在血管损伤部位的血小板活化和随后的血栓形成对于正常止血是至关重要的，但它也可能导致心肌梗塞和中风(coughlinsr.nature.2000；407：258-64)。血小板粘附和活化是涉及多个血小板受体-配体相互作用的多步过程。在血管壁损伤后，循环血小板通过糖蛋白(gp)ib-v-ix复合物与固定在暴露的内皮下细胞外基质上(例如胶原上)的vonwillebrand因子(vwf)的瞬时相互作用快速减少(shapiromj等人，thejournalofbiologicalchemistry.2000；275：25216-21)。这种相互作用使血小板靠近血管壁并促进gpvi和胶原之间的接触(nieswandtb等人，blood.2003；102：449-61)。gpvi-胶原相互作用诱导细胞内信号传导级联，导致血小板活化和次级血小板激动剂如血栓素a2(txa2)和二磷酸腺苷(adp)的释放。这些可溶激动剂与局部产生的凝血酶一起通过g蛋白(gi，gq，g12/13)偶联受体进一步促进血小板活化(offermannss，circulationresearch.2006；99：1293-304)。所有这些信号传导途径协同诱导复合细胞应答，如整联蛋白的活化，颗粒内容物的释放和提供用于活化凝血级联的促凝血表面(nakanishi-matsuim等人，nature.2000；404：609-13；cunninghamma等人，thejournalofexperimentalmedicine.2000；191：455-62)。最终的血栓被嵌入纤维蛋白网络中以承受由流动血液产生的剪切力。新形成的血栓的稳定对于在血管损伤部位阻止出血是必不可少的。它们在血小板粘附中的中心作用使两种受体复合物成为血小板研究的焦点：i)gpib-v-ix复合物与固定在受损血管壁或活化血小板上的vwf相互作用，从而将血小板从血流中募集到在高剪切条件下的反应性表面。ii)gpiib/iiia(整联蛋白iib3)是纤维蛋白原和vwf的受体，其需要由激动剂受体介导的内向外活化，有助于牢固抗剪切血小板粘附并且对于聚集体形成是必需的。gpib-v-ix复合物由4种相关的跨膜gp组成：gpib，gpib，gpv和gpix，它们以2：4：2：1的化学计量结合(luosz等人，blood.2007；109(2)：603-9)。在这个复合体中，gpib和gpib通过二硫键连接，并与gpix非共价结合。gpv与gpib-ix非共价结合(nieswandtb等人，jthrombhaemost.2009；7：206-9)。在人血小板表面上发现大约30,000个拷贝的gpib-ix复合物(varga-szabod等人，jthrombhaemost.2009；7：1057-66)。gpib-v-ix功能的丧失引起bernard-soulier综合征(bss)，一种严重的出血性疾病。bss的特征在于异常巨大的循环血小板，其对vwf的粘附有缺陷并且凝血酶响应性降低(canobbioi，等人cellularsignaling.2004；16：1329-44)。尽管gpib或gpix缺乏或功能障碍与bss相关，但未报道过gp5中的功能缺失突变，并且小鼠中gpv的缺乏不导致bss表型(ramakrishnanv等人，pnas.1999；96：13336-41；kahnml等人，blood.1999；94：4112-21)。gpv是复合物正确表达所不需要的唯一亚基(dongj-f等人，jbiolchem.1998；273:31449-54)。gpv是高度糖基化的并且含有凝血酶切割位点，导致在凝血酶存在下gpv从血小板表面的定量去除和可溶性gpv(sgpv)的产生(ravanatc等人，blood.1997；89：3253-62；azorsado等人，thrombosisandhaemostasis.1999；81：131-8)。通过凝血酶切割产生的可溶性人gpv具有如seqidno：10所示的氨基酸序列。值得注意的是，该凝血酶切割位点在小鼠、大鼠和人蛋白中是保守的(ravanatc等人，blood.1997；89：3253-62)。然而，与对凝血酶刺激不响应的蛋白酶活化受体(par)4-缺陷型小鼠(kahnml等人，blood.1999；94：4112-21；kahnml等人，nature.1998；394：690-4)相比，gp5-/-小鼠显示出非常正常的血小板功能。在体外，gp5-/-血小板与野生型血小板几乎不可区分(ramakrishnanv等人，pnas.1999；96：13336-41；kahnml等人，blood.1999；94：4112-21)。只有在用阈值剂量的凝血酶活化后，观察到增加的反应性(ramakrishnanv等人，pnas.1999；96：13336-41)，这已经被认为缺乏gpv作为与par竞争的凝血酶的替代底物。对于两种gp5-/-小鼠品系之一，报道了减少的尾出血时间，加速的血栓形成和增加的栓塞(ramakrishnanv等人，pnas.1999；96：13336-41；nih等人，blood.2001；98:368-73)，而第二个小鼠系的分析显示未改变的尾出血时间和受损的血栓形成(kahnml等人，blood.1999；94：4112-21；moogs等人，blood.2001；98：1038-46)。后一组将缺陷血栓形成归因于gpv在胶原信号传导中的作用，由此建立胶原作为gpv的配体(moogs等人，blood.2001；98：1038-46)。关于gp5-/-小鼠的最新报道使用与c57bl/6背景回交的小鼠，并证实了凝血酶响应性增加以及在胶原蛋白上略有降低的粘附性。通过使用激光损伤，作者证实gpv缺乏对血栓形成的影响取决于损伤的严重程度，并得出结论认为gpv与动脉血栓形成仅有微小的相关性(nonnec等人，jthrombhaemost.2008；6：210-2)。到目前为止，gpv在血栓形成和止血中的作用似乎与维持止血和血小板功能不太相关。然而，gpv在血栓形成、止血和血栓性炎性脑梗塞中的确切功能仍然不甚了解。发明概述本发明人令人惊讶地发现，用抗gpv细胞外结构域的区域(其与gpv的胶原结合位点不同)的抗体处理的小鼠显示出达到体内血栓形成的加速的时间。此外，抗体介导的gpv阻断可完全弥补体内血栓形成和止血中gpvi的缺乏。因此，本发明涉及以下实施方案[1]至[28]：[1]用作凝血剂的糖蛋白v(血小板糖蛋白v；gpv)的抑制剂。[2]用于治疗或预防出血性病症的糖蛋白v(血小板糖蛋白v；gpv)的抑制剂。[3]根据实施方案[2]使用的抑制剂，其中所述出血性病症是由血小板障碍引起的。