衣壳的制作方法

发明领域

本发明涉及腺相关病毒(aav)衣壳变体。

发明背景

近年来已经开发了基于不同病毒的多个重组基因转移载体。基于腺相关病毒(aav)的基因转移载体、即aav载体是优选的，因为它们能够转导不同类型的不同组织的分裂和非分裂细胞的能力，以及建立稳定的长期转基因表达的能力。虽然基于其他病毒例如腺病毒和逆转录病毒的载体可能具有某些期望的特征，但它们也与不期望的副作用相关。基于aav的基因转移载体尚未检测到此类副作用(mannoetal.,naturemedicine,12(3):342(2006))。

已经鉴定、克隆、测序并转化为载体的许多aav血清型。这些血清型包括aav8、aav5、aav3b和最近描述的aav-lk03(wo2013/029030)。然而，本发明人已经发现许多目前使用的载体在人中具有低的转导率。例如，aav8载体在人中的转导是小鼠中的二十分之一，以及发生在三分之二的高剂量组群中瞬时、泼尼松龙反应性转氨酶升高(transaminitis)。因此，需要新的aav载体来提高效能和安全性，并且促进更广泛的临床适用性。

为此，本发明人通过经验交换来自4种不同aav衣壳的各种结构域已经开发了新的杂合衣壳：(1)aav8，(2)aav5，(3)aav3b和(4)aav-lk03。开发了与目前使用的载体相比达到至多5倍的基因转移水平的衣壳。

发明概述

在本发明的第一方面，提供了具有与seqidno：3具有至少98％同一性或与seqidno：4具有至少94％同一性的氨基酸序列的aav衣壳蛋白。

发明人已经出乎意料地发现，该新的衣壳蛋白产生提供比目前使用的aav载体更高的转导率的衣壳。此外，已经发现，患者中针对该衣壳的抗体的流行率低于一些目前使用的aav载体。

在一些实施方案中，氨基酸序列与seqidno：4的序列具有至少95％的同一性。在具体实施方案中，氨基酸序列与seqidno：4的序列具有至少96％的同一性。在进一步的实施方案中，氨基酸序列与seqidno：4的序列具有至少97％的同一性。在一些实施方案中，氨基酸序列与seqidno：4的序列具有至少98％的同一性。在其它实施方案中，氨基酸序列与seqidno：4的序列具有至少99％的同一性。在具体实施方案中，氨基酸序列具有seqidno：4的序列。

在一些实施方案中，氨基酸序列与seqidno：3的序列具有至少98.5％的同一性，优选与seqidno：3的序列具有至少99％的同一性，更优选与seqidno：3的序列具有至少99.5％的同一性。在具体实施方案中，氨基酸序列具有seqidno：3的序列。

在一些实施方案中，氨基酸序列与seqidno：3的序列具有同一性。在其它实施方案中，氨基酸序列与seqidno：4的序列具有同一性。在优选的实施方案中，氨基酸序列具有seqidno：4的序列。更优选地，氨基酸序列具有seqidno：3的序列。

具有上述氨基酸序列的衣壳蛋白是功能性衣壳蛋白，其可以与其它必需的衣壳蛋白一起形成功能性衣壳。功能性衣壳是可以包围遗传物质，进入细胞并用遗传物质转导细胞的衣壳。确定衣壳是否功能正常在技术人员的能力范围内。例如，以下在本发明的详述中描述的实验可以用于确定衣壳是否可以成功转导细胞。

通过克隆包含aav3b衣壳的vp2和vp3结构域上游的aav8vp1区的146个氨基酸区域来产生seqidno：3。通过克隆aav3bvp2和vp3区上游的aav5vp1区产生seqidno：4。以下提供aav血清型和衣壳蛋白的进一步细节。

