本公开内容涉及能够通过皮肤递送生物活性物质的皮肤穿透肽、其衍生物、用于对皮肤外用的包含所述肽或其衍生物的药物组合物以及包含所述肽或其衍生物的化妆品组合物。
背景技术：
皮肤是不断地与外部环境接触的组织。其充当防止体液渗漏、感染和水分损失的保护性屏障。特别地，作为皮肤的最外层的表皮角质层通过防止水分损失和电解质离开皮肤来防止皮肤干燥，并且通过提供用于皮肤的正常生化代谢的环境来保护人体免受来自外部的物理伤害和化学物质。此外，其在阻止细菌、真菌、病毒等侵入皮肤中起重要作用(bouwstraj.a，honeywell-nguyenp.l.goorisg.s.和ponecm.proglipidres.42：1-36(2003))。
通过皮肤的吸收途径包括通过角质层的吸收、通过毛囊和皮脂腺的吸收以及通过汗腺的吸收(prausnitzm.r.和langerr.natbiotech.26：1261-1268(2008))。通过皮肤递送生理活性分子受到皮肤的结构和物理特性的限制。目前，通过角质层的吸收是已知最重要的吸收途径。特别地，在角质形成细胞(keratinocyte)转变成无生命的角质细胞时形成的皮肤角质层是具有致密结构的最外层。其阻止水分蒸发和外来物质的侵入，并且由于汗液和各种脂质成分而表现出ph5左右的酸性。物质要穿透角质层的屏障，其应该具有500da或更小的分子量以及亲脂性(methar.c.和fitzpatrickr.e.dermatol.ther.20：350-359(2007))。
尽管已知通常用作化妆品成分的分子量为500da或更小的低分子量合成化合物或天然化合物可容易地递送到细胞中，但由于构成皮肤屏障的角质层的固有性质，低分子量物质的穿透效率很低。具有500da或更大的分子量的大分子，例如蛋白质、肽或核酸，由于其大的分子量，更加难以穿透由脂双层结构组成的细胞膜。作为提高低分子量物质和大分子穿过细胞质膜的穿透效率的方法，近来对透皮药物递送(transdermaldrugdelivery，tdd)的兴趣越来越大(prausnitzm.r.和langerr.natbiotech.26：1261-1268(2008))。然而，透皮药物递送的最大障碍是角质层中的角质形成细胞和角质细胞间脂质。由于皮肤的角质层对大多数表现出对皮肤的生理活性的分子(在下文中是指生理活性分子)有抵抗力，因此它们的透皮渗透性很低。
已经研究了多种用于提高这些生理活性分子的透皮渗透性的方法。最近，使用细胞穿透肽的递送系统吸引了很多注意。使用细胞穿透肽具有若干优点，这些优点主要来源于可对肽的序列进行的多种修饰。这允许指定其他的细胞子域以及操纵能运载多种形式货物分子(cargomolecule)的载体。
tat(膜穿透肽的代表性实例)是在hiv-1(humanimmunodeficiencyvirus-1，人免疫缺陷病毒-1)感染机制中发现的第一种穿透细胞膜的蛋白质。由此衍生的tat肽“ygrkkrrqrrr”是最常用的并且正得到积极的研究(mann，d.a.等，emboj10：1733-1739，1991)。tat肽已用于将β-半乳糖苷酶、辣根过氧化物酶、rna酶a、假单胞菌(pseudomonas)外毒素a(pe)的结构域等递送到细胞内以研究它们在细胞中的功能和定位(fawell，s.等，pnas91：664-668，1994)。已经发现tat肽通过与细胞膜上的硫酸乙酰肝素相互作用然后内吞而进入细胞，其中涉及脂质筏(jehangirs.w.等，naturemed10：310-315，2004)。
此外，衍生自触角足同源异型蛋白(antennapediahomeoprotein)并且是果蝇的发育过程中的重要转录因子的由16个氨基酸序列组成的细胞穿透肽penetratin(antp)、衍生自由hsv-1(herpessimplexvirustype1，单纯疱疹病毒1型)表达的vp22蛋白的细胞穿透肽vp22、由27个氨基酸序列组成的人工合成的转运素(transportan)、通过人工重复预期在细胞穿透肽中起到最重要的作用的精氨酸残基得到的多聚精氨酸(poly-arginine)等是公知的细胞穿透肽。
由于这些现有细胞穿透肽衍生自病毒(如hiv-1)的蛋白质、衍生自由其他物种(如果蝇)表达的蛋白质、或基于对先前已知的细胞穿透肽的氨基酸序列的分析人工合成，所述当将其用于人体时，可能引起副作用，如免疫应答等。
此外，由于它们由相对长的氨基酸链组成，所以其更有可能引起不需要的免疫应答，并且由于它们可能影响待递送的蛋白质的结构和功能，所以与将生物活性物质递送到细胞内相关的效率通常很低。
本公开内容的发明人已经证明衍生自人astn1(星形肌动蛋白1(astrotactin1)，一种参与小脑发育和神经元迁移的神经蛋白)蛋白的肽序列与细胞穿透肽tat或以前已知的皮肤穿透肽相比表现出非常卓越的进入表皮细胞或皮肤组织的渗透效率，并且完成了本公开内容。
公开内容
技术问题
本公开内容旨在提供用于将由于其分子量或皮肤的角质层的固有性质而不能容易地通过皮肤递送的生理活性分子有效引入皮肤细胞内的皮肤穿透肽，该皮肤穿透肽与现有皮肤穿透肽相比引起免疫应答的可能性较低，并且表现出显著改善的皮肤渗透性。
本公开内容还旨在提供肽融合产物，其解决了在预防或治疗炎性皮肤病中由于分子量或皮肤的角质层的固有性质在通过在皮肤表面直接施用的困难，并且同时与现有皮肤穿透肽相比引起免疫应答的可能性较低，并且表现出显著改善的皮肤渗透性。
本公开内容还旨在提供用于通过皮肤、特别是通过经角质层施用来有效地预防或治疗皮肤病的化妆品组合物，或用于皮肤外用来预防或治疗炎性皮肤病的药物组合物。
技术方案
本公开内容提供了具有序列(x1)n-x2-(半胱氨酸)-(x3)m的皮肤穿透肽，其中n是3至14的整数，m是4至14的整数，x1和x3各自独立地是精氨酸、赖氨酸或组氨酸，以及x2是丙氨酸、甘氨酸、脯氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸、缬氨酸、精氨酸、赖氨酸或组氨酸。
本公开内容还提供了其中所述皮肤穿透肽与生物活性物质融合的融合产物。
本公开内容还提供了包含编码所述融合产物的基因的重组表达载体。
本公开内容还提供了包含所述融合产物作为活性成分的化妆品组合物。
本公开内容还提供了用于皮肤外用的包含所述融合产物作为活性成分的药物组合物。
本公开内容还提供了用于预防或治疗炎性皮肤病的方法，其包括向对象的皮肤施用有效量的用于皮肤外用的药物组合物的步骤。
有益效果
本公开内容的皮肤穿透肽可有效地将蛋白递送到表皮细胞、真皮细胞和皮肤组织中。其能够比现有tat肽或皮肤穿透肽更有效地递送蛋白质，并且还能够有效地用于递送生物活性物质，例如蛋白质、遗传物质、化合物等，它们通过皮肤递送并且用于治疗目的。
根据本公开内容的融合产物可被有效地递送到表皮细胞、真皮细胞和皮肤组织中，并且不仅能够抑制引起皮肤病的多种炎性细胞因子信号转导，而且能够同时抑制t细胞的激活和增殖。因此，其在治疗、预防或改善炎性皮肤病或病症方面表现出了非常优异的效果。
此外，本公开内容的肽融合产物表现出了非常优异的稳定性和皮肤渗透性，因此可非常有利地应用于药物、准药物和化妆品。
附图简述
图1示出了制备实施例2的编码ap-egfp的789-bp双链dna片段的1％琼脂糖凝胶电泳的结果，其中ap与egfp连接。
图2示出了制备实施例3的用nhei和hindiii限制酶处理ap-egfpdna片段(789bp)和prset-b载体(2.9kb)用于插入ap-egfpdna片段并且通过1％琼脂糖凝胶电泳对dna量进行量化的结果。
图3示出了用制备实施例3的其中插入了编码ap-egfp的dna片段的prset-b载体转化dh5α大肠杆菌(e.coli)，在液体lb培养基中培养从平板lb培养基上的培养中选择的菌落，通过质粒小量制备来分离dna，并且进行1％琼脂糖凝胶电泳的结果。
图4示出了通过用nhei和hindiii限制酶处理并进行1％琼脂糖凝胶电泳证实在制备实施例3中分离的质粒dna由编码ap-egfp的dna片段(789bp)和prset-b载体(2.9kb)组成的结果。
图5是制备实施例3的其中插入了ap-egfp的prset-b载体的模式图。
图6示出了制备实施例4的纯化的ap-egfp蛋白、作为阴性对照组的其中未连接细胞穿透肽的egfp蛋白以及作为阳性对照组的最广为人知的细胞渗透肽tat-egfp蛋白的12％sds凝胶电泳的结果。
图7示出了测试实施例1中通过流式细胞术(flowcytometry)的细胞内荧光强度分析的结果，显示ap-egfp蛋白以浓度依赖和时间依赖的方式被递送到jurkat细胞内。
图8示出了测试实施例2中通过流式细胞术的细胞内荧光强度分析的结果，比较了通过ap和作为阳性对照组的现有细胞穿透肽将蛋白质递送到jurkat细胞内的效率。
图9示出了测试实施例3中通过流式细胞术的细胞内荧光强度分析的结果，比较了通过ap和作为阳性对照组的现有细胞穿透肽将蛋白质递送到jurkat细胞内的效率。
图10示出了测试实施例4中通过流式细胞术的细胞内荧光强度分析的结果，比较了通过ap和作为阳性对照组的现有细胞穿透肽将蛋白质递送到皮肤表皮hacat细胞内的效率。
图11示出了测试实施例4中通过流式细胞术的细胞内荧光强度分析的结果，比较了通过ap和作为阳性对照组的现有细胞穿透肽将蛋白质递送到皮肤真皮nih3t3细胞内的效率。
图12示出了测试实施例5中通过流式细胞术的细胞内荧光强度分析的结果，比较了通过ap和作为阳性对照组的现有细胞穿透肽将蛋白质递送到皮肤表皮hacat细胞内的效率。
图13示出了测试实施例5中通过流式细胞术的细胞内荧光强度分析的结果，比较了通过ap和作为阳性对照组的现有细胞穿透肽将蛋白质递送到皮肤真皮nih3t3细胞内的效率。
图14示出了测试实施例6中通过流式细胞术的细胞内荧光强度分析的结果，比较了占据了ap的最大部分的精氨酸和作为对照组的具有较少精氨酸的那些对蛋白质递送至细胞内的作用。