[4]根据实施方案[3]使用的抑制剂，其中所述血小板障碍的特征在于血小板数目减少。[5]根据实施方案[3]或[4]使用的抑制剂，其中所述血小板障碍是血小板减少症，例如特发性血小板减少性紫癜，血栓性血小板减少性紫癜，由化疗引起的血小板减少症或免疫血小板减少症。[6]根据实施方案[2]至[4]中任一项使用的抑制剂，其中所述出血性病症选自炎症性出血，出血性中风，败血症引起的过度出血，血小板减少引起的过度出血，弥散性血管内凝血(dic)引起的过度出血，化疗引起的过度出血，溶血性尿毒症综合征引起的过度出血，施用可溶性gpv时的过度出血以及hiv感染引起的过度出血。[7]根据前述实施方案中任一项使用的抑制剂，其中所述gpv是人gpv。[8]根据实施方案[7]使用的抑制剂，其中所述人gpv包含seqidno：3所示的氨基酸序列或由其组成。[9]根据前述实施方案中任一个使用的抑制剂，其中所述抑制剂是多肽。[10]根据实施方案[9]使用的抑制剂，其中所述抑制剂是(i)能够结合gpv的细胞外结构域的抗体，(ii)抗体的片段或衍生物，所述片段或衍生物能够结合gpv的细胞外结构域的抗体，(iii)能够结合gpv的细胞外结构域内的表位的抗体，或(iv)抗体的片段或衍生物，所述片段或衍生物能够结合gpv的胞外结构域内的表位。[11]根据实施方案[10]使用的抑制剂，其中所述细胞外结构域包含seqidno：3的氨基酸1至503或由其组成。[12]根据实施方案[10]或[11]使用的抑制剂，其中所述抗体、片段或衍生物结合gpv胞外结构域的不同于gpv的胶原结合位点的区域。[13]根据实施方案[10]至[12]中任一项使用的抑制剂，其中所述抗体、片段或衍生物不延迟胶原诱导的聚集。[14]根据实施方案[10]至[13]中任一项使用的抑制剂，其中所述表位在gpv的胶原结合位点外和/或不与gpv的胶原结合位点重叠。[15]根据实施方案[10]至[14]中任一项使用的抑制剂，其中所述抗体是单克隆抗体或其功能片段或功能衍生物。[16]根据前述实施方案中任一个使用的抑制剂，其中所述抑制剂是核酸。[17]根据实施方案[16]使用的抑制剂，其中所述核酸能够降低gpv的表达。[18]根据实施方案[17]使用的抑制剂，其中所述核酸选自反义核酸、sirna和shrna。[19]根据实施方案[16]使用的抑制剂，其中所述核酸能够结合gpv的细胞外结构域。[20]根据实施方案[19]使用的抑制剂，其中所述核酸是适体。[21]根据前述实施方案中任一项使用的抑制剂，其中所述抑制剂在施用于受试者时基本上不影响所述受试者中血小板的数量。[22]根据实施方案[2]至[21]中任一项使用的抑制剂，其中所述抑制剂用作凝血剂。[23]根据实施方案[2]至[22]中任一项使用的抑制剂，其中所述治疗或预防包括向受试者、优选人施用药学有效量的所述抑制剂。[24]根据实施方案[23]使用的抑制剂，其中所述治疗或预防还包括向所述受试者施用不同于所述抑制剂的凝血剂。[25]根据实施方案[24]使用的抑制剂，其中所述不同于所述抑制剂的凝血剂选自抗纤维蛋白溶解剂，血小板浓缩物，凝固因子浓缩物和新鲜冷冻血浆。[26]药物组合物，其包含前述任一实施方案中定义的抑制剂和药学上可接受的赋形剂。[27]如实施方案[26]中定义的药物组合物，用于治疗或预防出血性病症。[28]治疗受试者、优选人的出血性病症的方法，其包括向受试者施用有效量的如实施方案[1]至[21]中任一项所定义的抑制剂或实施方案[26]的药物组合为。附图的简要说明图1：单克隆抗gpv抗体89f12结合gpv的胞外结构域。(a)通过流式细胞术评估，89f12-fitc结合wt，但不结合gpv缺陷的血小板。(b)89f12-hrp在elisa系统中检测重组鼠sgpv。图2：单克隆抗gpv抗体89f12结合gpv的胞外结构域而不影响血小板计数和凝血酶介导的gpv切割。(a，b)静脉内注射100μg89f12，然后分析血小板计数以及gpv表面表达。(c)通过流式细胞术评估，抗体89f12不影响凝血酶介导的gpv切割。(d)89f12不改变响应凝血酶的p-选择素暴露和αiibβ3整联蛋白介导的血小板活化。图3：89h11，但不是89f12，阻断了gpv上的胶原结合位点。在媒介物(黑色曲线)或抗gpv抗体89h11(浅灰色)或89f12(深灰色)的存在下，用2μg/ml原纤维胶原刺激缺乏胶原结合整联蛋白α2β1的小鼠(itga2-/-)的经洗涤的鼠血小板。显示了2次独立实验的代表性凝集曲线，每组四只小鼠。图4：抗体89f12在野生型小鼠中促进止血并在gpvi/clec-2双缺陷动物中恢复止血。显示的是所示小鼠品系的尾出血时间。每个符号代表一只动物。在小鼠不能阻止出血的情况下，fisher精确检验用于计算p值。图5：抗体89f12在gpvi/itga2双重缺陷小鼠中恢复止血。显示的是所示小鼠品系的尾出血时间。每个符号代表一只动物。在小鼠不能阻止出血的情况下，fisher精确检验用于计算p值。图6：单克隆抗gpv抗体89f12补偿了体内血栓形成模型中gpvi的缺乏。用20％fecl3损伤肠系膜小动脉，并通过活体显微镜监测荧光标记血小板的粘附和血栓形成。每个点表示一个容器，水平线表示中位数。*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001。图7：抗体89f12可以补偿止血中rhoa的缺失。显示的是所示鼠标线的尾出血时间。每个符号代表一只动物，水平线表示中位数(如果中位数超过1200s，则不显示)。在小鼠不能阻止出血的情况下，fisher精确检验用于计算p值。*p<0.05；**p<0.01。发明详述本发明涉及用作凝血剂的血小板糖蛋白v(gpv)抑制剂和/或用于治疗或预防出血性疾病的gpv抑制剂。糖蛋白v如本文所用，术语“糖蛋白v”或“gpv”表示与seqidno：3中所示氨基酸序列具有至少50％序列同一性的膜蛋白质。优选地，gpv与seqidno：3所示的氨基酸序列具有至少60％，或至少70％，或至少80％，或至少90％，或至少95％的氨基酸同一性。gpv具有功能性跨膜结构域。根据本发明，在两个序列的比对后，被评估的序列(“比较序列”)与要求保护或描述的序列(“参考序列”)具有某一“百分比同一性”，或者是某一“百分比相同”的。“百分比同一性”是根据以下公式确定的：同一性百分比＝100[1-(c/r)]在该公式中，c是参考序列和比较序列之间在两个序列之间的比对长度上的差异数目，其中(i)参考序列中在比较序列中不具有对应的碱基的每个碱基，和(ii)参考序列中的每个间隙，以及(iii)参考序列中与比较序列中的比对碱基不同的每个比对碱基构成差异。