本发明的第二方面提供了包含上述aav衣壳蛋白的aav衣壳。aav衣壳是由vp1、vp2和vp3蛋白组成的蛋白质壳，其包裹(或包围)病毒的遗传物质。

此外，提供了包含上述aav衣壳蛋白的病毒颗粒。病毒颗粒包含aav衣壳和病毒的遗传物质。

在本发明的第三方面，提供了包含编码上述氨基酸序列的核苷酸序列的重组aav(raav)载体。这意味着该载体含有编码功能性衣壳蛋白的核苷酸序列。

优选地，该载体还包含启动子，使得核苷酸序列是可表达的。优选地，该载体包含aav2p40病毒启动子，其在大多数哺乳动物细胞类型中是组成型活性的。

因此，本发明提供了基于通常感染人(例如，血清型1、2、3a、3b、4、5和6)或灵长类动物(例如，血清型1和4)的腺相关病毒(aav)的基因递送载体。关于这种病毒的进一步信息在kennethi.berns,"parvoviridae:thevirusesandtheirreplication,"chapter69于fieldsvirology(3ded.1996)中有描述。

所有已知aav血清型的基因组组成非常相似。aav的基因组是长度小于约5,000个核苷酸(nt)的线性单链dna分子。末端反向重复序列(itr)侧接编码非结构复制(rep)蛋白和结构(vp)蛋白的独特核苷酸序列。vp蛋白(vp1、vp2和vp3)形成衣壳。末端145nt是自身互补的并且被组织成以便可以形成形成t形发夹的能量稳定的分子内的双链体。这些发夹结构作为病毒dna复制的起点，用作细胞dna聚合酶复合物的引物。在哺乳动物细胞中野生型(wt)aav感染后，rep基因(即编码rep78和rep52蛋白)分别由p5启动子和p19启动子表达，并且两个rep蛋白在病毒基因组的复制中具有功能。reporf中的剪接事件导致实际上四种rep蛋白的表达(即rep78、rep68、rep52和rep40)。然而，已经显示在哺乳动物细胞中编码rep78和rep52蛋白的未剪接的mrna足以产生aav载体。在昆虫细胞中，rep78和rep52蛋白也足以产生aav载体。

在适合用作基因治疗载体的aav中，载体基因组通常包含待包装的用于递送至靶细胞的目的核酸。根据该特定实施方案，核酸位于载体基因组任一端的病毒itr之间。aav基因组有可能仅使用一个itr发挥功能。因此，在基于aav的本发明的基因治疗载体中，载体基因组侧接至少一个itr，但更典型地侧接两个aavitr(通常具有载体基因组的任一侧，即5'末端一个和3'末端一个)。载体基因组中的核酸与itr中的一个或多个之间可能存在插入序列。

在本发明的上下文中，“至少一个itr”被理解为是指包含大部分互补的、对称排列的序列也称为“a”、“b”和“c”区的回文序列。itr起复制起点的作用，复制起点是在复制中具有“顺式”作用的位点，即作为反式作用复制蛋白例如rep78(或rep68)的识别位点，其识别回文和回文内的特定序列。itr序列的对称性的一个例外是itr的“d”区。它是独特的(在一个itr内没有互补序列)。单链dna的切口发生在a区和d区之间的交界处。这是新dna合成开始的区域。d区通常位于回文的一侧，并为核酸复制步骤提供方向性。在哺乳动物细胞中复制的aav通常具有两个itr序列。然而，可以工程改造itr，使得结合站点对称地位于a区和d区的两条链上，在回文的每一侧上有一个。在双链环状dna模板(例如质粒)上，rep78-或rep68-辅助的核酸复制然后在两个方向上进行，单个itr足以用于环状载体的细小病毒复制。因此，在本发明的上下文中可以使用一个itr核苷酸序列。然而，优选地，使用两个或另一偶数个常规itr。最优选地，使用两个itr序列。为了安全起见，可能需要构建在初始引入细胞后不能进一步繁殖的aav载体。用于限制接收者中不希望的载体繁殖的这种安全机制可以通过使用具有us2003148506中所述的嵌合itr的aav来提供。