图15示出了测试实施例6中通过流式细胞术的细胞内荧光强度分析的结果，通过用丙氨酸替换它们的每一个，比较了构成ap的色氨酸(x2)、半胱氨酸和赖氨酸(x3的首个氨基酸)对蛋白质递送至细胞内的作用。
图16示出了测试实施例6中通过流式细胞术的细胞内荧光强度分析的结果，通过用精氨酸替换它们的每一个，比较了构成ap的色氨酸(x2)、半胱氨酸和赖氨酸(x3的首个氨基酸)对蛋白质递送至细胞内的作用。
图17示出了测试实施例7中通过流式细胞术的细胞内荧光强度分析的结果，比较了根据温度和培养基中血清浓度的变化，ap和作为阳性对照组的现有细胞穿透肽进入细胞的细胞内递送效率的变化。
图18示出了测试实施例8中比较根据肝素和mβcd(甲基-β-环糊精)浓度变化，ap-egfp和作为阳性对照组的现有细胞穿透肽的细胞内递送效率的变化。
图19示出了测试实施例9的荧光显微图像，表明ap-egfp被递送至hela细胞内。
图20示出了测试实施例10中通过共焦显微术的细胞内荧光强度分析结果，比较了通过ap和作为阳性对照组的现有细胞穿透肽将蛋白质递送至皮肤表皮hacat细胞内以及细胞内定位。
图21示出了测试实施例10中通过共焦显微术的细胞内荧光强度分析结果，比较了通过ap和作为阳性对照组的现有细胞穿透肽将蛋白质递送至皮肤真皮nih3t3细胞内以及细胞内定位。
图22示出了测试实施例11中的荧光显微图像，表明ap-egfp被递送至不同小鼠器官的细胞内。
图23示出了测试实施例12中的荧光显微图像，比较了ap-egfp和作为阳性对照组的现有细胞穿透肽进入小鼠皮肤组织的递送效率随时间的变化。
图24示出了测试实施例13中的荧光显微图像，比较了ap-dtomato与现有细胞穿透肽进入小鼠皮肤的递送效率的变化。
图25示出了测试实施例14中的共聚焦显微图像，表明ap-dtomato被递送至绿色荧光蛋白靶向的小鼠的皮肤内。
图26示出了图25的放大图像。
图27示出了在制备实施例4中纯化的ap-egfp蛋白和在制备实施例7中纯化的ap-rptp蛋白的12％sds凝胶电泳的结果。
图28示出了测试实施例16中预测的ap-rptp蛋白的三维结构。
图29示出了测试实施例17中研究ap-egfp蛋白和ap-rptp蛋白的磷酸酶活性的结果。
图30示出了测试实施例18中通过ap-rptp将蛋白质递送至皮肤表皮hacat细胞内的效率的通过流式细胞术的细胞内荧光强度分析的结果。
图31示出了测试实施例19中通过流式细胞术的细胞内荧光强度分析的结果，比较了随时间通过ap-rptp将蛋白质递送至皮肤表皮hacat细胞内的递送效率。
图32示出了测试实施例20中用ap-rptp蛋白处理的小鼠脾细胞(splenocyte)中的细胞因子(cytokine)刺激的效果的图像。
图33示出了测试实施例21中用na或pbs(‘na’和‘α-cd3αcd28+pbs’；a，b)处理的原代小鼠cd4-t细胞的增殖或用ap-rptp蛋白(c)处理的原代小鼠cd4-t细胞的增殖的测量结果。
图34a-34d示出了测试实施例22中用ap-rptp或ap-egfp蛋白处理小鼠脾细胞中细胞因子il-17(34a)、il-13(34b)、ifn-γ(34c)和il-2(34d)的表达水平的测量结果。
图35示出了测试实施例23的
图36示出了测试实施例23中致敏后6天诱导接触性皮炎的小鼠的耳的观察结果。可以看出用ap-rptp处理降低了小鼠耳中的炎症。
图37示出了测试实施例23中与用pbs处理的对照小鼠组相比，用ap-rptp处理的小鼠组耳厚度降低。
图38示出了测试实施例23中与用pbs处理的对照小鼠组相比，用ap-rptp处理的小鼠组耳重量降低。
图39示出了测试实施例23中的光学显微图像，示出了用h&e染色后用ap-rptp处理的小鼠组与用pbs处理的对照小鼠组在耳厚度上的差异。
图40示出了测试实施例24的
图41示出了测试实施例24的
图42示出了测试实施例25中的卵白蛋白(ova)诱导的慢性(chronic)皮炎动物模型的方案。
图43示出了测试实施例25中用h&e染色后的光学显微图像，表明用ap-rptp处理的小鼠组与用pbs治疗的对照小鼠组在耳厚度上的差异。
图44示出了图43中h&e染色组织学评分的比较结果。
图45示出了测试实施例25中动物模型的皮肤组织中il-13mrna表达水平的比较结果。
图46示出了测试实施例26的咪喹莫特诱导的银屑病样(psoriasis-like)皮炎动物模型的方案。
图47示出了测试实施例26中用ap-rptp或ap-egfp处理6天的咪喹莫特诱导的银屑病样皮炎动物模型的耳厚度变化的测量结果。
图48示出了测试实施例26中的光学显微图像，显示了用h&e染色后用用ap-rptp或ap-egfp处理的小鼠组与阴性对照组(假手术)的耳厚度的差异。
图49示出了测试实施例26中的用ap-rptp或ap-egfp处理的小鼠组或阴性对照组(假手术)的耳组织细胞中细胞因子(il-7a、il-17f、il-6)的mrna表达水平的量化结果。
图50示出了测试实施例26中的用ap-rptp或ap-egfp处理的小鼠组或阴性对照组(假手术)的耳组织细胞中抗菌肽(s100a8、s100a9)的mrna表达水平的量化结果。
图51示出了制备实施例7中表达和纯化的ap-rptp的12％sds凝胶电泳的结果。
图52示出了由ptpn2蛋白(tc-ptp)设计的重组肽(rptp)与皮肤穿透肽(ap)的融合产物的结构。
最佳模式
本公开内容提供了具有序列(x1)n-x2-(半胱氨酸)-(x3)m的皮肤穿透肽，其中n是3至14的整数，特别地3至6的整数，以及m是4至14的整数，特别地4至7的整数。
皮肤穿透肽由特别地9至14个、更特别地9至12个、最特别地9至10个氨基酸组成。当氨基酸的数量小于下限时，细胞穿透效率可能迅速降低。并且如果其超过了上限，免疫应答的风险会增加。
在皮肤穿透肽中，x1和x3各自独立地是带正电荷的氨基酸，特别是精氨酸(arg，r)、赖氨酸(lys，k)或组氨酸(his，h)，更特别是精氨酸或赖氨酸。(x1)n由n个对应于x1的带正电荷的氨基酸形成。n个氨基酸可以是相同的或不同的带正电荷的氨基酸。同样地，(x3)m由m个带正电荷的氨基酸形成，这些氨基酸可以彼此不同。
在皮肤穿透肽中，x2是非极性的或带正电荷的氨基酸，特别是丙氨酸(ala，a)、甘氨酸(gly，g)、脯氨酸(pro，p)、色氨酸(trp，w)、苯丙氨酸(phe，f)、亮氨酸(leu，l)、异亮氨酸(ile，i)、甲硫氨酸(met，m)、缬氨酸(val，v)、精氨酸(arg，r)、赖氨酸(lys，k)或组氨酸(his，h)，更特别是丙氨酸、色氨酸或精氨酸。
更特别地，皮肤穿透肽由seqidno1、seqidno5、seqidno8或seqidno12的氨基酸序列组成。
本公开内容还提供了其中皮肤穿透肽与生物活性物质融合的融合产物。
生物活性意指通过皮肤递送至体内或细胞内的物质的与生理现象或治疗目的有关的活性。由于其通过本公开内容的皮肤穿透肽递送，所以生物活性物质也被称为货物(cargo)，并且可以是蛋白质、遗传物质、脂肪、碳水化合物和化合物。
与皮肤穿透肽融合的蛋白质可以包括例如细胞因子及其受体(除了包含细胞因子或受体的嵌合蛋白以外)，例如肿瘤坏死因子-α或-β、其受体及其衍生物；肾素；生长激素，例如人生长激素、牛生长激素、甲硫氨酸人生长激素、脱苯丙氨酸人生长激素和猪生长激素；生长激素释放因子(grf)；甲状旁腺和脑垂体激素；促甲状腺激素；人胰腺激素释放因子；脂蛋白；秋水仙素；泌乳素；促肾上腺皮质激素；催产素；加压素；促生长素抑制激素；特利加压素；肠促胰酶素；亮丙瑞林；α-1-抗胰蛋白酶；胰岛素a链；胰岛素b链；前胰岛素；促卵泡激素；降血钙素；促黄体激素；促黄体激素释放激素(lhrh)；lhrh激动剂和拮抗剂；胰高血糖素；凝血因子，例如viiic因子、ix因子、组织因子和血管性血友病因子；抗凝因子，例如蛋白质c；心房利钠因子；肺表面活性物质(pulmonarysurfactant)；除了组织纤溶酶原激活物(t-pa)之外的纤溶酶原激活物，例如尿激酶；铃蟾肽；凝血酶；造血生长因子；脑啡肽酶；rantes(regulatedonactivation，normalt-cellexpressedandsecreted)；人巨噬细胞炎性蛋白(mip-1-α)；血清白蛋白，例如人血清白蛋白；苗勒氏抑制物(müllerian-inhibitingsubstance)；松弛素a链；松弛素b链；前松弛素(prorelaxin)；鼠促性腺激素相关肽；绒膜促性腺激素；促性腺激素释放激素；牛促生长素；猪促生长素；微生物蛋白质，例如β-内酰胺酶；脱氧核糖核酸酶；抑制素；激活素；血管内皮生长因子(vegf)；激素或生长因子受体；整合素；蛋白质a或d；类风湿因子；神经营养因子，例如骨源神经营养因子(bdnf)、神经妥乐平-3、-4、-5或-6(nt-3、nt-4、nt-5或nt-6)，神经生长因子例如ngf-β；血小板源生长因子(pdgf)；成纤维细胞生长因子，例如酸性fgf和碱性fgf；表皮生长因子(egf)；转化生长因子(tgf)，例如tgf-α和tgf-β，包括tgf-β1、tgf-β2、tgf-β3、tgf-β4或tgf-β5；胰岛素样生长因子-i和-ii(igf-i和igf-ii)；des(1-3)-igf-i(脑igf-i)，胰岛素样生长因子结合蛋白；cd蛋白，例如cd-3、cd-4、cd-8和cd-19；促红细胞生成素；骨诱导因子；免疫毒素；骨形态生成蛋白(bmp)；干扰素，例如干扰素-α(例如干扰素α2a)、-β、-γ、-λ和共有序列干扰素；集落刺激因子(csf)，例如m-csf、gm-csf或g-scf；白介素(il)，例如il-1至il-10；超氧化物歧化酶；t细胞受体；表面膜蛋白；衰变加速因子；病毒抗原，例如hiv-1包膜糖蛋白的一部分、gp120、gp160或其片段；转运蛋白；归巢受体；地址素；生育抑制剂，例如前列腺素；生育启动子；调节蛋白；抗体(包括其片段)和嵌合蛋白，例如免疫粘附素；这些化合物的前体、衍生物、前药和类似物，以及这些化合物或其前体、衍生物、前药和类似物的药学上可接受的盐。