r是参考序列在与比较序列的比对长度上的碱基数目，在参考序列中创建的任何缺口也被计算为碱基。如果比较序列和参考序列之间存在比对，使得百分比同一性(如上计算)大约等于或大于指定的最小值，则比较序列具有指定的最小百分比同一性，即使比对可能在别处以显示比指定的百分比更低的百分比同一性存在于序列中。在一个优选的实施方案中，用于比较目的比对序列的长度为参考序列长度的至少30％，优选至少40％，更优选至少50％，甚至更优选至少60％，甚至更优选至少70％，80％或90％。两个氨基酸序列之间的序列比较和百分比同一性(和百分比相似性)的确定可以使用任何合适的程序来完成，例如，程序“blast2sequences(blastp)”(tatusova等人，femsmicrobiol.lett.1999，174：247-250)，其具有以下参数：matrixblosum62；打开缺口11和延伸缺口1的罚分；缺口x_dropoff50；预计10.0字大小3；过滤器：无。根据本发明，序列比较覆盖至少40个氨基酸，优选至少80个氨基酸，更优选至少100个氨基酸，最优选至少120个氨基酸。本文中提到的gpv通常是血小板糖蛋白v.通常，gpv是天然存在的gpv。优选地，gpv是哺乳动物来源的。最优选地，gpv是人gpv。根据该实施方案，gpv优选包含seqidno：3所示的氨基酸序列或由其组成。gpv的抑制剂gpv的抑制剂(以下称为“gpv抑制剂”)是(i)具有促凝活性，(ii)能够与gpv的细胞外结构域结合，或者能够减弱gpvmrna的表达的化合物。优选地，gpv抑制剂是这样的化合物，其(i)具有促凝活性并且(ii)能够结合gpv的细胞外结构域。根据本发明，如实施例中所述在“出血时间测定”中测定促凝活性，条件是在出血时间测定中使用的小鼠是缺乏内源性gpv并表达人gpv的转基因小鼠。如实施例中所述，可以在elisa中确定与gpv的胞外结构域的结合。在一个实施方案中，使用重组可溶性gpv在elisa中测定与gpv的胞外结构域的结合，如图1b所示，条件是使用重组可溶性人gpv。最优选地，使用重组可溶性gpv在elisa中测定与gpv的胞外结构域的结合，如图1b所示，条件是使用基本上由seqidno：3的氨基酸1-503组成的重组可溶性人gpv。gpv抑制剂可以影响，例如抑制，在向受试者施用gpv抑制剂后受试者中凝血酶介导的gpv切割。在另一个实施方案中，gpv抑制剂不影响在向受试者施用gpv抑制剂后受试者中凝血酶介导的gpv切割。gpv抑制剂的类型或种类没有特别限制。然而，优选该化合物是肽或多肽，更优选该化合物是抗体或其片段。在又一个实施方案中，gpv抑制剂是核酸。抗体在一个优选的实施方案中，gpv抑制剂是抗体。如本文所用，术语“抗体”是指与特定抗原结合或与特定抗原发生免疫反应的免疫球蛋白分子，并且包括多克隆、单克隆、基因工程和其他修饰形式的抗体，包括但不限于嵌合抗体，人源化抗体，人抗体，异源缀合抗体(例如双特异性抗体，双抗体，三抗体和四抗体)，单结构域抗体(纳米抗体)和抗体的抗原结合片段，包括例如fab'，f(ab')2，fab，fv，rigg和scfv片段。此外，除非另有说明，否则术语“单克隆抗体”(mab)意指包括完整分子以及抗体片段(例如fab和f(ab')2片段)，其能够与蛋白质结合。fab和f(ab')2片段缺乏完整抗体的fc片段，从动物的循环中被更快地清除，并且可能具有比完整抗体更少的非特异性组织结合(wahl等人，j.nucl.med.1983；24：316)。通常，抗体能够结合gpv的细胞外结构域，优选人gpv的细胞外结构域。可以通过实施例/图1a或1b中所述的结合测定(参见下文)来确定分子或抗体是否能够结合gpv的细胞外结构域。本文提及的抗体、片段或衍生物优选结合与gpv的胶原结合位点不同的gpv细胞外结构域内的区域。在另一个实施方案中，抗体、片段或衍生物不延迟胶原诱导的聚集。这可以在如实施例中所述的聚集测定中确定(参见图3和材料和方法)。进一步优选的抑制剂是与抗体89f12竞争结合人gpv的抗体、其片段和衍生物。进一步优选的抑制剂是与gpv上的表位结合的抗体、其片段和衍生物，所述表位与抗体89f12的gpv上的表位重叠。进一步优选的抑制剂是与抗体89f12结合gpv上的相同表位的抗体、其片段和衍生物。在其他实施方案中，抑制剂是不与抗体89h11竞争结合人gpv的抗体、其片段或衍生物。在另一个实施方案中，抑制剂是与gpv上的表位结合的抗体、其片段或衍生物，所述表位不与抗体89h11的gpv上的表位重叠。在又一个实施方案中，抑制剂是与gpv上的表位结合的抗体、其片段或衍生物，所述表位不同于抗体89h11的gpv上的表位。在其他实施方案中，抑制剂是不与抗体v.3竞争结合人gpv的抗体、其片段或衍生物(azorsado等人，thrombosisandhaemostasis.1999；81：131-8；moogs等人，blood.2001；98：1038-46)。在另一个实施方案中，抑制剂是与gpv上的表位结合的抗体、其片段或衍生物，所述表位不与抗体v.3的gpv上的表位重叠。在又一个实施方案中，抑制剂是与gpv上的表位结合的抗体、其片段或衍生物，所述表位不同于抗体v.3的gpv上的表位。前面段落中的实施方案可以彼此组合。抗体优选结合seqidno：3的氨基酸1-503内的表位。例如，本发明包括但不限于以下实施方案：表1由gpv的胞外结构域和抗体形成的复合物的解离常数kd优选小于100μm，更优选小于10μm，最优选小于5μm。典型地，kd的范围从约1pm到约10μm，或从约10pm到约1μm，或从约100pm到约100nm。优选地，抗体-gpv复合物具有5pm至1nm范围内的kd，最优选10pm至500pm的kd。优选地，抗体是单克隆抗体。如本文所用的术语“单克隆抗体”不限于通过杂交瘤技术产生的抗体。术语“单克隆抗体”是指衍生自单一克隆(包括任何真核生物、原核生物或噬菌体克隆)的抗体，而不限于产生其的方法。单克隆抗体可以使用本领域已知的多种技术制备，包括使用杂交瘤、重组和噬菌体展示技术或其组合(harlow和lane，“antibodies，alaboratorymanual”cshpress1988，coldspringharborny)。在其他实施方案中，包括在人中体内使用抗gpv抗体，可以使用嵌合、灵长类动物化、人源化或人抗体。在一个优选的实施方案中，抗体是人抗体或人源化抗体，更优选单克隆人抗体或单克隆人源化抗体。如本文所用的术语“嵌合”抗体是指具有衍生自非人免疫球蛋白(例如大鼠或小鼠抗体)的可变序列和通常选自人免疫球蛋白模板的人免疫球蛋白恒定区的抗体。生产嵌合抗体的方法是本领域已知的。