本领域技术人员将理解，可以考虑病毒itr的来源来选择用于产生本发明的aav载体的病毒rep蛋白。例如，尽管itr的血清型和rep蛋白不是必须匹配的，aav5itr通常与aav5rep蛋白更有效地相互作用。

本发明中使用的itr通常是功能性的，即它们可以是完全可分解的(resolvable)，并且是aav序列，优选血清型1、2、3、4、5或6的aav序列。根据本发明的可分解的aavitr不需要具有野生型itr序列(例如，可以通过插入、缺失、截短或错义突变改变的野生型序列)，只要itr介导期望的功能，例如，病毒包装、整合和/或原病毒拯救等。

在进一步优选的实施方案中，aavcap基因和aavrep基因从模板基因组(并且因此从其产生的病毒颗粒dna)中缺失。该构造使得能够由aav衣壳携带的核酸序列的大小最大化。

可以在本发明中用于生产aav基因治疗载体的aav序列可以从任何aav血清型的基因组衍生。通常，aav血清型具有在氨基酸和核酸水平上具有显著同源性的基因组序列，提供相同的一组遗传功能，产生基本上物理和功能等同的病毒颗粒，并通过实际相同的机制复制和组装。对于各种aav血清型的基因组序列和基因组相似性的概述，参见例如genbank登录号u89790；genbank登录号j01901；genbank登录号af043303；genbank登录号af085716。aav血清型1、2、3、4、5、6、7、8或9可用于本发明。然而，aav血清型1、5或8是用于本发明上下文的aav序列的优选来源。当用于生产基因治疗载体时，来自aav血清型的序列可以被突变或工程改造。

优选地，用于本发明上下文中的aavitr序列衍生自aav1、aav2、aav4和/或aav6。同样，rep(rep78和rep52)编码序列优选衍生自aav1、aav2、aav4和/或aav6。

大多数血清型中aavrep和itr序列特别保守。各种aav血清型的rep78蛋白是例如大于89％的相同，并且在aav2、aav3a、aav3b和aav6之间的基因组水平上的总核苷酸序列同一性约为82％。此外，已知许多aav血清型的rep序列和itr可以在哺乳动物细胞中aav颗粒的生产中有效地交叉互补(即功能上替代)来自其它血清型的相应序列。us2003148506报道，aavrep和itr序列还有效地与昆虫细胞中的其他aavrep和itr序列交叉互补。

已知aavvp蛋白质确定aav病毒颗粒的细胞向性(tropicity)。vp蛋白编码序列比不同aav血清型中的rep蛋白和基因显著更不保守。rep和itr序列交叉互补其他血清型的相应序列的能力允许产生包含一种血清型(例如aav1、5或8)的衣壳蛋白和另一aav血清型(如aav2)的rep和/或itr序列的假型aav颗粒。这种假型raav颗粒是本发明的一部分，因为任何aav血清型的rep和/或itr序列可以与本发明的经修饰的衣壳蛋白一起使用。

经修饰的“aav”序列也可以在本发明的上下文中使用，例如，用于生产aav基因治疗载体。这样的经修饰的序列例如包括与aav1，aav2，aav3，aav4，aav5，aav6，aav7，aav8或aav9itr或rep具有至少约70％，至少约75％，至少约80％，至少约85％，至少约90％，至少约95％或更多核苷酸和/或氨基酸序列同一性的序列(例如，具有约75-99％核苷酸序列同一性的序列)可用于替换野生型aavitr或rep序列。

尽管与其他aav血清型在许多方面相似，aav5比其他已知的人和猿猴aav血清型不同于其他人和猿血清型的不同之处更多。鉴于此，raav5的产生可能与昆虫细胞中其他血清型的产生不同。在本发明的方法用于产生raav5的情况下，优选一种或多种构建体，在多于一种构建体的情况下，总体上包含aav5itr的核苷酸序列，核苷酸序列包含aav5rep编码序列(即核苷酸序列包含aav5rep78)。可以根据需要修饰这样的itr和rep序列以获得aav5或假型aav5载体的有效生产。

