包括使用修饰的单糖化合物的用于特异性标记活微生物的方法与流程

术语“活微生物”包括能够在培养条件下繁殖的任何单细胞生物体，更特别地包括原核微生物和单细胞真核微生物。

原核微生物包括细菌(也称为真细菌)以及古菌(也称为古细菌)。

细菌包括革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌以及既不是革兰氏阴性也不是革兰氏阳性的细菌。

单细胞真核微生物包括单细胞真菌(尤其包括酵母)、变形虫和单细胞原生生物。

本发明更特别地提供允许标记包括细菌以及单细胞真菌和变形虫的微生物的方法。

本文术语“包膜”包括在微生物表面的任何的壁、层或膜，尤其是微生物的细胞壁，包膜更特别地包括细菌的内部质膜和肽聚糖层以及革兰氏阴性菌的外膜。

WO 2013/107759公开了标记活菌(更特别地是革兰氏阴性菌)的方法。所述方法本质上在于通过同化作用将修饰的酮糖酸型的内源性单糖化合物的类似物合并入所述细菌的膜中，以使其带有所谓的第一反应化学官能团，如叠氮基(-N₃)或炔基(-C≡CH)，从而使得该第一反应基团能够尤其通过所谓的点击化学反应(click chemistry reaction)与带有互补反应基团的分子反应。

更特别地，在WO 2013/107759中已公开，这样的包含酮糖酸或酮糖酸盐残基的修饰的内源性糖的类似物是特别有利的，因为这样的残基可见于细菌细胞膜的聚糖中，尤其是所有革兰氏阴性菌的LPS中，而且，它们能够以相同的形式被直接同化，其中它们会被合并入所述革兰氏阴性菌的LPS的聚糖中。

酮糖酸(也称为酮糖首酸(ketoaldonic acids)，或首酮糖酸(aldulosonic acids))是酮糖家族的单糖，其在C-2上存在酮官能团，并在C-1上存在羧酸。辛酮糖酸和壬酮糖酸见于多种天然聚糖中，包括不同形式的细菌聚糖(尤其是LPS、荚膜多糖、糖蛋白)中。导致这些聚糖细化(elaboration)的生物合成通路通常涉及作为中间体的游离酮糖酸，其然后以CMP-糖供体的形式被直接激活。所有革兰氏阴性菌的LPS都包含所述酮糖酸盐残基。

更准确地，WO 2013/107759中公开的方法是用于在包含细菌的样品中特异性标记给定类别的细菌的活菌的方法，所述方法包括以下步骤：

a)将所述样品的所述细菌和至少一种单糖化合物的类似物孵育，所述单糖是该给定类别的细菌的外膜聚糖的内源性单糖残基，所述内源性单糖残基包含酮糖酸或酮糖酸盐残基，所述单糖化合物的类似物是在给定位置被第一反应化学基团取代的修饰的单糖，所述第一反应化学基团能够与标记分子的第二反应基团反应，和

b)将所述细菌与包含所述第二反应基团的所述标记分子接触，以产生合并入所述活菌的所述外膜聚糖中的所述类似物残基的所述第一反应基团与所述标记分子的所述第二反应基团的反应。

特别地，在WO 2013/107759中，所述单糖类似物是具有下式(I”)之一的被取代的酮糖酸或其酮糖酸盐：

其中

-A、B和C可以独立地是H、OH、NH₂，OH和NH₂被或不被其保护基取代，且

-D是C₂至C₄的烷基链，且

-A、B、C或D基团中的至少一个被所述第一反应基团取代。

在WO 2013/107759中，在步骤a)中与活菌孵育然后在被细菌同化后合并入其外膜中的所述单糖类似物除了仅通过被所述第一反应基团取代而被修饰以外，可以与合并入外膜的聚糖链中的内源性单糖相同。

本发明的目的在于发现在单细胞微生物的广泛范围内，尤其是细菌的更广泛范围内和尤其是革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌以及单细胞真核微生物(诸如单细胞真菌、变形虫和单细胞原生生物)的广泛范围内，能够被同化的其他单糖化合物，以及呈现就所涉及的微生物类别而言它们的合并特异性方面的有利的和不同的性质。

更准确地，本发明提供在包含微生物的样品中特异性标记活微生物的方法，所述方法包括以下步骤：

a)将所述样品的所述微生物与至少一种修饰的单糖化合物孵育，所述单糖化合物包含能够与第二反应基团化学反应的第一反应化学基团，以使带有所述第一反应基团的残基被合并入所述活微生物中，优选在所述微生物的表面，尤其是合并入所述微生物的包膜中，和

b)将合并入所述活微生物中的所述残基与包含所述第二反应基团的标记分子接触，以产生合并入所述活微生物中的所述残基的所述第一反应基团与所述标记分子的所述第二反应基团的化学反应，导致共价连接，

