶组织中的内源干细胞或祖细胞群；以及(b)将干细胞群给药到所述对象的靶组织，其中被给药的干细胞群植入到所述对象的靶组织中。在某些实施方式中，所述干细胞群在所述免疫毒素已从所述对象的靶组织清除或消散后被给药到所述对象的靶组织。

在某些实施方式中，本文公开的发明涉及选择性耗减或去除对象的靶组织中的内源造血干细胞(HSC)或祖细胞群的方法，所述方法包括向所述对象给药有效量(例如1.5mg/kg)的与毒素偶联的药剂；其中所述药剂选择性结合到CD45，并且所述毒素被所述内源HSC或祖细胞群内化，由此耗减或去除所述靶组织中的内源HSC或祖细胞群。

在某些实施方式中，本文公开的发明涉及选择性耗减或去除对象的靶组织中的内源造血干细胞或祖细胞群的方法，所述方法包括向所述对象给药有效量的与毒素偶联(例如功能性偶联)的药剂；其中所述药剂选择性结合到CD117，并且所述毒素被所述内源HSC或祖细胞群内化，由此耗减或去除所述靶组织中的内源HSC或祖细胞群。

本文还公开了选择性去除对象的靶组织中的内源干细胞(例如造血干细胞)或祖细胞群的方法，所述方法包括：向所述对象给药有效量的特异性或选择性结合到CD45并与毒素偶联的内化抗体，由此去除所述靶组织中的内源干细胞群。

在某些实施方式中，本文公开了干细胞移植(例如造血干细胞移植)的方法，所述方法包括：向对象给药有效量的特异性或选择性结合到CD117并与毒素偶联的内化抗体，由此去除靶组织中的内源干细胞群；以及将外源干细胞群给药到所述对象的靶组织中。

在某些情况下，还公开了在对象中治疗或治愈血红蛋白病(例如镰状细胞贫血)的方法，所述方法包括：向所述对象给药有效量的特异性或选择性结合到CD45或CD117并与毒素偶联的内化抗体，由此去除所述对象的靶组织中的内源干细胞(例如造血干细胞)或祖细胞群；然后进行将外源干细胞群给药到所述对象的靶组织的步骤。在某些实施方式中，所述外源干细胞群在所述免疫毒素(例如抗CD45-SAP或抗CD117-SAP免疫毒素)已从所述对象的靶组织清除或消散后被给药到所述对象的靶组织。

在某些情况下，本文公开的药剂选择性靶向所述靶组织的细胞群。例如，在某些实施方式中，这种药剂(例如抗体或配体)可以在所述药剂结合到被靶向的造血干细胞表达的细胞表面蛋白之后被所述造血干细胞内化。因此，由所述靶组织的细胞(例如驻留在骨髓干细胞巢中的造血干细胞)表达的细胞表面蛋白，提供了将本文公开的免疫毒素靶向、在某些情况下区别性地靶向表达该蛋白的细胞群的手段。在某些情况下，所述蛋白的表达限于特定细胞群，并且所述蛋白可以作为靶，用于将所述免疫毒素选择性递送到该细胞群，而不影响或极小地影响不表达所述蛋白的细胞群(例如所述对象的非靶组织或脱靶组织)。或者，被所述免疫毒素靶向的细胞表面蛋白的表达不限于特定细胞群；在这些情况下，可以使用不同组成部分将所述免疫毒素的递送限制到表达所述细胞表面蛋白靶的仅仅一部分细胞群。例如，在双特异性抗体的情形中，一种特异性可以针对所述靶细胞表面蛋白，另一种特异性可针对表达受限于所选细胞群的标志物。

在某些实施方式中，对象的靶组织的细胞包含内源干细胞群，例如驻留在所述靶组织中的内源造血干细胞和/或祖细胞。在某些情况下，所述造血干细胞或祖细胞表达一种或多种标志物，其可用于将包含本文公开的免疫毒素组合物的药剂选择性靶向所述对象的靶组织的细胞。

能够用于将所述靶细胞群与所述非靶细胞群区分开的任何标志物，包括本文中描述的任一标志物，可以被包含本文描述的免疫毒素的药剂靶向，用于将毒素递送到所述细胞群。例如，在本发明的某些情况下，包含所述免疫毒素组合物的药剂可以选择性结合到由所述靶组织的细胞表达的一种或多种细胞表面标志物(例如CD45-SAP免疫毒素可以选择性结合到具有CD45标志物的细胞表面表达的造血干细胞)。在某些实施方式中，被靶向的造血干细胞或祖细胞表达可以被靶向并且所述免疫毒素选择性或偏好性地与其结合的一种或多种标志物，这些标志物选自下述标志物：HLA-DR、CD11a、CD18、CD34、CD41/61、CD43、CD45、CD49d(VLA-4)、CD49f(VLA-6)、CD51、CD58、CD71、CD84、CD90、CD97、CD117(c-kit)、CD133、CD134、CD162、CD166、CD 184(CXCR4)、CD205和CD361。在某些实施方式中，所述靶组织中被靶向的细胞(例如造血干细胞或祖细胞)表达可以被靶向并且所述免疫毒素选择性或偏好性地与其结合的一种或多种标志物，这些标志物选自下述标志物：CD13，CD33，CD34，CD44，CD45，CD49d:VLA-4，CD49f:VLA-6，CD59，CD84:CD150家族，CD90:Thy1，CD93，CD105:内皮糖蛋白，CD117:cKit/SCF受体，CD 123:IL-3R，CD 126:IL-6R，CD 133，CD135:Flt3受体，CD166:ALCAM，CD 184:CXCR4，Prominin 2，促红细胞生成素R，内皮细胞选择性粘附分子，CD244，Tie1，Tie2，MPL，G-CSFR或CSF3R，IL-1R，gp130，白血病抑制因子受体，制瘤素M受体，Embigin和IL-18R。在其他实施方式中，所述靶组织中被靶向的细胞(例如造血干细胞或祖细胞)表达可以被靶向并且所述包含免疫毒素的药剂选择性地与其结合的一种或多种标志物，这些标志物选自下述标志物：CD150，CD27和CD201。例如，在某些实施方式中，所述造血干细胞或祖细胞表达CD45。同样地，在某些实施方式中，所述造血干细胞或祖细胞表达CD117。同样地，在某些实施方式中，所述造血干细胞或祖细胞表达CD34。

在某些实施方式中，所述标志物选自HLA-DR、CD11a、CD18、CD34、CD41/61、CD43、CD45、CD47、CD58、CD71、CD84、CD97、CD117(c-kit)、CD133、CD162、CD166、CD205和CD361。在某些实施方式中，所述被靶向的细胞包含人类造血干细胞，其表达可以被靶向并且所述包含免疫毒素的药剂与其结合的一种或多种标志物，这些标志物选自CD7、CDw12、CD13、CD15、CD19、CD21、CD22、CD29、CD30、CD33、CD34、CD36、CD38、CD40、CD41、CD42a、CD42b、CD42c、CD42d、CD43、CD45、CD45RA、CD45RB、CD45RC、CD45RO、CD48、CD49b、CD49d、CD49e、CD49f、CD50、CD53、CD55、CD64a、CD68、CD71、CD72、CD73、CD81、CD82、CD85A、CD85K、CD90、CD99、CD104、CD105、CD109、CD110、CD111、CD112、CD114、CD115、CD117、CD123、CD124、CD126、CD127、CD130、CD131、CD133、CD135、CD138、CD151、CD157、CD162、CD164、CD168、CD172a、CD173、CD174、CD175、CD175s、CD176、CD183、CD191、CD200、CD201、CD205、CD217、CD220、CD221、CD222、CD223、CD224、CD225、CD226、CD227、CD228、CD229、CD230、CD235a、CD235b、CD236、CD236R、CD238、CD240、CD242、CD243、CD277、CD292、CDw293、CD295、CD298、CD309、CD318、CD324、CD325、CD338、CD344、CD349和CD350。

在某些实施方式中，所述被靶向的细胞包含人类造血干细胞，其表达可以被靶向并且所述包含免疫毒素的药剂与其结合的一种或多种标志物，这些标志物选自CD11a、CD 18、CD37、CD47、CD52、CD58、CD62L、CD69、CD74、CD97、CD103、CD132、CD156a、CD179a、CD179b、CD184、CD232、CD244、CD252、CD302、CD305、CD317和CD361。

在某些实施方式中，所述内源细胞(例如HSC或祖细胞)表达一种或多种标志物，并且被给药的药剂(例如抗体-毒素偶联物)选择性结合到所述一种或多种标志物或其片段或表位。在某些情况下，本文公开的方法特异性或区别性地靶向或导向所述对象的靶组织，而不影响或极小地影响所述对象的非靶组织或脱靶组织(例如胸腺)。在某些实施方式中，本文公开的方法和组合物不耗减或去除内源嗜中性粒细胞或髓系细胞。在某些实施方式中，本文公开的方法和组合物引起成熟内源嗜中性粒细胞的增加。在某些情况下，本文公开的方法和组合物不耗减或去除内源血小板。在其他实施方式中，本文公开的方法和组合物不在所述对象中引起贫血。

在某些实施方式中，所述标志物是内化性(internalizing)的。例如，在所述药剂结合到内化标志物(例如细胞表面受体)之后，所述组合物被表达这样的标志物的细胞内化。

在某些实施方式中，所述标志物不是内化性的。例如，在这些实施方式中，第一标志物可以用作区别性靶向细胞群的手段，而第二标志物可以被靶向以实现所述免疫毒素组合物在细胞内的内化。

本文公开的免疫毒素组合物包含便于将这些组合物选择性递送到所述靶组织中的细胞群(例如骨髓干细胞巢的造血干细胞)的药剂。在某些实施方式中，本文公开的药剂包含抗体(例如单克隆抗体)。在某些实施方式中，所述抗体是阻断性抗体或拮抗剂抗体。在某些实施方式中，所述抗体不是阻断性抗体或拮抗剂抗体。在某些实施方式中，本文公开的药剂包含配体。在某些情况下，所述药剂选择性结合到CD45。在某些情况下，所述药剂是CD45拮抗剂。或者，在某些实施方式中，所述药剂不是CD45拮抗剂。在某些实施方式中，所述毒素在所述药剂结合到CD45细胞表面标志物的表位之后被表达CD45的细胞内化。

在某些实施方式中，本文公开的药剂选择性结合到CD117。在某些情况下，所述药剂是CD117拮抗剂。或者，在某些情况下，所述药剂不是CD117拮抗剂。在某些实施方式中，所述毒素在所述药剂结合到CD117细胞表面标志物的表位之后被表达CD117的细胞内化。

在某些情况下，所述药剂是抗体克隆104。在某些实施方式中，所述药剂是抗体克隆30F11。在某些实施方式中，所述药剂是抗体克隆ACK2。在某些情况下，所述药剂是克隆ACK2之外的抗体。在某些情况下，所述药剂是抗体克隆ACK2，并且所述毒素不被直接偶联到所述抗体。在其他情况下，所述药剂是抗体克隆2B8。在某些实施方式中，所述药剂是克隆2B8之外的抗体。在某些实施方式中，所述药剂是克隆2B8之外的抗体，并且所述毒素不被直接偶联到所述抗体。在某些情况下，所述药剂是抗体克隆3C11。在某些实施方式中，所述药剂是抗体克隆MEM-28。在某些实施方式中，所述药剂是抗体克隆HI30。在某些实施方式中，所述药剂是抗体克隆581。在某些实施方式中，所述药剂是抗体克隆4H11。在某些情况下，所述药剂是选自克隆L243、克隆TS2/4、克隆TS1/18、克隆581、克隆4H11、克隆A2A9/6、克隆CD43-10G7、克隆BHPT-1、克隆orb12060、克隆2D1、克隆CC2C6、克隆TS2/9、克隆CY1G4、克隆OKT9、克隆CD84.1.21、克隆VIM3b、克隆A3C6E2、克隆EMK08、克隆TMP4、克隆KPL-1、克隆3a6、克隆HD83和克隆MEM-216的抗体。在某些实施方式中，所述药剂是包含与选自下列的一种或多种抗体的互补决定区相同的互补决定区的抗体：克隆L243，克隆TS2/4，克隆TS1/18，克隆581，克隆4H11，克隆A2A9/6，克隆CD43-10G7，克隆BHPT-1，克隆orb12060，克隆2D1，克隆CC2C6，克隆TS2/9，克隆CY1G4，克隆OKT9，克隆CD84.1.21，克隆VIM3b，克隆A3C6E2，克隆EMK08，克隆TMP4，克隆KPL-1，克隆3a6，克隆HD83和克隆MEM-216。在某些实施方式中，所述药剂是与选自下列的一种或多种抗体结合到相同的表位的抗体：克隆L243，克隆TS2/4，克隆TS1/18，克隆581，克隆4H11，克隆A2A9/6，克隆CD43-10G7，克隆BHPT-1，克隆orb12060，克隆2D1，克隆CC2C6，克隆TS2/9，克隆CY1G4，克隆OKT9，克隆CD84.1.21，克隆VIM3b，克隆A3C6E2，克隆EMK08，克隆TMP4，克隆KPL-1，克隆3a6，克隆HD83和克隆MEM-216。在某些情况下，所述药剂包含选择性识别和/或结合到CD34标志物的抗体(例如克隆581或克隆4H11)。在某些情况下，所述药剂包含选择性识别和/或结合到CD45标志物的抗体(例如克隆MEM-28或克隆HI30)。在某些情况下，所述药剂是人源化抗体。

在某些实施方式中，所述药剂是配体。例如，在某些实施方式中，所述配体可以选自下述配体：干细胞因子(SCF)或cKit配体、CXCL12:基质细胞衍生因子1(SDF1)、血管生成素1至4(Ang1、Ang2、Ang3、Ang4)、TPO(促血小板生成素)、促红细胞生成素、FLT3L、VLA4、VLA6、IL-1、IL-3、IL-6、IL-18、G-CSF、制瘤素M和LIF。

在某些实施方式中，所述药剂被偶联到毒素(例如皂角素)。在某些情况下，本文公开的药剂(例如抗体)的特征在于是内化性的。在某些情况下，这些药剂在表达与所述药剂结合的标志物或组成部分(例如细胞表面标志物或抗原)(包括但不限于CD45和/或CD117)的细胞结合这些药剂(例如抗体或配体)后，被所述细胞内化。

在某些实施方式中，所述毒素通过受体介导的内化作用被内化。在某些情况下，本文公开的毒素以至少约10％的比率(例如经过约24小时)被所述内源干细胞群内化。在某些情况下，本文公开的毒素以至少约50％的比率(例如经过约24小时)被所述内源干细胞群内化。在其他实施方式中，本文公开的毒素以至少约90％的比率(例如经过约24小时)被所述内源干细胞群内化。

本文公开的方法可以使用任何适合的毒素来实践。在某些情况下，所述毒素选自下述毒素：皂角素、白喉毒素、假单胞菌外毒素A、蓖麻毒素A链衍生物、小分子毒素及其组合。在某些情况下，所述毒素是皂角素。在某些实施方式中，所述毒素失活核糖体。在某些实施方式中，所述毒素抑制蛋白质合成。在某些情况下，所述毒素不是放射免疫毒素。在某些实施方式中，所述毒素在进入所述靶组织中的一个或多个细胞的细胞内区室中之后发挥其效果。在某些实施方式中，本文公开的方法和组合物不通过DNA损伤诱导细胞死亡。在某些实施方式中，不论所述细胞的细胞周期阶段如何，所述毒素都诱导细胞死亡。

在某些情况下，所述毒素选自相思豆毒素、蒴莲素毒素、多花白树毒蛋白毒素、苦瓜毒蛋白毒素、天花粉蛋白毒素、丝瓜子蛋白毒素及其组合。

在本发明的任一情况的各种不同实施方式中，在本发明的免疫毒素组合物和方法中有用的毒素包含一种或多种DNA损伤性分子。例如，所选的毒素可能包含一种或多种抗微管蛋白药剂(例如美登素)或微管蛋白抑制剂、DNA交联剂、DNA烷化剂和细胞周期或有丝分裂破坏剂。

在本发明的任一情况的某些实施方式中，所述毒素抑制RNA聚合酶II和/或III(例如哺乳动物的RNA聚合酶II)。在某些情况下，这种RNA聚合酶II和/或III抑制剂毒素是或包含一种或多种鹅膏毒素或其功能性片段、衍生物或类似物。例如，设想用于本文公开的任何方法或组合物的毒素可以包括或包含一种或多种鹅膏毒素，其选自α-鹅膏蕈碱、β-鹅膏蕈碱、γ-鹅膏蕈碱、￡-鹅膏蕈碱、三羟基鹅膏毒素(amanin)、三羟鹅膏毒素酰胺、一羟鹅膏毒素酰胺(amanullin)、一羟鹅膏毒素羧酸及其任何功能性片段、衍生物或类似物。

本文中设想了将药剂(例如抗体)连接或偶联到毒素(例如皂角素)，以便于这些药剂向靶组织的细胞的靶向递送。在某些情况下，所述药剂被直接偶联到所述毒素，例如作为嵌合融合蛋白。或者，在某些情况下，所述药剂被间接偶联到所述毒素(例如使用链霉亲和素嵌合体)。在某些实施方式中，所述药剂与毒素的偶联通过链霉亲和素-生物素相互作用(间接连接的实例)来促进。在某些实施方式中，所述药剂被生物素化。在某些情况下，所述毒素被生物素化。在某些实施方式中，所述药剂被偶联到链霉亲和素-毒素嵌合体。在某些情况下，所述毒素被偶联到链霉亲和素-毒素嵌合体。

在某些情况下，药剂(例如抗体)与链霉亲和素-毒素的比例为约1：1、约1：4、约2：1或约4：1。

在某些情况下，药剂(例如抗体)与毒素的比例为约1：2、约1：2.5、约1：2.8、约1：3、约1：3.5、约1：4、约1：4.5、约1：5、1：6或约1：8。

在某些情况下，本文公开的方法还包括将干细胞群给药到所述对象的靶组织的步骤，其中被给药的干细胞群植入到所述对象的靶组织中。在某些实施方式中，所述给药或移植干细胞群的步骤在将所述内源干细胞(例如造血干细胞)或祖细胞从所述靶组织部分或完全耗减或去除后进行。在优选实施方式中，这样的给药步骤在所述对象的靶组织(例如骨髓组织)已按照本文公开的方法和组合物预处理后进行。在某些实施方式中，所述干细胞群在所述免疫毒素(例如抗CD45-SAP或抗CD117-SAP免疫毒素)已从所述对象的靶组织清除或消散之后给药到所述对象的靶组织，以便残留在所述对象的靶组织中的免疫毒素的水平不在被移植的细胞群中引起显著的细胞死亡。例如，在某些实施方式中，所述干细胞群在所述免疫毒素给药后约2至约18天被给药到所述对象的靶组织。在某些实施方式中，在所述免疫毒素已从所述对象的靶组织清除或消散后至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、12、13、14、15、18、21、36、42、56、63、70、80、90、100、120天或更多天，将所述干细胞群给药到所述对象的靶组织。

在某些实施方式中，当与仅使用将所述干细胞群给药到所述对象的靶组织的步骤进行的方法相比时，本文公开的这些方法提高了所述被给药的干细胞群在所述靶组织中的植入效率。例如，在某些实施方式中，所述植入效率提高至少约5-100％，例如5、10、15、20、25、50、75、100％或更多。

本文公开的方法和组合物可用于预处理对象的组织(例如骨髓)以备植入或移植，并且在这种预处理之后，将干细胞群给药到所述对象的靶组织。在某些情况下，所述干细胞群包含外源干细胞群。在某些实施方式中，所述干细胞群包含所述对象的内源干细胞(例如已被遗传修饰以校正疾病或遗传缺陷的内源干细胞)。

在某些实施方式中，本文公开的方法和组合物引起粒细胞集落刺激因子(GCSF)的增加。在某些情况下，本文公开的方法和组合物引起巨噬细胞集落刺激因子(MCSF)的增加。在某些实施方式中，本文公开的方法和组合物引起内源髓系细胞的增加。不希望受到任何特定理论或作用机制限制，在给药本文公开的药剂、毒素和相关偶联物后观察到的内源髓系细胞的增加，可能作为所述对象的内源GCSF和/或MCSF增加的结果而发生。因此，在某些实施方式中，这种内源髓系细胞的增加作为可能继发于本文公开的方法和组合物的粒细胞集落刺激因子(GCSF)和/或巨噬细胞集落刺激因子(MCSF)的增加的结果而发生。在某些情况下，本文公开的方法和组合物不耗减或去除内源淋巴系细胞。

在某些情况下，在按照本文公开的方法和组合物预处理对象的靶组织之后，所述对象的先天性免疫力得以保留。在某些情况下，在按照本文公开的方法和组合物预处理对象的组织之后，所述对象的适应性免疫力得以保留。在某些实施方式中，本文公开的方法和组合物保留所述对象的胸腺完整性。同样地，在某些实施方式中，本文公开的方法和组合物保留所述对象的血管完整性。

在某些实施方式中，按照本文公开的方法和组合物预处理对象的靶组织，实现所述外源干细胞群的至少约5-90％的植入。例如，按照本文公开的方法和组合物预处理对象的组织，实现所述外源干细胞群的至少约5％、10％、12.5％、15％、17.5％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97.5％、99％或更高的植入。

在某些实施方式中，按照本文公开的方法和组合物预处理对象的组织，在向所述对象给药所述外源干细胞群后4个月，在所述对象的靶组织(例如骨髓)中实现至少约5-90％的供体细胞嵌合率(例如20％的供体细胞嵌合率)。例如，在某些实施方式中，按照本文公开的方法和组合物预处理对象的组织，在向所述对象给药所述外源干细胞群后4个月，在所述对象的靶组织中实现至少约5％、10％、12.5％、15％、17.5％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97.5％、99％或更高的供体细胞嵌合率。

本文公开的方法和组合物可用于预处理骨髓组织。在某些情况下，本文公开的药剂(例如抗CD45-毒素偶联物)可用于非清髓性预处理，例如在造血干细胞移植之前的骨髓预处理。

本文公开的方法和组合物可用于治疗、治愈或校正多种疾病，包括例如选自镰状细胞贫血、地中海贫血、范科尼贫血、威斯科特-奥尔德里奇综合征、腺苷脱氨酶SCID(ADA SCID)、HIV/AIDS、异染性脑白质营养不良、Diamond-Blackfan贫血和Schwachman-Diamond综合征的疾病。优选地，这些方法和组合物可用于治疗这些疾病而不引起对传统的预处理疗法例如辐射做出响应而观察到的毒性。