特别地，蛋白质是生长激素，例如人生长激素(hgh)、重组人生长激素(rhgh)、牛生长激素、甲硫氨酸人生长激素、脱苯丙氨酸人生长激素和猪生长激素；胰岛素、胰岛素a链、胰岛素b链和前胰岛素；或生长因子，例如血管表皮生长因子(vegf)、神经生长因子(ngf)、血小板源生长因子(pdgf)、成纤维细胞生长因子(fgf)、表皮生长因子(egf)、转化生长因子(tgf)和胰岛素样生长因子-i和-ii(igf-i和igf-ii)。
生物活性物质可以是衍生自ptpn2蛋白的重组肽(rptp)。与本公开内容的皮肤穿透肽融合的rptp肽可局部施用于皮肤以改善或治疗皮炎的症状。
与皮肤穿透肽融合的遗传物质不仅可以是核酸，而且可以是其前体、衍生物、前药或类似物，例如治疗性核苷酸或核酸及其类似物；治疗性寡核苷酸；以及治疗性多核苷酸。
遗传物质特别可用作抗癌剂或抗病毒剂。遗传物质可以是，例如核糖酶、反义寡脱氧核苷酸、适配子(aptamer)或sirna。合适的核苷类似物的实例包括阿糖胞苷(aractp)、吉西他滨(gemcitabine)(dfdctp)和氟尿苷(fdutp)。此外，遗传物质可以是，例如干扰rna，例如shrna、mirna或sirna。合适的sirna的实例包括il-7(白介素-7)sirna、il-10(白介素-10)sirna、il-22(白介素-22)sirna、il-23(白介素23)sirna、cd86sirna、krt6a(角蛋白6a)sirna、k6an171k(角蛋白6an171k)sirna、tnfα(肿瘤坏死因子α)sirna、tnfr1(肿瘤坏死因子受体-1)sirna、tace(肿瘤坏死因子(tnf)-α转化酶)sirna、rrm2(核糖核苷酸还原酶亚基)sirna和vegf(血管表皮生长因子)sirna。这些sirna的人基因靶mrna序列是本领域已知的。另外，选择特定mrna靶序列用于sirna设计的各种方法和技术是本领域已知的。
与皮肤穿透肽偶联的脂肪包括脂肪酸。脂肪酸是具有饱和或不饱和脂肪族尾部的一元羧酸。如在国际化妆品成分字典和手册(internationalcosmeticingredientdictionaryandhandbook)第7版(1997)，第2卷，第1567页中定义的那样，脂肪酸具有约7个或更多个碳原子。例如，最丰富的天然脂肪酸棕榈酸是在棕榈油和其他脂肪中发现的饱和脂肪酸。棕榈酸也是由皮脂腺产生的皮肤的主要脂肪酸之一，并且作为保湿剂用于美容护理和化妆品中。其通过稳定油平衡、软化皮肤和起到类似于抗角质化剂的作用来保持皮肤处于正常和健康的状态。棕榈酸酯用于为皮肤和头发丝提供柔滑感。棕榈酸充当可将五肽递送至皮肤内的载体。其还被广泛地用作润滑剂、乳化剂、表面活性剂和制剂调质剂(texturizer)。
适合于本公开内容的脂肪酸包括月桂酸、硬脂酸、棕榈酸、十一碳烯酸、棕榈油酸、油酸、亚油酸、亚麻酸、花生四烯酸和芥酸，尽管并不局限于此。其他合适的脂肪酸公开于国际化妆品成分字典和手册第7版(1997)，第2卷，第1567页。
与皮肤穿透肽融合的化学化合物可包括维生素、其衍生物和类视色素，尽管并不局限于此。抗坏血酸(维生素c)、α-生育酚(维生素e)、类视色素(维生素a)可以为皮肤提供良好的特性。抗坏血酸刺激结缔组织的合成并且特别地参与刺激和调节胶原产生。其有助于防止或最小化由脂肪氧化、持续暴露于uv或其他原因引起的细胞损伤(varani，j.等，j.invest.dermatol.114：480-486(2000)；offord，e.a.等，freeradicalbiol.&med.32：1293-1303，(2002))。抗坏血酸有助于抑制黑色素产生和经细胞膜的组胺分泌，弥补皮肤中的维生素e缺乏，参与防止皮肤脱色并且具有抗自由基的活性。α-生育酚是阻止细胞膜的磷脂和自由基的有害效应的抗氧化剂(j.b.chazan等，freeradicalsandvitamine.cah.nutr.diet.1987，22(1)：66-76)。类视色素在皮肤中阻断炎性介质并且通过增加原骨胶原的生成而增加i型和iii型骨胶原的生成。
在本公开内容中使用的术语“肽融合产物(融合肽)”表示具有新的分子结构的肽融合产物，其通过将具有生理活性的低分子量肽rptp肽结合在皮肤穿透肽或改变了一个或更多个氨基酸的皮肤穿透肽的变体的n-末端或c-末端获得。
皮肤穿透肽可以是具有序列(x1)n-x2-(半胱氨酸)-(x3)m的皮肤穿透肽，其中n是3至14的整数，特别地3至6的整数，m是4至14的整数，特别地4至7的整数。
皮肤穿透肽由特别地9至14个、更特别地9至12个、最特别地9至10个氨基酸组成。当氨基酸的数量小于下限时，细胞穿透效率可能迅速降低。并且如果其超过了上限，免疫应答的风险会增加。
在皮肤穿透肽中，x1和x3各自独立地是带正电荷的氨基酸，特别地精氨酸(arg，r)、赖氨酸(lys，k)或组氨酸(his，h)，更特别地精氨酸或赖氨酸。(x1)n由n个对应于x1的带正电荷的氨基酸形成。n个氨基酸可以是相同的或不同的带正电荷的氨基酸。同样地，(x3)m由m个带正电荷的氨基酸形成，这些氨基酸可以彼此不同。
在皮肤穿透肽中，x2是非极性的或带正电荷的氨基酸，特别地丙氨酸(ala，a)、甘氨酸(gly，g)、脯氨酸(pro，p)、色氨酸(trp，w)、苯丙氨酸(phe，f)、亮氨酸(leu，l)、异亮氨酸(ile，i)、甲硫氨酸(met，m)、缬氨酸(val，v)、精氨酸(arg，r)、赖氨酸(lys，k)或组氨酸(his，h)，更特别地丙氨酸、色氨酸或精氨酸。
更特别地，皮肤穿透肽由seqidno1、seqidno5、seqidno8或seqidno12的氨基酸序列组成。
rptp肽是具有生物活性并且由ptpn2蛋白的片段组成的重组肽。通过经皮递送至细胞内，其表现出了与生理现象或治疗目的相关的活性。
ptpn2蛋白是t细胞蛋白酪氨酸磷酸酶，也被称为tc-ptp。其为可调节与jak-stat通路相关的细胞因子受体信号(jak1、jak3、stat1、stat3、stat5、stat6)的酶，并且抑制t细胞受体信号分子如src家族酪氨酸激酶(lck、fyn)。编码ptnt2蛋白的基因如图52所示。在它们之中，rptp肽通过将催化结构域与同ap序列结合的底物结合结构域相结合来设计(图52，底部)。如上所述的设计的rptp肽局部施用于皮肤以改善或治疗皮炎的症状。
由于上述氨基酸序列以外的衍生自ptpn2蛋白的亚型很难有效地与皮肤穿透肽结合，它们可能表现出降低的皮肤穿透效率或降低的预防和治疗炎性皮肤病的效果。
此外，根据本公开内容设计的由seqidno20形成的氨基酸序列的rptp蛋白的优点在于其表现出治疗或预防炎性皮肤病(银屑病、过敏、慢性皮炎等)的良好效果。
皮肤穿透肽和rptp肽之间的融合是肽键合或化学键合。化学键合可选自二硫化物键合、二胺键合、硫化物-胺键合、羧基-胺键合、酯键合和共价键合。
根据本公开内容的融合产物可具有seqidno19的氨基酸序列并且与单独的生理活性蛋白相比，具有显著优异的预防和治疗炎症皮肤病的效果。
当使用其他现有肽作为皮肤穿透肽时，对炎性皮肤病的效果显著降低。因此，可以看出皮肤渗透效率(特别是经皮的细胞穿透效率)以及治疗或预防炎性皮肤病的效果的改善并不是因为皮肤穿透肽或rptp肽的固有性质。
如上所述，根据本公开内容的肽融合产物不仅表现出了良好的皮肤穿透效率，而且在仅经皮施用的情况下就能够表现出良好的治疗和预防效果。因此，根据本公开内容的融合产物可有效地用作能够有效预防和治疗炎性皮肤病的药物。
融合产物有效地调节激活的t细胞中细胞因子的产生并且在炎性皮肤病(银屑病、过敏性皮炎、慢性皮炎)的预防和治疗模型两者中都显示了抑制效果。
皮肤穿透肽和rptp肽通过共价键合融合，共价键合包含酯键合、酰胺键合、醚键合和脲键合，尽管并不局限于此。
由于皮肤穿透肽是非常小的肽，因此其可以使可能发生的由活性物质引起的生物干扰最小化。皮肤穿透肽与生物活性物质的融合产物可通过皮肤递送至身体内。
本公开内容的另一个方面涉及包含编码融合产物的基因的重组表达载体。
重组表达载体可包含皮肤穿透肽和rptp肽的序列(seqidno19)和有利于融合产物的纯化的标签序列，例如连续的组氨酸密码子、麦芽糖结合蛋白密码子、myc密码子等，并且还可包含用于提高融合产物的溶解度的融合配偶体。为了稳定重组蛋白的整个结构和功能或由每个基因编码的蛋白质的柔性，其还可包含间隔区氨基酸或碱基序列。间隔区的实例包括但不限于aay(p.m.daftarian等，jtransmed2007，5：26)、aaa、nkrk(r.p.m.sutmuller等，jimmunol.2000，165：7308-7315)或一个或多个赖氨酸残基(s.ota等，canres.62，1471-1476；k.s.kawamura等，jimmunol.2002，168：5709-5715)。另外，可包含用于鉴定由酶特异性切割的序列的递送的标志物或报告基因序列，以便从进入细胞的重组蛋白或表达调节序列除去不需要部分，尽管不局限于此。
用于重组表达载体中的表达调节序列可以是包含启动子的调节结构域。所述启动子是靶rna和/或dna被选择性递送至或在其中表达的细胞、组织或器官特异性的。
在本公开内容的化妆品组合物中，与皮肤穿透肽融合的生物活性物质可以是具有以下活性的物质：抗氧化、增加血管形成、减轻粉刺的症状、减少分泌、延迟衰老、减少皱纹、减少黑色素的产生、减轻皮肤炎症或改善皮肤干燥。