其特征在于所述修饰的单糖化合物具有下式(I')，或其盐：

-X可以是O、NH或S，优选O和NH，且

-R1和R2可以独立地是H、OH、NH₂，OH和NH₂被或不被其保护基取代，优选被烷基、羟基烷基、酰基、甲酰基或亚胺酰基取代，且

-R3是H或C₁至C₄的烷基链，每个碳被或不被OH或NH₂取代，所述OH或NH₂被或不被其保护基取代，优选被烷基、羟基烷基、酰基、甲酰基或亚胺酰基取代，且

-X、R1、R2和R3基团中的至少一个，优选R3，被所述第一反应基团Ra取代。

因此，与WO 2013/107759中相平衡的式I”化合物和对应的式II相反，上述定义的式I'化合物不包含在式I'环的C-1位置的羧酸基团(-CO2H)。

这样的式(I')化合物可以被广泛范围类别的活微生物同化，尤其是包括单细胞原核微生物(包括古菌和细菌)以及单细胞真核生物体(更特别地包括单细胞真菌(包括interalia酵母)、变形虫和单细胞原生生物)。

根据本发明，带有所述第一反应基团的所述修饰的单糖被微生物同化以合并入所述残基的准确机制并不完全确定。

然而，看起来所述单糖化合物可以是不同于所述微生物的内源性单糖残基，尤其不同于所述微生物包膜的内源性单糖残基，并且更特别地，在革兰氏阴性菌的情况下，不同于这样的细菌外膜聚糖的内源性单糖残基，诸如细菌的LPS或荚膜多糖(CPS)，然而其能够穿透并被合并入所述微生物中。

表述“内源性单糖残基”的意思是天然存在于所述微生物中的残基，尤其是存在于所述微生物的包膜(更特别地是所述细菌的包膜)中的残基。

根据本发明，所述被所述第一反应基团修饰的所述单糖化合物可包括在所述微生物(尤其是在所述微生物的包膜中，更特别地是在所述细菌的包膜)中的其生物合成通路中的内源性单糖前体类似物。

更特别地，本发明的单糖化合物的其上被所述第一反应基团取代的部分不同于合并入所述微生物中的内源性单糖残基，尤其不同于合并入所述细菌包膜聚糖的内源性单糖残基，但是在合并入所述细菌包膜聚糖的修饰的单糖残基中它可被代谢，所述单糖被所述第一反应基团修饰。

更特别地，在本发明的方法中，所述修饰的单糖化合物可以是WO 2013/107759中公开并要求保护的上述式(I')的细菌的修饰的内源性单糖的前体的类似物。本发明的化合物可以在孵育步骤a)期间被代谢和转化，以被所述细菌同化，可能合并入所述细菌的包膜聚糖中，即作为这样的细菌包膜聚糖的修饰的单糖残基被合并，即其中被修饰的单糖残基带有所述第一反应基团。

更特别地，所述合并入的残基可以是单糖残基。然而，可选地，可能所述修饰的单糖化合物可在分子中被转化、代谢或降解，产生不是合并入所述微生物的单糖残基的所述残基，或产生所述残基的前体。

呋喃糖环(furanosic cycle)(I')可以与以下吡喃糖(pyranosic)化合物(II')部分地相平衡，但实践中所述反应基团Ra阻止吡喃糖环的形成：

其中在化合物(I')和(II')中，X、R1、R2和R3是如上定义的，Y＝O或NH且R4是H或C₁至C₃的烷基链，以使R3＝CHYHR4，每个碳被或不被OH或NH₂取代，所述OH或NH₂被或不被其保护基取代，优选被烷基、羟基烷基、酰基、甲酰基或亚胺酰基取代。

更特别地，在式(I')化合物中，当R3是C₁至C₄的烷基链时，R3不是CHYHR4，因此化合物(I')不与(II')相平衡。

优选地，所述修饰的单糖化合物是具有式(I)的立体异构体或其盐

优选地，所述修饰的单糖化合物是具有式(I)或(I')的化合物或其盐，其中：

-X是O，且

-R1是H、OH、NH₂，OH和NH₂被或不被所述保护基取代，且

-R2是H、OH、NH₂，OH和NH₂被或不被所述保护基取代，且；

-至少R1、R2或R3被所述第一反应基团Ra取代。

更特别地，所述修饰的单糖化合物是具有下式的化合物或其盐，其中：

-R1和R2是OH，OH被或不被保护基取代，且

-R3是-CH₃、-CH₂OH或-CH₂NH₂，优选-CH₃或-CH₂NH₂，这些基团被所述第一反应基团Ra取代。

更优选地，所述修饰的单糖化合物是具有以下立体异构体式(Ia)的化合物(下文称为“Ara-N₃”)或其盐，其中：

更特别地，对于OH的保护基优选可以是烷基、羟基烷基、酰基或甲酰基。

更特别地，对于NH₂的保护基可以选自烷基、羟基烷基、酰基、甲酰基或亚胺酰基。

NH₂可被一个或两个保护基保护，尤其是一个CH₃基团和一个烷基、羟基烷基、酰基、甲酰基或亚胺酰基，尤其是乙酰基(Ac)、亚氨代乙酰基(Am)、N-甲基-亚氨代乙酰基、N,N-二甲基-亚氨代乙酰基、甲酰基(Fo)或羟基丁酰基。