在某些情况下，所述对象具有非恶性血红蛋白病(例如选自镰状细胞贫血、地中海贫血、范科尼贫血和威斯科特-奥尔德里奇综合征的血红蛋白病)。在某些情况下，所述对象具有免疫缺陷症。例如，在某些实施方式中，所述对象具有先天性免疫缺陷症。或者，在其他情况下，所述对象具有获得性免疫缺陷症(例如选自HIV和AIDS的获得性免疫缺陷症)。在其他实施方式中，所述对象具有干细胞障碍，其选自下述障碍：非恶性血红蛋白病、免疫缺陷症和癌症。在某些实施方式中，所述对象具有、患有代谢障碍(例如选自糖原贮积病、黏多醣贮积症、高歇氏病、胡尔勒氏症、神经鞘脂贮积病和异染性脑白质营养不良的代谢障碍)或以其他方式受到所述代谢障碍影响。在某些实施方式中，所述对象具有、患有恶性肿瘤或以其他方式受到所述恶性肿瘤影响。在某些实施方式中，所述对象具有、患有选自下列的疾病或病症或以其他方式受到所述疾病或病症影响：重症联合免疫缺陷症，威斯科特-奥尔德里奇综合征，高免疫球蛋白M综合症，Chédiak-Higashi病，遗传性淋巴组织细胞增生症，骨硬化病，成骨不全症，贮积病，重型地中海贫血，镰状细胞病，系统性硬化症，系统性红斑狼疮，多发性硬化症和青少年类风湿性关节炎。例如，在某些实施方式中，所述对象患有选自血液癌(例如白血病、淋巴瘤、多发性骨髓瘤和骨髓增生异常综合征)和成神经细胞瘤的恶性肿瘤。

在某些情况下，本文公开的免疫毒素组合物可用于诱导实体器官移植耐受性(例如诱导与肾移植相关的免疫原性耐受性)。在这些实施方式中，本文公开的免疫毒素组合物和方法可用于从靶组织耗减或去除细胞群(例如从骨髓干细胞巢耗减HSC)。在细胞从所述靶组织的这种耗减后，可以将来自于器官供体的干细胞或祖细胞群(例如来自于器官供体的HSC)给药到移植受体，并在这些干细胞或祖细胞植入后，获得暂时的稳定的混合性嵌合，由此能够不需其他免疫抑制剂即可实现长期的移植器官耐受性。

在某些情况下，所述对象是哺乳动物(例如所述对象是人类)。在某些情况下，所述对象是有免疫能力的。或者，在某些实施方式中，所述对象是免疫受损的。

本文还公开了用于选择性耗减或去除内源干细胞群的候选药剂的鉴定方法，这些方法包括下述步骤：(a)将包含所述干细胞群的样品与偶联(例如功能性偶联)到毒素的试验药剂相接触；以及(b)检测所述干细胞群的一个或多个细胞是否从所述样品被耗减或去除；其中在所述接触步骤后所述干细胞群的一个或多个细胞的耗减或去除，将所述试验药剂鉴定为候选药剂。在某些实施方式中，将所述细胞与所述试验药剂接触至少约2-24小时。

在某些实施方式中，所述细胞是人类细胞。在某些实施方式中，所述细胞是小鼠细胞。在某些实施方式中，所述细胞是干细胞。在某些情况下，这些细胞包含造血干细胞或祖细胞。在某些实施方式中，所述造血干细胞或祖细胞表达一种或多种标志物，其选自HLA-DR、CD11a、CD 18、CD34、CD41/61、CD43、CD45、CD49d(VLA-4)、CD49f(VLA-6)、CD51、CD58、CD71、CD84、CD90、CD97、CD117(c-kit)、CD133、CD134、CD162、CD166、CD184(CXCR4)、CD205和CD361。在某些实施方式中，所述人类造血干细胞或祖细胞表达CD34。

在某些实施方式中，所述靶向的细胞包含人类造血干细胞，其表达可以被靶向并且包含所述免疫毒素的药剂选择性与其结合的一种或多种标志物，这些标志物选自CD7、CDw12、CD13、CD15、CD19、CD21、CD22、CD29、CD30、CD33、CD34、CD36、CD38、CD40、CD41、CD42a、CD42b、CD42c、CD42d、CD43、CD45、CD45RA、CD45RB、CD45RC、CD45RO、CD48、CD49b、CD49d、CD49e、CD49f、CD50、CD53、CD55、CD64a、CD68、CD71、CD72、CD73、CD81、CD82、CD85A、CD85K、CD90、CD99、CD104、CD105、CD109、CD110、CD111、CD112、CD114、CD115、CD117、CD123、CD124、CD126、CD127、CD130、CD131、CD133、CD135、CD138、CD151、CD157、CD162、CD164、CD168、CD172a、CD173、CD174、CD175、CD175s、CD176、CD183、CD191、CD200、CD201、CD205、CD217、CD220、CD221、CD222、CD223、CD224、CD225、CD226、CD227、CD228、CD229、CD230、CD235a、CD235b、CD236、CD236R、CD238、CD240、CD242、CD243、CD277、CD292、CDw293、CD295、CD298、CD309、CD318、CD324、CD325、CD338、CD344、CD349和CD350。

在某些实施方式中，被靶向的细胞包含人类造血干细胞，其表达可以被靶向并且包含所述免疫毒素的药剂选择性与其结合的一种或多种标志物，这些标志物选自CD11a、CD18、CD37、CD47、CD52、CD58、CD62L、CD69、CD74、CD97、CD103、CD132、CD156a、CD179a、CD179b、CD184、CD232、CD244、CD252、CD302、CD305、CD317和CD361。

在某些实施方式中，所述试验药剂是抗体。在某些情况下，所述试验药剂是配体。在某些实施方式中，所述毒素被所述HSC或祖细胞群的一个或多个细胞内化。在某些实施方式中，所述内化包括受体介导的内化作用。在某些实施方式中，所述毒素选自下述毒素：皂角素、白喉毒素、假单胞菌外毒素A、蓖麻毒素A链衍生物、小分子毒素及其组合。在某些情况下，所述毒素选自相思豆毒素、蒴莲素毒素、多花白树毒蛋白毒素、苦瓜毒蛋白毒素、天花粉蛋白毒素、丝瓜子蛋白毒素及其组合。在某些实施方式中，所述毒素是或包含鹅膏毒素(例如α-鹅膏蕈碱)。

尽管本文公开的某些实施方式设想了将例如药剂-毒素偶联物用于耗减或预处理组织(例如骨髓组织)或用于毒素的受体介导的内化作用，但本文公开的发明不限于这些实施方式。相反，本文设想了可用于将毒素选择性细胞内递送到靶组织的细胞的任何方法。例如，在某些实施方式中，本文公开了使用孔介导的内化作用细胞内递送毒素的方法。

在某些实施方式中，本文公开了预处理对象以备植入的方法，这些方法包括通过下述步骤选择性耗减或去除所述对象的靶组织(例如骨髓组织)中的内源干细胞群：(a)向所述对象给药有效量的包含与药剂偶联(例如功能性偶联)的突变的保护抗原(mut-PA)的成孔嵌合体，并由此在所述内源干细胞群的细胞膜中形成一个或多个孔；以及(b)向所述对象给药有效量的第二嵌合体，其中所述第二嵌合体包含与毒素偶联的因子(例如酶因子)，其中所述因子选自致死因子N-端(LFN)、水肿因子N-端(EFN)或其片段，并且其中所述毒素被所述内源干细胞群内化，由此选择性耗减或去除所述靶组织中的内源干细胞群并预处理所述对象以备植入。

在某些实施方式中，本发明涉及将干细胞植入到对象中的方法，这些方法包括下述步骤：(a)向所述对象给药有效量(例如1.5mg/kg)的包含与药剂偶联的突变的保护抗原(mut-PA)的成孔嵌合体，并由此在内源干细胞群的细胞膜中形成一个或多个孔；(b)向所述对象给药有效量的第二嵌合体，其中所述第二嵌合体包含与毒素偶联的因子(例如酶因子)，其中所述因子选自致死因子N-端(LFN)、水肿因子N-端(EFN)或其片段，并且其中所述毒素被所述内源干细胞群内化，由此耗减或去除所述靶组织(例如骨髓组织)中的内源干细胞群；以及(c)将干细胞群给药到所述对象的靶组织，其中被给药的干细胞群植入到所述对象的靶组织中。在某些实施方式中，所述干细胞群在所述毒素(例如融合到LFN的白喉毒素A链嵌合体(LFN-DTA))已从所述对象的靶组织清除或消散之后给药到所述对象的靶组织。

在某些实施方式中，所述药剂选自scfv、Fab、discfv、biscFv、tri-scfv、串联的scfv、适体、抗体和配体。在某些实施方式中，所述药剂是单链可变区片段(scFv)。在某些情况下，所述药剂是双特异性抗体。

在其他实施方式中，所述药剂是配体。例如，这种配体可以选自下述配体：干细胞因子(SCF)、CXCL12:基质细胞衍生因子1(SDF1)、血管生成素1至4(Ang1、Ang2、Ang3、Ang4)、TPO(促血小板生成素)、促红细胞生成素、FLT3L、VLA4、VLA6、IL-1、IL-3、IL-6、IL-18、G-CSF、制瘤素M、LIF及其组合。

在本文公开的方法的某些实施方式中，所述毒素通过孔介导的内化作用被内化。在某些实施方式中，所述毒素是皂角素。在某些实施方式中，所述毒素失活核糖体。在某些实施方式中，所述毒素抑制蛋白质合成。在某些情况下，所述毒素选自下述毒素：皂角素、白喉毒素、假单胞菌外毒素A、蓖麻毒素A链衍生物、小分子毒素及其组合。在某些实施方式中，所述毒素是或包含鹅膏毒素(例如α-鹅膏蕈碱)。在某些实施方式中，所述毒素选自相思豆毒素、蒴莲素毒素、多花白树毒蛋白毒素、苦瓜毒蛋白毒素、天花粉蛋白毒素、丝瓜子蛋白毒素及其组合。

在某些实施方式中，所述内源干细胞群包含造血干细胞。在某些实施方式中，所述造血干细胞或祖细胞包含或表达一种或多种标志物。例如，在某些实施方式中，所述造血干细胞或祖细胞表达选自下列标志物的一种或多种标志物：CD13，CD33，CD34，CD44，CD45，CD49d:VLA-4，CD49f:VLA-6，CD59，CD84:CD150家族，CD90:Thy1，CD93，CD105:内皮糖蛋白，CD117:cKit/SCF受体，CD123:IL-3R，CD126:IL-6R，CD133，CD135:Flt3受体，CD166:ALCAM，CD184:CXCR4，Prominin 2，促红细胞生成素R，内皮细胞选择性粘附分子，CD244，Tie1，Tie2，MPL，G-CSFR或CSF3R，IL-1R，gp130，白血病抑制因子受体，制瘤素M受体，Embigin和IL-18R。在某些实施方式中，所述造血干细胞或祖细胞表达选自下列的一种或多种标志物：HLA-DR，CD11a，CD18，CD34，CD41/61，CD43，CD45，CD47，CD58，CD71，CD84，CD97，CD117(c-kit)，CD133，CD162，CD166，CD205和CD361。在某些情况下，所述药剂选择性结合到所述标志物。在某些情况下，在所述药剂结合到所述标志物之后，所述免疫毒素被表达这样的标志物的细胞内化。

在某些实施方式中，所述对象是哺乳动物。在某些实施方式中，所述哺乳动物是人类。在某些实施方式中，本文公开的方法和组合物可用于治疗、治愈或以其他方式改善受影响的对象中的疾病或病症。因此，在某些情况下，所述对象具有非恶性血红蛋白病。例如，这种对象可能受到选自镰状细胞贫血、地中海贫血、范科尼贫血和威斯科特-奥尔德里奇综合征的血红蛋白病影响。

在某些情况下，所述对象具有免疫缺陷症。例如，在某些实施方式中，所述免疫缺陷症是先天性免疫缺陷症。或者，在某些情况下，所述免疫缺陷症是获得性免疫缺陷症。例如，选自HIV和AIDS的获得性免疫缺陷症。

在其他实施方式中，所述对象具有选自非恶性血红蛋白病、免疫缺陷症和癌症的干细胞障碍，或以其他方式受到所述干细胞障碍影响。

在本发明的任一情况的各种不同实施方式中，本文公开的组合物和方法还包括向所述对象给药一种或多种动员剂(例如CXCR2激动剂与CXCR4拮抗剂的组合)。例如，本文公开的组合物可以与一种或多种动员剂共同给药，和/或可以在所述一种或多种动员剂给药后给药(例如在所述动员剂给药后15分钟)。在某些情况下，所述动员剂是或包含非格司亭(GCSF)。在某些情况下，所述动员剂选自CXCR2激动剂(例如Gro-beta)、CXCR4拮抗剂(例如普乐沙福)及其组合。在某些实施方式中，所述动员剂包含Gro-beta。在某些情况下，所述动员剂包含Gro-betaΔ4。在某些实施方式中，所述动员剂包含普乐沙福。在某些情况下，所述动员剂包含Gro-beta和普乐沙福。在某些情况下，所述动员剂包含Gro-betaΔ4和普乐沙福。在某些情况下，所述动员剂包含硫酸乙酰肝素抑制剂。

通过参考下面本发明的详细描述，本发明的上面讨论的以及许多其他特点和伴随的优点将变得更好理解。

附图说明

本专利或申请文件含有至少一张彩图。本专利或专利申请出版物的带有彩图的拷贝将在申请并支付必要费用后由专利办公室提供。

图1说明了CD45单克隆抗体与链霉亲和素-皂角素偶联物相结合以产生针对CD45的免疫毒素(CD45-SAP)。还描绘了这种CD45-SAP引起表达CD45的造血干细胞(HSC)或祖细胞的细胞死亡的机制。

图2A-2G演示了几项研究的结果，所述研究评估了抗CD45小鼠单克隆抗体与链霉亲和素-皂角素偶联物相结合以产生针对CD45的免疫毒素(CD45-SAP)的效果。图2A示出了在预处理后8天收获的骨髓中造血干细胞(HSC)的频率，并证实了在CD45-SAP组中98％的HSC耗减，但是在非生物素标记的抗体加皂角素组中没有观察到耗减。图2B示出了通过预处理后8天收获的骨髓级分的集落形成计数所评估的短期祖细胞活性。图2C示出了预处理后8天的总骨髓细胞构成(cellularity)。图2D示出了被移植的小鼠的外周血供体细胞嵌合率的时间过程分析。图2E示出了在CD45-SAP给药后不同天进行的移植后2个月时的供体细胞嵌合率。图2F描绘了在未预处理的对照和CD45-SAP预处理的小鼠中，在移植后8个月时的总体三谱系分布。图2G示出了在未预处理的对照小鼠和CD45-SAP预处理的小鼠两者中，在移植后8个月时3种谱系的每种谱系内的供体细胞嵌合率。*表示p值<0.05；N.S.表示在统计上不显著。

图3A-3D示出了在用CD45-SAP预处理并且不接受供体细胞移植的小鼠中，在100天时间段内评估的几种血液学参数的恢复。具体来说，图3A示出了红细胞计数，图3B示出了嗜中性粒细胞计数(灰色框内的计数代表嗜中性粒细胞减少症)，图3C示出了血小板计数(灰色框内的计数代表血小板减少症)，图3D示出了淋巴细胞计数(B-和T-细胞)，它们在使用CD45-SAP预处理的小鼠中，在100天时间段内评估。呈现的结果证实了CD45-SAP预处理以非清髓性为特征。*表示p值<0.05；N.S.表示在统计上不显著。

图4A-4C示出了CD45-SAP免疫毒素在体外的细胞杀死活性并证实了通过靶向CD45，本文公开的免疫毒素可以被内化。如图4A中所示，EL4和EML细胞死亡被CD45-SAP组(三角形)诱导，而这种现象在非生物素标记的抗体加皂角素组(圆形)中没有观察到。图4B示出了使用CD45-SAP观察到的IC₅₀相对于在非生物素标记的抗体加皂角素组中观察到的IC₅₀。图4C示出了在alexa-fluor 488(AF488)标记的CD45抗体中观察到的24小时内化。

图5A-5E示出了CD45-SAP免疫毒素在体内耗减造血干细胞(HSC)。图5A-5C示出了在给药CD45-SAP免疫毒素的动物中的HSC频率百分率(图5A)、每个股骨的集落(图5B)和每个股骨的总细胞(图5C)。如图5D中所示，在使用CD45-SAP免疫毒素的单一i.v.剂量治疗后8天，相对于对照，HSC从骨髓组织被耗减。同样地，图5E证实了在完成的移植中有功能HSC的丧失。

图6A-6D示出了在小鼠中给药CD45-SAP后的植入结果。图6A总体说明了本发明的一个实施方式，其中将CD45-SAP免疫毒素给药到小鼠，然后用单剂外源细胞植入。图6B示出了在移植后4个月的嵌合率百分数。图6C和6D比较了在预处理和未预处理的小鼠两者中的供体细胞嵌合率百分数。

图7A-7F比较了CD45-SAP免疫毒素药剂相对于传统的辐射(5Gy)预处理方案的毒性。具体来说描绘了在T-细胞(图7A)、B-细胞(图7B)、髓系细胞(图7C)、细胞构成(图7D)、干细胞(图7E)和CFC活性(图7F)方面这种CD45-SAP免疫毒素相对于传统辐射的比较。

图8证实了在预处理后2天，相对于辐射来说，在给药CD45-SAP免疫毒素的小鼠中没有观察到对胸腺的损伤。相反，在用辐射预处理后，在小鼠中观察到胸腺萎缩。

图9示出了骨髓组织学，并证实了在使用CD45-SAP的小鼠中，在预处理后2天血管完整性保持完好。相反，在辐射后的小鼠中，在预处理后2天血管完整性受损。

图10描绘了在使用CD45-SAP药剂预处理后2天，血管完整性得以保留。相反，在辐射后的小鼠中，在预处理后2天血管完整性受损。

图11A-11D示出了在小鼠模型中，使用CD45-SAP预处理的植入能够校正镰状细胞贫血。图11A示出了在所评估的三种条件中的每种条件下的供体髓系细胞嵌合率百分数。如图11B-11D中所示，红细胞、血红蛋白和网织红细胞水平返回正常。

图12A-12B说明了在小鼠模型中镰状细胞的校正，并示出了在预处理的小鼠的血液中不再观察到镰状血红蛋白。图12A呈现了在用CD45-SAP预处理然后移植的动物中镰状血红蛋白(Hbs)和正常血红蛋白(Hba)的非变性PAGE凝胶分析的结果，并证实了镰状细胞的校正。图12B呈现了用CD45-SAP预处理然后移植的动物中的血液涂片和染色的结果，并进一步证实了所述动物中镰状细胞病的校正。

图13A-13B证实了在用CD45-SAP预处理然后移植的动物中脾脏尺寸的校正。具体来说，图13A和13B分别说明了镰状细胞小鼠模型中的脾脏重量和脾脏尺寸，在那些用CD45-SAP预处理的小鼠中得到校正。N.S.表示在统计上不显著。

图14A-14E证实了CD45-SAP表现出强烈细胞耗减活性。图14A描绘了用于评估免疫毒素在有免疫能力的小鼠中耗减HSC的能力的实验纲要。图14B示出了CD45-SAP对在给药后8天评估的祖细胞集落形成细胞(CFC)和HSC耗减的剂量依赖性影响。数据表示平均值±SD(n＝5只小鼠/组)。图14C证实了CD45-SAP耗减HSC，而非生物素化的CD45抗体在链霉亲和素-皂角素存在下不耗减HSC。数据表示平均值±SD(n＝5只小鼠/组)。图14D示出了CD45-SAP克隆104在体外杀死EML祖细胞，而非生物素化的抗体在链霉亲和素-皂角素存在下不影响活力。图14E示出了在使用克隆104的EL4细胞中CD45受体内化的定量。数据表示代表性实验的平均值±SD。*指示p值<0.05；**指示p值<0.01；***指示p值<0.001；n.s.指示不显著(p值>0.05)。

图15A-15G说明了免疫毒素的细胞耗减活性。图15A示出了在给药后6天在骨髓中评估的候选免疫毒素的HSC耗减活性。数据表示平均值±范围(n＝2只小鼠/组)。图15B描绘了CD45抗体与链霉亲和素-皂角素的各种不同比例对HSC耗减活性的影响的调查。数据表示平均值±SD(n＝4只小鼠/组)。图15C示出了在从对照或CD45-SAP预处理的小鼠收获的骨髓的竞争性移植后4个月的外周嵌合率，证实了有功能HSC被CD45-SAP的耗减。数据表示平均值±SD(n＝5只小鼠/组)。图15D示出了在CD45.1小鼠中CD45-SAP克隆104不耗减HSC。数据表示平均值±SD(n＝5只小鼠/组)。图15E呈现了在与CD45-SAP克隆104和30-F11温浴72h后针对EL4和EML细胞系的体外IC₅₀值。数据表示3个独立实验的平均值±SD。图15F示出了从克隆104和30-F11产生的CD45-SAP的HSC耗减。数据表示平均值±SD(n＝4只小鼠/组)。图15G示出了在给药后24h，AF488-标记的CD45抗体克隆104和30-F11在外周白细胞、脾细胞和LKS骨髓祖细胞中的体内保留。数据表示平均值±SD(n＝3只小鼠/组)。*指示p值<0.05；**指示p值<0.01；***指示p值<0.001；n.s.指示不显著(p值>0.05)。

图16A-16F显示了CD45-SAP能够进行高效的供体细胞植入。图16A描绘了在CD45-SAP预处理和CD45.1或CD45.2-GFP全骨髓细胞移植之后用于评估移植窗口的实验概要。图16B示出了在CD45-SAP预处理后各种不同天注射的CD45.2GFP或CD45.1细胞的供体细胞嵌合率(移植后4个月)。对照代表接受移植的未预处理的小鼠。数据表示平均值±SD(n＝5只小鼠/组)。图16C示出了代表性的流式细胞术图，说明了在对照或CD45-SAP预处理的小鼠中，在移植后外周血中的供体细胞。图16D示出了在CD45-SAP预处理后8天，CD45.2-GFP细胞移植后的外周血嵌合率的长期评估。数据表示平均值±SD(n＝5只小鼠/组)。图16E描绘了在CD45-SAP预处理的小鼠中供体细胞对髓系、B-和T-细胞的贡献相比于在未处理的对照小鼠中的总体分布。数据表示平均值±SD(n＝5只小鼠/组)。图16F示出了在未预处理的对照和CD45-SAP预处理的小鼠中，在2,000个纯化的HSC(LKS CD48-CD150+或LKS CD34-CD150+)移植后4个月的供体髓系细胞嵌合率。数据表示平均值±SD(n＝5只小鼠/组)。*指示p值<0.05；**指示p值<0.01；***指示p值<0.001；n.s.指示不显著(p值>0.05)。