选择最合适的病毒、病毒亚型或病毒血清型在本领域技术人员的技术技能之内。对于某种类型的组织，某些亚型或血清型可能比其他亚型或血清型更合适。

例如，目的核酸的肝特异性表达可以有利地由aav介导的肝细胞转导诱导。肝脏适合于aav介导的转导，可以使用不同的血清型(例如，aav1、aav5或aav8)。肌肉的转导可以通过经由血流施用aav编码核酸来实现。因此，静脉内或动脉内施用是适用的。

有利地，通过使用本发明的载体，可以获得更大程度的细胞转导。在肝细胞中尤其如此。

因此，本发明的载体因此代表了通过工程改造有效转导合适的细胞类型例如肝细胞的基因治疗载体内的核酸用于体内递送治疗性核苷酸序列的开发策略的工具。

载体可以包含允许表达功能性治疗性蛋白质的其它元件。这些元件是本领域技术人员众所周知的。

优选分离上述核酸和氨基酸序列。

本领域技术人员产生上述核酸分子和氨基酸序列的能力将是很好的。这可以例如使用给定序列的化学合成来完成。

本发明还涉及将目的核酸转移到哺乳动物中的方法，其包括将重组aav载体导入哺乳动物，所述重组aav载体包含被包裹到包含上述衣壳蛋白的衣壳中的目标基因。

本发明还提供了包含具有上述氨基酸序列的衣壳蛋白或上述载体的宿主细胞。

如本文所用，术语“宿主”是指含有本发明的蛋白质或载体的生物体和/或细胞，以及适用于表达重组基因或蛋白质的生物体和/或细胞。本发明不限于任何特定类型的细胞或生物体。实际上，考虑了将在本发明中用作宿主的任何合适的生物体和/或细胞。宿主细胞可以是单细胞、相似或不同细胞的群体的形式，例如以培养物(例如液体培养物或固体基质上的培养物)、生物体或其一部分的形式。

根据本发明的宿主细胞可以允许表达治疗性核酸分子。因此，宿主细胞可以是例如细菌、酵母、昆虫或哺乳动物细胞。

此外，本发明提供了包含含有上述氨基酸序列的衣壳蛋白或上述载体的细胞的转基因动物。优选地，动物是非人哺乳动物，特别是灵长类动物。或者，动物可以是啮齿动物，特别是小鼠；或者可以是犬，猫，羊或猪。

在一方面，本发明提供了包含具有本发明的氨基酸序列的衣壳蛋白或本发明的载体和一种或多种药学上可接受的赋形剂的药物组合物。一种或多种赋形剂包括载体、稀释剂和/或其它药用剂、药物制剂或佐剂等。

用本发明的序列实现的更高水平的基因转移代表了超出现有技术水平的进步。已经观察到效力的改善，其将允许使用更低载体剂量和以更低的成本的基因转移，从而提高安全性(特别是降低剂量依赖性的肝毒性)。因此，本发明的序列和载体可对例如先天性fvii缺乏症，戈谢病，otc缺乏症，法布里病，糖原贮积病，α-1-抗胰蛋白酶缺乏症，进行性家族性肝内胆汁淤积症，威尔逊氏症，克里格勒-纳贾尔综合征和肝细胞癌等的障碍具有临床适用性。

因此，本发明可以提供一种治疗上述一种或多种疾病的方法，其包括向患有所述疾病的患者施用治疗有效量的如上所述的载体。优选地，患者是人。

当所述疾病在上述方法中“得到治疗”时，这意味着所述疾病的一种或多种症状得到改善。这并不意味着所述疾病的症状被完全补救，使得它们不再存在于患者体内，尽管在某些方法中可能是这种情况。治疗方法导致所述疾病的一种或多种症状的比治疗前更不严重。