在本公开内容的用于皮肤外用的药物组合物中，与皮肤穿透肽融合的生物活性物质可以是作用于以下的化学化合物：外周神经、肾上腺素受体、胆碱受体、骨骼肌、心血管系统、平滑肌、血循环系统、突触位点、神经效应器结、内分泌和激素系统、免疫系统、生殖系统、骨骼系统、自体有效物质系统(autacoidsystem)、消化和排泄系统、组胺系统和中枢神经系统。
化学化合物可能包含局部麻醉剂、抗炎剂、抗感染剂、祛痘剂、抗病毒剂、抗菌剂、抗银屑病剂如外用皮质类固醇等。
例如，化学化合物可选自16α，17α-环氧黄体酮(casno.1097-51-4)、对-甲氧基肉桂酸/4-甲氧基肉桂酸(casno.830-09-1)、甲氧基肉桂酸辛酯(casno.5466-77-3)、甲氧基肉桂酸辛酯(casno.5466-77-3)、对甲氧基肉桂酸甲酯(casno.832-01-9)、4-雌烯-17β-ol-3-酮(casno.62-90-8)、对茴香酰基乙酸乙酯(casno.2881-83-6)、二氢尿嘧啶(casno.1904-98-9)、洛匹那韦(casno.192725-17-0)、利坦色林(casno.87051-43-2)、尼洛替尼(casno.641571-10-0)；罗库溴铵(casno.119302-91-9)、对硝基苄基-6-(1-羟乙基)-1-氮杂双环(3.2.0)庚烷-3，7-二酮2-羧酸盐(casno.74288-40-7)、阿维菌素(casno.71751-41-2)、帕潘立酮(casno.144598-75-4)、吉米沙星(casno.175463-14-6)、戊柔比星(casno.56124-62-0)、咪唑立宾(casno.50924-49-7)、琥珀酸索利那新(casno.242478-38-2)、拉帕替尼(casno.231277-92-2)、地屈孕酮(casno.152-62-5)、2，2-二氯-n-[(1r，2s)-3-氟-1-羟基-1-(4-甲基磺酰基苯基)丙烷-2-基]乙酰胺(casno.73231-34-2)、替米考星(casno.108050-54-0)、依法韦仑(casno.154598-52-4)、吡柔比星(casno.72496-41-4)、那格列奈(casno.105816-04-4)、表柔比星(casno.56420-45-2)、恩替卡韦(casno.142217-69-4)、艾托考昔(casno.202409-33-4)、西尼地平(casno.132203-70-4)、盐酸阿霉素(casno.25316-40-9)、依他普仑(casno.128196-01-0)、磷酸西他列汀一水合物(casno.654671-77-9)、阿昔曲丁(casno.55079-83-9)、苯甲酸利扎曲普坦(casno.145202-66-0)、多尼培南(casno.148016-81-3)、苯磺酸阿曲库铵(casno.64228-81-5)、尼鲁米特(casno.63612-50-0)、3，4-二羟基苯乙醇(casno.10597-60-1)、酒石酸酮舍林(casno.83846-83-7)、奥扎格雷(casno.82571-53-7)、甲磺酸依普罗沙坦(casno.144143-96-4)、盐酸雷尼替丁(casno.66357-35-5)、6，7-二氢-6-巯基-5h-吡唑并[1，2-a][，2，4]三唑鎓氯化物(casno.153851-71-9)、磺胺吡啶(casno.144-83-2)、替考拉宁(casno.61036-62-2)、他克莫司(casno.104987-11-3)、罗美昔布(casno.220991-20-8)、烯丙醇(casno.107-18-6)、经保护的美罗培南(casno.96036-02-1)、奈拉滨(casno.121032-29-9)、吡美莫司(casno.137071-32-0)、4-[-甲氧基-7-(3-哌啶-1-基丙氧基)喹唑啉-4-基]-n-(4-丙烷-2-基氧基苯基)哌嗪-1-甲酰胺(casno.387867-13-2)、利托那韦(casno.155213-67-5)、阿达帕林(casno.106685-40-9)、阿瑞匹坦(casno.170729-80-3)、依普利酮(casno.107724-20-9)、甲磺酸雷沙吉兰(casno.161735-79-1)、米替福新(casno.58066-85-6)、雷特格韦钾(casno.871038-72-1)、达沙替尼一水合物(casno.863127-77-9)、二氧异丁嗪(casno.3689-50-7)、普拉克索(casno.104632-26-0)、帕瑞考昔钠(casno.198470-85-8)、替加环素(casno.220620-09-7)、妥曲珠利(casno.69004-03-1)、长春氟宁(casno.162652-95-1)、屈螺酮(casno.67392-87-4)、达托霉素(casno.103060-53-3)、孟鲁司特钠(casno.151767-02-1)、布林佐胺(casno.138890-62-7)、马拉维若(casno.376348-65-1)、度骨化醇(casno.54573-75-0)、
皮肤穿透肽和rptp肽通过共价键合融合，共价键合包含酯键合、胺键合、醚键合和脲键合，尽管并不局限于此。
由于皮肤穿透肽是非常小的肽，因此其可以使可能发生的由活性物质引起的生物干扰最小化。皮肤穿透肽与生物活性物质的融合产物可通过皮肤递送至身体内。
本公开内容的化妆品组合物可能包含其中皮肤穿透肽与rptp肽融合的融合产物。
本公开内容的化妆品组合物或用于皮肤外用的药物组合物包含融合产物，其量为基于组合物的总重量的0.0001wt％-50wt％。除了融合产物之外，组合物还可包含一种或更多种表现出相同或相似效果的活性成分。
由于融合产物穿透皮肤的角质层，所以含有其的化妆品组合物或用于皮肤外用的药物组合物可以最特别地是透皮的。例如，其可被配制成药膏或凝胶。由于这个特殊的性质，其可直接施用于疾病部位。此外，由于其具有更小的副作用，所以其可以通过透皮施用更有利地提供对皮肤病的预防和治疗效果。
除了上述的融合产物之外，组合物还可包含药学地或生理学可接受的载体、赋形剂或稀释剂。可包含在组合物中的合适的载体、赋形剂或稀释剂的实例包括乳糖、右旋糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、木糖醇、赤藓糖醇、麦芽糖醇、淀粉、阿拉伯树胶、藻酸盐、明胶、磷酸钙、硅酸钙、纤维素、甲基纤维素、非晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、水、羟基苯甲酸甲酯、羟基苯甲酸丙酯、滑石、硬脂酸镁、矿物油等。组合物还可包含常用的填料、增量剂、粘合剂、崩解剂、表面活性剂、抗凝剂、润滑剂、润湿剂、香料、乳化剂、防腐剂等。
组合物可被配制成用于向皮肤或其他组织施用的溶液、乳剂(包括微乳剂)、悬浮液、乳膏、洗剂、凝胶、粉末或通常固体或液体组合物。组合物还可包含抗菌剂、保湿品、水合剂、渗透剂、防腐剂、乳化剂、天然油或合成油、溶剂、表面活性剂、清洁剂、胶凝剂、软化剂、抗氧化剂、香料、填料、增稠剂、蜡、除臭剂、染料、着色剂、粉末、粘度调节剂和水，并且可任选地包含麻醉剂、抗痒剂、植物提取物、调节剂、增深剂或淡化剂、闪光剂、湿润剂、云母、矿物、多元酚、硅酮或其衍生物、防晒霜、维生素或植物药。
组合物的施用剂量可根据对象的体重、年龄、性别、身体状况和饮食、施用时间、施用方法、排泄率、疾病的严重程度等改变。每日施用剂量可以为约0.01mg/kg-100mg/kg，特别地0.5mg/kg-10mg/kg，并且可以每天施用一次或多次。
最特别地，炎性皮肤病可以是炎性皮炎、银屑病、创伤或特应性皮炎。
本公开内容提供了用于预防或治疗炎性皮肤病的方法，其包括向对象的皮肤施用有效量的用于皮肤外用的药物组合物的步骤。
由于用于皮肤外用的药物组合物可通过皮肤注射身体或细胞，所以其可施用至人或非人动物的皮肤、特别地疾病部位以有效地预防或治疗疾病。
本公开内容提供了用于透皮递送生物活性物质的方法，其包括：通过使皮肤穿透肽与生物活性物质结合来制备递送复合物的步骤；以及将递送复合物通过皮肤注射到体内或细胞内的步骤。
皮肤穿透肽与生物活性物质之间的结合可使用表达载体通过克隆技术经间接连接在核苷酸水平实现，或者通过肽与生物活性物质之间的化学或物理共价键合或非共价键合经直接连接实现。
最特别地，生物活性物质可以是衍生自ptpn2蛋白的rptp肽。
本公开内容提供了用于基因治疗的方法，其包括：通过使皮肤穿透肽与遗传物质结合来制备递送复合物的步骤；以及将递送复合物注射到皮肤细胞内的步骤。
皮肤穿透肽和遗传物质之间的结合可通过肽和遗传物质之间的化学或物理共价键合或非共价键合经直接连接实现。遗传物质的递送复合物可通过与上述的相同途径注射到体内或细胞内。
最特别地，生物活性物质可以是衍生自ptpn2蛋白的rptp肽。
遗传物质的递送复合物是非免疫原性和非感染性的，并且由于dna不是封装在病毒生物体如逆转录酶病毒或腺病毒中，所以不受质粒尺寸的限制。因此，其可用于任何实际尺寸的重组基因表达结构中。
发明模式
在下文中，将通过实施例详细地描述本公开内容。然而，以下的实施例只用于说明性目的，并且对于本领域普通技术人员来说明显的是，本公开内容的范围不受实施例的限制。
制备衍生自皮肤穿透肽(ap)和ptpn2的肽
制备实施例1：肽的合成和纯化
从具有选自seqidno1-12、15和17的氨基酸序列的皮肤穿透肽(ap)和ptpn2蛋白合成具有seqidno20的氨基酸序列的重组肽(rptp)。
在合成对应于氨基酸序列的正义和反义寡脱氧核苷酸后，接着在95℃3分钟以除去二级或三级结构(变性)之后，通过将温度改变到50℃然后到72℃来制备双链dna。为插入到prset-b载体中，除了正义和反义寡脱氧核苷酸外，还将限制酶特异性序列插入到5′和3′位点中。然后，通过转化至大肠杆菌内使序列大量扩增。在证实了序列的完整性后，在大肠杆菌内诱导表达。