图17A-17E说明了CD45-SAP给药后的供体植入。图17A演示了移植后4个月外周血和骨髓HSC群中的嵌合率。数据表示平均值±SD(n＝5只小鼠/组)。图17B示出了在CD45-SAP预处理后8天，在CD45.1细胞移植后外周血嵌合率的长期评估。数据表示平均值±SD(n＝5只小鼠/组)。图17C示出了来自于移植有CD45.2-GFP或CD45.1细胞的CD45-SAP预处理的小鼠的、骨髓连续移植后4个月的血液细胞嵌合率。数据表示平均值±SD(n＝5只小鼠/组)。图17D比较了CD45-SAP和5Gy全身辐照(TBI)在CD45.1细胞移植后4个月实现相近水平的嵌合率(70-80％)，而ACK2预处理不能实现植入(<5％)。数据表示平均值±SD(n＝5只小鼠/组)，例外的是ACK2(n＝2只小鼠)。图17E示出了将低细胞剂量(1百万个骨髓细胞)移植到用CD45-SAP、TBI(5Gy)或其组合预处理的小鼠中之后4个月的嵌合率。数据表示平均值±SD(n＝5只小鼠/组)。*指示p值<0.05；**指示p值<0.01；***指示p值<0.001；n.s.指示不显著(p值>0.05)。

图18A-18D描绘了CD45-SAP与辐射相比对骨髓的差异效果。图18A示出了在CD45-SAP或5Gy全身辐照(TBI)后各个不同时间点的相对骨髓细胞构成。数据表示相对于未处理的小鼠的平均百分率±SEM(n＝4只小鼠/组)。图18B示出了在CD45-SAP或5Gy全身辐照(TBI)后各个不同时间收获的骨髓细胞的相对集落形成细胞(CFC)活性。数据表示相对于未处理小鼠的平均百分率±SEM(n＝4只小鼠/组)。图18C示出了在CD45-SAP或5Gy TBI后各个不同时间点收获的骨髓中HSC的相对免疫表型定量。数据表示相对于未处理小鼠的平均百分率±SEM(n＝4只小鼠/组)。图18D示出了颅盖骨的体内显微术，以评估血管完整性。对照小鼠或用CD45-SAP或5Gy TBI处理(预处理后2天)的小鼠用高分子量(2MDa)葡聚糖-罗丹明i.v.注射，以评估血管完整性(红色通道)。图像在葡聚糖给药后20分钟捕获，并且骨骼表面在蓝色通道中示出。*指示p值<0.05；**指示p值<0.01；***指示p值<0.001；n.s.指示不显著(p值>0.05)。

图19示出了CD45-SAP和辐射对骨髓组织学的影响。在预处理后2天对照、CD45-SAP或5Gy TBI预处理的小鼠的股骨骨髓的代表性的苏木精和曙红染色。顶部和底部图像中的标尺条分别表示500和200微米。

图20A-20E示出了CD45-SAP与辐射相比对血液和胸腺的差异影响。图20A示出了在CD45-SAP或5Gy TBI后外周髓系细胞的相对水平。图20B示出了在预处理后2天和未预处理的对照中，在系统性白假丝酵母(Candida albicans)攻击后的Kaplan-Meier存活曲线(n＝10只小鼠/组)。图20C示出了CD45-SAP或5Gy TBI后CD3+T-细胞的相对水平。图20A和20C中的数据表示相对于未处理对照的平均百分率±SEM(n＝4只小鼠/时间点)。图20D示出了来自于对照、CD45-SAP或5Gy TBI预处理的小鼠的在预处理后2天收获的胸腺(500微米标尺条)和胸腺皮质(50微米标尺条)的苏木精和曙红染色。图20E示出了在预处理后3天每mg胸腺组织的T-细胞受体切除环(TREC)的绝对数目(n＝4只小鼠/组)。*指示p值<0.05；**指示p值<0.01；***指示p值<0.001；n.s.指示不显著(p值>0.05)。

图21A-21G描绘了CD45-SAP和辐射对血液和胸腺的影响。图21A示出了Wright Giemsa染色并确认了在CD45-SAP给药后6天小鼠的外周血中成熟嗜中性粒细胞(用箭头指示)的存在(20微米标尺条)。图21B示出了在CD45-SAP或5Gy TBI后B-细胞的相对水平(平均值±SEM，n＝4只小鼠/组)。图21C示出了在处理后3天收获的对照、CD45-SAP或5Gy TBI预处理的小鼠的胸腺质量。数据表示平均值±SD(n＝4只小鼠/组)。在CD45-SAP或5Gy TBI后各个不同时间点的(图21D)红细胞(RBC)、(图21E)血红蛋白、(图21F)红细胞比容和(图21G)血小板的相对水平。数据表示相对于未处理对照的平均百分率±SEM(n＝4只小鼠/时间点)。*指示p值<0.05；**指示p值<0.01；***指示p值<0.001；n.s.指示不显著(p值>0.05)。

图22A-22F证实了镰状细胞病的校正。图22A描绘了在镰状细胞病小鼠中用于CD45-SAP预处理和移植的实验概要(6只小鼠/组，3组)。图22B示出了在图22A中的条件下移植的三组镰状细胞病小鼠中，在移植后4个月的供体髓系细胞嵌合率。数据表示平均值±SD(n＝6只小鼠/组)。图22C示出了在移植后4个月，野生型对照、镰状细胞病对照和组A(校正的镰状细胞病小鼠)中红细胞(RBC)、血红蛋白、红细胞比容和网织红细胞数目的评估。数据表示平均值±SEM(n＝6只小鼠/组)。图22D示出了在来自于野生型对照、镰状细胞病和组A小鼠(来自于每个组的2只代表性小鼠)的血液中正常(Hba)和镰状细胞(Hbs)血红蛋白的非变性PAGE分析。图22E示出了野生型、镰状细胞病和组A小鼠的代表性外周血涂片，其中镰状细胞用箭头指示。图22F示出了来自于野生型对照、镰状细胞病和组A小鼠的代表性脾脏。*指示p值<0.05；**指示p值<0.01；***指示p值<0.001；n.s.指示不显著(p值>0.05)。

图23A-23F证实了在CD45-SAP预处理后镰状细胞病通过HSCT的校正。图23A示出了在给药各种不同剂量的CD45-SAP后8天，镰状细胞病小鼠中的HSC耗减。数据表示平均值±SEM(n＝3只小鼠/组)。图23B描绘了在镰状细胞病小鼠(3个组，n＝6只小鼠/组)中用于CD45-SAP预处理和移植的详细实验概要，其中指明了免疫毒素的剂量和移植的全骨髓细胞的数目。示出了野生型对照、镰状细胞病对照和3组CD45-SAP预处理和移植的镰状细胞病小鼠的(图23C)红细胞计数、(图23D)血红蛋白水平、(图23E)网织红细胞频率。图23C-23E中的数据表示平均值±SEM(n＝6只小鼠/组)。图23F示出了野生型对照、镰状细胞病对照和3组CD45-SAP预处理和移植的镰状细胞病小鼠在移植后4个月的脾脏质量。数据表示平均值±SD(n＝3只小鼠/组)。*指示p值<0.05；**指示p值<0.01；***指示p值<0.001；n.s.指示不显著(p值>0.05)。

图24说明了各种不同抗体和抗体-免疫毒素偶联物、包括2B8-SAP对EML祖细胞系的体外杀死。正如所示，2B8(CD117)和104(CD45)抗体是无活性的，除非与皂角素组合以产生内化性抗体-毒素偶联物。此外，ACK2(CD117)抗体由于拮抗干细胞因子(SCF)-CD117相互作用，在没有皂角素的情况下表现出固有的细胞耗减活性。需要SCF的细胞对拮抗作用敏感。

图25A和25B描绘了皂角素前导性研究的结果，其中评估了针对HSC上的已知抗原的各种不同单克隆抗体。图25A示出了在抗体-毒素偶联物给药后6天表型HSC的数目。图25B说明了在给药后6-8天各种不同抗体-毒素偶联物对HSC的体内耗减。

图26示出了ACK2-SAP和2B8-SAP抗体两者的干细胞耗减，并且正如所示，两者均实现表型HSC耗减，然而只有2B8-SAP使得能够植入。

图27描绘了前导性增强HSC植入研究的结果。正如所示，ACK2-SAP只比ACK2更好，但2B8-SAP比任一者明显更加高效，并且与CD45-SAP相当。

图28示出了在外周血和骨髓的LKS-SLAM(HSC)中的16周前导性植入研究的结果。在抗体-毒素偶联物给药后8天，移植1千万个全骨髓GFP细胞，并在移植后16周评估血液细胞和骨髓HSC中的嵌合率。正如所示，CD117 ACK2-SAP偶联物不能实现植入，而CD117 2B8-SAP偶联物能够实现GFP供体细胞的高效植入(80-98％)。

图29描绘了在给药后8天体内2B8-SAP剂量优化研究(n＝4只小鼠/组)的结果。

图30说明2B8-SAP偶联物保持外周血无损，证实了2B8-SAP是非清髓性的和不去除淋巴细胞的，正如在给药后8天所确定的。正如所示，CD45-SAP偶联物耗减B-和T-细胞，而2B8-SAP偶联物不耗减B-和T-细胞。

图31比较了在骨髓组织中各种不同CD117-SAP克隆相对于CD45-SAP克隆和5Gy全身辐照的体内效能(n＝5只小鼠/组)。在抗体-毒素偶联物给药后8天，评估对象动物的骨髓组织中的干细胞数目。正如所示，ACK2-SAP偶联物不能显著耗减HSC，而两种非拮抗剂CD117抗体-毒素偶联物(2B8-SAP和3C11-SAP)在作为免疫毒素耗减HSC中更加高效。

图32描绘了使用所描绘的CD117 2B8-SAP偶联物进行的16周植入研究的结果(n＝5只小鼠/组)。为了进行所述研究，在CD117 SAP-2B8偶联物给药后8天移植1千万个全骨髓CD45.1细胞，并在移植后16周评估嵌合率。如图32中所示，在具有完全免疫能力的动物中非拮抗剂2B8-SAP偶联物实现高效的供体细胞植入，因此将疾病范围极大扩展到包括非SCID病症。

图33说明了抗人CD45-SAP偶联物针对人造血细胞的体外活性。将人Jurkat CD45+造血细胞在体外用各种不同浓度的抗人CD45-SAP免疫毒素(使用抗人抗体产生)处理72小时，并使用MTS测定法(Promega)评估细胞活力。正如所示，对于MEM-28和HI30克隆来说，细胞杀死的IC₅₀值分别为130pM和200pM。数据表示代表性实验的平均值±SD(n＝3个技术平行样)。

图34呈现了抗人CD34-SAP针对人造血干细胞(HSC)的体外活性。将动员的人外周血CD34+ HSC在体外用各种不同浓度的抗人CD34-SAP免疫毒素处理96小时，并使用MTS测定法(Promega)评估细胞活力。正如所示，对于两种试验的克隆来说，细胞杀死的IC₅₀值约为100pM。

图35描绘了使用致死因子(LF)和水肿因子(EF)和保护抗原进行移位以耗减HSC或祖细胞的机制。

图36说明了LFN-DTA针对人造血干细胞(HSC)的体外活性。将动员的人外周血CD34+ HSC在体外用各种不同浓度的LFN-DTA免疫毒素在10nΜWT-PA存在下处理96小时，并使用MTS测定法(Promega)评估细胞活力。正如所示，在1飞摩尔浓度的LFN-DTA下观察到100％的细胞死亡，证实了LFN-DTA可用于实现人HSC的强力杀死。

图37描绘了LFN-DTA对各种不同造血细胞系的活性，其通过将这些细胞在体外用各种不同浓度的LFN-DTA免疫毒素处理48小时，并使用MTS测定法(Promega)评估细胞活力。正如所示，LFN-DTA表现出针对所处理的造血细胞系的活性。

图38描绘了几种预处理性靶或标志物。将50μL IMDM细胞因子培养基中的30,000个全骨髓细胞用各种不同浓度的免疫毒素或单独的皂角素处理24h。然后将细胞铺在M3434甲基纤维素中，并在7天后计数从造血干细胞和祖细胞(HSPC)产生的集落。发现所有免疫毒素都是有活性的并耗减HSPC，其IC₅₀值为1-10nM。单独的皂角素(无抗体)即使在高浓度(100nΜ)下也无活性。

图39描绘了人CD34+造血干细胞(HSC)杀死测定法的结果。免疫毒素从皂角素和靶向各种不同细胞表面受体的抗人单克隆抗体(mAb)产生，试验它们在5天内杀死人骨髓来源的CD34+ HSC的能力，并使用MTS测定法评估细胞活力。示出了杀死超过20％的CD34+细胞的免疫毒素。

图40A-40B描绘了在有免疫能力的Balb/c小鼠中进行的移植研究。将8周龄的有免疫能力的Balb/c小鼠用3mg/kg CD45-SAP(克隆104)或1.5mg/kg CD117-SAP(克隆2B8)注射，并在免疫毒素后6天用1千万个全骨髓供体细胞移植，如图40A中所示。在移植后16周，评估动物的外周血中的总体总细胞和髓系特异性供体细胞嵌合率。如图40B中所示，CD45-SAP和CD 117-SAP与未预处理的对照小鼠相比能够实现高效供体细胞植入(至少n＝3只小鼠/组)。

图41A-41B示出了所进行的涉及将人CD34+供体细胞移植到免疫受损的NSG小鼠中的研究。如图41A中所示，将8周龄的免疫受损的NSG小鼠用2Gy辐射、3mg/kg CD45.1-SAP或1.5mg/kg CD117-SAP预处理，并在免疫毒素后6天用人脐带血CD34+供体细胞移植。在移植后16周评估外周血中的总人类供体细胞嵌合率(n＝5只小鼠/组)并且描绘在图41B中。

图42A-42C说明了在用2Gy辐射、CD117-SAP或CD45.1-SAP预处理后NSG骨髓的人类嵌合率的结果。如图42A和42B中所示，在移植后16周，使用2Gy辐射、CD 117-SAP或CD45.1-SAP的预处理能够在骨髓中实现高水平的人类植入。如图42C中所示，骨髓中的人类供体细胞主要由B-细胞和一些髓系细胞以及少量T-细胞构成。

具体实施方式

本文公开的组合物和方法总的来说涉及可用于预处理对象的组织以备植入或移植(例如造血干细胞移植)的组合物、方法、疗法和方案。具体来说，这些组合物和方法选择性靶向标志物(例如细胞表面标志物例如CD45或CD117受体)，并便于免疫毒素向所述靶组织的一种或多种细胞(例如CD45+或CD117+细胞)，例如对象的骨髓组织中的造血干细胞(HSC)和/或祖细胞的细胞内递送。通过选择性靶向表达所选标志物(例如CD45或CD117)的细胞，本文公开的组合物和方法能够对那些被靶向的细胞行使它们的细胞毒性效应，同时减少、最小化并且在某些情况下消除对非靶细胞和组织的不利效应。例如，在某些情况下，本文公开的组合物和方法选择性去除或耗减靶组织(例如骨髓组织)的内源干细胞巢；然而，与传统的预处理方案(例如由Bolanos-Meade等，Blood(2012),120(22):4286所公开的用于镰状细胞贫血的缩减预处理方案)相反，这些组合物和方法不在所述对象中引起危及生命的嗜中性粒细胞减少症、血小板减少症和/或贫血。

在某些情况下，本文公开的组合物和方法涉及靶向、去除和/或耗减驻留在对象的靶组织中的造血干细胞或祖细胞(HSPC)，例如干细胞巢(例如对象的骨髓)内的造血干细胞或祖细胞。当在本文中使用时，“造血干细胞”是指可以分化成造血谱系并产生所有血细胞类型例如白细胞和红细胞的干细胞，所述谱系包括髓系(例如单核细胞和巨噬细胞、嗜中性粒细胞、嗜碱性粒细胞、嗜曙红粒细胞、红细胞、巨核细胞/血小板、树突状细胞)和淋巴系(例如T-细胞、B-细胞、K-细胞)谱系。干细胞由它们形成多种细胞类型的能力(多能性)和它们自我更新的能力来定义。人类造血干细胞可以例如通过细胞表面标志物例如CD34+、CD90+、CD49f+、CD38-和CD45RA-来鉴定。鼠类造血干细胞可以例如通过细胞表面标志物例如CD34-、CD133+、CD48-、CD150+、CD244-、cKit+、Scal+和缺乏谱系标志物(对尤其是B220、CD3、CD4、CD8、Mac1、Gr1和Ter119阴性)来鉴定。本文描述的组合物和方法可用于耗减或去除任何干细胞，包括但不限于外周血干细胞、骨髓干细胞、脐带干细胞、遗传修饰的干细胞等。

当在本文中使用时，术语“造血祖细胞”涵盖定向于造血细胞谱系，通常不自我更新，能够分化成造血系统的几种细胞类型例如粒细胞、单核细胞、红细胞、巨核细胞、B-细胞和T-细胞的多能细胞，包括但不限于短期造血干细胞(ST-HSC)、多能祖细胞(MPP)、共同髓系祖细胞(CMP)、粒细胞-单核细胞祖细胞(GMP)、巨核细胞-红细胞祖细胞(MEP)和定向淋巴系祖细胞(CLP)。造血祖细胞的存在可以在完全甲基纤维素测定法中作为集落形成单元细胞(CFU-C)在功能上确定，或者使用本领域专业技术人员已知的测定法通过细胞表面标志物(例如CD45、CD34+、Ter119-、CD16/32、CD127、cKit、Sca1)的检测在表型上确定。

本发明设想了出于专业技术人员所需的任何目的去除或耗减造血干细胞和/或祖细胞。在某些实施方式中，将所述造血干细胞和/或祖细胞从对象的靶组织(例如干细胞巢)去除或耗减，以预处理所述对象以备移植的造血干细胞和/或祖细胞细胞的植入，例如通过减少所述被移植的细胞可以植入的干细胞巢(例如骨髓)中的造血干细胞和/或祖细胞的数目或消除所述造血干细胞和/或祖细胞。

尽管本发明的某些情况设想了例如从干细胞巢去除或耗减造血干细胞，但本发明也可用于去除或耗减参与维持干细胞巢的非造血干细胞。例如，本文公开的化合物和方法可用于靶向在造血干细胞的巢维护中发挥作用的非HSC造血亚类。这些可以本文公开的组合物和方法靶向、去除或耗减的造血亚类包括例如表达CD4、CD3或CD8的T-细胞、表达B220或CD 19的B-细胞和表达Gr-1或Mac-1(CD11b)的髓系细胞。

当在本文中使用时，术语“去除”一般是指从靶组织(例如对象的骨髓组织)部分或完全除去细胞(例如造血干细胞或祖细胞)的群。在某些情况下，这种去除包括从所述靶组织完全除去或耗减这些细胞。或者，在其他情况下，这种去除是从所述靶组织部分除去或耗减这些细胞(例如HSC或祖细胞)。例如，在某些情况下，本文公开的方法和组合物引起所述靶组织的细胞(例如HSC或祖细胞)的至少约5％、10％、12.5％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、92.5％、95％、97.5％、98％或99％的耗减。

CD45受体是独特且普遍存在的膜糖蛋白，表达在几乎所有的造血细胞上。同样地，CD117是一种在造血干细胞、祖细胞以及其他细胞类型的表面上表达的细胞因子受体。本文公开的发明部分是基于某些标志物(例如细胞表面标志物例如CD45和CD117)具有内化性质这一发现，所述内化性质可以被利用以促进毒素(例如毒素如皂角素)向靶组织的细胞的细胞内递送并由此诱导细胞死亡，正如图1中一般性说明的。因此，在某些实施方式中，本文公开的药剂(例如抗体和/或配体)和组合物的特征在于是内化性的，并因此可以引起或以其他方式促进一种或多种免疫毒素向靶组织的、表达被靶向的标志物(例如被靶向的细胞表面标志物)的细胞的细胞内递送。

在某些情况下，本文公开的发明设想了选择一种或多种标志物(例如细胞表面标志物)以促进所述药剂向靶组织的细胞的选择性靶向。当在本文中使用时，术语“选择性地”意味着所述药剂(例如抗体)偏好性地或有区别地识别和/或结合到标志物或这种标志物(例如细胞表面标志物)的片段或表位。选择性识别和/或结合细胞表面标志物(例如CD45、CD117和CD34)并且可以按照本发明使用的示例性抗体药剂包括克隆104、克隆30F11、克隆ACK2、克隆2B8、克隆3C11、克隆MEM-28、克隆HI30、克隆581和克隆4H11。在某些情况下，所述药剂包含选择性识别和/或结合到CD34标志物的抗体(例如克隆581或克隆4H11)。在某些情况下，所述药剂包含选择性识别和/或结合到CD45标志物的抗体(例如克隆MEM-28或克隆HI30)。在某些情况下，所述药剂是选自克隆L243、克隆TS2/4、克隆TS1/18、克隆581、克隆4H11、克隆A2A9/6、克隆CD43-10G7、克隆BHPT-1、克隆orb12060、克隆2D1、克隆CC2C6、克隆TS2/9、克隆CY1G4、克隆OKT9、克隆CD84.1.21、克隆VIM3b、克隆A3C6E2、克隆EMK08、克隆TMP4、克隆KPL-1、克隆3a6、克隆HD83和克隆MEM-216的抗体。通过选择性靶向所述靶组织的细胞，本文公开的方法和组合物可以降低、限制或以其他方式避免在历史上困扰传统的预处理方案并引起危及生命的并发症的毒性。