“治疗有效量”是指在剂量上和必要的时间段内有效实现所期望的治疗结果的量。

此外，本发明可以提供用于治疗的如上所述的衣壳蛋白或如上所述的载体，优选用于治疗上述疾病之一。

此外，本发明可以提供如上所述的衣壳蛋白或如上所述的载体在制备用于治疗上述疾病之一的药物中的用途。

在以上说明书中，术语“同一性”用于指两个序列的相似性。为了本发明的目的，这里定义为了确定两个氨基酸序列的同一性百分比，为了最佳比较的目的对齐序列(例如，可以在氨基酸序列中引入缺口以获得与第二氨基酸序列的最佳比对)。然后比较氨基酸残基。当第一序列中的位置被与第二个序列中相应位置的相同的氨基酸或氨基酸残基占据时，则该位置处的分子是相同的。两个序列之间的同一性百分比是序列共有的相同位置的数目的函数(即，同一性百分比＝相同位置的数量/位置总数(即重叠位置)×100)。优选地，两个序列的长度相同。

可以在被比较的两个序列的整个长度上进行序列比较，或者在两个序列的片段上进行序列比较。通常，比较将在被比较的两个序列的全长上进行。然而，序列同一性可以在例如约二十，约五十，约一百，约二百，约五百，约1000或约2000或更多个连续氨基酸残基的区域上进行。

本领域技术人员将意识到几个不同的计算机程序可用于确定两个序列之间的同源性或同一性的事实。在优选实施方案中，使用软件包clonemanagerprofessional版本9(优选版本9.4)分析两个序列之间的同一性。该分析工具由sci-edsoftware(scientific&educationalsoftware，11010lakegroveblvd，ste100，pmb122，morrisville，nc27560，usa-http://www.scied.com/index.htm)生成。用于比较序列的设置优选如下：比对：全局dna比对；参数：两条链；评分矩阵：线性(不匹配2，opengap4，extgap1)。或者，也可以使用相同的软件和本地设置使用如fastscan-maxscore和fastscanmaxqual的方法。

其他方法也可用于确定序列同一性。例如，可以使用已经并入到accelrysgcg软件包中的gap程序中的needleman和wunsch(1970)算法(可从http://www.accelrys.com/products/gcg/获得)，使用blosum62矩阵或pam250矩阵，缺口权重为16、14、12、10、8、6或4，长度权重为1、2、3、4、5或6来确定两个氨基酸或核酸序列之间的同一性百分比。

本发明文件中引用的所有专利和文献通过引用整体并入本文。

本领域技术人员将理解，本发明的所有方面，无论它们是否涉及例如氨基酸、病毒颗粒、载体、宿主细胞或用途，均可同样适用于本发明的所有其它方面。特别地，治疗方法例如载体的施用的方面可以比本发明的一些其它方面更详细地描述，例如涉及载体在治疗中的用途。然而，本领域技术人员将会理解，对于本发明的特定方面给出了更详细的信息，该信息通常同样适用于本发明的其它方面。此外，本领域技术人员还将理解，与治疗方法相关的描述同样适用于载体在治疗中的用途。

发明详述

现在将仅通过参考附图的方式详细描述本发明，其中：

图1显示了杂合aav衣壳的评估。a部分显示了杂合衣壳的示意图，b部分示出了huh7细胞中两种不同moi(感染复数)下不同杂合衣壳的体外转移效率。

图2显示细胞转导实验的结果。图2a显示用aav8、aav5、aav-rh10、aav-lk03和aav突变体c载体转导huh7细胞的结果。图2b显示了用aav8、aav5、aav-lk03和aav突变体c载体转导贴壁hepg2细胞的结果。

图3a显示用aav8、aav5、aav-rh10和aav突变体c载体转导原代肝细胞的流式细胞术分析。图3b是转导的肝细胞的荧光显微镜图像。

图4a显示了在1×10⁴或1×10⁵的moi下用含有gfp基因的aav8和aav突变体c载体转导hepg2细胞的3d培养物获得的485nm/535nm处的gfp激发/发射。图4b是转导的3dhepg2细胞的荧光显微镜图像(5倍物镜，gfp曝光时间恒定[300ms])。