参见例如morrison.science.1985；229(4719):1202-7；oi等人biotechniques.1986；4:214-221；gillies等人j.immunol.methods1985；125:191-202；us5,807,715；us4,816,567和us4,816,397，其全部内容通过引用并入本文。非人(例如鼠)抗体的“人源化”形式是嵌合免疫球蛋白，免疫球蛋白链或其片段(如fv，fab，fab'，f(ab')2或抗体的其他靶结合子序列)，其含有来自非人免疫球蛋白的最小序列。通常，人源化抗体将包含基本上全部的至少一个且通常两个可变结构域，其中全部或基本上全部的互补决定区(cdr)对应于非人免疫球蛋白的互补决定区(cdr)，全部或基本上全部的构架(fr)区域是人免疫球蛋白共有序列的区域。人源化抗体还可以包含免疫球蛋白恒定区(fc)典型地所选人免疫球蛋白模板的恒定区的至少一部分。人源化是一种制备嵌合抗体的技术，其中人可变结构域的一个或多个氨基酸或部分已经被来自非人物种的相应序列取代。人源化抗体是在非人物种中产生的结合所需抗原的抗体分子，其具有来自非人物种的一个或多个cdr和来自人免疫球蛋白分子的fr。通常，人构架区中的构架残基将被来自cdr供体抗体的相应残基取代以改变、优选改善抗原结合。这些构架取代通过本领域公知的方法鉴定，例如通过建模cdr和构架残基的相互作用以鉴定对于抗原结合重要的构架残基和序列比较以鉴定特定位置处的异常构架残基。参见例如riechmann等人nature1988,332：323-7和queen等人us5,530,101；us5,585,089；us5,693,761；us5,693,762；和us6,180,370(其全部内容通过引用整体并入)。可以使用本领域已知的多种技术将抗体人源化，所述技术包括例如cdr嫁接(ep239400；wo91/09967；us5,225,539；us5,530,101和us5,585,089)，饰面或表面重修(ep0592106；ep0519596；padlan.molimmunol.1991；28：489-498；studnicka等人，proteng.1994；7：805-814；roguska等人pnas1994；91：969-973和链改组(us5,565,332))，所有这些在此通过引用整体并入。在一些实施方案中，人源化抗体如queen等人，us5,530,101；us5,585,089；us5,693,761；us5,693,762；和us6,180,370(其全部内容通过引用整体并入)中所述制备。在一些实施方案中，抗gpv抗体是人抗体。完全“人”抗gpv抗体对于人患者的治疗是期望的。如本文所用，“人抗体”包括具有人免疫球蛋白氨基酸序列的抗体，并且包括从人免疫球蛋白文库或从对于一种或多种人免疫球蛋白是转基因的并且不表达内源免疫球蛋白的动物分离的抗体。人抗体可以通过本领域已知的多种方法制备，包括使用衍生自人免疫球蛋白序列的抗体文库的上述噬菌体展示方法。参见us4,444,887和us4,716,111；和wo98/46645；wo98/50433；wo98/24893；wo98/16654；wo96/34096；wo96/33735；和wo91/10741，其各自通过引用整体并入本文。人抗体也可以使用不能表达功能性内源性免疫球蛋白但能表达人免疫球蛋白基因的转基因小鼠产生。参见例如wo98/24893；wo92/01047；wo96/34096；wo96/33735；us5,413,923；us5,625,126；us5,633,425；us5,569,825；us5,661,016；us5,545,806；us5,814,318；us5,885,793；us5,916,771；和us5,939,598，其通过引用整体并入本文。可以使用被称为“引导选择”的技术来产生识别选定表位的完全人抗体。在该方法中，选择的非人单克隆抗体，例如小鼠抗体用于指导选择识别相同表位的完全人抗体(jespers等人，biotechnology.1988；12：899-903)。在一些实施方案中，抗gpv抗体是灵长类动物化抗体。术语“灵长类动物化抗体”是指包含猴可变区和人恒定区的抗体。产生灵长类化抗体的方法是本领域已知的。参见例如us5,658,570；us5,681,722；和us5,693,780，其通过引用整体并入本文。在一些实施方案中，抗gpv抗体是衍生抗体。例如但不限于，已经被修饰的衍生抗体，所述修饰是例如通过糖基化，乙酰化，聚乙二醇化，磷酸化，酰胺化，通过已知的保护/封闭基团衍生化，蛋白水解切割或与细胞配体或其他蛋白质连接(参见下面关于抗体缀合物的讨论)。许多化学修饰中的任何一种可通过已知的技术进行，包括但不限于特定化学切割，乙酰化，甲酰化或衣霉素的代谢合成等。另外，所述衍生物可含有一种或多种非经典氨基酸。在一些实施方案中，抗gpv抗体或其片段可以是这样的抗体或抗体片段，其序列已被修饰以相对于相应的野生型序列减少至少一个恒定区介导的生物效应子功能。为了修饰抗gpv抗体，以使其表现出与fc受体的减弱的结合，抗体的免疫球蛋白恒定区片段可以在fc受体(fcr)相互作用所需的特定区域发生突变(参见例如canfield和morrison，jexpmed.1991；173：1483-1491；和lund等人，jimmunol.1991；147：2657-2662)。抗体的fcr结合能力的降低还可以降低依赖于fcr相互作用的其他效应子功能，例如调理作用，吞噬作用和抗原依赖性细胞毒性。在又一方面，抗gpv抗体或其片段可以是已被修饰以增加或降低它们对胎儿fc受体fcrn的结合亲和力的抗体或抗体片段。为了改变与fcrn的结合亲和力，抗体的免疫球蛋白恒定区片段可以在fcrn相互作用所需的特定区域发生突变(参见例如wo2005/123780)。增加与fcrn的结合亲和力应该增加抗体的血清半衰期，并且想对应地，降低与fcrn的结合亲和力应该降低抗体的血清半衰期。合适的氨基酸取代的具体组合在wo2005/123780的表1中确定，该表通过引用整体并入本文。还参见hinton等人，us7,217,797，us7,361,740，us7,365,168和us7,217,798，其通过引用整体并入本文。在其他方面，抗gpv抗体具有插入一个或多个其高变区的一个或多个氨基酸，例如如us2007/0280931中所述。抗体缀合物在一些实施方案中，抗gpv抗体是被修饰(例如，通过将任何类型的分子共价连接至抗体，使得共价连接不干扰与gpv的结合)的抗体缀合物。