当在本文中使用时，术语“标志物”一般是指可以定位或表达在靶组织的细胞表面上，并且可用于辨别细胞群的任何蛋白质、受体、抗原、糖类、脂类或其他组成部分。具体来说，这些标志物可用于将包含本文公开的免疫毒素组合物的药剂选择性靶向至靶组织的细胞。尽管本文公开的某些实施方式设想了使用例如CD34、CD45和/或CD117标志物进行细胞的选择性靶向，但本发明不限于那些标志物。相反，本发明设想了选择和使用可能有用或适用于细胞群的选择性靶向的任何标志物(例如细胞表面标志物)，包括任何尚未被发现的标志物。优选地，所选标志物选择性表达在靶细胞群的表面上，由此便于使用本文公开的药剂(例如抗体和/或配体)对这些细胞群进行选择性或区别性靶向。例如，在某些情况下，所选标志物表达在造血干细胞或祖细胞上。示例性的标志物可以选自标志物HLA-DR、CD11a、CD18、CD34、CD41/61、CD43、CD45、CD49d(VLA-4)、CD49f(VLA-6)、CD51、CD58、CD71、CD84、CD90、CD97、CD117(c-kit)、CD133、CD134、CD162、CD166、CD184(CXCR4)、CD205和CD361。在某些实施方式中，所选标志物仅表达在所述被靶向的细胞群(例如靶HSC群)上，由此限制或避免了已限制传统预处理方案的用途的“脱靶”效应。

在某些实施方式中，标志物的选择可以在对这种标志物(例如细胞表面标志物)在靶细胞上检测到的表达相对于这种标志物在对照细胞群上的表达进行比较的基础上做出。例如，可以将标志物在HSC或祖细胞上的表达与同一标志物在其他细胞上的平均表达进行比较。

在某些实施方式中，所述标志物是受体。可以按照本文公开的发明用作或选择为标志物的示例性的人类受体，可以选自标志物CD13、CD33、CD34、CD44、CD45、CD49d:VLA-4、CD49f:VLA-6、CD59、CD84:CD150家族、CD90:Thy1、CD93、CD105:内皮糖蛋白、CD117:cKit/SCF受体、CD123:IL-3R、CD126:IL-6R、CD 133、CD135:Flt3受体、CD166:ALCAM、CD 184:CXCR4、Prominin 2、促红细胞生成素R、内皮细胞选择性粘附分子、CD244、Tie1、Tie2、MPL、G-CSFR或CSF3R、IL-1R、gp130、白血病抑制因子受体、制瘤素M受体、Embigin和IL-18R。

在某些情况下，在人类造血干细胞上表达，可以被靶向并且包含免疫毒素的药剂选择性与其结合的示例性标志物可以选自CD7、CDw12、CD13、CD15、CD19、CD21、CD22、CD29、CD30、CD33、CD34、CD36、CD38、CD40、CD41、CD42a、CD42b、CD42c、CD42d、CD43、CD45、CD45RA、CD45RB、CD45RC、CD45RO、CD48、CD49b、CD49d、CD49e、CD49f、CD50、CD53、CD55、CD64a、CD68、CD71、CD72、CD73、CD81、CD82、CD85A、CD85K、CD90、CD99、CD104、CD105、CD109、CD110、CD111、CD112、CD114、CD115、CD117、CD123、CD124、CD126、CD127、CD130、CD131、CD133、CD135、CD138、CD151、CD157、CD162、CD164、CD168、CD172a、CD173、CD174、CD175、CD175s、CD176、CD183、CD191、CD200、CD201、CD205、CD217、CD220、CD221、CD222、CD223、CD224、CD225、CD226、CD227、CD228、CD229、CD230、CD235a、CD235b、CD236、CD236R、CD238、CD240、CD242、CD243、CD277、CD292、CDw293、CD295、CD298、CD309、CD318、CD324、CD325、CD338、CD344、CD349和CD350。

在某些实施方式中，在人类造血干细胞上表达，可以被靶向并且包含免疫毒素的药剂选择性与其结合的示例性标志物可以选自CD11a、CD18、CD37、CD47、CD52、CD58、CD62L、CD69、CD74、CD97、CD 103、CD132、CD156a、CD179a、CD179b、CD184、CD232、CD244、CD252、CD302、CD305、CD317和CD361。

可以按照本文公开的发明用作或选择为标志物的示例性的小鼠受体可以选自Sca-1、CD150、CD27和CD201。

可以按照本文公开的发明用作或选择为标志物的示例性的配体可以选自标志物干细胞因子(SCF)或cKit配体、CXCL12:基质细胞衍生因子1(SDF1)、血管生成素1至4(Ang1、Ang2、Ang3、Ang4)、TPO(促血小板生成素)、促红细胞生成素、FLT3L、VLA-4、VLA-6、IL-1、IL-3、IL-6、IL-18、G-CSF、制瘤素M和LIF。

本文公开的组合物包含药剂，以促进这些组合物向例如对象的靶组织中的内源造血干细胞或祖细胞群的靶向。当在本文中使用时，术语“药剂”是指可用于或以其他方式促进组成部分例如与这些药剂偶联的毒素向一种或多种细胞(例如对象的靶组织中的一种或多种造血干细胞或祖细胞)的靶向或导向的任何物质、分子、化合物或组成部分例如抗体或配体或适体。在某些情况下，所述药剂选择性靶向靶组织(例如骨髓组织)中的细胞，引起偶联到它的组成部分(例如毒素)被这些细胞内化，并由此从所述靶组织去除或耗减这些细胞。在某些实施方式中，所述药剂选择性识别和/或结合到标志物或这些标志物(例如细胞表面标志物例如受体)的片段或表位。

本文公开的药剂包括但不限于可以选择性靶向、结合到或识别可能在所述靶组织的细胞的细胞表面上差异表达的标志物或表位的任何药剂。在某些实施方式中，这些药剂将本文公开的免疫毒素导向或靶向至所述靶组织的细胞(例如癌症干细胞)，由此从所述靶组织耗减或去除这些细胞并预处理这样的靶组织。在某些实施方式中，所述药剂是或包含配体(例如配体如干细胞因子)。在某些实施方式中，所述药剂是或包含适体。本发明的药剂不限于上述说明性实例，而是可以使用可以选择性靶向、结合到或识别靶组织的细胞的细胞表面上表达的标志物或表位的任何药剂。在某些实施方式中，所述药剂通过重组方法制备。

在某些情况下，所述药剂是或包含抗体(例如单克隆或多克隆抗体)。本发明的抗体可以是多克隆或单克隆的，术语“抗体”打算涵盖多克隆和单克隆抗体两者。例如，在某些情况下，所述抗体选自克隆104、克隆30F11、克隆ACK2、克隆2B8、克隆3C11、克隆MEM-28、克隆HI30、克隆581和克隆4H11。在某些实施方式中，所述药剂是包含与选自下列的一种或多种抗体的互补决定区相同的互补决定区的抗体：克隆104，克隆30F11，克隆ACK2，克隆2B8，克隆3C11，克隆MEM-28，克隆HI30，克隆581和克隆4H11。在某些实施方式中，所述药剂是与选自下列的一种或多种抗体结合到相同表位的抗体：克隆104，克隆30F11，克隆ACK2，克隆2B8，克隆3C11，克隆MEM-28，克隆HI30，克隆581和克隆4H11。

在某些情况下，所述抗体选自克隆L243、克隆TS2/4、克隆TS1/18、克隆581、克隆4H11、克隆A2A9/6、克隆CD43-10G7、克隆BHPT-1、克隆orb12060、克隆2D1、克隆CC2C6、克隆TS2/9、克隆CY1G4、克隆OKT9、克隆CD84.1.21、克隆VIM3b、克隆A3C6E2、克隆EMK08、克隆TMP4、克隆KPL-1、克隆3a6、克隆HD83和克隆MEM-216。在某些实施方式中，所述药剂是包含与选自下列的一种或多种抗体的互补决定区相同的互补决定区的抗体：克隆L243，克隆TS2/4，克隆TS1/18，克隆581，克隆4H11，克隆A2A9/6，克隆CD43-10G7，克隆BHPT-1，克隆orb12060，克隆2D1，克隆CC2C6，克隆TS2/9，克隆CY1G4，克隆OKT9，克隆CD84.1.21，克隆VEVBb，克隆A3C6E2，克隆EMK08，克隆TMP4，克隆KPL-1，克隆3a6，克隆HD83和克隆MEM-216。在某些实施方式中，所述药剂是与选自下列的一种或多种抗体结合到相同表位的抗体：克隆L243，克隆TS2/4，克隆TS1/18，克隆581，克隆4H11，克隆A2A9/6，克隆CD43-10G7，克隆BHPT-1，克隆orb12060，克隆2D1，克隆CC2C6，克隆TS2/9，克隆CY1G4，克隆OKT9，克隆CD84.1.21，克隆VIM3b，克隆A3C6E2，克隆EMK08，克隆TMP4，克隆KPL-1，克隆3a6，克隆HD83和克隆MEM-216。此外应该理解，本文中描述的利用抗体作为药剂以促进免疫毒素向靶组织的细胞递送的方法，也可以利用这些抗体的功能性片段(例如抗原结合片段)。

本发明的抗体可以针对适合的标志物或抗原例如分离和/或重组的哺乳动物CD34、CD45或CD117:cKit/SCF受体或其部分或表位来产生。抗体可以通过本领域技术人员已知的方法，针对所选标志物(例如细胞表面标志物)或抗原来产生。这些用于产生多克隆抗体的方法在本领域中是公知的，并详细描述在例如Harlow等，1988，《抗体实验指南》(Antibodies,A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor,NY)中。

通常，这些抗体通过用相关抗原(例如CD34、CD45或CD117:cKit/SCF受体)的多次皮下或腹膜内注射免疫动物(例如兔、大鼠、小鼠、驴等)来产生，其中所述抗原任选地偶联到钥孔戚血蓝蛋白(KLH)、血清白蛋白、其他免疫原性载体，在无菌盐水中稀释并与佐剂(例如完全或不完全弗氏佐剂)合并，以形成稳定乳液。然后从所述被免疫的动物的血液或腹水回收多克隆抗体。将收集的血液凝结，倾倒出血清，通过离心澄清，并测量抗体滴度。所述多克隆抗体可以按照本领域中的标准方法包括亲和层析、离子交换层析、凝胶电泳、透析等，从血清或腹水中纯化。也可以使用标准程序为多克隆抗血清赋予单特异性(参见例如Agaton等，“用于基于抗体的蛋白质组学尝试的单特异性多克隆抗体的选择性富集”(Selective Enrichment of Monospecific Polyclonal Antibodies for Antibody-Based Proteomics Efforts)，J Chromatography A 1043(1):33-40(2004)，其整体通过参考并入本文)。

在某些实施方式中，单克隆抗体可以使用杂交瘤方法来制备，例如Kohler和Milstein，“分泌具有预定特异性的抗体的融合细胞的连续培养”(Continuous Cultures of Fused Cells Secreting Antibody of Predefined Specificity)，Nature 256:495-7(1975)所描述的，所述文献整体通过参考并入本文。使用所述杂交瘤方法，对小鼠、仓鼠或其他适合的宿主动物进行免疫，以引发淋巴细胞生产特异性结合到免疫抗原的抗体。或者，淋巴细胞可以在体外免疫。在免疫后，分离所述淋巴细胞并使用例如聚乙二醇将其与适合的骨髓瘤细胞系融合，以形成杂交瘤细胞，其然后可以从未融合的淋巴细胞和骨髓瘤细胞中选出。通过免疫沉淀、免疫印迹或通过体外结合测定法例如放射免疫测定法(RIA)或酶联免疫吸附测定法(ELISA)所确定的产生特异性针对例如细胞表面标志物如CD34、CD45或CD117:cKit/SCF受体的单克隆抗体的杂交瘤，然后可以使用标准方法在体外培养中繁殖(James Goding，《单克隆抗体：原理与实践》(Monoclonal Antibodies:Principles and Practice)(1986)，其整体通过参考并入本文)，或在体内作为动物中的腹水肿瘤来繁殖。然后可以如上面对多克隆抗体所述，从所述培养基或腹水中纯化所述单克隆抗体。

在某些实施方式中，单克隆抗体可以使用重组DNA方法来制造，例如在Cabilly等人的美国专利号4,816,567中所描述的，所述专利整体通过参考并入本文。从例如成熟的B-细胞或杂交瘤细胞，使用特异性扩增编码抗体的重链和轻链的基因的寡核苷酸引物，通过例如RT-PCR分离编码单克隆抗体的多核苷酸，并使用常规程序确定它们的序列。然后将编码所述重链和轻链的分离的多核苷酸克隆到适合的表达载体中，然后将其转染到宿主细胞例如原本不产生免疫球蛋白的大肠杆菌(E.coli)细胞、猴COS细胞、中华仓鼠卵巢(CHO)细胞或骨髓瘤细胞，并通过所述宿主细胞产生单克隆抗体。所需物种的重组单克隆抗体或其片段也可以按照描述从噬菌体展示文库分离(McCafferty等，“噬菌体抗体：展示抗体可变结构域的丝状噬菌体”(Phage Antibodies:Filamentous Phage Displaying Antibody Variable Domains)，Nature 348:552-554(1990)；Clackson等，“使用噬菌体展示文库制造抗体片段”(Making Antibody Fragments using Phage Display Libraries)，Nature 352:624-628(1991)；以及Marks等，“绕过免疫接种：来自于噬菌体上展示的V-基因文库的人类抗体”(By-Passing Immunization.Human Antibodies from V-Gene Libraries Displayed on Phage)，J.Mol.Biol.222:581-597(1991)，所述文献整体通过参考并入本文)。

编码单克隆抗体的多核苷酸可以使用重组DNA技术以大量不同方式进一步修饰，以产生可选抗体。在一个实施方式中，可以将例如小鼠单克隆抗体的轻链和重链的恒定结构域替换为人类抗体的那些区域，以产生嵌合抗体。或者，可以将小鼠单克隆抗体的轻链和重链的恒定区替换为非免疫球蛋白多肽，以产生融合抗体。在其他实施方式中，所述恒定区被截短或移除，以产生所需的单克隆抗体的抗体片段。此外，可以使用可变区的定点或高密度突变来优化单克隆抗体的特异性和亲和性。

在某些实施方式中，所述针对细胞表面标志物或抗原例如CD34、CD45或CD117:cKit/SCF受体的单克隆抗体是人源化抗体。在某些实施方式中，所述针对细胞表面标志物或抗原例如HLA-DR、CD11a、CD18、CD34、CD41/61、CD43、CD45、CD47、CD58、CD71、CD84、CD97、CD117、CD133、CD162、CD166、CD205和/或CD361的单克隆抗体是人源化抗体。人源化抗体是在可变区内含有来自于非人类(例如鼠类)抗体的极少序列的抗体。这些抗体被治疗性用于在给药到人类对象时降低抗原性和人抗小鼠抗体应答。在实践中，人源化抗体通常是具有极少到没有非人类序列的人类抗体。人类抗体是由人类产生的抗体或具有对应于由人类产生的抗体的氨基酸序列的抗体。

人源化抗体可以使用本领域中已知的各种不同技术来生产。抗体可以通过将人类抗体的互补决定区(CDR)用具有所需特异性、亲和性和能力的非人类抗体(例如小鼠、大鼠、兔、仓鼠等)的互补决定区替换，进行人源化(Jones等，“用来自于小鼠的互补决定区代替人类抗体中的互补决定区”(Replacing the Complementarity-Determining Regions in a Human Antibody With Those From a Mouse)，Nature 321:522-525(1986)；Riechmann等，“重塑用于疗法的人类抗体”(Reshaping Human Antibodies for Therapy)，Nature 332:323-327(1988)；Verhoeyen等，“重塑人类抗体：嫁接抗溶菌酶活性”(Reshaping Human Antibodies:Grafting an Antilysozyme Activity)，Science 239:1534-1536(1988)，所述文献整体通过参考并入本文)。所述人源化抗体可以通过Fv框架区中和/或被替换的非人类残基内的其他残基的替换被进一步修饰，以精炼和优化抗体特异性、亲和性和/或能力。

人类抗体可以使用本领域中已知的各种不同技术直接制备。可以产生在体外免疫的或从被免疫的个体分离的、产生针对靶抗原的抗体的永生化的人B淋巴细胞(参见例如Reisfeld等，单克隆抗体和癌症疗法77(Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy 77)(Alan R.Liss1985)和Garrard的美国专利号5,750,373，其整体通过参考并入本文)。此外，人类抗体也可以从噬菌体文库选择，其中该噬菌体文库表达人类抗体(Vaughan等，“从大型非免疫的噬菌体展示文库分离的具有低于纳摩尔的亲和性的人类抗体”(Human Antibodies with Sub-Nanomolar Affinities Isolated from a Large Non-immunized Phage Display Library)，Nature Biotechnology,14:309-314(1996)；Sheets等，“大型非免疫噬菌体抗体文库的高效构建：针对蛋白质抗原的高亲和性人类单链抗体的生产”(Efficient Construction of a Large Nonimmune Phage Antibody Library:The Production of High-Affinity Human Single-Chain Antibodies to Protein Antigens)，Proc Nat'l Acad Sci USA 95:6157-6162(1998)；Hoogenboom等，“绕过免疫接种：来自于体外重排的种系VH基因区段的合成的合集的人类抗体”(Bypassing Immunisation.Human Antibodies From Synthetic Repertoires of Germline VH Gene Segments Rearranged In Vitro)，J Mol.Biol,227:381-8(1992)；Marks等，“绕过免疫接种：来自于噬菌体上展示的V-基因文库的人类抗体”(By-passing Immunization.Human Antibodies from V-gene Libraries Displayed on Phage)，J.Mol.Biol,222:581-97(1991)，所述文献整体通过参考并入本文)。人源化抗体也可以在含有人类免疫球蛋白基因座的转基因小鼠中制造，所述小鼠在免疫后能够在不存在内源免疫球蛋白生产的情况下产生人类抗体的完整合集(repertoire)。这种方法描述在Surani等的美国专利号5,545,807、Lonberg等的美国专利号5,545,806、Lonberg等的美国专利号5,569,825、Lonberg等的美国专利号5,625,126、Lonberg等的美国专利号5,633,425和Lonberg等的美国专利号5,661,016中，所述专利整体通过参考并入本文。

在某些实施方式中，包含本发明的免疫毒素组合物的药剂包括特异性识别一种或多种细胞表面标志物的双特异性抗体。双特异性抗体是能够特异性识别并结合至少两个不同表位的抗体。双特异性抗体可以是完整抗体或抗体片段。用于制造双特异性抗体的技术在本领域中是常用的(Brennan等，“通过单克隆免疫球蛋白G1片段的化学重组制备双特异性抗体”(Preparation of Bispecific Antibodies by Chemical Recombination of Monoclonal Immunoglobulin G1 Fragments)，Science 229:81-3(1985)；Suresh等，“来自于杂交瘤的双特异性单克隆抗体”(Bispecific Monoclonal Antibodies From Hybrid Hybridomas)，Methods in Enzymol.121:210-28(1986)；Traunecker等，“双特异性单链分子(Janusins)靶向HIV感染的细胞上的细胞毒性淋巴细胞”(Bispecific Single Chain Molecules(Janusins)Target Cytotoxic Lymphocytes on HIV Infected Cells)，EMBO J.10:3655-3659(1991)；Shalaby等，“与过表达HER2原癌基因的细胞毒性淋巴细胞和肿瘤细胞具有反应性的人源化双特异性抗体的开发”(Development of Humanized Bispecific Antibodies Reactive with Cytotoxic Lymphocytes and Tumor Cells Overexpressing the HER2 Protooncogene)，J.Exp.Med.175:217-225(1992)；Kostelny等，“使用亮氨酸拉链形成双特异性抗体”(Formation of a Bispecific Antibody by the Use of Leucine Zippers)，J.Immunol.148:1547-1553(1992)；Gruber等，“由大肠杆菌中表达的双特异性单链抗体介导的高效肿瘤细胞裂解”(Efficient Tumor Cell Lysis Mediated by a Bispecific Single Chain Antibody Expressed in Escherichia coli)，J.Immunol.152:5368-74(1994)；以及Carter等的美国专利号5,731,168，所述文献整体通过参考并入本文)。

在某些实施方式中，这些双特异性抗体的使用可以促进本文公开的免疫毒素组合物向由所述靶组织的细胞表达的第一细胞表面标志物以及能够促进这些免疫毒素组合物的内化的第二标志物的靶向。同样地，这些双特异性抗体可用于提高本文公开的免疫毒素组合物的靶向精确性。在某些情况下，双特异性抗体可用于结合特定细胞(例如髓系细胞)的细胞表面标志物，同时也可以靶向第二细胞表面标志物以内化所述免疫毒素组合物。例如，在某些实施方式中，本文公开的双特异性抗体结合具有内化性质的细胞表面标志物，所述内化性质可以被利用以促进毒素(例如毒素如皂角素)向靶组织的细胞的细胞内递送并由此引起细胞死亡。

结合例如CD34和CD45两者的双特异性抗体，可以通过本领域中已知的任何技术来制备。例如，在某些情况下，本文公开的双特异性抗体可以使用化学连键来制备。或者，这些双特异性抗体可以使用两个免疫球蛋白重链/轻链对的共表达来重组制备。在某些情况下，双特异性抗体可以通过下述方法来制备：二硫化物交换，杂合-杂交瘤的产生，通过转录和翻译以产生体现双特异性抗体的单一多肽链，或转录和翻译以产生可以共价结合以产生双特异性抗体的超过一条多肽链。

在某些实施方式中，本文公开的双特异性药剂或抗体结合到选自CD13、CD33、CD34、CD44、CD45、CD49d:VLA-4、CD49f:VLA-6、CD59、CD84:CD150家族、CD90:Thy1、CD93、CD105:内皮糖蛋白、CD 117:cKit/SCF受体、CD123:IL-3R、CD 126:IL-6R、CD 133、CD135:Flt3受体、CD166:ALCAM、CD 184:CXCR4、Prominin 2、促红细胞生成素R、内皮细胞选择性粘附分子、CD244、Tie1、Tie2、MPL、G-CSFR或CSF3R、IL-1R、gp130、白血病抑制因子受体、制瘤素M受体、Embigin和IL-18R的一种或多种标志物。在某些实施方式中，本文公开的双特异性药剂或抗体结合到选自HLA-DR、CD11a、CD18、CD34、CD41/61、CD43、CD45、CD47、CD58、CD71、CD84、CD97、CD117、CD133、CD162、CD166、CD205和CD361的一种或多种标志物。