为了使具有选自seqidno1-12、15和17的氨基酸序列的肽(在下文中也称作‘ap’)与由ptpn2蛋白设计的重组肽(在下文中也称作‘rptp’)(seqidno20)或绿色荧光蛋白(egfp)融合，构建了允许在ap的n-末端连接egfp的引物。在通过pcr产生ap-rptp或ap-egfp基因后，将其插入载体(prset-b)中。在大肠杆菌中表达蛋白质然后纯化以测量细胞内递送效果。
制备ap-egfp蛋白和重组表达载体
制备实施例2：制备编码具有连接在n-末端的egfp的ap的双链dna
通过将编码具有seqidno1的氨基酸序列的肽的dna碱基序列添加至编码绿色荧光蛋白(在下文中也称作“egfp”)的n-末端的一部分的dna碱基序列来构建正向引物。
seqidno13的正向引物包含在5′端的用于dna克隆的nhel限制酶识别位点和在ap与egfp碱基序列之间的banhi限制酶识别位点。同时，构建了seqidno14的反向引物用于通过pcr扩增ap-egfp。反向引物包含编码egfp的c-末端的一部分的dna碱基序列。为了dna克隆，hindiii限制酶识别位点插入在引物的5′端。
使用包含egfp基因的prsetb载体作为模板并使用seqidno13和seqidno14的引物进行pcr。在95℃初始热变性3分钟后，使用pcr仪(bio-rad)进行pcr30个循环(95℃模板热变性20秒→50℃在引物和模板之间聚合20秒→72℃延伸30秒)。
对得到的扩增产物ap-egfp进行1％琼脂糖凝胶电泳。证实扩增了789-bpdna片段(图1)。
制备实施例3：制备具有插入的ap-egfp的prsetb载体
为了表达ap-egfp蛋白，使用限制酶和连接酶将制备实施例2中制备的789-bpdna片段插入到蛋白质表达载体prsetb中。
用nhei和hindiii(neb)酶处理制备实施例2中扩增的dna片段以使dna的5′/3′端具有粘性。同时，用相同的限制酶处理prsetb以制备具有nhei和hindiii插入位点的线性prsetb载体。每个酶促反应后，使用pcr纯化试剂盒(cosmogenetech)分离产物。
将分离的ap-egfp双链dna片段和prset-b载体在25℃用t4连接酶(neb)处理2小时。通过1％琼脂糖凝胶电泳分析ap-egfp双链dna片段和prset-b载体的浓度(图2)。
将其中插入了ap-egfp的所得环状prsetb载体转化到dh5α大肠杆菌中，并且选择当在包含50μg/ml氨苄青霉素作为抗生素的平板lb培养基上培养时形成菌落的经转化大肠杆菌。将选择的大肠杆菌菌落在包含50μg/ml氨苄青霉素的液体lb培养基中再次培养然后使用质粒小量制备试剂盒(cosmogenetech)分离质粒载体(图3)。
为了确定分离的质粒载体是其中插入了ap-egfp的prsetb载体，将其用nhei和hindiii酶处理然后通过1％琼脂糖凝胶电泳进行分析。结果，证实了789-bpap-egfp的dna片段插入在2.9-kbpprset-b载体中(图4)。这可以通过dna碱基序列分析(bionics)最终证实。其中插入了ap-egfp的prsetb载体的结构如图5所示。
制备实施例4：在大肠杆菌中表达ap-egfp蛋白并且纯化
将制备实施例3的其中插入了ap-egfp的prsetb载体转化到大肠杆菌bl21(de3)starplyss中。将在包含34μg/ml氯霉素和50μg/ml氨苄青霉素作为抗生素的平板lb培养基上形成的菌落在50ml液体lb培养基中于37℃培养10小时，然后转移至500ml新鲜的lb培养基中。在相同温度下培养直到通过分光光度计测量的大肠杆菌的数量达到o.d.0.5后，加入浓度为1mm的iptg(异丙基β-d-1-硫代吡喃半乳糖苷)并且将大肠杆菌在设定为20℃和150rpm的振荡培养箱中进一步培养14小时。由大肠杆菌表达的蛋白质包含位于prset-b载体的ap-egfp上游的6x-his标签。蛋白质如下进行纯化。
将培养物离心并且在自然条件下在裂解缓冲液(0.5mnacl，5mm咪唑，20mmtris-hcl，ph8.0)中重悬。然后，使用超声波细胞破碎机vcx-130(sonics&materials)破碎细胞然后离心。将分离的上清液通过0.45-μm滤膜(advantec)过滤一次并允许在室温下结合至ni-nta琼脂糖(qiagen)1小时。然后，仅结合至ni-nta琼脂糖的蛋白产物与组氨酸柱(组氨酸柱，bio-rad)结合。用20mm咪唑溶液洗涤后，利用250mm的咪唑溶液洗脱蛋白质。最后，使用pd-10脱盐柱(amershambiosciences)从洗脱的蛋白产物中纯化ap-egfp(图6)。
制备ap-rptp蛋白和重组表达载体
制备实施例5：制备编码具有连接在n-末端的ap的rptp的双链dna
通过将编码具有seqidno1的氨基酸序列的皮肤穿透肽的dna碱基序列添加至编码衍生自rptp的n-末端seqidno20的一部分的dna碱基序列来构建正向引物。
seqidno21的正向引物包含在5′端的用于dna克隆的nhei限制酶识别位点和在ap和rptp碱基序列之间的bamhi和ecori限制酶识别位点。同时，构建了seqidno22的反向引物用于通过pcr扩增ap-rptp。反向引物包含编码rptp的c-末端的一部分的dna碱基序列。为了dna克隆，xhoi限制酶识别位点插入在引物的5′端。
使用包含rptp基因的pet28a载体作为模板并使用seqidno21和seqidno22的引物进行pcr。在95℃初始热变性3分钟后，使用pcr仪(bio-rad)进行pcr30个循环(95℃模板热变性20秒→50℃在引物和模板之间聚合20秒→72℃延伸30秒)。
对得到的扩增产物ap-rptp进行1％琼脂糖凝胶电泳。证实扩增了945-bp的dna片段。
制备实施例6：制备具有插入的ap-rptp的pet28a载体
为了表达ap-rptp蛋白，使用限制酶和连接酶将制备实施例5中制备的945-bpdna片段插入到蛋白质表达载体pet28a中。
用nhei和hindiii(neb)酶处理制备实施例5中扩增的dna片段以使dna的5′/3′端具有粘性。同时，用相同的限制酶处理pet28a以制备具有nhei和xhoi插入位点的线性pet28a载体。每个酶促反应后，使用pcr纯化试剂盒(cosmogenetech)分离产物。
将分离的ap-rptp双链dna片段和pet28a载体在25℃用t4连接酶(neb)处理2小时。通过1％琼脂糖凝胶电泳分析ap-rptp双链dna片段和pet28a载体的浓度(图2)。
将其中插入了ap-rptp的所得的环状pet28a载体转化到dh5α大肠杆菌中，并且选择当在包含50μg/ml卡那霉素作为抗生素的平板lb培养基上培养时形成菌落的经转化大肠杆菌。将选择的大肠杆菌菌落在包含50μg/ml卡那霉素的液体lb培养基中再次培养然后使用质粒小提试剂盒(cosmogenetech)分离质粒载体(图3)。
为了确定分离的质粒载体是其中插入了ap-rptp的pet28a载体，将其用nhei和xhoi酶处理然后通过1％琼脂糖凝胶电泳进行分析。结果，证实了945-bpap-rptp的dna片段插入在2.9-kbppet28a载体中。这可以通过dna碱基序列分析(bionics)最终证实。
制备实施例7：在大肠杆菌中表达ap-rptp蛋白并且纯化
将制备实施例6的其中插入了ap-rptp的pet28a载体转化到大肠杆菌rosetta中。将在包含34μg/ml氯霉素和50μg/ml卡那霉素作为抗生素的的平板lb培养基上形成的菌落在在50ml液体lb培养基中于37℃培养10小时，然后转移至500ml新鲜的lb培养基中。在相同温度下培养直到通过分光光度计测量的大肠杆菌的数量达到o.d.0.5后，加入浓度为0.2mm的iptg(异丙基β-d-1-硫代吡喃半乳糖苷)并且将大肠杆菌在设定为20℃和150rpm的振荡培养箱中进一步培养14小时。由大肠杆菌表达的蛋白质包含位于pet28a载体的ap-rptp上游的6x-his标签。蛋白质如下进行纯化。
将培养物离心然后在自然条件下在裂解缓冲液中(0.3mnacl，10rnm咪唑，50mmnah2po4，ph8.0)中重悬。然后，使用超声波细胞破碎机vcx-130(sonics&materials)破碎细胞然后离心。将分离的上清液通过0.45-μm滤膜(advantec)过滤一次并允许在室温下结合至ni-nta琼脂糖(qiagen)1小时。然后，仅结合至ni-nta琼脂糖的蛋白产物与组氨酸柱(组氨酸柱，bio-rad)结合。用20mm咪唑溶液洗涤后，利用250mm的咪唑溶液洗脱蛋白质。最后，使用pd-10脱盐柱(amershambiosciences)从洗脱的蛋白产物中纯化ap-rptp(图51)。
测试实施例1：比较ap-egfp蛋白进入永生化人t细胞jurkat细胞的递送效率
将制备实施例4中纯化的ap-egfp蛋白递送到永生化人t细胞jurkat细胞中并研究效率。使用rpmi培养基(hyclone)培养jurkat细胞然后转移至含有350μlrpmi培养基的24孔板(spllifesciences)，在100μlrpmi培养基中每孔1x106个细胞。然后，在将蛋白质与50μld-pbs(welgene)混合至总体积500μl后，在以下的各种条件下用蛋白质处理细胞。除非以下另有说明，否则将细胞用5μm的每种蛋白质处理然后在5％co2的培养箱中于37℃培养1小时。
首先，在用浓度为1μm或5μm的ap-egfp蛋白处理后，将细胞在5％co2的培养箱中37℃培养1小时。作为对照组，使用了未连接至ap的egfp蛋白和作为现有细胞穿透肽之一的tat-egfp蛋白。1小时后，回收所有的细胞并转移至管中。在进行离心后，除去上清液。将用1mld-pbs洗涤细胞、重悬然后离心的过程重复2次。洗涤后，将得到的细胞最终重悬在500μld-pbs中，并且使用facs仪(facscantoii，bdscience)通过流式细胞术测量细胞内荧光来测量蛋白质进入细胞的递送效率。结果，证实ap-egfp蛋白以浓度依赖的方式递送到了jurkat细胞内。