用于将效应子部分缀合至抗体的技术是本领域众所周知的(参见例如hellstrom等人，controlleddragdelivery，第2版，623-53(robinson等编，1987)；thorpe等人，immunolrev.282；62：119-58和dubowchik等人，pharmacologyandtherapeutics1999；83：67-123)。在一个实例中，抗体或其片段经由共价键(例如肽键)在任选n端或c端融合至另一种蛋白质(或其部分；优选至少蛋白质的10、20或50个氨基酸部分)。优选地，抗体或其片段在抗体恒定结构域的n端与其他蛋白质连接。可以使用重组dna程序来产生这种融合，例如如wo86/01533和ep0392745中所述。在另一个实例中，效应分子可以增加体内半衰期。此类合适的效应分子的例子包括聚合物，白蛋白，白蛋白结合蛋白或白蛋白结合化合物，如wo2005/117984中所述的那些。在一些实施方案中，抗gpv抗体可以连接到聚(乙二醇)(peg)部分。例如，如果抗体是抗体片段，则peg部分可以通过位于抗体片段中的任何可用的氨基酸侧链或末端氨基酸官能团连接，例如任何游离氨基，亚氨基，巯基，羟基或羧基。这样的氨基酸可以在抗体片段中天然存在或可以使用重组dna方法工程化到片段中。参见例如us5,219,996。可以使用多个位点来连接两个或更多个peg分子。优选地，peg部分通过位于抗体片段中的至少一个半胱氨酸残基的巯基共价连接。在使用巯基作为连接点的情况下，可以使用适当活化的效应子部分，例如硫醇选择性衍生物，如马来酰亚胺和半胱氨酸衍生物。在另一个实例中，抗gpv抗体缀合物是聚乙二醇化的修饰的fab'片段，即具有共价连接至其的peg(聚(乙二醇))，例如根据ep0948544中公开的方法。还参见poly(ethyleneglycol)chemistry,biotechnicalandbiomedicalapplications,(j.miltonharris(ed.),plenumpress,newyork,1992)；poly(ethyleneglycol)chemistryandbiologicalapplications,(j.miltonharrisands.zalipsky,eds.,americanchemicalsociety,washingtond.c,1997)；和bioconjugationproteincouplingtechniquesforthebiomedicalsciences,(m.aslamanda.dent,eds.,grovepublishers,newyork,1998)；和chapman.advanceddrugdeliveryreviews2002；54:531-545。核酸在本发明的其他实施方案中，gpv抑制剂是核酸。在一个具体的实施方案中，核酸能够减弱gpvmrna的表达。gpv的表达可以通过rna干扰来抑制或减少或消除，例如，通过使用sirna或shrna。另一种可能性是使用反义核酸，例如，反义rna。如本文所用，短语“减弱mrna的表达”意指施用或表达一定量的干扰rna(例如sirna)以通过mrna切割或通过直接抑制翻译来减少靶mrna至蛋白质的翻译。靶mrna或相应蛋白质表达的降低通常称为“敲低”，并且相对于施用或表达非靶向对照rna(例如非靶向对照sirna)后存在的水平来报道。本文的实施方案考虑了包含和在50％和100％之间的量的表达的敲低。然而，为了达到本发明的目的，达到这样的敲低水平是不必要的。通常通过使用定量聚合酶链式反应(qpcr)扩增测量mrna水平或通过蛋白质印迹或酶联免疫吸附测定(elisa)测量蛋白质水平来评估敲低。分析蛋白质水平提供了对mrna切割以及翻译抑制的评估。用于测量敲低的其他技术包括rna溶液杂交，核酸酶保护，northern杂交，使用微阵列的基因表达监测，抗体结合，放射免疫测定和荧光活化细胞分析。gpvmrna表达的抑制也可以通过在转染gpv干扰rna后评估例如人细胞中的gpvmrna水平或gpv蛋白水平来体外测定。在本发明的一个实施方案中，干扰rna(例如sirna)具有有义链和反义链，并且有义链和反义链包含至少19个核苷酸的至少接近完美的连续互补性的区域。在本发明的另一个实施方案中，干扰rna(例如sirna)具有有义链和反义链，并且反义链包含与gpvmrna的靶序列具有至少19个核苷酸的至少接近完美的连续互补性的区域并且有义链包含与gpvmrna的靶序列具有至少19个核苷酸的至少接近完美的连续同一性的区域。在本发明的另一个实施方案中，干扰rna包含分别与mrna内相应靶序列的3'末端的倒数13、14、15、16、17或18个核苷酸具有一定百分比的互补性或一定百分比的序列同一性的至少13、14、15、16、17或18个连续核苷酸的区域。干扰rna的每条链的长度包含19至49个核苷酸，并且可以包含19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48或49个核苷酸的长度。sirna的反义链是sirna的活性引导剂，因为反义链掺入到risc中，因此允许risc鉴定与反义sirna链至少部分互补的靶mrna以进行切割或翻译抑制。在本发明的实施方案中，使用可用的设计工具选择gpvmrna序列内的干扰rna靶序列(例如sirna靶序列)。然后通过转染表达靶mrna的细胞然后如上所述评估敲低来测试对应于gpv靶序列的干扰rna。在“sirnadesign:methodsandprotocols”,debraj.taxman编辑,2012(isbn-13:9781627031189)中提供了用于选择sirna的靶序列的技术。在第二个具体实施方案中，核酸能够结合人gpv的细胞外结构域。根据该实施方案，核酸优选为适体。可以按照“denovomoleculardesign”,2013,gisbertschneider编辑,第21章(isbn-13:9783527677030)；或“theaptamerhandbook:functionaloligonucleotidesandtheirapplications”,2006,svenklussmann编辑(isbn-13:9783527607914)中所述设计适体。出血性病症本文所述的抑制剂优选用于治疗或预防出血性病症。出血性病症的特征是出血过多。出血过多可能有各种原因。在一个实施方案中，出血性病症是由血小板障碍引起的。血小板障碍的特征可在于血小板数量减少，例如在血小板减少症的情况下。