在某些实施方式中，本文公开的双特异性药剂或抗体结合到选自CD13、CD33、CD34、CD44、CD45、CD49d:VLA-4、CD49f:VLA-6、CD59、CD84:CD150家族、CD90:Thy1、CD93、CD 105:内皮糖蛋白、CD117:cKit/SCF受体、CD123:IL-3R、CD126:IL-6R、CD 133、CD135:Flt3受体、CD166:ALCAM、CD 184:CXCR4、Prominin 2、促红细胞生成素R、内皮细胞选择性粘附分子、CD244、Tie1、Tie2、MPL、G-CSFR或CSF3R、IL-1R、gp130、白血病抑制因子受体、制瘤素M受体、Embigin和IL-18R的两种或更多种标志物。在某些实施方式中，本文公开的双特异性药剂或抗体结合到选自HLA-DR、CD11a、CD18、CD34、CD41/61、CD43、CD45、CD47、CD58、CD71、CD84、CD97、CD117、CD133、CD162、CD166、CD205和CD361的两种或更多种标志物。

在某些实施方式中，本文公开的双特异性药剂或抗体结合到在人类造血干细胞上表达的两种或更多种标志物，所述标志物选自CD7、CDw12、CD13、CD15、CD19、CD21、CD22、CD29、CD30、CD33、CD34、CD36、CD38、CD40、CD41、CD42a、CD42b、CD42c、CD42d、CD43、CD45、CD45RA、CD45RB、CD45RC、CD45RO、CD48、CD49b、CD49d、CD49e、CD49f、CD50、CD53、CD55、CD64a、CD68、CD71、CD72、CD73、CD81、CD82、CD85A、CD85K、CD90、CD99、CD104、CD105、CD109、CD110、CD111、CD112、CD114、CD115、CD117、CD123、CD124、CD126、CD127、CD130、CD131、CD133、CD135、CD138、CD151、CD157、CD162、CD164、CD168、CD172a、CD173、CD174、CD175、CD175s、CD176、CD183、CD191、CD200、CD201、CD205、CD217、CD220、CD221、CD222、CD223、CD224、CD225、CD226、CD227、CD228、CD229、CD230、CD235a、CD235b、CD236、CD236R、CD238、CD240、CD242、CD243、CD277、CD292、CDw293、CD295、CD298、CD309、CD318、CD324、CD325、CD338、CD344、CD349和CD350。

在某些实施方式中，本文公开的双特异性药剂或抗体结合到在人类造血干细胞上表达的两种或更多种标志物，所述标志物选自CD11a、CD18、CD37、CD47、CD52、CD58、CD62L、CD69、CD74、CD97、CD103、CD132、CD156a、CD179a、CD179b、CD184、CD232、CD244、CD252、CD302、CD305、CD317和CD361。

在某些实施方式中，本文公开的双特异性抗体结合到CD34和CD117:cKit/SCF受体。在某些实施方式中，本文公开的双特异性抗体结合到CD45和CD117:cKit/SCF受体。在某些实施方式中，本文公开的双特异性抗体结合到CD34和CD45。

在某些实施方式中，使用抗体片段而不是完整抗体可能是合乎需要的。用于生产抗体片段的各种不同技术是已知的。传统上，这些片段通过完整抗体的蛋白水解消化来衍生(例如Morimoto等，“小鼠单克隆抗体(免疫球蛋白G1的)F(ab')2片段通过使用TSKgel Phenyl-5PW的疏水相互作用高效液相色谱的单步纯化”(Single-step Purification of F(ab')2Fragments of Mouse Monoclonal Antibodies(immunoglobulins G1)by Hydrophobic Interaction High Performance Liquid Chromatography Using TSKgel Phenyl-5PW)，Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107-117(1992)和Brennan等，“通过单克隆免疫球蛋白G1片段的化学重组制备双特异性抗体”(Preparation of Bispecific Antibodies by Chemical Recombination of Monoclonal Immunoglobulin G1Fragments)，Science 229:81-3(1985)，所述文献整体通过参考并入本文)。然而，这些片段现在通常通过如上所示的重组宿主细胞直接生产。因此，Fab、Fv和scFv抗体片段都可以在大肠杆菌或其他宿主细胞中表达并从其中分泌，因此允许生产大量这些片段。或者，可以从上面讨论的抗体噬菌体文库分离这些抗体片段。所述抗体片段也可以是如Rinderknecht等的美国专利号5,641,870中所描述的线性抗体，所述专利通过参考并入本文，并且可以是单特异性或双特异性的。用于生产抗体片段的其他技术对于有经验的从业人员来说是显而易见的。

本发明还涵盖了与所述嵌合、人源化和人类抗体或其抗体片段基本上同源的变体和等效物。它们可以含有例如保守替换突变(例如一个或多个氨基酸被相似的氨基酸替换，其维持或提高所述抗体或抗体片段的结合活性)。

在优选实施方式中，表达所述标志物的细胞可用作免疫原或用于筛选结合所述标志物的抗体。在一个实施方式中，所述抗体对所述标志物、其表位或一部分具有特异性。在所述药剂是或包含抗体的那些实施方式中，在鉴定并选择在所述靶组织的细胞表面上表达的标志物(例如CD45、CD117或其部分或表位)之后，可以使用本领域公知的技术和方法针对这些标志物产生抗体。

在某些情况下，所述药剂是或包含配体。例如，在某些实施方式中，所述药剂是或包含配体，例如干细胞因子，并且其与细胞表面受体例如CD117相互作用或结合到所述受体。

在某些实施方式中，所述药剂被用于将毒素递送到靶组织的细胞或用于促进所述递送，并且在这样的毒素被递送到所述靶组织的细胞后，这样的毒素被这些细胞内化，并因此对所述靶组织的这些细胞发挥细胞毒性效应。在某些实施方式中，所述药剂被用于将成孔组成部分例如突变的保护抗原(mut-PA)递送到所述靶组织的细胞或用于促进所述递送。在某些实施方式中，在将与毒素偶联的药剂(例如CD117-SAP)递送到靶组织的细胞后，所述药剂和毒素两者共定位到所述靶组织的一个或多个细胞的细胞内区室，由此去除或耗减这些细胞。

在某些实施方式中，本文公开的组合物和方法可以单独地或与其他可用疗法相组合进行给药或以其他方式实践。例如，本文公开的方法、偶联物和组合物可以作为主要疗法或作为辅助疗法给药到对象。

在某些实施方式中，本文公开的方法和组合物与一种或多种动员剂相组合实践或给药(例如共同给药)，所述动员剂能够诱导例如造血干细胞和/或祖细胞从第一区室(例如靶组织如干细胞巢或骨髓区室)迁移到第二区室(例如外周血或器官例如脾脏)中，正如在国际公开号WO2014/134539中所描述的，其内容整体通过参考并入本文。在这些实施方式中，所述对象可能经历动员疗法，并且本文公开的药剂可以被共同给药或随后给药到所述对象，使得被动员的细胞在这些细胞被动员到的区室中(例如外周区室中)接触被给药的组合物。

在某些情况下，本文公开的组合物与一种或多种动员剂的共同给药，通过提高所述组合物接触例如已被动员到外周区室中的造血干细胞和/或祖细胞的可能性，提供了提高或增强这些组合物的活性和/或效能的手段。示例性的动员剂包括例如一种或多种CXCR2激动剂(例如Gro-beta或Gro-betaΔ4)和CXCR4拮抗剂(例如普乐沙福或)。在某些情况下，所述动员剂包含单独的或与普乐沙福组合的G-CSF。在某些情况下，所述动员剂包含至少一种硫酸乙酰肝素抑制剂。在某些情况下，所述动员剂是或包含非格司亭(GCSF)。

在某些实施方式中，本文公开的方法、组合物和毒素的细胞毒性是依赖于内化的，因此需要所述毒素移位到所述靶组织的细胞的细胞内区室中。这种内化依赖性毒性可以与以前的使用抗CD45放射免疫毒素(RIT)的靶向方法区分开。具体来说，通过使这种CD45-RIT特异性结合到造血细胞，死亡不是内化依赖性的，而是发生在暴露于辐射、包括对脾脏和肝脏来说不想要的辐射的附近细胞中。相反，本文公开的组合物和方法能够使用例如抗CD45-SAP免疫毒素实现CD45受体内化介导的死亡(参见例如图4A-4C和图5A-5E，其说明了CD45-SAP免疫毒素在体外和体内的细胞杀死活性，并确认了通过靶向CD45，本文公开的免疫毒素可以被内化)。在某些实施方式中，本文公开的方法和组合物不通过DNA损伤诱导细胞死亡。

当在本文中使用时，术语“内化的”和“内化”通常意味着所述药剂和/或毒素被引入或以其他方式到达所述靶组织(例如骨髓)的一个或多个细胞(例如HSC或祖细胞)的细胞内区室。例如，药剂和/或毒素可以通过受体介导的过程(例如细胞内吞过程)到达细胞的细胞内区室，其中所述细胞仅仅摄入结合到特定受体之后的细胞外药剂和/或毒素。在某些情况下，本文公开的药剂和/或毒素以至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％或至少约99％的比率被所述内源干细胞(例如HSC)或祖细胞群内化。

在某些情况下，本文公开的组合物(例如抗体-毒素偶联物)在这样的药剂(例如抗体)结合到所述标志物(例如CD34、CD45或CD117)的表位之后被表达标志物(例如CD34、CD45或CD117细胞表面标志物)的细胞内化。

在某些实施方式中，本文公开的组合物和方法在毒素或免疫毒素被靶细胞(例如造血干细胞)内化后诱导细胞毒性或细胞死亡。当在本文中使用时，术语“毒素”通常被用于指称可以诱导对靶细胞的细胞毒性或有害效应的任何化学或生物化合物、组合物或组成部分。在某些实施方式中，由所述毒素或免疫毒素诱导的细胞毒性或有害效应发生在它被内化到细胞(例如CD45+或CD117+细胞)的细胞内区室中之后。例如，在某些情况下，在与毒素偶联的药剂内化后，所述毒素被从所述药剂上切下(例如所述毒素和药剂被解偶联)，并且所述毒素抑制蛋白质合成，由此引起细胞死亡。同样地，在某些情况下，在与毒素偶联的药剂内化后，所述毒素被从所述药剂上切下(例如所述毒素和药剂被解偶联)，并且所述毒素抑制核糖体活性，由此引起细胞死亡。

优选地，所述毒素必须获得细胞进入或以其他方式被内化，以发挥它的细胞毒性或有害效应。因此，优选的是仅在被靶组织的一个或多个细胞内化后才发挥细胞毒性或有害效应的毒素。皂角素这种终止蛋白质合成的催化性N-糖苷酶核糖体失活蛋白(RIP)，代表了用于本文公开的方法和组合物的示例性毒素。与其他蓖麻毒素家族的成员不同，皂角素缺少通用细胞进入结构域，并且除非偶联到能够进行受体介导的内化的靶向抗体或配体(例如2B8克隆)，否则是无毒性的。这在图2A中得到说明，该图证实了抗体加皂角素的共同给药，由于这种皂角素不能获得细胞进入而不能引起造血干细胞的耗减。相反，正如也在图2A中说明的，当皂角素毒素被偶联到抗CD45抗体时，在预处理后8天收获的骨髓中，CD45-SAP偶联物表现出造血干细胞的98％的耗减。在某些情况下，将毒素偶联到药剂(例如人源化抗体)以促进这样的毒素向一个或多个靶细胞(例如CD45+和/或CD 117+细胞)的靶向递送。

在某些情况下，所述毒素是基于蛋白质的毒素，并且可以包括例如修饰的蓖麻毒素和蓖麻毒素A链衍生物(例如蓖麻毒素A链、去糖基化的蓖麻毒素A链)、皂角素、白喉毒素、假单胞菌毒素和变体(例如PE38等)和小分子毒素。毒素可以是基于蛋白质的毒素，包括例如细菌、真菌、植物或动物来源的有生物活性的毒素及其片段。在某些实施方式中，所述毒素可以被重组制备。在某些情况下，毒素可以是合成的毒素。

尽管本文公开的某些实施方式涉及使用皂角素作为所选毒素，但应该理解，本文公开的发明不限于皂角素或基于蛋白质的毒素。相反，按照本发明的教示，可以使用几种可选的毒素。例如，白喉毒素(DT)和假单胞菌外毒素A(PE)两者在延伸步骤处终止蛋白质合成。蓖麻毒素家族毒素(例如皂角素)具有N-糖苷酶活性，引起28S核糖体RNA(rRNA)中关键腺嘌呤的脱嘌呤化。所有这些毒素抑制蛋白质合成并具有如果被内化将对分裂和未分裂的细胞有效的共同性质；这与抗体-药物偶联物(ADC)相反，在后者中所述药物通过共价修饰DNA或破坏微管动力学，特异性影响分裂的细胞。由于造血干细胞通常处于非增殖性静默状态，使用不论细胞周期状态如何都能诱导细胞死亡的蛋白质毒素，对有效的造血干细胞耗减和预处理来说是优选的。在某些实施方式中，所述毒素选自毒素皂角素、白喉毒素、假单胞菌外毒素A、修饰的蓖麻毒素类似物和蓖麻毒素A链衍生物、小分子毒素及其组合。在某些情况下，所述毒素是修饰的蓖麻毒素类似物或蓖麻毒素A链衍生物，例如蓖麻毒素A链。在某些情况下，所述毒素(例如蓖麻毒素A链)已被修饰，以例如缺失细胞进入结构域。

在某些情况下，所述毒素选自下述毒素：相思豆毒素、蒴莲素毒素、多花白树毒蛋白毒素、苦瓜毒蛋白毒素、天花粉蛋白毒素、丝瓜子蛋白毒素及其组合。

尽管在某些情况下所述毒素可以是基于蛋白质的毒素，但应该理解，所设想的毒素不限于基于蛋白质的毒素。相反，所设想的用于本发明的任何情况的毒素广泛地包括选择性地引起靶组织(例如骨髓干细胞巢)中的一种或多种细胞死亡或以其他方式降低细胞活力的任何化合物或药剂(例如细胞毒性化合物或药剂)。在本发明的任一情况的各种不同实施方式中，在本发明的组合物和方法中有用的毒素包含一种或多种DNA损伤性分子。例如，所选的毒素可以包含一种或多种抗微管蛋白药剂(例如美登素)或微管蛋白抑制剂、DNA交联剂、DNA烷化剂和细胞周期或有丝分裂破坏剂。在某些情况下，所选的毒素是或包含有丝分裂破坏剂或抑制剂，例如美登素或其功能性片段、衍生物或类似物。

在某些实施方式中，所述毒素(例如真菌来源的毒素)抑制RNA聚合酶II和/或III(例如哺乳动物RNA聚合酶II和/或III的抑制剂)。在某些情况下，这种RNA聚合酶II抑制剂毒素是或包含一种或多种鹅膏毒素或其功能性片段、衍生物或类似物。鹅膏毒素是RNA聚合酶II的强力且选择性的抑制剂，并包括从鹅膏菌属、尤其是鬼笔鹅膏(Amanita phalloides)分离到的由8个氨基酸构成的所有环状肽。这些鹅膏毒素可以从各种不同的伞菌物种(例如鬼笔鹅膏、纹缘盔孢伞(Galerina marginata)和肉褐麟小伞(Lepiota brunneo-incarnata))分离，或者在某些情况下可以合成制备。适合用于本文公开的任何方法或组合物的示例性毒素可以包括或包含一种或多种选自以下的鹅膏毒素：α-鹅膏蕈碱、β-鹅膏蕈碱、γ-鹅膏蕈碱、￡-鹅膏蕈碱、三羟基鹅膏毒素、三羟鹅膏毒素酰胺、一羟鹅膏毒素酰胺、一羟鹅膏毒素羧酸及其任何功能性衍生物或类似物。在某些实施方式中，所述毒素是或包含作为RNA聚合酶II和III的抑制剂的α-鹅膏蕈碱或其功能性片段、衍生物或类似物。

在某些实施方式中，所述毒素是小分子毒素。这些小分子毒素可以被偶联到药剂(例如单克隆抗体)以形成抗体-药物偶联物(ADC)，其可用于例如预处理对象的组织以备植入。在某些实施方式中，所述毒素源自于细菌。在某些实施方式中，所述毒素源自于昆虫。在某些实施方式中，所述毒素包含或源自于病毒。在某些实施方式中，所述毒素源自于植物或真菌。在某些实施方式中，所述毒素是天然存在的毒素或其片段。在某些实施方式中，这种天然存在的毒素可以相对于其天然存在的对应物进行修饰，以例如除去便于细胞进入的任何结构域或区域或替换一个或多个氨基酸。

在某些实施方式中，所述毒素可以被直接偶联或以其他方式结合到药剂(例如特异性或选择性结合CD34、CD45或CD117的抗体)。例如，所述药剂被直接偶联到一种或多种毒素(例如作为嵌合的融合蛋白)。当在本文中使用时，术语“偶联”广泛地是指两种或更多种组成部分或组分的任何物理、生物或化学连接或联结在一起。这种偶联可以是直接或间接的。例如，本文公开了可以被直接或间接偶联到毒素的药剂(例如双特异性药剂)。同样地，还公开了可以偶联到药剂的突变的保护抗原(mut-PA)。还公开了可以偶联到毒素的因子(例如致死因子N-端(LFN)和/或水肿因子N-端(EFN))。在某些实施方式中，所述因子是或包含酶因子。

在某些情况下，术语偶联是指功能性偶联。例如，本文中设想了两种或更多种组成部分的任何偶联，其功能是促进这样偶联的组成部分的细胞内共递送。在某些情况下，这种偶联可以是直接偶联或间接偶联。在某些实施方式中，这种偶联可以是永久的或暂时的。例如，在某些情况下，在偶联到毒素的药剂(例如双特异性药剂)内化后，所述偶联被切开，由此在细胞内释放出所述毒素并对所述细胞发挥细胞毒性效应。

所述药剂和毒素彼此共价或非共价偶联或连接。这种偶联可以是直接或间接的。例如，选自毒素皂角素、白喉毒素、假单胞菌外毒素A、修饰的蓖麻毒素类似物及其组合的毒素可以被直接或间接地偶联到选择性结合CD45的抗体，以形成免疫毒素。在某些实施方式中，本文公开的毒素可以被间接偶联到抗体，正如例如图1中所示。如图1中所示，这些抗体可以被生物素化并偶联到链霉亲和素-毒素组成部分。或者，在某些实施方式中，所示毒素可以被生物素化，其可以被间接偶联到抗CD34、抗CD45或抗CD117抗体，所示抗体可以结合到链霉亲和素、亲和素、中性亲和素及其任何其他变体中的一者或多者或用它们标记。在某些情况下，本文公开的抗体是人源化的。

在某些情况下，药剂(例如抗体)：毒素的比例为约0.1:1、约0.25:1、约0.5:1、约1:1、约2:1、约3:1、约4:1、约5:1、约6:1、约7:1、约8:1、约9:1或约10:1。在任何上述实施方式中，这些比例被表示为链霉亲和素四聚体-毒素化学偶联物(例如链霉亲和素四聚体-皂角素化学偶联物)的比例。例如，这种链霉亲和素四聚体可以包含平均2.8个毒素(例如皂角素)分子，并且可以表示为1:1的药剂与四聚体-毒素的比例或表示为1:2.8的药剂与毒素的比例。在某些实施方式中，药剂(例如抗体)与毒素的比例为约1:2、约1:2.5、约1:2.8、约1:3、约1:3.5、约1:4、约1:4.5、约1:5、约1:6、约1:7、约1:8、约1:9或约1:10。还设想了嵌合体，其中抗体和毒素作为单一蛋白被重组表达。还设想了可以通过CD45受体交联促进内化的抗体区域或片段，例如scFv-毒素偶联物、scFv-毒素嵌合体、scFv-毒素多价形式(例如双体抗体(diabody)、串联di-scFv、串联tri-scFv、三体抗体(triabody)和/或四体抗体(tetrabody))。还设想了抗体药物偶联物(例如CD45-ADC)，其也可用于血液恶性肿瘤作为移植的替选方案，并且在本公开的基础上涉及细胞表面标志物(例如CD45受体)的内化活性。在某些实施方式中，这些药剂或抗体是双特异性的并结合两种细胞表面标志物。

在某些实施方式中，本文公开的发明涉及内化性(抗体片段)Fab-毒素偶联物。在某些实施方式中，本文公开的发明涉及内化性(单链片段)scFv-毒素偶联物。在某些实施方式中，本文公开的发明涉及双体抗体:单链Fv(scFv)的非共价二聚体:靶向一种或多种受体。在某些实施方式中，本文公开的发明涉及双价(或双特异性)(scFv)₂。在某些实施方式中，本文公开的发明涉及串联scFv。还设想了内化性适体-毒素偶联物和内化性配体-毒素偶联物或上述物质的任何嵌合的或非共价组合(例如scFv-配体-毒素)，以及所有非共价配方(例如生物素-链霉亲和素并包括链霉亲和素类似物中性亲和素和亲和素)，和可以通过融合蛋白的重组表达、天然化学连接、酶催化的偶联(例如分拣酶等)或其他偶联方法(例如使用非天然氨基酸、修饰赖氨酸的NHS-酯试剂、修饰半胱氨酸的马来酰亚胺试剂、二硫桥的点击化学)产生的嵌合分子。还设想了并入促进本文公开的药剂和/或毒素的内化的肽序列(例如天然、非天然和环状肽)(例如HIV-TAT、细胞穿透肽(penetratin)、RGD肽、聚精氨酸和变体)。

本文公开的方法不限于毒素的受体介导的内化，而是设想了将毒素选择性递送到靶组织的细胞的细胞内区室的任何可用手段。例如，在某些实施方式中，本文公开了使用孔介导的内化将毒素递送到细胞内的方法。

本文公开了预处理对象以备植入的方法或选择性耗减或去除所述对象的靶组织(例如骨髓组织)中的内源干细胞群的方法，所述方法包括向所述对象给药有效量的包含与药剂(例如配体如干细胞因子)偶联的突变的保护抗原(mut-PA)的成孔嵌合体。保护抗原(PA)由炭疽芽孢杆菌(Bacillus anthracis)作为水溶性前体形式PA83(83kDa)分泌，其经历弗林型蛋白酶的蛋白水解激活从N-端切掉20kDa片段，并由此形成活化的PA单体，其能够形成前孔(pre-pore)七聚体。这种成孔嵌合体在内源干细胞群的细胞膜中形成一个或多个孔，并因此促进随后给药或共同给药的毒素向这样的干细胞群的递送。例如，可以将有效量的包含与毒素偶联的因子(例如酶因子例如致死因子N-端和/或水肿因子N-端，或其片段)的第二嵌合体给药到所述对象，随后所述毒素被所述内源干细胞群内化，由此选择性地耗减或去除所述靶组织中的内源干细胞群并预处理所述对象以备植入。在某些实施方式中，所述因子是致死因子N-端(LFN)或其片段。在某些实施方式中，所述因子是水肿因子N-端(EFN)或其片段。致死因子(LF)和水肿因子(EF)两者都需要结合组分保护抗原(PA)以递送到所述细胞的胞质溶胶中，在那里它们表现出酶活性。PA的63kDa的C-端部分形成七聚体通道，其在低pH下插入到胞内体膜中，为EF和LF移位到靶细胞的胞质溶胶中所必需。