然后，在用浓度为5μm的ap-egfp蛋白处理后，将细胞在5％co2的培养箱中于37℃培养30分钟至4小时。如上所述洗涤细胞后，通过流式细胞术测量细胞内荧光。结果，证实ap-egfp蛋白以时间依赖的方式递送到了jurkat细胞内(图7)。
测试实施例2：与现有细胞穿透肽比较蛋白质递送进入jurkat细胞的效率
为了与现有细胞穿透肽比较递送效率，将每种蛋白质以与测试实施例1中描述的相同方式在相同浓度下和相同时间内递送到jurkat细胞内。
使用未与细胞穿透肽连接的egfp蛋白作为阴性对照组，并且使用其中egfp(增强的绿色荧光蛋白)与各自的细胞穿透肽连接的tat-egfp、r9-egfp和hph-1egfp作为阳性对照组。结果，证实本公开内容的ap序列以比tat更高的效率将蛋白质递送到jurkat细胞内(图8)。
测试实施例3：与现有皮肤穿透肽比较蛋白质递送进入jurkat细胞的效率
为了与现有皮肤穿透肽比较递送效率，将每种蛋白质以与测试实施例1中描述的相同方式在相同浓度下和相同时间内递送到jurkat细胞内。
使用未与皮肤穿透肽连接的dtomato荧光蛋白作为阴性对照组，并且使用其中dtomato荧光蛋白与皮肤穿透肽连接的tdp1-dtomato和tdp2-dtomato作为阳性对照组。
tdp1-dtomato是具有seqidno16的氨基酸序列的融合产物，其通过在韩国专利公开no.10-2013-0135207中公开的皮肤穿透肽(氨基酸序列‘ngslnthlapil’，以下称为‘具有seqidno15的氨基酸序列的肽’或‘tdp1’)的c-末端连接可被限制酶识别的接头(氨基酸序列“gs”)然后在接头的c-末端连接dtomato荧光蛋白获得。
tdp2-dtomato是具有seqidno18的氨基酸序列的融合产物，其通过在韩国专利公开no.10-2013-0070607中公开的皮肤穿透肽(氨基酸序列‘mraaapavaa’，以下称为‘具有seqidno17的氨基酸序列的肽’或‘tdp2’)的c-末端连接可被限制酶识别的接头(氨基酸序列“gs”)然后在接头的c-末端连接dtomato荧光蛋白获得。
如同测试实施例2中其中ap与egfp连接的融合产物被有效地递送到jurkat细胞内，与阴性对照组(单独的dtomato)相比，其中ap与dtomato连接的融合产物也显示出显著改善的递送效率。还证实了当其与具有大分子量的荧光蛋白dtomato相连时，现有皮肤穿透肽tdp1或tdp2表现出与ap-dtomato相比非常低的递送效率(图9)。
测试实施例4：与现有细胞穿透肽比较蛋白质递送进入皮肤细胞的效率
hacat细胞是在研究与透皮递送和皮肤病相关的体外递送效率和机制中使用的人表皮细胞[jinvestdermatol.2011jul.131(7)：1477-85；biochempharmacol.2008mar15；75(6)：1348-57]。另外，nih3t3细胞鼠真皮细胞，其与hacat细胞一样经常用于研究透皮递送和皮肤病机制的体外实验[jpharmsci.2013nov.102(11)：4109-20；jimmunol.2003jan1.170(1)：548-55.]。
使用hacat细胞和nih3t3细胞，将egfp荧光蛋白通过ap进入皮肤细胞的递送效率与现有细胞穿透肽的递送效率进行比较。结果如图10和图11所示。
如同测试实施例2中，使用未与细胞穿透肽连接的egfp蛋白作为阴性对照组，并且使用其中egfp与各自的细胞穿透肽连接的tat-egfp和r9-egfp作为阳性对照组。此外，使用其中ap序列的半胱氨酸被丙氨酸替换的apc→aegfp作为另一测试组。
证实与tat或r9相比，ap不仅可以有效地将具有大分子量的蛋白质递送到免疫细胞(jurkat细胞)内，而且可以递送到hacat细胞和nih3t3细胞内。当氨基酸序列中的半胱氨酸替换成丙氨酸时，ap的递送效率显著降低。
测试实施例5：与现有皮肤穿透肽比较蛋白质递送进入皮肤细胞的效率
使用hacat细胞和nih3t3细胞，将dtomato荧光蛋白通过ap进入皮肤细胞的递送效率与现有皮肤穿透肽的递送效率进行比较。结果如图12和图13所示。
如同测试实施例3中，使用未与皮肤穿透肽连接的dtomato蛋白作为阴性对照组，并且使用其中dtomato荧光蛋白与各自的皮肤穿透肽连接的tdp1-dtomato和tdp2-dtomato作为阳性对照组。
证实ap不仅可以有效地将具有大分子量的蛋白质递送到免疫细胞(jurkat细胞)内，而且可以递送到hacat细胞和nih3t3细胞内，而现有皮肤穿透肽tdp1和tdp2在与具有大分子量的蛋白质连接时，其改善穿透效率的效果不明显。
测试实施例6：根据构成ap的氨基酸的替换、移除或添加比较蛋白质递送效率
为了研究构成ap的每个氨基酸的作用，制备并分析了多种变体用于比较。
(1)根据末端氨基酸的移除比较蛋白质递送效率
首先，制备从ap的n-末端移除一个精氨酸(ap_d1，seqidno2)，从c-末端移除一个精氨酸(ap_d2，seqidno3)以及从n-末端和c-末端的每一端移除一个精氨酸(ap_d3，seqidno4)的变体，然后将它们与作为对照组的egfp、ap-egfp、tat-egfp和r9-egfp进行比较。
结果，发现当失去一个精氨酸，即当x1的数目小于3或当x2的数目小于4时，与ap相比递送效率显著降低。因此，证实了在通过ap将蛋白质递送至细胞内的过程中氨基酸x1和x2数目下限的临界含义。
(2)根据x2、半胱氨酸或x3的替换比较蛋白质递送效率
为了研究色氨酸(x2)、半胱氨酸和赖氨酸(x3的首个氨基酸)的作用，通过用丙氨酸或精氨酸替换每个氨基酸来制备变体。丙氨酸适合于作为对照组，因为其不带电荷，是最简单的并且具有小的尺寸。
使用具有带正电荷的精氨酸的变体作为对照组，用于与包含9个精氨酸的r9比较效率。结果，丙氨酸变体和精氨酸变体显示出类似的模式。由于当用其他的氨基酸替换色氨酸时没有观察到效率方面的显著差异，所以证实其对ap的功能作用没有显著贡献。当用其他的氨基酸替换精氨酸时，效率大幅降低。认为带正电荷的精氨酸起到了积极的作用。当用其他氨基酸替换半胱氨酸时观察到了效率的最大降低。这表明半胱氨酸在ap中起到非常重要的功能作用(图15和图16)。
测试实施例7：研究ap的细胞穿透机制
为了研究ap是否如同最众所周知的现有细胞穿透肽tat一样通过内吞作用被递送至细胞内，测量了根据温度细胞内递送的变化并且研究了其是否根据培养基的血清浓度受到其他蛋白质的影响。使用未与细胞穿透肽连接的egfp作为阴性对照组，并且使用tat-egfp作为阳性对照组。
将jurkat细胞如上所述用5μm每种蛋白质在4℃、25℃和37℃的温度下独立地处理1小时。结果，证实了与tat一样，细胞内递送受到温度的影响。这表明了ap与tat一样通过能量依赖的内吞作用递送。因此，证实了ap以类似于先前已知的细胞穿透肽的方式将蛋白质递送至细胞内。此外，证实了在所有的温度下递送效率都高于tat(图17，顶部)。
另外，当rpmi培养基中的血清浓度分别为0％和10％时，分析了每种蛋白质(5μm)的递送效率。在用每种蛋白质处理后，将细胞在37℃培养1小时。使用未与细胞穿透肽连接的egfp作为阴性对照组，并且使用tat-egfp作为阳性对照组。
结果，证实了ap-egfp通过细胞膜进入细胞的递送效率随着血清浓度而降低。这表明了细胞穿透肽受到与其他蛋白质的竞争或相互作用的影响并且再次证实了根据本公开内容的ap作为细胞穿透肽的功能。在每个血清浓度下，ap都显示了比阳性对照组更高的递送效率(图17，底部)。测试实施例8：根据肝素和mβcd浓度变化的ap-egfp的细胞内蛋白质递送效率
(1)根据肝素浓度变化的ap-egfp的胞内蛋白质递送效率
预期用可干扰细胞穿透肽与细胞表面的硫酸乙酰肝素的结合的肝素处理将直接或间接地影响基于在测试实施例4中证实的ap-egfp递送机制的相互作用，将jurkat细胞用0μm/ml、10μm/ml、20μm/ml和50μm/ml的不同浓度肝素(肝素钠盐，来自猪肠粘膜，sigma)，然后用经d-pbs将终体积补充至100μl的10μm/mlap-egfp处理30分钟。使用tat-egfp作为阳性对照组用于比较。然后将细胞在5％co2的培养箱中37℃培养1小时。1小时后，回收所有的细胞并转移至管中。在进行离心后，除去上清液。将用1mld-pbs洗涤细胞、重悬然后离心的步骤重复2次。洗涤后，将得到的细胞最终重悬在500μl的d-pbs中，并且使用facs仪(facscanto，bdscience)通过流式细胞术测量细胞内荧光来测量蛋白质进入细胞的递送效率。
结果，证实随着肝素浓度升高，ap-egfp的细胞内递送效率显著降低(图18，顶部)。
(2)根据mβcd浓度变化的ap-egfp的细胞内蛋白质递送效率
另外，预期ap-egfp的细胞内递送将受到与组成细胞膜磷脂双层的脂质筏相关的内吞作用的影响，通过用已知从细胞膜中除去胆固醇的mβcd(甲基-β-环糊精)预先处理会抑制脂质介导的内吞作用。在冰上用0mm、3mm或5mm的mβcd处理jurkat细胞20分钟后，将细胞用10μmap-egfp处理1小时。使用tat-egfp作为阳性对照组用于比较。结果，证实随着mβcd浓度升高，ap-egfp的细胞内递送效率显著降低(图18，底部)。
这也表明了细胞穿透肽受到与其他蛋白质的竞争或相互作用的直接或间接影响，并且再次证实根据本公开内容的ap作为细胞穿透肽的功能。
测试实施例9：ap-egfp递送到hela癌细胞中
为了研究ap是否实际上与蛋白质一起被递送至细胞内以及其存在于细胞内的何处，将ap-egfp递送到hela细胞(宫颈癌细胞)中，并使用共焦显微术进行分析。