具体的血小板减少症包括但不限于特发性血小板减少性紫癜，血栓性血小板减少性紫癜，由于免疫介导的血小板破坏引起的药物诱发的血小板减少症(例如通过肝素，甲氧苄氨嘧啶/磺胺甲恶唑)，由于剂量依赖性骨髓抑制引起的药物诱导的血小板减少症(例如通过化疗剂)，伴随全身感染的血小板减少症，化学疗法引起的血小板减少症，妊娠性血小板减少症和免疫性血小板减少症(itp，以前称为免疫性血小板减少性紫癜)。血小板障碍的特征可以是血小板功能障碍，例如在由于缺乏血小板受体或信号传导分子而导致血小板信号传导缺陷的情况下。在一个优选的实施方案中，出血性病症选自炎症性出血，出血性中风，败血症引起的过度出血，血小板减少引起的过度出血，弥散性血管内凝血(dic)引起的过度出血，化疗引起的过度出血，溶血性尿毒症综合征引起的过度出血，施用可溶性gpv时的过度出血以及hiv感染引起的过度出血。在具体的实施方案中，本发明涉及本文所述的抑制剂作为用于施用可溶性gpv的解毒剂的用途。药物组合物和治疗疾病的治疗包括治疗在任何临床阶段或表现中已被诊断为患有任何形式的疾病的患者；延迟疾病症状或体征的发作或进展或加重或恶化；和/或预防和/或减轻疾病的严重程度。接受gpv抑制剂例如抗gpv抗体施用的“受试者”或“患者”可以是哺乳动物，例如非灵长类动物(例如牛，猪，马，猫，狗，大鼠等)或灵长类动物(例如猴或人)。在某些方面，人是儿科患者。在其他方面，人是成人患者。本文描述了包含gpv抑制剂和任选地一种或多种另外的治疗剂(例如下面描述的第二治疗剂)的组合物。该组合物通常作为包含药学上可接受的载体的无菌药物组合物的一部分提供。该组合物可以是任何合适的形式(取决于将其施用至患者的所需方法)。gpv抑制剂，例如抗gpv抗体可以通过各种途径例如口服、透皮、皮下、鼻内、静脉内、肌内、鞘内、局灶或局部施用至患者。在任何特定情况下，最合适的施用途径取决于具体的抗体、受试者、疾病的性质和严重程度以及受试者的身体状况。通常，gpv抑制剂，例如抗gpv抗体将通过静脉内施用。本发明的另一个方面是包含本发明的抗体或其抗原结合片段的药物组合物。可以根据用于制备药物组合物的已知方法配制抗体或其抗原结合片段。例如，可以与一种或多种药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂混合。例如，可以使用无菌水或生理盐水。其他物质，如ph缓冲溶液，粘度降低剂或稳定剂也可以包括在内。本领域已知多种药学上可接受的赋形剂和载体。这些药物载体和赋形剂以及合适的药物制剂已经在各种出版物中详细描述(参见例如“pharmaceuticalformulationdevelopmentofpeptidesandproteins”,frokjaer等人,taylor&francis(2000)或“handbookofpharmaceuticalexcipients”,3rdedition,kibbeetal.,pharmaceuticalpress(2000)a.gennaro(2000)"remington:thescienceandpracticeofpharmacy",20thedition,lippincott,williams,&wilkins；pharmaceuticaldosageformsanddrugdeliverysystems(1999)h.c.ansel等人,eds7thed.,lippincott,williams,&wilkins；和handbookofpharmaceuticalexcipients(2000)a.h.kibbe等人,eds.,3rded.amer.pharmaceuticalassoc)。特别地，包含本发明抗体的药物组合物可以配制成冻干或稳定的可溶形式。多肽可以通过本领域已知的各种程序来冻干。冻干制剂在使用前通过加入一种或多种药学上可接受的稀释剂如注射用无菌水或无菌生理盐水溶液而重建。本发明的药物组合物可以以本领域公知的剂量和技术施用。施用的数量和时间由治疗医生或兽医确定以达到所需目的。施用途径可以通过任何向待治疗的受试者的血液提供安全和治疗有效剂量的途径。可能的施用途径包括全身，局部，肠内和肠胃外途径，如静脉内，动脉内，皮下，皮内，腹膜内，口服，透粘膜，硬膜外或鞘内。优选的途径是静脉内或皮下。有效剂量和施用途径由诸如受试者的年龄和体重以及抗体或其抗原结合片段的性质和治疗范围等因素决定。剂量的确定通过已知方法确定，不需要过度的实验。治疗有效剂量是本发明的抗体或其抗原结合片段的剂量，其在需要治疗的患者或受试者中产生积极的治疗效果。治疗有效剂量范围为约0.01至50mg/kg，约0.01至30mg/kg，约0.1至30mg/kg，约0.1至10mg/kg，约0.1至5mgkg，约1至5mg/kg，约0.1至2mg/kg或约0.1至1mg/kg。治疗可以包括给予单次(例如推注)剂量或多次剂量。或者连续施用是可能的。如果需要多次剂量，可以每天，每隔一天，每周，每两周，每月或每两个月一次或根据需要施用。也可以使用缓慢且持续地释放抗体或其抗原结合片段的储藏剂。治疗有效剂量可以是将受试者中的gpv抑制至少50％，优选至少60％，70％，80％，90％，更优选至少95％，99％或甚至100％的剂量。抗体可以配制成水溶液。药物组合物可以方便地以每剂量含有预定量的gpv抑制剂例如抗gpv抗体的单位剂量形式存在。这样的单位可以含有0.5mg至5g，例如但不限于1mg，10mg，20mg，30mg，40mg，50mg，100mg，200mg，300mg，400mg，500mg，750mg，1000mg或任何两个前述值之间的任何范围，例如10mg至1000mg，20mg至50mg或30mg至300mg。药学上可接受的载体可以采取各种各样的形式，这取决于例如待治疗的病症或施用途径。使用gpv抑制剂例如抗gpv抗体的治疗的有效剂量、总剂量和治疗时间的确定完全在本领域技术人员的能力范围内，并且可以使用标准剂量递增研究来确定。通过将具有所需纯度的抑制剂例如抗体与本领域通常使用的任选的药学上可接受的载体、赋形剂或稳定剂(所有这些在本文中被称为“载体”，即缓冲剂，稳定剂，防腐剂，等渗剂，非离子型洗涤剂，抗氧化剂和其他各种添加剂，参见remington'spharmaceuticalsciences，第16版(osol，ed.)1980)混合，可以制备适用于本文所述方法的gpv抑制剂例如抗gpv抗体的治疗性制剂作为冻干制剂或水性溶液贮存。这种添加剂必须在所用剂量和浓度下对接受者无毒。缓冲剂有助于将ph保持在接近生理条件的范围内。它们可以以约2mm至约50mm的浓度存在。