图5显示了作为elisa免疫吸附法的结果的针对严重血友病患者中aav载体的抗体的流行率。

本发明人的研究计划旨在建立具有相对高转导率和最小副作用的aav载体。结果，本发明人开发了新的杂合衣壳和载体。

实施例1

通过经验交换来自4种不同aav衣壳的各种区域产生新的杂合衣壳：(1)aav8，(2)aav5，(3)aav3b和(4)aav-lk03(参见图1)。已经报道后者比目前可获得的天然存在的aav衣壳更有效地转导人肝细胞。值得注意的是，lk03具有与aav3b相比>95％的氨基酸序列同源性。本发明的衣壳蛋白是通过从血清型1-rh10中选择野生型aav衣壳的基序而开发的合成衣壳。用来自aav8和aav5的相应区域替换lk03的vp2和vp3区域，分别产生突变体a(seqidno：1)(muta)和b(seqidno：2)(mutb)。在突变体c(seqidno：3)(mutc)中，将包含aav8vp1区的146个氨基酸区克隆在aav3b衣壳的vp2和vp3结构域的上游。类似地，在突变体d(seqidno：4)(mutd)中，将aav5-vp1区域克隆在aav3bvp2和vp3区域的上游。在突变体e(seqidno：5)(mute)中，将aav8的结构域v-i、v-ii和v-ix替换为来自aav3b的同源物。在突变体f(seqidno：6)(mutf)中，将含有aav3b的肝细胞生长因子受体结合位点的262个氨基酸区域克隆到aav8衣壳的相应区域。

合成衣壳特别是突变体c和突变体d的vp1、vp2和vp3的比例与对aav2、3b、5或8观察到的相似。突变体c和突变体d二者对于人肝细胞具有强的向性(tropism)，当与包括aav5和aav8的野生型aav衣壳相比时，它们能够介导更高水平的基因转移到这些细胞中。

通过重叠pcr组装或通过基因合成(genscript；mutc、mute和f)产生衣壳序列。将衣壳序列克隆到含有经修饰的起始密码子(atg至acg)的aav2的rep78编码序列的aav辅助质粒中。通过用pcmv-egfp、prep2cap和腺病毒辅助质粒phgti的标准三重质粒转染hek293细胞制备载体储备物。通过用碘克沙醇的密度梯度离心纯化载体。用特异性针对egfp的引物通过qpcr滴定载体基因组。杂合aav载体的产量与先前用aav8观察到的相当。使用huh7肝细胞癌细胞系在1×10⁴和1×10⁵的感染复数(moi)下在体外评价这些杂合衣壳的基因转移效率。通过流式细胞术检测报告基因egfp，确定基因转移水平。基因转移的最高水平是通过突变体c达到aav8的至少5倍的水平(图1b)。该突变体介导了与aav3b和新的血清型lk03相似的基因转移水平。突变体d的基因转移效率低于突变体c的基因转移效率，但是亲本血清型aav5的基因转移效率的3倍。与野生型aav8和aav5所观察到的具有相似水平的gfp阳性细胞的突变体c相比，突变体e和f具有低得多的基因转移水平。

实施例2

重组aav载体的产生。aav载体的制备是通过共同转染贴壁hek293t细胞和包含其中egfp报告基因在cmv启动子控制下的载体质粒、腺病毒辅助质粒和包装质粒组成的质粒的组合，其中各自aavcap基因在内源性启动子控制下的aav2rep基因的下游。使用avb柱色谱纯化载体。所有载体的滴定通过qpcr测定以及碱性凝胶分析进行。

体外转导。以单层生长的肝癌细胞系用aav在各种moi下转导，然后在基因转移后小时使用流式细胞术评估转导效率。

原代人肝细胞获自life-technologies并根据供应商的说明书维持培养。然后将它们暴露于在cmv启动子下编码gfp的aav。3-4天后使用流式细胞术或直接荧光显微镜评估基因转移效率。