在某些实施方式中，成孔组成部分例如突变的保护抗原(mut-PA)被偶联到可用于将这样的成孔组成部分选择性靶向或导向到所述靶组织的细胞(例如造血干细胞或祖细胞)的药剂(Janowiak,B.E.等，Protein Sci.18(2):348-358(2009)；Mourez M.等，PNAS 100(24):13803-08(2003)；Ming,Y&R Collier,J.MolMed.9(1-2):46-51(2003)；Rogers M.S.等，Cancer Res.15；67(20):9980-5(2007))。例如，突变的保护抗原(mut-PA)可以被偶联或以其他方式融合到药剂(例如配体或scFv)，以产生能够细胞特异性地形成细胞表面孔的嵌合体。同样地，在某些实施方式中，突变的保护抗原(mut-PA)可以被偶联或以其他方式融合到双特异性药剂(例如双特异性抗体)，以产生能够细胞特异性地形成细胞表面孔的嵌合体。这些细胞表面孔进而可以被使用或利用以输入或内化被给药的(例如共同给药或随后给药的)致死因子N-端-毒素嵌合体(LFN-毒素)，并由此去除或耗减所述靶组织的细胞。

因此，在本发明的某些实施方式中，所选毒素可以包含与毒素偶联(例如功能性偶联)的一种或多种致死因子(例如LFN-SAP)。各种不同的毒素可以被偶联到LFN，包括白喉毒素和/或皂角素毒素(例如LFN-DTA、LFN-SAP等)。所述内化机制对于PA和LFN来说是固有的，并且一般性描述在图27中。与本文中公开的某些实施方式相反，上述实施方式有利地不需要内化性标志物、受体或抗体/配体的内化性质，而是依赖于PA和LFN的相互作用以促进所述毒素的细胞内递送。在某些实施方式中，所述药剂选自scfv、Fab、discfv、biscFv、tri-scfv、串联scfv、适体、抗体和配体。

本文公开的方法和组合物可用于预处理对象的很多靶组织，包括例如骨髓组织。当在本文中使用时，术语“靶组织”一般是指本文公开的组合物和方法可以选择性靶向的对象的任何组织。在某些实施方式中，这些靶组织包含内源HSC或祖细胞群(例如骨髓组织的干细胞巢)。在某些实施方式中，所述靶组织是或包含对象的骨髓组织。

在某些情况下，本发明的组合物和方法可用于对象中的非清髓性预处理，例如在造血干细胞或祖细胞移植之前的骨髓预处理。通过使用需要细胞进入来发挥其细胞毒性效应的毒素(例如皂角素)来选择性地靶向标志物(例如CD45细胞表面标志物)，本发明最小化了副作用的发生率和严重性。例如，通常与传统的预处理方案相伴的副作用例如粘膜炎的发生率和严重性，可以被最小化或者在某些情况下被消除。同样地，本发明人证实了使用本文公开的方法和组合物(例如CD45-SAP免疫毒素)预处理对象，最小化了危及生命的血小板减少症、嗜中性粒细胞减少症和红细胞丧失的发生率，所有这些病症通常与常常需要辐射和细胞毒性药物两者的传统预处理方法相伴。因此，在某些情况下，本文公开的组合物和方法的特征在于是非清髓性的。

考虑到嗜中性粒细胞表达CD45，在使用CD45-SAP预处理后观察到的没有嗜中性粒细胞减少症(如图3B中所示)和观察到的嗜中性粒细胞的扩增是令人吃惊的结果。不希望受到任何特定理论限制，可能与其他血液细胞不同，嗜中性粒细胞不内化CD45-SAP，或者由于它们的寿命短(12小时)，这种效应由于细胞群的快速更新而不可见。可以想象，观察到的嗜中性粒细胞的快速扩增可能是对CD45+细胞死亡的响应，因为嗜中性粒细胞负责凋亡细胞的清除。并不预期嗜中性粒细胞的短暂扩增会是不利作用，因为嗜中性粒细胞在对抗细菌感染中发挥显著作用，因此它们的扩增限制了细菌感染的发生，而细菌感染是与传统预处理相关的死亡的主要原因。

尽管观察到B-和T-细胞中短暂的淋巴细胞减少，但可能这对发生植入来说是必需的(但其本身可能不是充分的)，正如ACK2在有免疫能力的动物中的无效性和我们实验室中的研究所建议的，所述研究证实了调节性T-细胞直接与骨髓中的HSC相互作用并且为HSC留存所必需(Fujisaki,J.等，Nature(2011)474,216-219)。尽管T-细胞耗减可能是HIV对象关注的领域，但是在个体患者的逐个病例评估上短暂的耗减性质可能是可接受的(特别是在完全型AIDS发生之前)。此外，受体T-细胞的耗减也可能是有利的，因为它能够清除充当HIV的病毒储库的CCR5阳性T-细胞。本发明人预期短暂的T-细胞耗减对于其他血红蛋白病的治疗不构成问题，并且重要的是注意到目前的预处理方案完全去除T-细胞和B-细胞群。

由红细胞、红细胞比容或血红蛋白水平不降低所证实的在CD45-SAP预处理后不存在贫血，表明按照本文公开的方法的预处理将与实现贫血病症(例如镰状细胞、Diamond-Blackfan贫血和地中海贫血)中的移植相关。

本文公开的组合物和方法可用于治疗或治愈具有疾病(例如干细胞障碍)的对象，所述患者可以从造血干细胞或祖细胞移植(例如镰状细胞病)包括例如自体、同种异体、基因修饰和基因疗法方法获益。当在本文中使用时，短语“干细胞障碍”广泛地指称可以通过预处理对象的靶组织和/或通过去除靶组织中的内源干细胞群(例如从对象的骨髓组织去除内源HSC或祖细胞群)和/或通过将干细胞植入或移植在对象的靶组织中来治疗或治愈的任何疾病、障碍或病症。例如，已显示I型糖尿病通过造血干细胞移植治愈，并且可能从符合本发明的预处理获益。同样地，在某些情况下，本文公开的组合物和方法可用于预处理经历血液恶性肿瘤治疗的对象。在某些情况下，本文公开的方法和组合物可用于治疗、治愈或校正选自下列的疾病：镰状细胞贫血，地中海贫血，范科尼贫血，威斯科特-奥尔德里奇综合征，腺苷脱氨酶SCID(ADA SCID)，HIV，异染性脑白质营养不良，Diamond-Blackfan贫血和Schwachman-Diamond综合征。在某些实施方式中，所述对象具有遗传性血液障碍(例如镰状细胞贫血)或自体免疫障碍或受到所述障碍影响。在某些实施方式中，所述对象具有恶性肿瘤或受到恶性肿瘤影响。例如，选自血液癌(例如白血病、淋巴瘤、多发性骨髓瘤或骨髓增生异常综合征)和成神经细胞瘤的恶性肿瘤。在某些实施方式中，所述对象具有代谢障碍或以其他方式受到代谢障碍影响。例如，在某些情况下，所述对象可能患有选自下列的代谢障碍或以其他方式受到所述代谢障碍影响：糖原贮积病，黏多醣贮积症，高歇氏病，胡尔勒氏症，神经鞘脂贮积病，异染性脑白质营养不良，或可能从本文公开的治疗和疗法获益的任何其他疾病或障碍，其包括但不限于重症联合免疫缺陷症、威斯科特-奥尔德里奇综合征、高免疫球蛋白M综合症、Chédiak-Higashi病、遗传性淋巴组织细胞增生症、骨硬化病、成骨不全症、贮积病、重型地中海贫血、镰状细胞病、系统性硬化症、系统性红斑狼疮、多发性硬化症、青少年类风湿性关节炎，以及在“用于非恶性疾病的骨髓移植”(Bone Marrow Transplantation for Non-Malignant Disease,ASH Education Book,2000(1)319-338)中描述的疾病或障碍，所述文献的内容整体通过参考并入本文。

在某些情况下，本文公开的免疫毒素组合物可用于诱导实体器官移植耐受性。在这些实施方式中，本文公开的免疫毒素组合物和方法可用于从靶组织耗减或去除细胞群(例如从骨髓干细胞巢耗减HSC)。在这种从靶组织耗减细胞后，可以将来自于器官供体的干细胞或祖细胞群(例如来自于器官供体的HSC)给药到移植受体，并在这些干细胞或祖细胞植入后实现暂时的稳定的混合性嵌合，由此能够不需其他免疫抑制剂即可实现长期的移植器官耐受性。例如，本文公开的免疫毒素和方法可用于在实体器官移植受体(例如肾移植、肺移植、肝移植和心脏移植)中诱导移植耐受性。本文公开的免疫毒素和方法良好地适合用于诱导实体器官移植耐受性，特别是因为低百分率的暂时或稳定的供体植入足以诱导被移植的器官的长期耐受性。

本文公开的方法和组合物的特征在于它们的提高或改进的植入效率。当在本文中使用时，短语“植入效率”通常是指给药的干细胞群(例如HSC)植入到对象的被预处理的靶组织中的效率。在某些实施方式中，所述植入效率提高至少约5％、7.5％、10％、12.5％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、50％、60％、70％、75％、80％、90％、95％、100％或更多。在某些情况下，植入效率的确定相对于不使用本文公开的预处理方法进行的植入的方法的植入效率来评估。

在某些实施方式中，所述干细胞群(例如外源干细胞群)在所述毒素或免疫毒素(例如抗CD45-SAP免疫毒素)已从对象的靶组织清除或消散后被给药到所述对象的靶组织。通过允许在对象的靶组织中将所述毒素或免疫毒素清除或以其他方式减少到不可检测的水平，可以降低或以其他方式消除任何逗留的毒素或免疫毒素对被给药的干细胞群发挥细胞毒性效应的能力，从而进一步提高本文公开的方法和组合物的植入效率。因此，在某些实施方式中，所述干细胞群在对象的靶组织中所述免疫毒素的浓度已降低到不可检测的浓度之后被给药到所述对象。从对象的靶组织清除所述毒素或免疫毒素所必需的时间长度，可以使用本领域技术人员可用的任何常规手段来确定，例如通过检测对象的靶组织中所述药剂、毒素或免疫毒素的浓度。此外，从靶组织清除所述毒素或免疫毒素所必需的时间长度受到尤其是下述因素影响或参考所述因素决定：所述药剂、毒素或免疫毒素的性质，所述药剂、毒素或免疫毒素的给药剂量，所述对象的状况和/或共存病症(例如肾功能不全)和对象的靶组织。例如，在某些实施方式中，在所述免疫毒素已从对象的靶组织清除或消散后至少1、2、3、4、5、6、7、10、12、14、21、36、42、56、63、70、80、90、100、120天、6个月、9个月、12个月或更长时间，将所述干细胞群给药到所述对象的靶组织。

当在本文中使用时，术语“对象”是指可以向其提供本文公开的治疗的动物，例如哺乳动物或人。对于那些对特定动物例如人类对象特有的疾病状态的治疗来说，术语对象是指该特定动物。在某些实施方式中，所述对象是人(例如青少年、成年或老年人)。

本发明的组合物可以按照例如L.William，《Remington药物学科学与实践》(Remington:The Science and Practice of Pharmacy.22nd ed.Pharmaceutical Press(2012))中详细描述的来制备，并且可药用载体和赋形剂可以按照其中所述来选择，所述文献的全部内容通过参考并入本文。在某些情况下，本文公开的组合物(例如CD45-SAP偶联物)被配制成用于肠胃外给药到对象。

当在本文中使用时，术语“有效量”意味着足以对所述对象实现有意义的益处(例如预处理所述对象的靶组织以备移植)的量。例如，作为本发明的主题的药剂的有效量通常可以根据这些药剂的活性和去除或耗减所述干细胞巢所必需的这些药剂的量来确定。预处理所述对象或去除所述对象的造血干细胞或祖细胞所必需的组合物(例如抗体-毒素偶联物)的有效量，可以根据所述对象的疾病和其他相关特征容易地确定。这些特征包括所述对象的状况、总体健康、年龄、主观症状、客观表现、性别和体重。

在某些实施方式中，本文公开的免疫毒素组合物的有效量实现最大的干细胞耗减(例如从所述对象的靶组织耗减约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、97.5％、98％、99％、99.5％或更多的造血干细胞或祖细胞)。在某些实施方式中，本文公开的组合物的有效量在对象的体重的基础上确定。例如，在某些情况下，本文公开的组合物的这种有效量是或包含在约10-0.01mg/kg之间的范围内的一个或多个剂量。在某些情况下，本文公开的组合物(例如CD45-毒素或CD117-毒素偶联物)的有效量是或包含4.0mg/kg的一个或多个剂量。在某些情况下，本文公开的组合物的有效量是或包含3.0mg/kg的一个或多个剂量。在某些情况下，本文公开的组合物的有效量是或包含2.0mg/kg的一个或多个剂量。在某些情况下，本文公开的组合物的有效量是或包含2.5mg/kg的一个或多个剂量。在某些情况下，本文公开的组合物的有效量是或包含2.0mg/kg的一个或多个剂量。在某些实施方式中，本文公开的组合物(例如CD45-毒素或CD117-毒素偶联物)的有效量是或包含1.5mg/kg的一个或多个剂量。在某些情况下，本文公开的组合物(例如CD45-SAP偶联物)的有效量是或包含1.0mg/kg的一个或多个剂量。

本文还公开了鉴定可用于按照本文公开的方法选择性耗减或去除内源干细胞群的候选药剂的方法和测定法。在某些实施方式中，这些方法包括将包含所述干细胞群的样品(例如从对象获得的样品)与偶联到毒素的试验药剂相接触的步骤。在这个接触步骤后，对所述干细胞群的一个或多个细胞是否从所述样品耗减或去除做出确定，其中在所述接触步骤后所述HSC或祖细胞群的一个或多个细胞的耗减或去除，将所述试验药剂鉴定为可用于选择性耗减或去除内源干细胞群的候选药剂。在某些实施方式中，将所述细胞与所述试验药剂接触至少约2-24小时或更长时间。当在本文中使用时，术语“接触”是指将两种或更多种组成部分(例如细胞和药剂)带到一起或彼此紧密临近，使得所述组成部分可以反应。例如，在一个实施方式中，本发明的测定法包括将干细胞群与试验药剂相接触的步骤。

应该理解，本发明的应用不限于说明书中阐述的或示例的细节。本发明涵盖了其他实施方式并且可以以各种不同方式实践或执行。此外，还应该理解，本文中使用的短语和术语是出于描述的目的，不应被视为限制。

尽管根据某些实施方式具体描述了本发明的某些药剂、化合物、组合物和方法，但下面的实施例仅仅用于说明本发明的方法和组合物，并且不打算对其进行限制。

在本文中，在说明书和权利要求书中使用的没有具体数量的指称应该被理解为包括复数指称物，除非明确指明不是如此。在一组的一个或多个成员之间包括“或”的权利要求或描述，如果一个、超过一个或所有的组成员存在于给定产品或过程中、在其中使用或以其他方式与其相关，则被认为是得以满足的，除非指明与此相反或从上下文明显看出不是如此。本发明包括其中所述组的仅仅一个成员存在于给定产品或过程中、在其中使用或以其他方式与其相关的实施方式。本发明还包括其中超过一个或全部组成员存在于给定产品或过程中、在其中使用或以其他方式与其相关的实施方式。此外，应该理解，本发明涵盖了其中将来自于一个或多个列出的权利要求的一个或多个限制、要素、条款、描述性术语等引入到从属于同一基础权利要求(或者如果相关的话任何其他权利要求)的另一个权利要求中的所有变化、组合和排列形式，除非另有指明或除非本领域普通技术人员可以明显看出产生冲突或不一致。当要素作为名单呈现(例如采取马库什分组或类似的格式)时，应该理解所述要素的每个亚组也被公开，并且可以从所述组中移除任何要素。应该理解，一般来说，当本发明或本发明的情况被称为包含特定要素、特点等时，本发明或本发明的情况的某些实施方式由或基本上由这些要素、特点等构成。出于简化的目的，那些实施方式在本文中不是在每种情况下都用如此多的词句具体阐述。还应该理解，本发明的任何实施方式或情况可以从权利要求书中明确排除，不论所述具体的排除是否在说明书中叙述。在本文中参考以描述本发明的背景并提供关于它的实践的其他细节的出版物和其他参考资料，由此通过参考并入本文。

实施例

实施例1

本发明人开发并调查了生物素标记的抗CD45小鼠单克隆抗体与链霉亲和素-皂角素偶联物的联合使用以产生针对CD45的免疫毒素(CD45-SAP)。皂角素是毒素蓖麻毒素家族的成员，其催化性失活核糖体，终止蛋白质合成，由此导致细胞死亡。然而，与蓖麻毒素不同，皂角素缺少内化结构域，并且只有在偶联到被内化的配体或抗体时才诱导死亡(Bergamaschi,G.等，Br J Haematol(1996),93,789-794)。这允许本发明人选择性靶向待杀死的细胞，同时放过其他组织，降低总体毒性。

将全骨髓细胞用CD45-SAP离体处理并进行集落形成测定以评估短期干细胞和祖细胞活性。观察到集落形成活性以剂量依赖性方式被CD45-SAP强力抑制(IC₅₀为1nM)，而游离皂角素在100nM下未表现出生长抑制。

接下来本发明人调查了CD45-SAP作为单次注射的体内给药是否能够耗减骨髓中的干细胞，正如通过注射后8天收获的骨髓的流式细胞术所评估的。选择这个时间点是因为以前的报道表明，造血干细胞(HSC)或祖细胞从骨髓的持续耗减是发生高效的供体细胞植入所需要的(Xue,X.等，Blood(2010),116,5419-5422)。使用在以前的实验中被确定为1:1的抗体:毒素的最佳比例(每组4只小鼠)，进行了剂量响应研究，确定了24μg的CD45-SAP实现HSC的最大耗减(约98％被耗减，每组4只小鼠，如图2A中所示)。这个剂量利用了少量皂角素(约为游离皂角素的LD₅₀的14％)。HSC耗减对CD45-SAP是特异性的，因为本发明人在用非生物素化的抗CD45抗体和链霉亲和素-皂角素共同注射的对照组(CD45 Ab+SAP，图2A)中未能观察到HSC耗减。也试验了预处理后骨髓的短期祖细胞活性(集落测定法)，并且本发明人观察到集落形成活性降低50％，尽管98％的干细胞被耗减，如图2B中所示。有趣的是，相对于对照，在CD45-SAP处理的动物中骨髓级分的总细胞构成(股骨中活细胞的数目)事实上增加，可能是由于造血恢复(图2C)。这种观察到的结果与低剂量辐射形成鲜明对比，后者在同一时间点将骨髓细胞构成降低66％(Andrade,J.等，Biol Blood Marrow Transplant(2011)，17,608-619)。因此，上述结果证实了本文公开的CD45-SAP药剂可用于从骨髓高效清除造血干细胞或祖细胞。

接下来，本发明人调查了我们的单剂CD45-SAP方案是否能够实现供体细胞的长期植入。移植来自于GFP+供体小鼠的全骨髓细胞，以便我们可以在无GFP受体的背景中追踪植入。所述移植由注射1x10⁷个全骨髓细胞(其含有约500个长期干细胞，少于小鼠中总干细胞的5％)构成，这是在调查预处理的鼠类移植研究中的标准剂量。使用全骨髓而不是纯化的干细胞，因为这更紧密模拟临床中的移植程序。

为了表征用于移植的窗口，在CD45-SAP后的各个不同时间点(2、4、6、8、10或12天，每组5只小鼠)移植所述GFP+细胞。到目前为止，我们已经追踪外周血中的嵌合率2个月，其揭示出高水平的供体植入(对于CD45-SAP来说55％，与对照的未预处理小鼠的1％相比提高55倍，如图2D中所示)。本发明人在以前的前导性研究中已确定植入和混合嵌合是长期的(监测了4个月)。令人吃惊的是在时间点之间没有观察到植入的差异，表明移植窗口大，如图2E中所示。这与小鼠中基于辐射的预处理相反，在后者中在辐射后24小时移植是最佳的。在移植的小鼠中B-、T-和髓系细胞的总体分布的三谱系分析没有揭示出偏倚(图2F)。每个谱系内的分析证实了供体细胞对所有3个谱系有贡献，指示了真正的干细胞植入，正如图2G中所示。因为髓系细胞由于寿命短(12小时)而具有最快的谱系更新(Tak,T.等，J Leukoc Biol(2013),94,595-601)，因此髓系级分的嵌合率常常在早期时间点(<4个月)被用作供体植入水平的指示物(Valcarcel,D.等，Bone Marrow Transplant(2003),31,387-392)。如图2G中所示，在被认为代表了长期重建的时期的8个月时，在髓系谱系中观察到88％的供体细胞嵌合率。

为了将CD45-SAP表征为“非清髓性”预处理，我们接下来力图确定通过所述药剂预处理但不接受供体细胞移植的小鼠是否能够存活。发现我们的预处理方案是不致死的，因为所有小鼠(n＝4)在100天的评估中都存活，在所述时间时本研究结束。相反，接受全身辐照(TBI)预处理的小鼠如果不移植供体细胞的话，将在15-18天内死亡。本发明人还在100天时间内在小鼠中进行了连续血液分析，以确定各种不同血细胞的损失和恢复(图3A-3D)。如图3A中所示，CD45-SAP不诱导任何红细胞损失，更重要的是，没有观察到嗜中性粒细胞减少症(图3B)或血小板减少症(图3C；在第20天只观察到血小板的30％下降；90％的下降将被认为是血小板减少)。同时，CD45-SAP表现出B-和T-淋巴细胞的强力耗减，恢复快速，其中在6天内恢复20％并且到30天时完全恢复，如图2D中所示。