合适的缓冲剂包括有机和无机酸及其盐，例如柠檬酸盐缓冲剂(例如柠檬酸单钠-柠檬酸二钠混合物，柠檬酸-柠檬酸三钠混合物，柠檬酸-柠檬酸单钠混合物等)，琥珀酸盐缓冲剂(例如琥珀酸-琥珀酸单钠混合物，琥珀酸-氢氧化钠混合物，琥珀酸-琥珀酸二钠混合物等)，酒石酸盐缓冲剂(例如酒石酸-酒石酸钠混合物，酒石酸-酒石酸钾混合物，酒石酸-氢氧化钠混合物等)，富马酸盐缓冲剂(例如富马酸-富马酸一钠混合物，富马酸-富马酸二钠混合物，富马酸一钠-富马酸二钠混合物等)，葡糖酸盐缓冲剂(例如葡糖酸-葡糖酸钠混合物，葡糖酸-氢氧化钠混合物，葡糖酸-葡糖酸钾混合物等)，草酸盐缓冲剂(例如草酸-草酸钠混合物，草酸-氢氧化钠混合物，草酸-草酸钾混合物尿等)，乳酸盐缓冲剂(例如，乳酸-乳酸钠混合物，乳酸-氢氧化钠混合物，乳酸-乳酸钾混合物等)和乙酸盐缓冲剂(例如乙酸-乙酸钠混合物，乙酸-氢氧化钠混合物等)。此外，可以使用磷酸盐缓冲剂，组氨酸缓冲剂和三甲胺盐如tris。可以添加防腐剂以阻止微生物生长，并且可以以0.2％-1％(w/v)的量添加。合适的防腐剂包括苯酚，苯甲醇，间甲酚，对羟基苯甲酸甲酯，对羟基苯甲酸丙酯，十八烷基二甲基苄基氯化铵，苯扎卤铵(例如氯化物，溴化物和碘化物)，六甲基氯化铵和对羟基苯甲酸烷基酯例如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯，儿茶酚，间苯二酚，环己醇和3-戊醇。可以添加有时称作“稳定剂”的等渗剂以确保液体组合物的等渗性，并且包括多元糖醇，优选三元或更多元糖醇，例如甘油，赤藓糖醇，阿拉伯糖醇，木糖醇，山梨糖醇和甘露糖醇。稳定剂是指广泛类型的赋形剂，其功能范围可以是从增量剂到溶解治疗剂的添加剂，或有助于防止变性或粘附到容器壁。典型的稳定剂可以是多元糖醇(上面列举的)；氨基酸例如精氨酸，赖氨酸，甘氨酸，谷氨酰胺，天冬酰胺，组氨酸，丙氨酸，鸟氨酸，l-亮氨酸，2-苯丙氨酸，谷氨酸，苏氨酸等人，有机糖或糖醇如乳糖，海藻糖，水苏糖，甘露醇，山梨糖醇，木糖醇，核糖醇，肌醇，半乳糖醇，甘油等人，包括环醇如肌醇；聚乙二醇；氨基酸聚合物；含硫还原剂如尿素，谷胱甘肽，硫辛酸，巯基乙酸钠，硫代甘油，α-硫代甘油和硫代硫酸钠；低分子量多肽(例如10个残基或更少的肽)；蛋白质如人血清白蛋白，牛血清白蛋白，明胶或免疫球蛋白；亲水聚合物，如聚乙烯吡咯烷酮单糖，如木糖，甘露糖，果糖，葡萄糖；二糖如乳糖，麦芽糖，蔗糖和三糖如棉子糖；和多糖如葡聚糖。稳定剂可以以每重量份活性蛋白质0.1-10、000重量的范围存在。可以加入非离子表面活性剂或洗涤剂(也称为“润湿剂”)以帮助增溶治疗剂以及保护治疗蛋白免受搅动诱导的聚集，这也允许制剂暴露于剪切表面应力而不引起蛋白质的变性。合适的非离子表面活性剂包括聚山梨酸酯(20、80等)，泊洛沙姆(184、188等)，pluronic多元醇，聚氧乙烯脱水山梨糖醇单醚(等)。非离子表面活性剂可以以约0.05mg/ml至约1.0mg/ml的范围或以约0.07mg/ml至约0.2mg/ml的范围存在。另外的各种赋形剂包括填充剂(例如淀粉)，螯合剂(例如edta)，抗氧化剂(例如抗坏血酸，甲硫氨酸，维生素e)和助溶剂。除gpv抑制剂例如抗gpv抗体外，本文的制剂还可含有第二种治疗剂。下文提供了合适的第二治疗剂的实例。取决于许多临床因素，包括疾病类型、疾病严重程度和患者对gpv抑制剂例如抗gpv抗体的敏感性，施用方案可以从每月一次到每天不等。在具体的实施方案中，每天，每周两次，每周三次，每5天，每10天，每两周，每三周，每四周或每月一次或任何前述两个值之间的任何范围(例如从每四天到每个月，从每十天到每两周，或每周两到三次等)施用gpv抑制剂例如抗gpv抗体。待施用的gpv抑制剂例如抗gpv抗体的剂量将根据具体的抗体、受试者、疾病的性质和严重程度、受试者的身体状况、治疗方案(例如是否使用第二种治疗剂)和选定的施用途径而不同；本领域技术人员可以容易地确定合适的剂量。本领域技术人员将认识到，gpv抑制剂例如抗gpv抗体的单独剂量的最佳量和间隔将根据被治疗的病症的性质和程度、施用的形式、途径和部位以及被治疗的特定受试者的年龄和状况来确定，并且医生将最终确定要使用的适当的剂量。该剂量可以根据需要经常重复。如果出现副作用，根据正常的临床实践，可以改变或减少剂量的量和/或频率。联合治疗优选地，用gpv抑制剂例如抗gpv抗体治疗的患者还用常规凝血剂处理。例如，患有过度出血的患者通常也正在用抗纤维蛋白溶解剂、血小板浓缩物、凝血因子浓缩物和/或新鲜冷冻血浆进行治疗。本发明的又一方面是如上文所定义的抑制剂(优选抗体)用于促进止血的用途。本发明的又一方面是如上文所定义的化合物(优选抗体)，其用于降低患有过度出血的患者的出血时间。本发明进一步涉及一种减少出血时间的方法，其包括向受试者施用有效量的如上文定义的抑制剂(优选抗体)。本发明的另一方面是治疗出血性病症的方法，其包括向有需要的患者施用有效量的如上定义的抑制剂(优选抗体)。出血病症优选为上文所述的病症之一。本发明的另一方面是预防出血性病症的方法，其包括向有需要的患者施用有效量的如上定义的抑制剂(优选抗体)。出血病症优选为上文所述的病症之一。核苷酸和氨基酸序列概述：实施例结果89f12是一种单克隆大鼠抗小鼠gpv抗体。它通过融合永生化ag14骨髓瘤细胞和用小鼠血小板免疫的大鼠的脾细胞产生。89f12结合野生型小鼠血小板，但不结合gpv缺陷型小鼠血小板(图1a)，89f12结合在受体的凝血酶切割后形成的可溶性gpv(图1b)。此外，89f12与鼠gpv的重组表达的胞外结构域结合(图1b)。在体内，89f12-igg或89f12-fab片段对血小板计数没有影响，并且对凝血酶介导的gpv切割没有影响(图2和未显示的数据)。此外，通过流式细胞术(图2d)、集合度测定法或流动粘附测定法(未显示)评估89f12不影响体外血小板活化。值得注意的是，它不干扰gpv的胶原蛋白结合位点，因为它不会延迟胶原蛋白诱导的聚集(图3)，89h11则相反，89h11是阻断gpv胶原结合位点的抗gpv抗体。体内测试了抗gpv抗体对止血和血栓形成的作用。在wt小鼠中静脉内注射100μg89f12导致在尾出血时间测定中达到停止失血的加速时间。通过分别的jaq1-和inu1-注射对gpvi和clec-2的同时耗尽导致明显的止血缺陷，因为14只小鼠中的5只在20分钟的观察期内不能止血。通过89f12阻断gpv的细胞外结构域可补偿gpvi/clec-2双耗竭小鼠的止血缺陷，导致这些小鼠的尾出血时间与89f12-处理的wt小鼠相当。这意味着89f12可以恢复gpvi/clec-2双耗竭小鼠的止血。因此，在gpvi和clec-2不存在的情况下，89f12可防止止血并发症(图4)。为了测试受体二聚化或抗体的fc部分是否对其对血栓形成的作用是必需的，用媒介物或89f12-fab片段处理gpvi耗尽的α2缺陷型(itga2-/-)小鼠。