将包封的hepg2细胞的3d培养物暴露于不同的moi的aav，然后通过使用酶标仪或通过直接荧光显微镜定量绿色荧光进行评估。

抗aav抗体滴度。使用免疫吸附法评估从严重血友病患者获得的血浆样品中的抗aav抗体滴度。抗aav抗体滴度表示为终点滴度(相对单位/ml)，定义为吸光度值等于平均吸光度背景值的五倍的内推(interpolated)稀释度的倒数。

与人肝细胞系和原代人肝细胞中其他血清型相比，aav突变体c载体的转导效率

在重点研究中，比较了huh7(肝癌细胞系)和hepg2细胞株(肝癌细胞系)中aav8、aav5、aav-rh10、aav-lk03和aavmutc的体外转导效率。所有载体含有在巨细胞病毒(cmv)启动子控制下的绿色荧光蛋白(gfp)报告基因。

aav8、aav5和aav-rh10载体在转染huh7细胞方面效率较低，平均gfp表达范围为15％至26％。相比之下，用aav-lk03观察到更高水平的基因转移，对于用这些衣壳蛋白假型化的载体，mutc的转导效率接近70％(图2a)。mutc和aav8基因转移效率差异非常显著(p＝0.0012)。

当用aavmutc和aav-lk03转导hepg2细胞时，在hepg2细胞系中获得了类似的结果(图2b)，其基因转移效率为aav8和aav5的几乎10倍，与moi无关(p＝<0.05)。

接下来，评估了衍生自3个不同供体的原代人肝细胞的基因转移效率。所有供体均为男性，其中2名起源于白种人，1名起源于非裔加勒比人。这些供体的年龄从21-52岁不等。使用在cmv启动子控制下编码gfp的载体将原代肝细胞以10⁶的moi暴露于aav载体。转染效率通过荧光显微镜或流式细胞术在基因转移后4-5天进行评估。如图3所示，aavmutc(32.06±4％)达到的基因转移效率是aav8(7.3±7％)的4倍以上。原代人肝细胞在aavmutc和aav8组之间基因转移效率差异非常显著(p＝0.0015，使用1个样本t检验)。直接荧光图像分析验证了流式细胞术数据显示在用aavmutc转导的细胞中gfp表达水平高得多(图3b)。

接下来，本发明人使用jetcutter将aav介导的基因转移到包封在藻酸盐中的hepg2细胞的3d培养物中，以产生约500μm的含有近似浓度为1.7m/ml珠粒的hepg2细胞的球形珠。该模型的强度在于包封于珠内的细胞增殖以形成具有良好细胞与细胞接触和细胞功能的紧密细胞类球体(aels)。与单层培养相比，aels表现出更好的生长和上调的肝脏特异性功能，典型的细胞结构表现出桥粒、紧密连接和微绒毛、高质量的内质网和线粒体，以及产生与正常肝脏相似的细胞外基质。

使用含有cmvgfp表达盒的载体，以1×10⁴或1×10⁵的moi，用aav8或aavmutc转导3d珠培养物。如前所述，通过使用酶标仪(图4a)或直接荧光显微镜(图4b)定量绿色荧光来确定转导效率。与用aav8转导的珠中的gfp表达相比，用aavmutc观察到3d类球体的3-5倍的基因转移效率。使用直接荧光显微镜也注意到基因转移效率的差异。

对预先存在的对严重血友病患者中突变体c的抗体进行评估

筛选来自未经选择的严重血友病患者的血浆样品，以使用elisa免疫吸附法评估预先存在的针对aavmutc的抗体的流行率。63％的患者对aavmutc没有显示可检测的抗体。aav8和aav-lk03的相应水平为51％。因此，这表明较少的严重血友病患者具有针对aavmutc的抗体。

序列表

<110>ucl商业有限公司

<120>衣壳

<130>p531277pct

<150>gb1508026.0

<151>2015-05-11

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<213>合成蛋白

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