实施例2

接下来，本发明人在未移植小鼠中评估了CD45-SAP免疫毒素的毒性相对于辐射的毒性。在小鼠中进行了时间过程实验，以比较CD45-SAP预处理相对于等效的5Gy亚致死剂量的全身辐照的毒性。在预处理后2天，将小鼠安乐死并送交啮齿动物病理学家进行股骨和胸腺固定、切片和苏木精和曙红染色。也进行完整的血液计数和流式细胞术分析。未预处理的小鼠代表对照。

如图7A和7B中所示，相对于辐射，在CD45-SAP组中观察到快得多的B-和T-细胞群恢复。如图7D和7F中所示，相对于辐射，骨髓细胞构成和集落形成计数(祖细胞活性测定法)受到CD45-SAP的影响的不利程度也更小。

在预处理后2天，将活的小鼠(在麻醉下)固定在定制的2-光子共聚焦活体成像显微镜上。静脉内注射高分子量罗丹明-葡聚糖偶联物，并在给药后30分钟获取颅盖骨的图像以评估血管完整性。未预处理的小鼠代表对照。如图8中所示并且与辐射不同，与辐射相比在用CD45-SAP预处理后没有观察到对胸腺的损伤。

如图9中所示，骨髓组织学证实了相对于辐射，使用CD45-SAP时血管完整性保持完好。图10进一步描绘了在用CD45-SAP免疫毒素预处理后2天，血管完整性得以保留。

因此，上述结果证实了相对于全身辐照，使用CD45-SAP的预处理方案伴有毒性降低。

实施例3

为了调查CD45-SAP免疫毒素在校正镰状细胞病的动物模型中的用途，本发明人通过野生型受体的清髓性预处理，随后用来自于人类镰状血红蛋白敲入小鼠(Townes小鼠)的骨髓细胞进行移植，产生了镰状细胞小鼠嵌合体。在移植后2个月，将所述镰状细胞小鼠用CD45-SAP预处理，并用来自于野生型CD45.1供体小鼠的全骨髓细胞进行移植。

调查了三种不同的移植条件(概括在图11A中)，每种条件n＝6只小鼠。条件A组中的小鼠在第0天接受以前在野生型小鼠中使用的CD45-SAP标准剂量的1.3倍，然后在第3天用1x10⁷个供体全骨髓细胞(1X细胞剂量)进行移植。在条件B组中的小鼠在第0天和第3天接受1X CD45-SAP的注射，然后在第6天用1x10⁷个全骨髓细胞(1X细胞剂量)进行移植。条件C组中的小鼠在第0天接受1.3X CD45-SAP，并在第3和6天用1x10⁷个野生型全骨髓细胞(2X细胞剂量)进行移植。在移植后4个月评估供体细胞植入和疾病校正，并与年龄和性别匹配的未移植的镰状细胞病嵌合体或野生型小鼠进行比较。

如图11A-11D中所示，红细胞、网织红细胞、红细胞比容和血红蛋白水平返回正常。此外，如图12A-12B中所示，在血液中不再观察到镰状血红蛋白。也对脾脏和肝脏进行了病理学研究，并且如图13A-13B中所示，在CD45-SAP预处理的小鼠中脾脏尺寸恢复到正常。因此，上述结果证实了在小鼠模型中镰状细胞病的校正。

实施例4

为了进一步评估免疫毒素作为从HSC的巢中清空内源HSC的预处理策略，本发明人使用基于皂角素的免疫毒素靶向呈递在HSC(小鼠和人类)上的细胞表面抗原，并在具有完全免疫能力的C57B1/6小鼠中进行我们的实验；所述小鼠是已被证明对基于抗体的预处理构成挑战的背景。

通过将适合的生物素化的单克隆抗体与链霉亲和素-皂角素偶联物组合来制备免疫毒素，并通过图14A中的实验方案来评估HSC耗减。在我们的体内筛选中评估的候选抗原靶(CD45、CD49d、CD84、CD90、CD133、CD135和CD184)中，发现靶向CD45的基于皂角素的免疫毒素(CD45-SAP)高效耗减骨髓HSC(图15A)。比例和剂量优化研究(图14B和图15B)鉴定到3mg/kg的单一CD45-SAP剂量(通过i.v.注射)和1:1的抗体与链霉亲和素-皂角素比例实现最大的免疫表型HSC耗减(通过流式细胞术检测为98％)。除了HSC耗减之外，骨髓祖细胞的集落形成活性以剂量依赖性方式降低，但是比HSC受到更少不利影响(图14B)。竞争性骨髓移植证实了有功能的HSC被CD45-SAP耗减(图15C)。正如预期的，非生物素化的CD45抗体加链霉亲和素-皂角素不能在体内耗减HSC(图14C)。此外，由于使用的CD45单克隆抗体(克隆104)选择性识别鼠类CD45的CD45.2同种型，因此所述免疫毒素不能在CD45.1同类系小鼠中耗减HSC(图15D)。合在一起，这些结果与HSC被CD45-SAP的抗原特异性耗减相一致。

为了表征CD45-SAP免疫毒素，本发明人使用鼠类造血细胞系EML(多能祖细胞系)和EL4(T-细胞淋巴瘤株系)进行了一系列体外实验。EML细胞类似于造血干细胞和祖细胞，因为它们的生长依赖于干细胞因子(SCF)，并在细胞因子刺激后经历多谱系分化。除了CD45抗体克隆104之外，本发明人还调查了克隆30-F11(另一种抗CD45抗体)，并且两个克隆都强力诱导EML和EL4细胞死亡并具有40-71pM之间的范围内的相近的IC₅₀值(图14D和图15E)。在存在链霉亲和素-皂角素的情况下非生物素化的抗体不能在体外诱导细胞死亡(图14D)，证实了靶向皂角素的特异性。使用克隆104定量CD45受体在EL4细胞中的内化，显示出在24小时时间段内单独的抗体7％的内化并且抗体-链霉亲和素复合物12％的内化(图14E)。令人吃惊的是，尽管两种克隆在体外的活性相当，但只有克隆104能够在体内高效耗减HSC(图15F)。体内保留(给药后24小时)的评估揭示出克隆104显著结合到外周白细胞、脾细胞和含有HSC的骨髓LKS(Lin-cKit+Sca1+)细胞，而克隆30-F11在体内表现出不良的保留(图15G)。

合在一起，上述结果表明CD45-SAP免疫毒素的体内结合和内化从骨髓高效耗减HSC。

实施例5

接下来，本发明人调查了通过CD45-SAP耗减HSC是否能够实现供体细胞植入。由于供体移植物可能在体内受到未结合的CD45-SAP的负面影响，因此本发明人改变了移植时间以鉴定最适移植窗口(图16A)并探索了2种供体细胞类型(在不同组群中)的移植：不能被CD45-SAP靶向的同类系CD45.1细胞，或可以被潜在地靶向的同基因CD45.2-GFP细胞。将1千万个全骨髓供体细胞的剂量用于移植，这与以前的鼠类缩减预处理研究相一致并对应于约2％的鼠类总骨髓，由此模拟其中收获约5％的供体骨髓的人类移植。

在移植后4个月，本研究人员观察到在用CD45-SAP预处理的动物中，对于两种供体细胞类型来说，75-90％的供体细胞在外周血中植入(图16B和16C)。引人注目的是，对于在CD45-SAP给药后2-12天之间的任何时间移植的细胞，观察到等同的植入水平(图16B)，证实了宽广的移植窗口的产生。未预处理的对照动物不能表现出有意义的供体植入，其中嵌合率水平<2％(图16B和16C)。与外周血嵌合率相似，在CD45-SAP预处理的动物中，在移植后4个月也在骨髓HSC中观察到90％的供体细胞嵌合率(图17A)。时间过程评估揭示出对于两种供体细胞类型来说，外周嵌合率稳定并在15个月时达到93-94％(图16D和17B)。移植后8个月移植物的外周血分析揭示出髓系、B-和T-细胞谱系的正常分布，指示了真正无偏倚的干细胞植入(图16E)，其通过连续移植到致死辐射过的二次受体中得到进一步确认(图17C)。CD45-SAP预处理也实现纯化的干细胞的植入，因为2,000个LKS CD34-CD150+或LKS CD48-CD150+ HSC的注射在4个月时产生60％的嵌合率(图16F)，而未预处理的对照动物不能表现出有意义的植入(0-0.03％的嵌合率)。

为了将CD45-SAP与其他预处理方法进行比较，进行了进一步调查，以比较常规的TBI和使用ACK2单克隆抗体克隆的基于CD117-拮抗剂抗体的实验性预处理。如图17D中所示，在野生型小鼠中通过CD45-SAP在移植后4个月获得的嵌合率，与5Gy TBI(50％的致死TBI剂量)预处理相匹配。在这种有免疫能力的背景中，ACK2预处理不能实现显著的植入(<3％的植入)。十分之一的细胞剂量(1百万个骨髓细胞)的注射证实了在这种较低细胞剂量下CD45-SAP和5Gy TBI实现等同的植入(约20％的嵌合率)，并且当所述预处理方法合并时具有显著协同作用(约90％的嵌合率)(图17E)。

实施例6

由于CD45-SAP和5Gy TBI产生等同的嵌合率水平，因此本发明人通过在不经历预处理后移植的预处理的小鼠中测量各种不同的血液和骨髓参数，确定了这两种预处理方法的固有毒性。CD45-SAP和5Gy TBI两者都是非清髓性的，因为它们在没有干细胞移植的情况下允许长期存活(>6个月)(n＝12只小鼠/组，数据未示出)。预处理后的时间过程评估揭示出CD45-SAP与辐射相比对骨髓细胞构成具有明显更低的不利的即时效应(图18A)并更快恢复到正常水平(CD45-SAP与辐射相比分别为6天与12天)。同样地，CD45-SAP对骨髓祖细胞的影响与辐射发挥的影响相比更不显著，正如通过体外集落形成细胞(CFC)活性测定法所测量的(图18B)。尽管CD45-SAP对骨髓细胞构成和短期祖细胞的毒性总体降低，但CD45-SAP与辐射同样高效地耗减HSC(约98％的耗减，图18C)，尽管通过辐射耗减HSC更加即时。

在预处理后2天进行的股骨组织学分析表明CD45-SAP不仅以比辐射更高的程度保留骨髓细胞构成，而且维持骨髓内的血管完整性，因为与未处理的对照小鼠相似，RBC保留在血管内(图19)。相反，5Gy辐射的小鼠表现出骨髓内较低水平的有核细胞，并且红细胞分散在整个骨髓中，表明血管系统的总体破坏。为了确认这些差异，本发明人进行了功能性测定法以评估血管完整性。在预处理后2天静脉内注射高分子量(2MDa)罗丹明-葡聚糖，并进行颅盖骨骨髓的活体成像。如图18D中所示，罗丹明-葡聚糖被有效地保留在用CD45-SAP预处理的小鼠的血管内(与未预处理的对照类似)，表明血管完整性的维持。然而，辐射过的受体表现出葡聚糖弥散在整个骨髓中，指示了血管完整性受损。

合在一起，这些结果表明与5Gy辐射相比，CD45-SAP对骨髓细胞构成、造血祖细胞和血管完整性的危害较低，同时实现高效的HSC耗减并允许获得可比的植入水平。

实施例7

适应性和先天性免疫力恢复对于HSCT后的存活极为重要，并且它在预处理后的恢复失败造成与移植相伴的发病和死亡。预处理后(未移植)的外周血分析揭示出CD45-SAP与5Gy TBI预处理之间的显著差异。与将髓系(Mac1+，Gr1+)细胞抑制28天的辐射相反，CD45-SAP预处理的小鼠显示出循环髓系细胞的即时和可观的增加(3倍)，其在12天时返回到正常水平(图20A)。为了测试先天性免疫力，将预处理的小鼠用白假丝酵母的系统性感染(预处理后2天)进行攻击，这是感染预处理后的免疫受损HSCT患者的一种临床上相关的真菌菌株。用5Gy TBI预处理的小鼠对假丝酵母攻击高度易感，在感染后3天内出现100％致死(图20B，与对照相比p值<0.0001)。相反，用CD45-SAP预处理的小鼠具有相当高的复原力(与辐射相比p值<0.0002)，在50天内的总存活率与原初(naive)对照相近(对照与CD45-SAP相比p值＝0.57)。

在通过CD45-SAP和5Gy预处理后2天，B-和T-细胞两者都被同等且强力地耗减(图20C和21B)。然而，在CD45-SAP处理的小鼠中淋巴细胞的恢复明显更快。B-细胞在18天内恢复到80％(图21B)，T-细胞在12天内恢复到70％(图20C)。相反，辐射过的小鼠需要引人注目的额外的30-36天才能使B-和T-细胞恢复到可比的水平(图20C和21B)。在CD45-SAP后观察到的更快的T-细胞恢复可能是由对胸腺的差异影响造成的，胸腺是对于新的T-细胞的产生来说关键的器官，其已知被TBI预处理损伤。预处理后2天胸腺的组织学分析证实了辐射引起可见的胸腺萎缩，并且皮层中的胸腺细胞构成相当大地降低；而在CD45-SAP后没有明显的胸腺萎缩(图20D)。本发明人通过测量T-细胞受体切除环(TREC)的存在测试胸腺功能的保留，所述切除环是T-细胞受体重排的分子特征，其不随着基因组DNA复制并因此标志着新产生的T-细胞。在预处理后3天每mg胸腺组织的TREC的定量(图20E)揭示，在CD45-SAP处理后从新合成的T-细胞输出量为正常值的84％(与对照相比p值＝0.025)，而5Gy TBI将T-细胞输出量降低到8％(与对照相比p值<0.0001)。辐射还使胸腺质量降低80％，而CD45-SAP使胸腺质量降低50％(图21C)。

CD45-SAP不引起贫血，因为红细胞、红细胞比容和血红蛋白水平保持正常，而辐射在预处理后6天引起轻度贫血(图21D-21F)。血小板受到两种预处理方案的轻度影响，降低到正常水平的40％(图21G)。对于CD45-SAP或辐射来说，在胃肠道、肝脏和卵巢中没有观察到可察觉的毒性，正如通过尸体剖验和组织学分析所评估的(数据未示出)。

合在一起，上述结果表明与等效剂量的辐射预处理相比，CD45-SAP预处理保留髓系先天性免疫力，避免贫血并促进B-和T-淋巴细胞快速恢复。

实施例8

为了调查CD45-SAP预处理是否可以在相关的非恶性血红蛋白病模型中实现治愈性移植，本发明的研究人员使用带有人类镰状血红蛋白基因的敲入小鼠，其模拟人类镰状细胞病。这些小鼠表现出红细胞计数、红细胞比容和血红蛋白水平降低、不成熟红细胞(网织红细胞)的数目升高和异常大的脾脏。以前在镰状细胞病小鼠中进行的移植研究显示25％的髓系细胞嵌合率使血液参数返回到正常值的90％，而为了完全校正器官病理生理学，需要70％的髓系细胞嵌合率。

由于镰状细胞病小鼠具有升高的WBC水平(与野生型相比)，因此本发明人重新优化了CD45-SAP的剂量，并确定4mg/kg的单个剂量或3mg/kg的2个连续剂量的CD45-SAP实现最大的干细胞耗减(≈99％的耗减，图23A)。在这些剂量的基础上，调查了如图22A和23B中所概述的3种移植方案(组A-C)(6只小鼠/组)。所有3个用CD45-SAP预处理并用野生型细胞移植的组(18/18只小鼠)在移植后4个月表现出>90％的供体髓系细胞嵌合率(图22B)。在移植后也实现红细胞、血红蛋白、红细胞比容和网织红细胞水平的完全正常化(图22C和23C-E)。

血液中的镰状细胞血红蛋白完全被正常血红蛋白替换，正如通过非变性PAGE分析所评估的(图22D)。此外，血液涂片显示与镰状细胞病对照相比缺少镰状红细胞(图22E)，并且脾脏尺寸也返回到正常值(图22F和23F)。因此，CD45-SAP预处理在移植后实现>90％的髓系细胞嵌合率并对镰状细胞贫血实现完全的疾病校正。

实施例9

本发明人进行了活力测定以证实靶向CD45和CD117标志物的各种不同抗体和抗体-皂角素偶联物的活性。ACK2是针对mCD117的拮抗剂单克隆抗体克隆，其抑制干细胞因子1(SCF)结合到受体。2B8是针对mCD117的非拮抗剂单克隆抗体克隆，其与ACK2不同，不抑制SCF结合。MTS测定法通过用不同浓度的单独的或与皂角素偶联的抗体处理EML祖细胞系来进行。将细胞在含有200ng/ml SCF的培养基中生长，并在处理后72小时评估活力。使用10uM星状孢菌素作为100％死亡对照。如图24中所示，2B8-皂角素偶联物表现出在体外杀死EML祖细胞系。相反，2B8(CD 117)和104(CD45)抗体是无活性的，除非与皂角素组合以产生内化性抗体-毒素偶联物。此外，由于对SCF-CD117相互作用的拮抗，ACK2(CD117)抗体在没有皂角素的情况下表现出固有的细胞耗减活性。需要SCF的细胞对拮抗敏感。

进行了进一步研究以评估针对HSC上的已知抗原的各种不同单克隆抗体。如图25A和25B中所示，某些抗体产生非常高的HSC耗减(例如靶向CD45、CD117、CD49d和CD184标志物的抗体)，而几种其他抗体具有高毒性(例如CD34、CD93、CD201和ESAM)。尽管如图26中所示ACK2-SAP和2B8-SAP两者都实现表型HSC耗减，但只有2B8-SAP能够实现植入(图27和28)。如图27中所示，ACK2-SAP仅比ACK2更好，但2B8-SAP比任一者都更加高效，并且与CD45-SAP可比。

接下来，在抗体-毒素偶联物给药后8天移植1千万个全骨髓GFP细胞后，在血细胞和骨髓HSC中评估嵌合率(移植后16周)。正如图28中所示，CD117 ACK2-SAP偶联物不能实现植入，而CD117 2B8-SAP偶联物能够实现GFP供体细胞的高效植入(80-98％)。

实施例10

通过将2B8-SAP静脉内给药到9周C57/B16雌性小鼠，进行了体内CD117 2B8-SAP剂量优化研究(n＝4只小鼠/组)。向小鼠给药2B8-SAP，并在给药后8天评估干细胞耗减。如图29中所示，在0.1-0.5x剂量下没有观察到明显毒性，而在0.75x剂量下观察到2/4死亡，并且在1.0x剂量下观察到4/4死亡。

如图30中所示，2B8-SAP在给药后8天保持外周血无损，并因此是非清髓性和不去除淋巴细胞的。也如图30中所示，观察到骨髓区室的膨胀，并且与耗减B-和T-细胞的CD45-SAP相反，2B8-SAP令人吃惊地不耗减B-和T-细胞。因此，基于克隆2B8的CD117-皂角素避免了T-细胞和B-细胞耗减，表明先天性免疫力得以保留。没有观察到与贫血性疾病相关的RBC丧失。

实施例11

本发明人试图比较在体内各种不同的CD117-SAP克隆相对于CD45-SAP克隆和5Gy全身辐照的活性(n＝5只小鼠/组)。将所选的CD117-SAP偶联物静脉内给药到9周C57/B16雌性小鼠，并在抗体-毒素偶联物给药后8天评估对象动物的骨髓组织中的干细胞数目。如图31中所示，ACK2-SAP偶联物不能显著耗减HSC，而两种非拮抗剂CD117抗体-毒素偶联物(2B8-SAP和3C11-SAP)作为免疫毒素在耗减HSC时更加高效。

接下来，正如在图32中示意性描绘的，本发明人在9周C57/B16雌性小鼠中进行了CD117 2B8-SAP偶联物的16周植入研究(n＝5只小鼠/组)。在CD117 SAP-2B8偶联物给药后8天移植1千万个全骨髓CD45.1细胞，并在移植后16周评估嵌合率。总血液嵌合率是80％的供体；供体细胞对粒细胞(髓系)、T-细胞和B-细胞有贡献。如图32中所示，非拮抗剂2B8-SAP偶联物在具有完全免疫能力的动物中实现高效的供体细胞植入，因此将疾病的范围极大扩展到包括非SCID病症。上述方法代表了治疗恶性和前恶性疾病的可选方法，并且在许多这些病例中，恶性或前恶性细胞依赖SCF来生长并可能对这种试剂特别敏感。

实施例12

接下来，本发明人试图评估抗人CD45-SAP偶联物针对人造血干细胞的体外活性。从抗人抗体克隆104、MEM-28和HI30产生CD45-SAP免疫毒素。将人Jurkat CD45+造血细胞在体外用各种不同浓度的抗人CD45-SAP免疫毒素处理72小时，并使用MTS测定法(Promega)评估细胞活力。如图33中所示，对于MEM-28和HI30克隆来说，杀死细胞的IC₅₀值分别为130pM和200pM，证实了CD45内化不是种特异性的，并且这些CD45-SAP偶联物在体外在人类造血细胞中表现出效能。

也在体外评估了抗人CD34-SAP偶联物针对造血干细胞(HSC)的活性。将动员的人外周血CD34+ HSC在体外用各种不同浓度的抗人CD34-SAP免疫毒素处理96小时，并使用MTS测定法(Promega)评估细胞活力。如图34中所示，对于所试验的581和4H11克隆两者来说，杀死细胞的IC₅₀值约为100pM。

实施例13

可以将突变的保护抗原(mut-PA)融合到配体或scFv以产生能够细胞特异性形成细胞表面孔的嵌合体，所述孔可以输入致死因子N-端-毒素嵌合体(LFN-毒素)。可以使用各种不同的LFN-毒素，包括白喉毒素(LFN-DTA、LFN-SAP等)。对于PA和LFN来说内化机制是固有的，不需要内化性受体或抗体/配体的内化性质，并且如图35中所描绘。

本发明人试图在体外证实LFN-DTA针对人造血干细胞(HSC)的活性。将动员的人外周血CD34+ HSC在体外，在10nΜ WT-PA存在下用各种不同浓度的LFN-DTA免疫毒素处理96小时，并使用MTS测定法(Promega)评估细胞活力。如图36中所示，在1飞摩尔浓度的LFN-DTA下观察到100％细胞死亡，证实了LFN-DTA可用于实现人HSC的强力杀死。

也在各种不同细胞系中评估了LFN-DTA针对造血细胞的活性，方法包括将这些细胞在体外用各种不同浓度的LFN-DTA免疫毒素处理48小时，并使用MTS测定法(Promega)评估细胞活力。如图37中所示，LFN-DTA表现出针对被处理的细胞系的活性。