所述修饰的单糖化合物(Ia)的所述单糖残基是天然前体阿拉伯糖5-P(A5P)的阿拉伯糖类似物，如WO 2013/107759图1B的通路所示的，在许多细菌中后者(A5P)是称为Kdo(I-1')的其生物合成通路中的内源性单糖残基的前体。在细菌的Kdo生物合成通路(其中阿拉伯糖-5-P被转化成Kdo-8-P，Kdo-8-P变成Kdo)中，Kdo-8-磷酸盐(Kdo-8-P)合成酶将阿拉伯糖-5-磷酸盐转化为Kdo-8-P，Kdo-8-P磷酸酶将Kdo-8-P的OPO₃^2-基团转化为羟基(OH)以产生Kdo。

因此有可能化合物(Ia)可以被转化为下式(I-1)的修饰的内源性Kdo-N₃：

更通常地，式(I)和(I')化合物可以是如WO 2013/107759中公开的细菌外膜的式(I”)内源性化合物的前体的类似物：

根据化学式的常规表示，以上各种环的C-1至C-n位置的碳原子和结合这些碳原子的取代基H是不表示的。

所述第一反应基团和第二反应基团之间的所述化学反应导致共价连接，其在一些实例中可以是与配体配位的金属络合物中的共价配位连接。

优选地，所述第一反应基团Ra选自叠氮基(-N₃)或带有叠氮基(-N₃)的基团和炔基(-C≡C-)或带有炔基(-C≡C-)的基团，所述第一反应基团优选是叠氮基，并且所述第二反应基团选自炔基和叠氮基或分别带有炔基和叠氮基的基团，所述第二反应基团优选是炔基，并且通过进行叠氮炔烃环加成反应进行所述叠氮基反应基团与所述炔基反应基团的反应。

更优选地，Ra是-N₃或-C≡CH，优选-N₃。

式(I)和(I')化合物可用于标记活微生物，尤其包括单细胞原核微生物(包括古菌和细菌)以及单细胞真核微生物(更特别地包括单细胞真菌(尤其包括酵母)和单细胞原生生物)。

更特别地，式(I)和(I')化合物可用于标记所有种类的细菌，包括革兰氏阴性菌或革兰氏阳性菌以及单细胞真菌。

更特别地，式(I)和(I')化合物可用于标记革兰氏阴性菌以及革兰氏阳性菌，其可尤其选自以下细菌属，例如：

a)革兰氏阴性菌：不动杆菌属(Acinetobacter)、拟杆菌属(Bacteroides)、巴通体属(Bartonella)、鲍特菌属(Bordetella)、短螺菌属(Brachyspira)、布鲁氏菌属(Brucella)、伯克霍尔德菌属(Burkholderia)、嗜衣体属(Chlamydophila)、柯克斯体属(Coxiella)、金黄杆菌属(Chryseobacterium)、阪崎肠杆菌属(Cronobacter)、梭菌属(Clostridium)、弯曲菌属(Campylobacter)、埃希菌属(Escherichia)、弗朗西丝菌属(Francisella)、心杆菌属(Cardiobacterium)、爱德华菌属(Edwardsiella)、埃立克体属(Ehrlichia)、艾肯菌属(Eikenella)、伊丽莎白菌属(Elizabethkingia)、肠杆菌属(Enterobacter)、梭形杆菌属(Fusobacterium)、嗜血杆菌属(Haemophilus)、螺杆菌属(Helicobacter)、克雷伯菌属(Klebsiella)、军团菌属(Legionella)、钩端螺旋体属(Leptospira)、摩根菌属(Morganella)、粘球菌属(Myxococcus)、奈瑟菌属(Neisseria)、新立克次体属(Neorickettsia)、巴斯德菌属(Pasteurella)、邻单胞菌属(Plesiomonas)、卟啉单胞菌属(Porphyromonas)、普氏菌属(Prevotella)、变形杆菌属(Proteus)、普鲁威登菌属(Providencia)、假交替单胞菌属(Pseudoalteromonas)、假单胞菌属(Pseudomonas)、立克次氏体属(Rickettsia)、红环菌属(Rhodocycclus)、沙门菌属(Salmonella)、沙雷菌属(Serratia)、中华根瘤菌属(Sinorhizobium)、志贺菌属(Shigella)、希瓦氏菌属(Schewanella)、Shewamma、窄食单胞菌(Stenotrophomonas)、耶尔森菌属(Yersinia)、链杆菌属(Streptobacillus)、黄杆菌属(Tenacibaculum)、密螺旋体属(Treponema)、弧菌属(Vibrio)，和

b)革兰氏阳性菌：芽孢杆菌属(Bacillus)、考克氏菌属(Kocuria)、肠球菌属(Enterococcus)、乳球菌属(Lactococcus)、乳杆菌属(Lactobacillus)、李斯特菌属(Listeria)、微球菌属(Micrococcus)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、链球菌属(Streptococcus)。

在可同化式(I)和(I')(优选(Ia))化合物的革兰氏阴性菌中，可引用以下菌种：鲍曼不动杆菌(Acinetobacter baumannii)、阪崎肠杆菌(Cronobacter sakazakii)、大肠杆菌(Escherichia coli)、肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)、嗜肺军团菌(Legionella pneumophila)、淋病奈瑟球菌(Neisseria gonorrhoeae)、脑膜炎奈瑟球菌(Neisseria meningitidis)、奇异变形杆菌(Proteus mirabilis)、斯氏普鲁威登菌(Providentia stuartii)、荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)、鼠伤寒沙门菌(Salmonella typhimurium)、粘质沙雷菌(Serratia marcescens)、嗜麦芽窄食单胞菌(Stenotrophomonas maltophilia)、霍乱弧菌(Vibrio cholerae)。