在12孔板(spllifesciences)每孔中的圆形盖玻片(marinfield)上接种1x105个hela细胞后，将细胞在dmem培养基(hyclone)中培养18小时以便细胞附着于盖玻片上。在通过吸出完全弃去培养基并且添加450μl新鲜的dmem后，将细胞用制备实施例3中纯化的ap-egfp(5μm)处理，所述已经ap-egfp通过与d-pbs混合将终体积补充到了50μl。然后，将细胞在5％co2的培养箱中37℃培养1小时。然后，在通过吸出完全弃去培养基以除去细胞外蛋白后，用1mld-pbs洗涤细胞。该步骤重复5次。然后，用1ml甲醛(甲醛37％溶液，福尔马林，sigma)固定细胞。固定后，用1mld-pbs洗涤细胞5次。然后，用500μl稀释至1：4000的hoechst染色剂(hoechstag)染色细胞核。10分钟后，用1mld-pbs洗涤细胞5次。使用封固剂(sigma)将制备的盖玻片安装于载玻片上并且使用荧光显微镜dmi-8(leica)观察绿色荧光蛋白的定位和细胞内递送。结果，证实ap-连接的绿色荧光蛋白通过细胞膜被递送至细胞内并且存在于细胞质中(图19)。
测试实施例10：ap-egfp递送到hacat和nih3t3皮肤细胞中
为了研究ap是否实际上与蛋白质一起被递送至皮肤细胞内以及其存在于皮肤细胞内的何处，以与测试实施例9中相同的方式将ap-egfp递送到hacat和nih3t3皮肤细胞中并使用共焦显微术进行分析。使用tat-egfp和r9-egfp作为阳性对照组用于比较。此外，使用其中ap序列的半胱氨酸被丙氨酸替换的apc→aegfp作为另一测试组。
结果，证实ap-连接的绿色荧光蛋白以比阳性对照组或c→aegfp更高效率通过细胞膜被递送至皮肤细胞内并且存在于核和细胞质中(图20和图21)。
测试实施例11：ap-egfp递送到小鼠器官中
为了研究ap是否在实际体内的环境下被递送以及如果这样，多少可被递送至何种器官中，将5mgap-egfp蛋白质腹膜内注射至6周大的雌性c57bl/6小鼠。2小时后，取出诸如脑、心脏、肾脏、肝脏、肺、脾、肠等器官并用4％多聚甲醛固定。在用d-pbs洗涤2-3次后，使用oct化合物制备冷冻块。在使用低温恒温器制备6μm厚的切片后，在荧光显微镜下观察玻片样品以确认ap-egfp递送到了组织器官中。将玻片样品用hoechst染色剂染色10分钟并且通过与荧光蛋白重叠研究细胞内递送。使用未与细胞穿透肽连接的egfp作为对照组。结果，证实与egfp相比，ap连接的绿色荧光蛋白能更好地被递送至脑、心脏、肾脏、肝脏、肺、脾、肠等的细胞内(图22)。
测试实施例12：ap-egfp随时间递送到小鼠皮肤内
为了研究ap是否被递送至皮肤组织中以及如果这样，其可被递送至多深，将7周大的雌性c57bl/6小鼠脱毛并且通过附着并分离胶带10次从皮肤上除去角质层后，利用纸贴片粘附100μgap-egfp。2小时、4小时、6小时和8小时后，取出皮肤组织并用4％多聚甲醛固定。然后，使用oct化合物制备冷冻块。在使用低温恒温器制备7μm厚的切片后，在荧光显微镜下观察玻片样品以确认ap-egfp递送到了皮肤组织内。将玻片样品用hoechst染色剂染色15分钟并且通过与荧光蛋白重叠研究细胞内递送。使用未与现有细胞穿透肽连接的tat-egfp作为阳性对照组。
然而，直到8小时tat-egfp才能将绿色荧光蛋白递送至皮肤组织内，而ap连接的绿色荧光蛋白(ap-egfp)在2小时后被显著地递送至组成皮肤组织的细胞内(图23)。
测试实施例13：ap-dtomato进入小鼠皮肤的蛋白质递送效率与现有皮肤穿透肽的比较
研究了与现有皮肤穿透肽相比，与具有大的分子量的dtomato荧光蛋白连接的本公开内容的ap能否将荧光蛋白递送至皮肤组织内。如同在测试实施例3中，使用未与皮肤穿透肽连接的dtomato荧光蛋白作为阴性对照组，并且使用其中dtomato荧光蛋白与各自的皮肤穿透肽连接的tat-dtomato、tdp1-dtomato和tdp2-dtomato作为阳性对照组用于比较。实验以与测试实施例12相同的方式进行，只是在6小时后取出皮肤组织。
证实只有本公开内容的ap-dtomato将dtomato荧光蛋白递送到了皮肤组织内(图24)。
测试实施例14：ap-dtomato递送至绿色荧光蛋白靶向的小鼠的皮肤内
为了阐明本公开内容的ap被递送至皮肤组织的皮肤细胞内，以与测试实施例12中相同的方式，使用纸贴片将ap-dtomato荧光蛋白附着于在所有细胞中表达绿色荧光蛋白(gfp)的gfp基因靶向的小鼠的皮肤上。6小时后，取出皮肤组织并用4％多聚甲醛固定。然后，使用oct化合物制备冷冻块。在使用低温恒温器制备20μm厚的切片后，在荧光显微镜下观察玻片样品以确认ap-egfp递送到了皮肤组织中。
将玻片样品用hoechst染色剂染色15分钟并且通过与荧光蛋白重叠研究细胞内递送。结果如图25和图26所示。使用未与皮肤穿透肽连接的dtomato作为阴性对照组。
结果，显然证实与dtomato相比，与ap连接的红色荧光蛋白被递送至组成皮肤组织的细胞内(图25)。ap-dtomato荧光蛋白进入gfp表达绿色细胞内的递送还通过在高放大倍率下的图像得到了证实。
测试实施例15：ap-egfp蛋白和ap-rptp蛋白在大肠杆菌中的表达和纯化
对在制备实施例4中纯化的ap-egfp蛋白和在制备实施例7中纯化的ap-rptp蛋白进行12％sds凝胶电泳。结果如图27所示。
从图27中可见，两种蛋白在大肠杆菌中适当地表达并且很好地纯化。
测试实施例16：ap-rptp蛋白的三维结构
图28示出了预测的在制备实施例7中纯化的ap-rptp蛋白的三维结构。其通过sparksx(http：//sparks-lab.org)预测并使用pymol显示。
从图28中可见，ap-rptp蛋白保持了几乎完整的rptp蛋白的三维结构并且没有观察到结构的迅速改变。
测试实施例17：测量ap-egfp蛋白和ap-rptp蛋白的磷酸酶活性
图29示出了研究在制备实施例4中纯化的ap-egfp蛋白和在制备实施例7中纯化的ap-rptp蛋白的磷酸酶活性的结果。
为了测量ap-egfp蛋白和ap-rptp蛋白的磷酸酶活性，在向ap-egfp蛋白和ap-rptp蛋白添加比色底物后进行pnpp(对硝基苯磷酸酯)测定(bioassay517systems，hayward，ca，usa)。
从获得的数据中，绘制相对于蛋白质浓度的初始速率(v0)。通过单因素方差分析(*p＜0.001)进行统计学分析。
从图29中可见，ap-rptp蛋白显示了1.5nmol/min/μg的磷酸酶活性，而ap-egfp蛋白未检测到任何活性。
测试实施例18：研究ap-rptp蛋白进入皮肤细胞的递送效率
hacat细胞是在研究与透皮递送和皮肤病相关的体外递送效率和机制中使用的人表皮细胞[jinvestdermatol.2011jul.131(7)：1477-85；biochempharmacol.2008mar15；75(6)：1348-57]。
使用hacat细胞研究了本公开内容的ap-rptp蛋白是否能被递送到皮肤细胞中。结果如图30所示。用抗his标签抗体对ap-rptp蛋白染色。通过alexafluor-488缀合的抗鼠igg抗体放大信号并且通过流式细胞术测量细胞内荧光强度。
图30示出了制备实施例7中制备的ap-rptp进入皮肤表皮hacat细胞的蛋白质递送效率的通过流式细胞术的细胞内荧光强度分析的结果。在图30中，右边图中的x轴表示mfi，或“平均荧光强度”。
从图30中可见，用1μm或5μmap-rptp蛋白处理1小时后，ap-rptp蛋白以非常优异的效率被递送至细胞内。
测试实施例19：研究随时间的ap-rptp蛋白进入皮肤细胞的递送效率
hacat细胞是在研究与透皮递送和皮肤病相关的体外递送效率和机制中使用的人表皮细胞[jinvestdermato1.2011jul.131(7)：1477-85；biochempharmacol.2008mar15；75(6)：1348-57]。
用ap-rptp蛋白处理hacat细胞不同的时间(0.5至12小时)后，比较进入皮肤细胞的递送效率(图31)。
用抗his标签抗体对ap-rptp蛋白进行染色。信号通过alexafluor-488共轭的抗鼠igg抗体放大并且通过流式细胞术测定细胞内荧光强度。
图31示出了通过流式细胞术进行细胞内荧光强度分析的结果，比较了，比较了随时间通过制备实施例7中制备的ap-rptp将蛋白质递送至皮肤表皮hacat细胞内的递送效率。在图31中，右边图中的x轴表示mfi，或“平均荧光强度”。
从图31中可见，在2小时后达到最大的荧光强度。此后荧光强度迅速降低并在12小时后保持平稳。通过这样，证实本公开内容的ap-rptp蛋白可在1至8小时内实现足够的细胞内递送效率。最特别地，通过处理1.5至3.5小时能达到1.5倍或更高的细胞内递送效率。
测试实施例20：研究在脾细胞中ap-rptp蛋白的细胞因子信号转导抑制效率
研究了ap-rptp蛋白是否可抑制细胞因子信号转导。特别地，将从6至8周大的c57bl/6小鼠中取出的脾细胞分别用pbs、ap-rptp和ap-egfp在37℃孵育1小时，然后用细胞因子重组小鼠ifn-γ(10ng/ml；bd)、il-4(20ng/ml；bd)和il-6(30ng/ml；bd)激活。将细胞在冰上用pbs和ripa缓冲液(cellsignaling，beverly，ma，usa)(1mmnaf，1mmpmsf，halt蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合物(thermofisherscientific，waltham，ma，usa))洗涤30分钟。
通过免疫印迹测量每种细胞因子刺激的stat蛋白的酪氨酸磷酸化。使用pvdf膜(bio-rad)和磷酸化stat1(tyr701)兔mab、磷酸化stat3(tyr705)兔mab和磷酸化stat6(tyr641)兔mab作为一抗进行免疫印迹。试剂购买自cellsignaling，β-肌动蛋白鼠mab购买自santacruzbiotechnology(ca，usa)。