实施例14

为了调查本文公开的预处理疗法是否能够在人类中实现治愈性移植，本发明人期望在患有镰状细胞病的一个或多个人类对象(例如有免疫能力的人类对象)中进一步评估这些疗法的效能。具体来说，本发明人设想了将剂量逐步上升的本文公开的免疫毒素给药到人类对象，以评估这些免疫毒素在从对象的靶组织预处理(例如耗减或去除)细胞中的效能。

患有镰状细胞病或以其他方式受到镰状细胞病影响的人类对象的组织(例如骨髓组织)，通过向所述对象给药本文公开的免疫毒素(例如抗CD45-SAP免疫毒素)来预处理。在使用本文公开的免疫毒素预处理后，预计干细胞将从所述对象的靶组织被耗减。然后在预处理疗法之前评估基线完全血细胞计数(例如红细胞计数、红细胞比容和血红蛋白水平)、对象血液中镰状血红蛋白的存在和对象的脾脏尺寸，并在预处理疗法期间和之后监测这些参数。

在预处理所述人类对象并且所述免疫毒素从对象的靶组织消散后，将干细胞群(例如外源干细胞群)给药、移植或以其他方式植入到所述对象的预处理过的靶组织。评估植入之前和之后两者的百分嵌合率。

本发明人预期在将干细胞给药到对象的靶组织(例如骨髓组织)后，在所述对象中将观察到红细胞、血红蛋白、红细胞比容和网织红细胞水平的完全正常化，并且所述对象的血液中的镰状血红蛋白将完全被正常血红蛋白替换(例如通过非变性PAGE分析所评估的)。同样地，预计在植入后获得的血液涂片将证实相对于基线值或镰状细胞病对照缺少镰状红细胞，并且脾脏尺寸也返回到正常值。

正如在疾病的动物模型中观察到的，预期本文公开的靶向免疫毒素向人类对象的给药也将避免传统上与当前的基因毒性预处理方法相伴的毒性，同时保留先天性免疫力、胸腺完整性并且能够更快地恢复适应性免疫细胞，并同时避免血管完整性的丧失、不想要的贫血和长期血细胞减少。考虑到这些优点，本发明人预期上述研究将证实本文公开的免疫毒素和相关方法作为预处理人类对象(例如非恶性肿瘤移植对象)的手段的效能。因此，上述研究也将确认本文公开的免疫毒素的非清髓性质，以及本文公开的免疫毒素和相关方法在人类对象中完全校正疾病的能力。

实施例15

本发明人进行了人CD34+造血干细胞(HSC)杀死测定法。使用皂角素从列出的可商购抗人单克隆抗体(mAB)产生了免疫毒素，其靶向各种不同细胞表面受体，并测试了它们在5天内杀死人类骨髓来源的CD34+ HSC的能力。杀死超过20％的人类CD34+ HSC的免疫毒素被示出在下面的表1中并描绘在图39中。

表1-人CD34+ HSC杀死测定法

因此，上述结果证实了本发明的免疫毒素表现出人CD34+ HSC杀死活性。

实施例16

制备CD45-SAP，并且如图40A中总体描绘的，在有免疫能力的Balb/c小鼠中进行移植研究。将8周龄的有免疫能力的Balb/c小鼠用3mg/kg CD45-SAP(克隆104)或1.5mg/kg CD117-SAP(克隆2B8)注射，并在免疫毒素后6天移植1千万个全骨髓供体细胞。在移植后16周评估动物的外周血中的总体总供体细胞和髓系特异性供体细胞嵌合率。如图40B中所示，CD45-SAP和CD117-SAP与未预处理的对照小鼠相比能够实现高效的供体细胞植入(至少n＝3只小鼠/组)。

然后本发明人进行了涉及将人CD34+供体细胞移植到免疫受损NSG小鼠中的研究，如图41A中所示。将8周龄免疫受损NSG小鼠用2Gy辐射、3mg/kg CD45.1-SAP或1.5mg/kg CD117-SAP预处理，并在免疫毒素后6天移植人脐带血CD34+供体细胞。在移植后16周评估外周血中的总人类供体细胞嵌合率(n＝5只小鼠/组)，并描绘在图41B中。

如图41B、图42A和42C中所示，用2Gy辐射、CD117-SAP或CD45.1-SAP预处理，在移植后16周能够在骨髓中实现高水平的人类植入。正如图42C中所示，骨髓中的人类供体细胞主要由B-细胞和一些髓系细胞和少量T-细胞构成。

讨论

上述结果第一次演示了将内化性非放射性标记的免疫毒素作为单一实体药剂用于高效预处理具有完全免疫能力的动物以备HSCT，并且本发明人相信这是无基因毒性预处理的第一个实例，并且随后的HSCT证实了在动物模型中的疾病校正。由于CD45受体被造血细胞专门表达，因此CD45可能是使得对非造血组织的毒性最小化的理想的标志物和免疫毒素靶。

考虑到嗜中性粒细胞表达CD45，在用CD45-SAP预处理后观察到的没有嗜中性粒细胞减少症(如图3B中所示)和观察到的嗜中性粒细胞的扩增示令人吃惊的结果。不希望受到任何特定理论限制，可能嗜中性粒细胞与其他血液细胞不同，不内化CD45-SAP，或者由于它们的寿命短(12小时)，这种效应由于细胞群的快速更新而不可见。可以想象，观察到的嗜中性粒细胞的快速扩增可能是对CD45+细胞死亡的响应，因为嗜中性粒细胞负责清除凋亡的细胞。并不预期嗜中性粒细胞的短暂扩增会是不利作用，因为嗜中性粒细胞在对抗细菌感染中发挥显著作用，因此它们的扩增限制了细菌感染的发生，细菌感染是传统的与预处理相关的死亡的主因。

尽管观察到B-和T-细胞中短暂的淋巴细胞减少，但可能这对于发生植入来说是必需的(但其可能本身不是充分的)，正如ACK2在有免疫能力的动物中的无效性和我们实验室中的研究所建议的，所述研究证实了调节性T-细胞直接与骨髓中的HSC相互作用并且为HSC留存所必需(Fujisaki,J.等，Nature(2011)474,216-219)。尽管T-细胞耗减可能是HIV患者关注的领域，但是在个体患者的逐个病例评估上短暂的耗减性质可能是可接受的(特别是在完全型AIDS发生之前)。此外，受体T-细胞的耗减也可能是有利的，因为它能够清除充当HIV的病毒储库的CCR5阳性T-细胞。本发明人预期短暂的T-细胞耗减对于其他血红蛋白病的治疗不构成问题，并且重要的是注意到目前的预处理方案完全去除T-细胞和B-细胞群。

在CD45-SAP预处理后不存在贫血，正如由红细胞、红细胞比容或血红蛋白水平没有降低所证实的，表明CD45-SAP预处理将与实现贫血病症(例如镰状细胞贫血、Diamond-Blackfan贫血和地中海贫血)中的移植相关。

以前探索的抗CD117抗体的使用可以靶向非造血CD117+细胞(例如心脏祖细胞、胃肠细胞、神经元细胞和生殖系统的细胞)。此外，预期使用CD117拮抗剂的成功预处理局限于免疫受损患者，并且临床前研究表明这种方法可以导致严重的嗜中性粒细胞减少症、血小板减少症和贫血，这是可能限制广泛应用的因素。

蛋白免疫毒素的使用与全身辐射、DNA烷化剂或放射免疫疗法(RIT)相比提供了显著优点。除了通过抗体靶向实现的特异性之外，蛋白毒素需要受体介导的内化作用显著降低了脱靶和旁观者毒性(例如对巢细胞)的风险。尽管抗CD45RIT目前作为常规预处理的清髓性可选替代方案正在急性髓系白血病(AML)和骨髓增生异常综合征(MDS)患者中进行临床调查，但它引起与常规预处理相似的毒性，包括嗜中性粒细胞减少症、淋巴细胞减少症和血小板减少症。相反，上述研究证实使用基于蛋白质的毒素靶向CD45避免了嗜中性粒细胞减少、贫血和胸腺损伤，同时据推测通过避免对非靶巢细胞的毒性而促进骨髓和外周淋巴细胞快速再生。因此，在稳定的混合性嵌合足以治愈隐含的疾病的情况下，基于蛋白质的免疫毒素对于非恶性病症(例如血红蛋白病和SCID病症)来说，可能是优选的。此外，基于蛋白质的免疫毒素的提高的稳定性和成本效益高的生产将可能促进广泛使用，特别是在血红蛋白病更加流行的国家中。此外，由于基于蛋白质的免疫毒素与RIT相比不引起DNA损伤，因此它们可能更好地适合于预处理前恶性范科尼贫血患者，所述患者在遗传上易于对DNA损伤性药剂和常规预处理高敏。

可以想象，在上述研究中使用的原理证明方法可以产生HSC特异性免疫毒素，其完全保留免疫力并同时能够实现植入。为此目标，上述研究提供几种考虑。由于HSC主要出于静默的非分裂状态，因此有趣的是确定蛋白质合成抑制剂毒素(例如皂角素、修饰的蓖麻毒素类似物、假单胞菌毒素或白喉毒素)是否有权进行HSC耗减，因为它们不依赖于细胞周期诱导死亡，这与目前用于抗体-药物偶联物(ADC)中的抗有丝分裂小分子相反。尽管以前的研究表明CD45由于不良的内化频率而不是用于内化免疫毒素的适合的靶，但本发明人观察到对于体内应用来说，12％的内化足以实现强力HSC耗减。由于CD45被高表达，每个白细胞具有200,000个分子，因此是被内化分子的绝对数目而不是单独的内化频率决定了靶适合性。此外，除了有利的体内保留之外，为了实现宽的移植窗口，需要将脱落和供体细胞的不想要的靶向降至最低的高亲和性免疫毒素。

合在一起，本文中呈现的结果支持抗人CD45和/或CD117抗体-靶向免疫毒素作为低毒性、非清髓性预处理方案的用途和效能。此外，这些结果令人吃惊且出人意料地确认了靶向CD45+和CD117+细胞作为可行的预处理靶，并提供了明显不同的优点和差异(例如相对于CD45放射免疫毒素)。考虑到靶向CD45的单克隆抗体以前尚未被当作可行的内化策略(Press等，Blood.(1994),83(5):1390-1397)，这些观察是特别令人吃惊的。例如，本文公开的靶向CD45的免疫毒素是储存稳定的，并且制造起来成本效益高，而CD45放射免疫毒素具有短的半衰期(由于放射活性衰减)并需要高度专用和昂贵的基础设施来生产。与模拟辐射的清髓性质的CD45放射免疫毒素形成鲜明对比，本文公开的靶向CD45的免疫毒素不耗减嗜中性粒细胞和血小板，因此预期将患者的风险和对移植后姑息护理的需求降至最低。

此外，本文公开的方法和组合物选择性靶向CD45+和/或CD117+细胞，因为内化是细胞死亡的先决条件。相反，尽管CD45放射免疫毒素特异性结合到造血细胞，但死亡不是内化依赖性的，并且将发生在暴露于辐射(包括对脾脏和肝脏的不想要的辐射)的邻近细胞中。重要的是，暴露于辐射的细胞、包括构成巢的细胞，对于植入进行是必不可少的(Wang,Y.等，Free Radio Biol Med(2010),48,348-356；Wang,Y.等，Blood(2006),107,358-366；和Madhusudhan,T.等，Stem Cells Dev(2004),13,173-182)。因此，尽管CD45放射免疫毒素适合于患有恶性肿瘤的患者中的BMT(例如其中为了实现100％的供体细胞嵌合率必需清髓性预处理)，但本文公开的CD45-和/或CD117-免疫毒素适用于部分嵌合率足以校正非恶性疾病的对象的治疗，并将预处理程序中的风险降至最低。CD45和/或CD117免疫毒素的降低的风险和作为单一实体储存稳定的药剂的使用，可能能够实现骨髓移植(同种异体和自体基因疗法两者)的更广泛的使用，即使是对于目前缺少基础设施(例如辐射器)或姑息护理设施以进行传统BMT的医院来说。

到目前为止，尚无非放射性标记的基于抗体的方法成功地预处理有免疫能力的动物，并且本文公开的CD45-SAP、CD117-SAP和相关组合物和方法代表了其第一个实例。此外，ACK2抗体(c-kit受体的拮抗剂)是只在免疫缺陷小鼠中工作并且不能在有免疫能力的动物中预处理的抗体方法的实例。内化抗体-免疫毒素以前尚未在任何动物中用于预处理。

尽管免疫毒素在抗癌疗法中的临床用途受到免疫原性和累计剂量限制性毒性的极大限制，但这些因素不适用于HSC移植前的预处理，在其中非反复性使用是可能的。此外，从以前的靶向血液恶性肿瘤的免疫毒素临床试验可获得的大量安全性数据，事实上可以促进快速的临床转化。本文中呈现的结果强烈建议，CD45-SAP、CD117-SAP或类似的基于蛋白质的免疫毒素可能在干细胞移植中有用，以便能够治疗当前受到现有预处理方案的毒性限制的疾病。

材料和方法

通用方法和统计学

用于动物研究的样本量(通常在每个实验中n＝5只小鼠/组)是基于以前的类似工作而没有使用另外的统计估算。所有统计数据使用双向分析，使用未配对student t-检验来计算，例外的是Kaplan-Meier数据，其通过对数秩(Mantel-Cox)检验来分析。使用字母数字编码以便对病理学样品和集落形成细胞(CFC)计数进行盲评。

动物

所有动物研究在机构的IACUC批准下进行。雌性野生型CD45.2小鼠(C57BL/6J)、同类系CD45.1小鼠(B6.SJL-Ptprca Pepcb/BoyJ)、GFP小鼠(CByJ.B6-Tg(UBC-GFP)30Scha/J)和镰状细胞病小鼠(B6；129-Hbatm1(HBA)Tow Hbbtm2(HBG1，ΗΒΒ*)Tow/Hbbtm3(HBG1，HBB)Tow/J购自Jackson Laboratories。除非另有陈述，否则小鼠在约9周龄时用于实验。对于镰状细胞病实验来说，通过将致死辐射(9.5Gy单剂量，铯-137辐射器，JL Shephard&Associates)的6周龄C57BL/6J小鼠用5百万个从镰状细胞病小鼠收获的全骨髓(BM)细胞进行移植，产生镰状细胞病嵌合体。在镰状细胞病嵌合体中的免疫毒素预处理和移植在嵌合体产生后8周进行。

抗体和免疫毒素制备

生物素化的抗CD45(克隆30-F11)、抗CD45.2(克隆104)、抗CD49d(克隆9C10)和抗CD84(克隆mCD84.7)单克隆抗体购自BioLegend。生物素化的抗CD90(克隆30-H12)、抗CD133(克隆13A4)、抗CD184(克隆CD184)和抗CD135(克隆A2F10)单克隆抗体购自eBioscience。抗CD117拮抗剂抗体(克隆ACK2)购自BioLegend并以28mg/kg的剂量注射。免疫毒素通过将生物素化的抗体(160kDa MW)与链霉亲和素-皂角素偶联物(135kDa MW，Advanced Targeting Systems)以1:1的摩尔比合并来制备，并随后在即将使用之前在PBS中稀释。剂量计算假定免疫毒素的合并分子量为295kDa。免疫毒素的体内给药通过静脉内注射(300μL体积)来进行。

体外细胞死亡测定法

涉及EL4(ATCC TIB-39)或EML(ATCC CRL-11691)细胞的体外细胞死亡实验在96孔板中进行，以5,000细胞/孔铺板在100μL含有各种不同浓度的免疫毒素的细胞培养基中。进行三个独立实验，每个实验中含有三个技术平行样。在200ng/mL重组鼠类干细胞因子(R&D Systems)存在下测试EML细胞。在72小时后，使用CellTiter MTS测定法(Promega)确定细胞活力。PBS处理和10μΜ星状孢菌素处理的细胞(Sigma Aldrich)被分别用作活细胞和死细胞对照。

抗体内化的测量

体外抗体内化如之前所述进行评估。简单来说，将完全培养基(RPMI w/o酚红，10％FBS)中的EL4细胞(200,000/mL)铺板在含有20nM AF488标记的抗CD45.2抗体(克隆104，BioLegend)或生物素化的抗CD45.2抗体与链霉亲和素-AF488偶联物(Life Technologies)的1:1混合物的96孔板中。温浴24小时后，将细胞清洗两次并重悬浮在含有2％FBS的PBS中。将样品分成两半，并将一半与0.25mg/mL多克隆抗AF488淬灭抗体(克隆A-11094，Life Technologies)温浴。通过流式细胞术定量含有和不含淬灭抗体的样品中的AF488信号。进行未染色的和零时对照以确定淬灭效率并计算内化频率。

体内抗体留存

将小鼠用与生物素化抗CD45抗体预先混合的链霉亲和素-AF488偶联物(1:1比例，在PBS中，1.8mg/kg)i.v.注射。给药后24小时，收获血液、BM和脾脏，并通过流式细胞术确定AF488信号。将BM细胞用谱系混合物(BD Biosciences)、抗cKit和抗Sca1抗体共染色，以便确定Lin-cKit+Scal+(LKS)祖细胞群内的AF488信号。脾细胞和外周血细胞中AF488的信号，在用抗CD45 PeCy7抗体离体染色后，在CD45+细胞级分内评估。

BM分析和移植

用于移植或分析的BM细胞通过分别压碎所有四肢或一根股骨来收获。总细胞构成通过完全血细胞计数(CBC)分析，使用Abaxis VetScan HM5仪器来确定；并且祖细胞集落测定法按照制造商的说明书来进行(Stem Cell Technologies)。免疫表型干细胞定量通过流式细胞术，使用谱系抗体混合物、抗cKit、抗Sca1、抗CD48和抗CD150抗体来进行，并且干细胞被定义为Lin-cKit+Scal+CD48-CD150+。对于全BM移植来说，静脉内注射300μL PBS中的1千万个细胞。对于纯化的干细胞的注射来说，将全BM细胞通过磁选法(BD Biosciences)进行谱系耗减，随后对LKS CD48-CD150+或LKS CD34-CD150+细胞进行FACS分拣。每只小鼠注射2000个纯化的干细胞。二次移植通过注射1百万个来自于初次预处理并移植过的小鼠(在移植后4个月)的BM细胞来进行，并注射到二次致死辐射过的受体(9.5Gy单剂量)中。竞争性移植通过将含有比例为1:1的CD45.1竞争物和CD45.2测试细胞的1百万个BM细胞注射到致死辐射过(9.5Gy单剂量)的同类系CD45.1受体中来进行。

外周血分析

将小鼠组群(通常为4只小鼠/组)连续采血或通过心脏取血最终采血。通过CBC分析(Abaxis VetScan HM5)定量白细胞(WBC)、血红蛋白、红细胞(RBC)、血小板和红细胞比容水平。为了对T-、B-和髓系细胞进行流式细胞术定量，将血液样品进行RBC裂解并固定，然后用抗CD45、B220、CD3、Mac1和Gr1抗体染色，并使用流式细胞术频率和WBC值计算T-、B-、髓系细胞的绝对数目。对于涉及CD45.1供体细胞的移植来说，外周血供体细胞嵌合率通过流式细胞术，使用抗CD45.1和CD45.2抗体来确定。对于使用CD45.2-GFP供体细胞的移植来说，嵌合率基于CD45+门(gate)内的GFP+事件。红细胞群内的网织红细胞频率通过流式细胞术，使用噻唑橙染色(Retic-COUNT试剂，BD Biosciences)来确定。血红蛋白的非变性PAGE分析在any-kD预制凝胶(Bio-Rad)上使用裂解的全血样品来进行。

病理学和组织学分析

在各个不同时间点(预处理后2、4、6和8天)将小鼠安乐死，固定在Bouin's溶液(Sigma Aldrich)中并送去进行尸体剖验和组织学分析。使用1只小鼠/组进行两个独立实验。在肝脏、脾脏、股骨、肾脏、肠道、淋巴结、胸腺和卵巢的石蜡包埋的切片上进行苏木精和曙红染色，用于毒性评估。示出的代表性图像在两个独立的实验之间是一致的。

血管完整性的活体成像

预处理的小鼠(预处理后2天)或未处理的对照小鼠的小鼠颅盖BM血管系统的活体成像使用定制的多光子显微镜(Thorlabs,Inc.)来进行，所述显微镜合并有基于高脉冲能量光纤的飞秒激光器(Cazadero FLCPA，Calmar激光器)，其激发波长设定在775和950nm。水浸60x/1.00w物镜(LUMPLFLN60XW,Olympus)提供415x415μm视野，并使用0.5-5μm的Z轴步级直至150-200μm的深度。将小鼠维持在麻醉下(1.35％异氟烷/氧气混合物)，并使用加温板维持核心体温。头皮上的U型切口暴露出颅盖骨，向其施加2％甲基纤维素凝胶用于折射率匹配。使用二次谐波发生信号(在387.5nm处激发)使骨胶原蛋白可视化并确定感兴趣的区域。进行2MDa罗丹明-葡聚糖偶联物(150μL的3.3mg/mL D-7139，Life Technologies)的台上眶后注射，并在注射后的前2-5分钟连续记录(13帧/秒)罗丹明信号(585nm激发)。收集连续图像直至注射后30分钟。在葡聚糖给药后相同时间获取的图像被用于组之间的比较，并且使用n＝1只小鼠/组进行2个独立实验。图中的图像的对比度和亮度设置经过调整，仅仅是出于显示的目的。

使用白假丝酵母(Candida albicans)的系统性攻击

将来自于冷冻储用物的白假丝酵母野生型菌株SC5314(ATCC MYA-2876)在含有100μg/mL氨苄青霉素(Sigma)的酵母提取物、蛋白胨和右旋糖(YPD)培养基(BD Biosciences)中，在定轨摇床中在30℃下过夜生长。在成粒并用冷PBS清洗后，使用血细胞计数器对酵母进行计数，并在PBS中将细胞密度调整到75,000CFU/200μL。将小鼠通过侧尾静脉用75,000CFU注射并每日监测动物。垂死的小鼠进行人道安乐死。

胸腺T-细胞受体切除环(TREC)的定量

TREC定量按照以前的描述进行。简单来说，从未预处理的小鼠、5Gy TBI或CD45-SAP预处理的小鼠(预处理后3天)收获胸腺。在Bullet Blender Storm BBX24仪器(Next Advance,Inc.)中组织匀浆后，使用TRIZOL提取总DNA。通过UV-Vis对DNA进行定量，并使用每个样品1μg DNA作为实时PCR的输入。使用小鼠sjTREC质粒的标准曲线计算每个样品的sjTREC的绝对数目。