更特别地，在可同化式(I)和(I')(优选(Ia))化合物的革兰氏阳性菌中，可引用以下菌种：枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)、耐久肠球菌(Enterococcus durans)、粪肠球菌(Enterococcus faecalis)、单核细胞性李斯特菌(Listeria monocytogenes)、藤黄微球菌(Micrococcus luteus)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、金黄色葡萄球菌金黄亚种(Staphylococcus aureus aureus)、表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermis)、腐生葡萄球菌(Staphylococcus saprophyticus)、无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)。

更特别地，式(I)和(I')化合物可用于标记真菌，其尤其可选自以下属，例如：曲霉菌属(Aspergillus)、假丝酵母菌属(Candida)、镰孢菌属(Fusarium)和地霉菌属(Geotrichum)和棘阿米巴(Acanthamoebae)属的变形虫。

更特别地，所述式(I)和(I')化合物(优选(Ia))可被同化，尤其在以下真菌和酵母的种中：黑曲霉(Aspergillus niger)、白假丝酵母菌(Candida albicans)和白地霉(Geotrichum candidum)和变形虫卡氏棘阿米巴(Acanthamoebae castellanii)的以下种。

在以上微生物中，以下细菌不同化WO 2013/107759中的Kdo-N₃(I-1')：枯草芽孢杆菌、淋病奈瑟球菌、粪肠球菌、单核细胞性李斯特菌、藤黄微球菌、金黄色葡萄球菌、金黄色葡萄球菌金黄亚体、表皮葡萄球菌，以及以下真菌：黑曲霉、白假丝酵母菌、镰孢菌、白地霉和变形虫卡氏棘阿米巴。

更特别地，步骤a)的孵育时间会取决于微生物的倍增时间，更特别地孵育时间是从1小时至72小时，更特别地从1小时至36小时，并且修饰的单糖化合物的浓度是从10^-5M至1M，用于检测微生物的浓度优选不超过10¹¹细胞/ml，更特别地不超过10⁹细胞/ml。

鉴于大多数卫生法规涉及能够繁殖(尤其能够在固体生长介质上或液体生长介质中繁殖)的细菌的数目，有利地，本发明更特别地提供用于特异性标记能够繁殖的微生物的方法，其中在培养基中(液体介质中)或(固体介质上)孵育所述微生物，所述微生物能够在其中繁殖。

严重的病原体隐藏在以上提及的微生物中，快速标记和/或检测活微生物代表主要的卫生挑战。本发明的修饰的单糖被微生物快速同化，并且能够对其快速标记和检测，对于活的野生型微生物，整个过程花费少于一天。常见的活微生物的检测通常需要2天到一个月以上(取决于微生物菌株)，相比于此，本方法是非常快速的。

有利地，本发明包括进一步的步骤(c)检测活微生物，以检测所述微生物是否包含结合于所述活微生物的所述标记分子，和/或将带有所述标记分子的所述活微生物固定到固体基质上，其中所述标记分子是包含可检测物质的分子，或能够与可检测物质反应或结合的分子，或所述标记分子是带有所述第二反应基团的第一分子，所述第一分子能够与第二分子和/或固体基质反应或结合，优选所述第二分子包含可检测物质和/或所述第二分子结合于或能够结合于所述固体基质。

因此，本发明能够(a)标记活微生物以及(b)计数或检测活微生物以及(c)浓缩和/或分离被固定到固体支持物上的活微生物；尤其是使用由带有所述第二反应基团的磁珠构成的固体支持物。

更特别地，所述标记分子是包含可检测物质的可检测分子，所述方法包括检测活微生物以检测所述微生物是否包含结合于所述微生物的所述可检测分子的步骤c)。

所述检测步骤c)可在液体介质中或固体基质上进行。

更特别地，所述标记分子可以是可检测分子，即为可检测物质或带有可检测物质的分子，即为能够用本领域技术人员已知的技术(诸如荧光法、比色法、发光法)检测的物质。

更特别地，所述标记分子是带有所述第二反应基团的第一配体或第一结合蛋白，并且在步骤c)中偶联至所述第一配体或第一结合蛋白的所述活微生物通过所述第一配体或第一结合蛋白与第二配体或第二结合蛋白接触而被检测和/或被固定，所述第二配体或第二结合蛋白与所述第一配体或第一结合蛋白特异性反应或结合。

更特别地，所述标记分子是带有所述第二反应基团的第一配体，优选生物素，并且在步骤c)中偶联至所述第一配体的所述活微生物通过所述微生物与特异于所述第一配体的抗体或另一种蛋白质的反应而被检测，所述抗体带有可检测物质，优选荧光染料或发光分子或酶。