图32示出了用ap-rptp蛋白处理的小鼠脾细胞中细胞因子的刺激效果。在每个条带的左上角标记的ifn-γ、il-6和il-4表示相应细胞因子的刺激。
na表示没有免疫细胞激活并且对应于阴性对照组。pbs表示用ifn-γ、il-6和il-4刺激用于激活免疫细胞并且对应于阳性对照组。示出了4个独立试验的代表性结果(n＝4)。
从图32中可见，作为用ap-rptp或ap-egfp蛋白孵育1小时，用ifn-γ、il-6和il-4分别刺激60分钟、30分钟或15分钟，以及比较stat蛋白的磷酸化程度的结果，证实了用ap-rptp蛋白处理导致stat1、stat3和stat6的磷酸化显著降低。
总之，通常认为根据本公开内容的ap-rptp蛋白在免疫细胞中负调节细胞因子信号转导。
测试实施例21：研究通过ap-rptp蛋白的脾细胞中cd4t细胞的增殖效率
研究了根据本公开内容的ap-rptp蛋白能否还可以调节t细胞的活性。
在0.5％co2的培养箱中37℃下，将0.1μg的抗cd3和抗cd8抗体在96孔板上包被5小时。然后，以每孔2.5x105个细胞接种分离的小鼠脾细胞。用pbs或ap-rptp蛋白处理后，将细胞在0.5％co2的培养箱中37℃培养3天。然后，用cfse(invitrogen，carlsbad，ca，usa)在4℃对细胞进行荧光染色20分钟。然后，通过流式细胞术(facs)分析来自制备的细胞的cfse信号。
图33示出了用na或pbs(‘na’和‘α-cd3αcd28+pbs’；a，b)处理的原代小鼠cd4-t细胞的增殖和用ap-rptp蛋白(c)处理的原代小鼠cd4-t细胞的增殖的测量结果。
na表示免疫细胞未激活并且对应于阴性对照组。pbs表示用抗cd3和抗cd28单克隆抗体刺激用于激活免疫细胞并且对应于阳性对照组。
从图33中可见，作为研究由激活的t细胞产生的细胞因子和通过用抗cd3和抗cd28抗体刺激的cd4t细胞的增殖的结果，证实ap-rptp显著降低了激活的t细胞的增殖。
测试实施例22：脾细胞中ap-rptp蛋白和ap-egfp蛋白的细胞因子表达水平的比较
在0.5％co2的培养箱中37℃下，将2μg/rml(bdpharmingen)的抗cd3和抗cd28抗体在96孔板上包被5小时。然后，以每孔2.5x105个细胞接种分离的小鼠脾细胞。用ap-egfp蛋白或ap-rptp蛋白处理后，将细胞在0.5％co2的培养箱中37℃培养3天。然后，对细胞培养上清液进行对于ifn-γ(biolegend)、il-2(biolegend)、il-13(ebioscience)和il-17(ebioscience)的elisa分析。结果如图34所示。使用购买自biolegend的elisa试剂盒并且根据标准步骤进行elisa分析。
图34a-34d示出了用ap-rptp或ap-egfp蛋白处理的小鼠脾细胞中细胞因子il-17(34a)、il-13(34b)、ifn-γ(34c)和il-2(34d)的表达水平的测量结果。所有数据为至少3个实验的平均值。数据表示为平均值±标准差(*：p＜0.05；**：p＜0.01；***：p＜0.001)。通过单因素方差分析进行统计学分析。
从图34a-34d中可见，证实包含il-2、ifn-γ、il-13和il-17的多种的细胞因子的产生以浓度(剂量)依赖的方式显著降低。该结果证实了根据本公开内容的ap-rptp蛋白可用作潜在的免疫调节剂，其不仅调节炎性细胞因子信号转导而且调节t细胞的增殖和活性。
测试实施例23：在
在将7周大的雌性c57bl/6小鼠脱毛后，第二天通过喷涂10μl在丙酮∶橄榄油(4∶1)中的2％
结果，证实与用pbs处理的阴性对照组相比，涂有ap-rptp的小鼠组的耳显示了炎症减轻(图36)。作为使用千分尺(mitutoyo)测量耳厚度的结果，证实与用阴性对照组相比，涂有ap-rptp的组的耳厚度降低(图37)。同样，观察到了耳重量的降低(图38)。
更特别地，将耳用4％多聚甲醛固定1天并且在通过浸于30％蔗糖中使组织脱水1天后使用oct化合物制备冷冻块。制备10μm厚的切片后，用h&e对其染色并在光学显微镜下观察。结果，证实与阴性对照组相比，耳厚度降低(图39)。
虽然还用其中使用现有细胞穿透肽替换ap的tat-rptp融合产物或r9-rptp融合产物进行了实验以便研究rptp介导的病理学调节的调节功能，证实与ap-rptp不同，它们并没有表现出调节功能。换言之，与阴性对照组相比，它们并没有显示出显著改变。
测试实施例24：比较
对在测试实施例23中制备的
证实用根据本公开内容的ap-rptp蛋白处理(红)显示了与假手术(黑，对照组)相似的细胞因子和趋化因子的表达水平。与用根据本公开内容的ap-rptp蛋白处理相比，用ap-egfp蛋白(绿)处理引起了细胞因子和趋化因子显著升高。细胞因子表达水平升高至两倍或更高以及趋化因子表达水平升高高达3倍。
换言之，证实ap-rptp蛋白可有效地控制患有oxa诱导的急性皮炎的皮肤组织中的炎症反应。
测试实施例25：在卵白蛋白(ova)诱导的慢性皮炎动物模型中研究ap-rptp蛋白的预防和治疗效果
将7至8周大的雌性balb/c小鼠脱毛后，使用无菌纱布将100μg卵白蛋白施用于背部。该步骤在1周内重复3次。
更特别地，每次施用将100μgap-rptp蛋白与ova共同施用用于研究预防效果，以及仅在最终ova施用期间施用ap-rptp蛋白用于研究治疗效果(图42)。
更特别地，将背部组织用4％多聚甲醛固定1天并在通过浸于30％蔗糖中使组织脱水1天后制备石蜡块。制备6μm厚的切片后，用h&e对其染色并在光学显微镜下观察。结果，证实当用根据本公开内容的ap-rptp处理时，背部厚度显著降低并且炎症显著降低(预防或治疗模型)，而阴性对照组(假手术)显示了表皮增生(图43)。
图44示出了图43中h&e染色的组织学评分的比较结果。证实用ap-rptp蛋白透皮治疗小鼠引起了在预防模型和治疗模型二者中炎症组织的显著减少。
图45示出了预防模型和治疗模型的皮肤组织中il-13mrna表达水平的比较结果。可以看出用本公开内容的ap-rptp的处理引起了il-13mrna表达水平的显著降低。
总结这些结果，可以看出急性或慢性变应性皮炎的炎症可使用纸贴片透皮施用ap-rptp显著减轻。换言之，证实了对皮炎的预防和治疗效果。测试实施例26：在咪喹莫特诱导的银屑病样皮炎动物模型中研究ap-rptp蛋白的预防和治疗效果
由于根据本公开内容的ap-rptp蛋白靶向炎性细胞因子信号转导和t细胞受体信号转导，所以预期其可对过敏性炎症以外的皮肤病表现出预防或治疗效果。进行以下实验来证明这一点。
在将7周大的雄性c57bl/6小鼠脱毛后，从第二天起每天使用纸贴片将艾达乐(aldara)(咪喹莫特5％)乳膏和100μgap-rptp或ap-egfp施用于耳1小时(图46)。每天测量耳厚度。结果如图47所示。在第7天进行病理学分析。结果如图48至50所示。
图47示出了用ap-rptp或ap-egfp处理6天的咪喹莫特诱导的银屑病样皮炎动物模型的耳厚度变化的测量结果。
从图47中可见，作为使用千分尺(mitutoyo)测量耳厚度的结果，证实与阴性对照组假手术相比，施用ap-rptp的小鼠组的耳厚度没有明显增加，并且与ap-egfp处理组相比，施用ap-rptp的组的耳厚度降低。
图48示出了光学显微图像，显示了用h&e染色后用ap-rptp或ap-egfp处理的小鼠组与阴性对照组(假手术)的耳厚度的差异。
从图48中可见，证实与用ap-egfp处理相比，用ap-rptp处理导致表皮的炎性细胞的侵袭和增生的显著降低。
图49示出了在用ap-rptp或ap-egfp处理的小鼠组或阴性对照组(假手术)的耳组织细胞中，细胞因子(il-7a、il-17f、il-6)的mrna表达水平的量化结果。图50示出了在用ap-rptp或ap-egfp处理的小鼠组或阴性对照组(假手术)的耳组织细胞中，抗菌肽(s100a8、s100a9)的mrna表达水平的量化结果。
从在图49和图50中所示的耳皮肤组织的mrna表达谱的研究结果中，证实当透皮施用ap-rptp时，il-17a、il-17f和il-6mrna的表达迅速降低。
同样证实ap-rptp的施用引起对嗜中性粒细胞具有趋化性的s100a8肽和s100a9肽明显减少。总之，可以看出当透皮施用时，ap-rptp对银屑病样的皮肤病表现出了非常有效的预防和治疗效果。
工业实用性
本公开内容的皮肤穿透肽和其中皮肤穿透肽与生物活性物质融合的融合产物可广泛应用于化妆品、药物等。
<110>iucf-hyu(industry-universitycooperationfoundationhanyanguniversity)
<120>皮肤穿透肽及其使用方法
<130>pct461
<160>22
<170>kopatentin2.0
<210>1
<211>9
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>皮肤穿透肽;ap
<400>1
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15
<210>2
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<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>皮肤穿透肽;ap
<400>2
argargtrpcyslysargargarg
15
<210>3
<211>8
<212>prt
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