本发明还提供用于进行本发明方法的试剂盒，其包含：

-式(I)的所述修饰的单糖化合物，和

-所述标记分子，其包含能够与所述第一反应基团反应的所述第二反应基团，和

-如果需要，反应物，其用于产生所述第一反应基团与所述标记分子的所述第二反应基团的反应，和

-优选地，允许所述微生物生长的培养基或孵育介质，优选特异于所述微生物的生长。

优选地，所述第一反应基团Ra选自叠氮基(-N₃)或带有叠氮基(-N₃)的基团和炔基(-C≡C-)或带有炔基(-C≡C-)的基团，并且所述第二反应基团Rb选自炔基(-C≡C-)和叠氮基(-N₃)或分别带有炔基(-C≡C-)和叠氮基(-N₃)的基团，并且通过进行叠氮炔烃环加成反应进行所述叠氮基反应基团与所述炔基(-C≡C-)的反应。

叠氮炔烃环加成反应是公知的在铜催化剂存在或不存在下的所谓的点击化学反应，其中叠氮基与炔基反应得到三唑。更特别地，可以在三-三唑基配体，优选TGTA的存在下，在铜催化条件下进行反应。更特别地，可检测分子是带有末端炔基的荧光染料。

更特别地，可以在三-三唑配体诸如TGTA(三((1-(β-D-吡喃葡萄糖基)-1H-[1,2,3]-三唑-4-基)甲基)胺)或TBTA(三-[(1-苄基-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲基]胺)和带有末端炔基的Alexa标记分子的存在下，使用催化剂进行反应，从而进行所述荧光染料与所述式(I)的类似物化合物的叠氮炔烃环加成反应。

其他合适的常用配体是：三(3-羟丙基三唑基甲基)胺(THPTA)、2-(4-((双((1-叔-丁基-1H-1,2,3-三唑-4基)甲基)氨基)甲基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)乙磺酸(BTTES)、三((1-((O-乙基)羧甲基)-(1,2,3-三唑-4-基))甲基)胺、红菲绕啉二磺酸盐(bathophenanthroline disulfonate)或三(2-苯并咪唑基甲基)胺。

可选地，如果使用张力炔(strained alkyne)，如氮杂二苯并环辛炔(azadibenzocyclooctyne)(ADIBO、DIBAC或DBCO)或四甲氧基二苯并环辛炔(tetramethoxydibenzocyclooctyne)(TMDIBO)，可以在铜不存在下进行叠氮炔烃环加成反应。

常用于无铜反应的其他合适的张力炔包括：环辛炔(OCT)、无芳基环辛炔(ALO)、单氟环辛炔(MOFO)、二氟环辛炔(DIFO)、二苯并环辛炔(DIBO)、二甲氧基氮杂环辛炔(DIMAC)、双芳基氮杂环辛炔铜(BARAC)、双环壬炔(BCN)、tetramethylthiepinium(TMTI、TMTH)、二氟苯并环辛炔(DIFBO)、氧杂-二苯并环辛炔(ODIBO)、羧甲基单苯并环辛炔(COMBO)或苯并环壬炔。

其他反应基团和其他反应可以是如：施陶丁格连接(Staudinger Ligation)(第一反应基团＝叠氮，并且第二反应基团＝膦)、无铜点击化学(第一反应基团＝叠氮，并且第二反应基团＝受限炔(constrained alkyne)(环内炔))、羰基缩合(第一反应基团＝醛或酮，并且第二反应基团＝酰肼或羟基胺)、硫醇-烯点击化学(第一反应基团＝硫醇，并且第二反应基团＝烯烃)、腈-氧化物-烯点击化学(第一反应基团＝腈氧化物或醛、肟、或羟肟氯(hydroxymoyl chloride)或氯肟(chlororoxime)，并且第二反应基团＝烯烃或炔烃)、腈亚胺-烯点击化学(第一反应基团＝腈亚胺或醛、腙、或腙酰氯(hydrazonoyl chloride)或氯腙(chlorohydrazone)，并且第二反应基团＝烯烃或炔烃)、逆电子需求的狄尔斯-阿尔德连接(inverse electron demand Diels-Alder ligation)(第一反应基团＝烯烃，并且第二反应基团＝四嗪)、异腈-四嗪点击化学(第一反应基团＝异腈，并且第二反应基团＝四嗪)、Suzuki-Miyaura偶联(第一反应基团＝芳卤，并且第二反应基团＝芳基硼酸酯)、His-tag(第一反应基团＝寡-组氨酸，并且第二反应基团＝镍-复合物或镍配体)。

在以上提及的参与反应的基团列表中，所述第一反应基团和所述第二反应基团可以交换。全部以上提及的化学反应都导致共价连接。

可以在微生物样品与两种所述不同的修饰的单糖化合物和两种不同的可检测分子的孵育中获得其他和更高的检测特异性。

在本发明方法的另一个特别的实施方案中，在膜过滤器上进行所述步骤a)的孵育和步骤b)的反应，以使得经繁殖的源自相同原始微生物的培养的微生物被集合到一起，并且可以用显微镜观察，并且可以通过用所述显微镜观察检测所述可检测分子。因此，可以由此定量可培养的微生物的数目。

该实施方案使得能够在所述修饰的单糖的同化之前在所述膜过滤器(如聚酯膜)上过滤受试样品，以避免由于同化期间的可能生长而高估活的微生物。事实上，当固定于这样的膜的顶部的细胞开始生长时，它们在一起并形成微菌落，由于来自于相同的单细胞，所述微菌落可以被容易地检测。因此，这使得能够通过计算可培养的微生物来计数。

本发明还提供用于进行本发明的方法的试剂盒，其进一步包含允许所述微生物生长的培养基或孵育介质。

优选地，所述培养基或孵育介质进一步包含增强和/或加快所述给定类别的微生物的生长速度和/或形成菌落的能力的试剂。更特别地，所述孵育介质包含至少一种抗氧化剂，诸如丙酮酸盐或过氧化氢酶。

更特别地，在一个实施方案中，所述试剂盒进一步包含：

-所述可检测分子或所述第二分子，其带有可检测物质，优选荧光染料或发光分子或酶，和/或

-固体基质，其带有能够与所述标记分子特异性反应或结合的所述第二分子。

更特别地，在一个实施方案中，本发明的试剂盒进一步包含：

-所述可检测分子，其包含能够与所述第一反应基团反应的所述第二反应基团，和

-固体介质，其允许在与所述修饰的单糖化合物、所述反应物和所述可检测分子孵育后，进行微生物的观察。

又更特别地，所述试剂盒包含：

-被所述第一反应基团取代的所述修饰的单糖化合物，所述第一反应基团包含叠氮基或炔基，和

-可检测分子的所述第二反应基团，其分别带有炔基或叠氮基，和

-可能地，包含铜催化剂和三-三唑基配体的所述反应物。

在第一个特别的实施方案中，所述标记分子可以是可检测分子，即为可检测物质或带有可检测物质的分子，即为能够被检测的物质诸如荧光染料或发光物质或酶诸如过氧化物酶，更特别地在与共反应物反应之后所述酶被检测。

在进一步的特别的实施方案中，为了分离和/或浓缩活微生物，当进行步骤b)时，可以将所述标记分子结合于固体基质。

在进一步的特别的实施方案中，所述标记分子是带有所述第二反应基团的第一配体或第一结合蛋白的分子，并且在步骤c)中偶联至所述第一配体或第一结合蛋白的所述活微生物，通过所述第一配体或第一结合蛋白与第二分子接触而被检测和/或被固定，所述第二分子是与所述第一配体或第一结合蛋白特异性反应或结合的第二配体或第二结合蛋白。

然后，有利地，所述第一或第二配体或结合蛋白可以与带有所述可检测物质诸如荧光染料或发光物质或酶如过氧化物酶的第三结合蛋白反应或结合，所述第三结合蛋白特异性结合于所述第一和/或第二配体或结合蛋白。通过所述第二配体或第二结合蛋白或第三结合蛋白检测所述可检测物质，能够放大所述可检测物质的信号。

更特别地，所述第一配体或第一结合蛋白可以是：

-生物素，则所述第二结合蛋白是亲和素或链霉亲和素，并且所述第三结合蛋白是抗生物素的抗体，或

-亲和素或链霉亲和素，则所述第二配体结合蛋白是生物素，并且所述第三结合蛋白是抗亲和素或抗链霉亲和素的抗体，或

-第一抗体，则所述第二结合蛋白是特异于所述第一抗体的第二抗体，并且所述第三结合蛋白是特异于所述第一抗体的第三抗体。

更特别地，所述标记分子是第一配体，优选生物素，其带有所述第二反应基团，并且在步骤c)中偶联至所述第一配体的所述活微生物通过所述微生物与特异于所述第一配体的抗体的反应而被检测，所述抗体带有可检测物质，优选荧光染料或发光分子或酶。

又更特别地，所述标记分子是第一配体，优选生物素，其带有所述第二反应基团，并且在步骤c)中，在通过细菌DNA酶扩增或通过所述细菌与第三结合蛋白(其与所述第一配体或第二结合蛋白特异性反应或结合)的反应而检测所述活微生物之前，偶联至所述第一结合蛋白的所述活微生物通过所述第一配体与固体基质(优选磁珠)的反应被固定，所述固体基质偶联至所述第二结合蛋白(优选亲和素或链霉亲和素)，所述第三结合蛋白带有可检测物质，优选荧光染料或发光分子或酶，所述第三结合蛋白优选是特异于所述第一配体或第一结合蛋白的抗体。

在一个实施方案中，更特别地，所述标记分子可以是带有第二反应基团的酶，诸如辣根过氧化物酶(HRP)或脲酶。

这样的实施方案，其中所述活微生物被固定于所述固体基质上，能够将样品浓缩为所述微生物，并且能够通过任何已知的方法定量所述活微生物，所述方法包括DNA酶扩增如PCR，尤其是实时PCR或涉及采用标记抗体的免疫反应的方法，如ELISA测试。

根据以下详细描述和说明性且非限制性的实施方案的实施例，本发明的其他特征和优点会更加明显。

实施例1：化合物(Ia)：Ara-N₃的合成

在该合成中使用了以下试剂和条件：(i)TsCl、吡啶。(ii)吡啶、Ac₂O。(iii)NaN₃、DMF。(iv)CH₃ONa、CH₃OH。

在Merck 60F₂₅₄上进行薄层色谱法，通过UV，和/或通过使用硫酸或KMnO₄或磷钼酸溶液炭化(charring)进行检测。使用硅胶60 40-63μm用于快速柱色谱法。

使用残留质子化溶剂作为内标，在Bruker Avance 300或500MHz光谱仪上采集NMR谱。以百万分之一(ppm)给出化学位移δ，并且偶合常数报道为赫兹(Hz)。裂分模式被定义为单峰(s)、双峰(d)、三重峰(t)、双重双峰(dd)、三重双峰(ddd)。不能解释或不能容易地观察的裂分模式被定义为多重峰(m)。

在Thermo Scientific TSQ或在Bruker micrOTOFq或在Waters LCT Premier XE(ToF)上采集质谱，检测模式为正电喷雾电离(ESI+)。

在Perkin Elmer Spectrum 100光谱仪上记录IR-FT谱。特征吸收以cm^-1报道。

使用Anton Paar MCP 300旋光仪在10cm的样品池中在20℃和589nm测量比旋度。

化合物(Ia)是以下路线1中的化合物(5)，路线1显示参与其合成步骤的各种化合物。

各步骤中的试剂和条件是：(i)TsCl(1.1当量)、吡啶(1.0M)，100℃->r.t.，18h。(ii)吡啶/Ac₂O(2:1,0.7M)，18h。(iii)NaN₃(2.0当量)、DMF(0.4M)，80℃，20h，15％经3步。(iv)CH₃ONa(0.1当量)、CH₃OH(0.2M)，r.t.，3h，99％。

1)5-叠氮基-5-脱氧-1,2,3-三-O-乙酰基-D-阿拉伯呋喃糖(4)的制备：

在吡啶(40mL)中将市售的D-阿拉伯糖(1)(6.00g,40mmol)在100℃加热2小时。使溶液冷却，进一步用甲苯磺酰氯(8.38g,44mmol,1.1当量)处理，并在室温下搅拌16小时(2)，不分离。然后加入醋酸酐(20mL)。通过TLC确定完全乙酰化后，蒸发溶剂，将残余痕量与甲苯共蒸发数次(3)，不分离。将残余物溶解在DMF(100mL)中，加入叠氮化钠(5.20g,80mmol,2.0当量)，将悬浮液在80℃加热20小时。用乙酸乙酯稀释并用水洗涤后，有机层经无水硫酸镁干燥并浓缩。残余物通过快速柱色谱法(石油醚/乙酸乙酯7:3)纯化。第一洗脱产物被确定是预期的5-叠氮基-1,2,3-三-O-乙酰基-D-阿拉伯呋喃糖(4)(1.83g,15％,α/β～2:1)。

¹H-NMR(360MHz,CDCl₃)δ(ppm):6.41(d,0.33H,J_1,2 3.5Hz,H-1β)；6.23(d,0.67H,J_1,2～1Hz,H-1α)；5.40-5.37(m,1.34H,H-2β,H-3β)；5.23(d,0.67H,J_1,2～1Hz,H-2α)；5.06(d,0.67H,J_3,4 4.6Hz,H-3α)；4.30(ddd,0.67H,H-4α)；4.16-4.10(m,0.33H,H-4β)；3.69(dd,0.67H,J_5a,5b 13.5,J_4,5a 3.1Hz,H-5aα)；3.61(dd,0.33H,J_5a,5b 13.1,J_4,5a 3.6Hz,H-5aβ)；3.51-3.43(m,1H,H-5bα,H-5bβ)；2.15,2.13,2.12,2.11,2.11,2.09(6s,18H,6CH₃CO)。

¹³C-NMR(62.5MHz,CDCl₃)δ(ppm):170.3,170.0,169.1(3C＝O)；99.2(C-1α)；93.5(C-1β)；84.1(C-4α)；80.8(C-4β)；80.6(C-3α)；77.4(C-2α)；75.1(C-2β)；74.8(C-3β)；53.0(C-5β)；51.3(C-5α)；20.9,20.6,20.3(3CH₃)。

LRMS(ESI+):[M+H]⁺324.0。

HRMS(ESI⁺):[M+H]⁺(C₁₁H₁₅N₃NaO₇)计算值m/z:324.0802,实测值:324.0802。

2)5-叠氮基-5-脱氧-D-阿拉伯呋喃糖(5)的制备：

然后将受保护的5-叠氮基-1,2,3-三-O-乙酰基-D-阿拉伯糖(4)溶解于无水甲醇(30mL)，用CH₃ONa的甲醇溶液(0.2mol.L^-1,3mL)处理并且在氩气氛下室温下搅拌3小时。中和(50(H⁺))后过滤，浓缩，获得99％产率的5-叠氮基-5-脱氧-D-阿拉伯呋喃糖(5)(1.03g)。

Rf(二氯甲烷/甲醇92:8):0.28。

IR(cm^-1):3367,2106,1281,1040。

HRMS(ESI⁺):[M+H-N₂]⁺(C₅H₁₀NO₄)计算值m/z:148.0604,实测值:148.0610。

α异头物(5α)：

¹H-NMR(500MHz,D₂O)δ(ppm):5.24(d,1H,J_1,2 2.9Hz,H-1)；4.17(ddd,1H,J_3,4 6.4,J_4,5b 5.8,J_4,5a 3.5Hz,H-4)；4.01(dd,1H,J_2,3 4.6,J_1,2 2.9Hz,H-2)；3.97(dd,1H,J_3,4 6.4,J_3,2 4.6Hz,H-3)；3.64(dd,1H,J_5a,5b 13.6,J_4,5a 3.5Hz,H-5a)；3.44(dd,1H,J_5a,5b 13.6,J_4,5b 5.8Hz,H-5b)。

¹³C-NMR(125MHz,D₂O)δ(ppm):101.0(C-1)；81.3(C-4)；81.2(C-2)；76.3(C-3)；51.5(C-5)。

β异头物(5β)：

¹H-NMR(500MHz,D₂O)δ(ppm):5.28(br d,1H,J_1,2 3.1Hz,H-1)；4.10-4.05(m,2H,H-2,H-3)；3.89(ddd,1H,J_3,4 7.1,J_4,5b 6.5,J_4,5a 3.5Hz,H-4)；3.59(dd,1H,J_5a,5b 13.3,J_4,5a3.5Hz,H-5a)；3.42(dd,1H,J_5a,5b 13.3,J_4,5b 6.5Hz,H-5b)。

¹³C-NMR(125MHz,D₂O)δ(ppm):95.2(C-1)；79.6(C-4)；75.8(C-2)；74.7(C-3)；52.6(C-5)。

实施例2：用本发明的化合物Ara-N₃(Ia)和用现有技术的化合物Kdo-N₃(I-1)标记的活微生物的比较。

1)材料和方法

1.1)微生物菌株和生长条件

表1和表3列出的细菌菌株和真菌菌株在表1和表2列出的培养基和条件中生长。所有菌株均在30℃或37℃的旋转摇床(160rpm)中生长。

表1：

表2：

1.2)铜催化的点击化学

将过夜培养物在含有Kdo-N₃(I-1)或Ara-N₃(Ia)(10mM)的新鲜介质(终体积100μl)中稀释100倍。将微生物在30℃或37℃孵育24小时，然后通过在室温以13,000×g离心2min用磷酸盐缓冲液(0.05M,pH 7.5)洗涤3次。

使用下式A488-炔(6a)和A594-炔(6b)的两个荧光染料-炔烃探针：

在37℃剧烈摇动下，将CuSO₄和TGTA以终浓度分别是2mM和4mM在磷酸盐缓冲液(0.05M,pH 7.5)中混合过夜。然后，将氨基胍、抗坏血酸钠和A488-炔(6a)或A594-炔(6b)以终浓度分别是4mM、5mM和1mM加入至CuSO₄/TGTA过夜混合物中。最后，将微生物重新悬浮于该溶液中，并在37℃摇动下孵育30分钟。最后，将细胞通过在室温以14,000×g离心2min用磷酸盐缓冲液洗涤3次，并通过显微镜分析。

1.3)荧光显微镜

将微生物接种至玻璃盖玻片上，并使用稀释的LB(1/10在磷酸盐缓冲液中(0.05M,pH 7.5))制成的薄(厚度为1mm)半固体1％琼脂垫覆盖。使用装备有CoolSNAP HQ 2照相机(Roper Scientific,Roper Scientific SARL，法国)和100×/1.4DLL物镜的落射荧光(epifluorescence)自动显微镜(Nikon TE2000-E-PDS,Nikon，法国)记录图像。通过120W金属卤化物灯发射激发光，并且使用合适的滤光器监测信号。通过自定义自动化脚本(Visual Basic)在Metamorph 7.5(Molecular Devices,Molecular Devices France，法国)下进行数字分析和图像处理。

2)结果

2.1)已将细菌、真菌和变形虫的不同菌株用本发明的化合物Ara-N₃(Ia)和现有技术的Kdo-N₃(I-1)进行测试比较。

这些菌株首先在化合物(Ia)或(I-1)的存在下生长，并且以之前描述的条件使用铜-催化的叠氮-炔烃环加成反应，使用硫酸铜、抗坏血酸钠、TGTA、铜(I)的水溶性三(三唑基)配体和上式(6a)或(6b)的荧光染料-炔烃探针，如上所公开的持续30分钟，在后续步骤中监测叠氮基化学报告分子合并入微生物中。

在这些试验中，菌株显示出高度差异性的荧光，在下表3中表明化学报告分子的有效代谢性合并的记为“+”，无标记的记为“-”，未检测的细菌在表3中记为“NT”。

表3：

这些试验显示本发明的化合物(Ia)被广泛范围的细菌和真菌以及变形虫同化(所有测试微生物都被标记)。有趣的是，以下细菌菌株(所有的革兰氏阳性菌)和真菌菌株(所有的测试真菌)同化化合物(Ia)，但不同化化合物(I-1)：

a)细菌：枯草芽孢杆菌、粪肠球菌、淋病奈瑟球菌、单核细胞性李斯特菌、藤黄微球菌、金黄色葡萄球菌、金黄色葡萄球菌金黄亚种，和

b)真菌：黑曲霉、白假丝酵母菌、镰孢菌和白地霉，和

c)变形虫：卡氏棘阿米巴。