媒介物处理的gpvi耗尽的itga2-/-小鼠出血超过20分钟，而89f12-fab片段恢复了这些小鼠的止血功能(图5)。由于gpv阻断促进止血，因此在89f12处理的小鼠中也研究了血栓形成。89f12处理的小鼠显示出达到体内血栓形成的加速时间。使用jaq1耗竭主要的血小板活化胶原受体gpvi导致wt小鼠血栓形成时间延迟，观察期内13个血管中只有6个闭塞。即使没有gpvi，89f12介导的gpv阻断导致血栓形成的较早开始(数据未显示)，最终导致更快的血管闭塞，即使与未处理的wt对照相比(p<0.001，图6)。89f12介导的gpv阻断在体内血栓形成和止血中可完全弥补gpvi的缺乏。gpv阻断可以抵消(hem)itam受体gpvi和clec-2的缺失的事实表明gpv充当血小板活化的一般负调节剂。因此，我们调查了gpv阻断是否可以弥补其他关键信号传导分子的缺失。血管壁损伤时的血小板活化导致细胞骨架重排，这对于从盘状转变为球形血小板形状和对于颗粒分泌和扩散至关重要。rho家族的小gtp酶，如rhoa，被认为参与了许多这些过程。rhoa在通过形成应力纤维组织肌动蛋白细胞骨架、调节肌动球蛋白收缩性和调节微管动力学中方面起着中心作用(busteloxr等人，bioessays.2007；29：356-70)。此外，rhoa参与gq-和g13-偶联的激动剂受体下游的不同细胞过程(pleinesi等人，blood.2012；119：1054-63)。巨核细胞和血小板特异性rhoa缺陷小鼠表现出显著的血小板减少症并伴有50％的血小板计数降低(pleinesi等人，blood.2012；119：1054-63)。缺乏rhoa延长尾出血时间(720±321s，与wt小鼠的430±267s相比)。相比之下，与wt小鼠相比，89f12处理rhoa缺陷型小鼠能够救援rhoafl/fl,pf4-cre小鼠的止血缺陷，导致尾出血时间缩短(对于89f12处理的rhoa缺陷型小鼠为286±118s，与rhoa缺陷小鼠相比，p<0.01，图7)。这表明抗体介导的gpv阻断也可以补偿关键的下游信号传导分子的缺失。血小板减少症是出血的危险因素。为了评估在这些条件下gpv阻断的作用，通过注射两种单克隆抗-gpibα抗体在小鼠中诱导血小板减少，所述抗体独立于免疫效应机制而耗竭小鼠中的循环血小板(nieswandtb等人，blood.2000；96：2520-7；bergmeierw等人，blood.2000；95：886-93)。如上所述评估每只小鼠的初始血小板计数并认为是100％。在注射抗体1小时后评估随后的计数并将其归一化至初始值。血小板数减少低于正常值15％的野生型小鼠显示延长的出血时间或在20分钟观察期内无法停止出血。相比之下，与具有正常血小板计数的89f12处理的小鼠相比，高达正常值的5％的血小板计数减少不会改变尾出血时间，但与血小板耗竭的wt-小鼠相比，显示尾出血时间显著缩短，表明gpv的阻断降低维持正常止血所需的血小板计数(未显示)。材料和方法小鼠使用c57bl/6jrj(janvierlabs)作为野生型对照小鼠。先前描述了缺乏gpv(gp5-/-)、α2-整联蛋白亚基(itga2-/-)的小鼠(kahnm.等人，blood1999.94：4112-21；等人，jbiolchem.2002.277(13)：10789-94)。先前描述了在巨核细胞/血小板中缺乏rhoa的小鼠(rhoafl/fl,pf4-cre+/-)(pleinesi.等人，blood2012.119：1054-63)。通过在实验前6天i.p.注射100μg抗-gpvi抗体、jaq1将gpvi耗竭(nieswandtb等人，jexpmed.2001；193：459-69)。通过i.p.注射200μginu1将clec-2耗竭((mayf等人，blood.2009；114：3464-72)；抗clec-2抗体)。gpv阻断通过在实验前30分钟至12小时注射50μg89f12-igg或fab片段来实现。动物研究由下弗兰肯地区政府批准(bezirksregierungunterfranken)。单克隆抗体产生抗gpv抗体将6至8周龄雌性wistar大鼠用小鼠血小板反复免疫。然后将大鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞(ag14.653)融合，并在hat培养基中选择杂交瘤。通过流式细胞术鉴定分泌针对血小板表面抗原的单克隆抗体(mab)的杂交瘤(见下文)。使用gp5-/-血小板作为对照来测试针对gpv的抗体特异性。在大规模生产前将阳性杂交瘤亚克隆两次。所使用的其他抗体总结于下表中。缓冲液和媒介物所有缓冲液均用双蒸水制备。磷酸盐缓冲盐水(pbs)，ph7.14nacl137mmkcl2.7mmkh2po41.5mmna2hpo48mm体外血小板分析血小板制备和洗涤小鼠在异氟烷麻醉下从眶后丛放血。将700μl血液收集到含有300μl肝素的tbs(20u/ml，ph7.3)的1.5ml反应管中。将血液在800rpm(52g；在eppendorf离心机5415c中)下在rt离心5分钟。将上清液和血沉棕黄层转移到新管中并在rt下以800rpm离心6分钟以获得富含血小板的血浆(prp)。为了制备洗涤过的血小板，在前列环素(pgi2)(0.1μg/ml)存在下，将prp以2800rpm(639g)在室温下离心5分钟，并将沉淀重悬于1ml含有pgi2(0.1μg/ml)和腺苷三磷酸双磷酸酶(0.02u/ml)的无ca2+tyrode缓冲液中。在37℃孵育10分钟后，样品以2800rpm离心5分钟。在1ml无ca2+tyrode缓冲液中再次重悬血小板后，血小板水平采用1:10稀释的血小板溶液测定并在sysmex计数器中测量血小板计数(见下文)。将沉淀重新悬浮于需要获得500,000个血小板/μl的体积的含有三磷酸腺苷双磷酸酶(0.02u/ml)的tyrode缓冲液中，并在分析前在37℃孵育至少30分钟。为了测定血小板计数和大小，使用肝素化微毛细管从麻醉小鼠的眶后丛中取出50μl血液，并收集到含有300μl肝素的tbs(20u/ml，ph7.3)的1.5ml反应管中。用pbs稀释肝素化血液，使用sysmexkx-21n自动血液分析仪(sysmexcorp.，kobe，japan)测定血小板计数和大小。流式细胞术为了确定糖蛋白表达水平，将血小板(1*106)在室温下用饱和量的上述荧光团缀合的抗体染色10分钟，并在加入500μlpbs后直接分析。通过加入500μlpbs终止反应，并在facscalibur(bectondickinson，heidelberg，德国)上分析样品。对于血小板活化研究，在jon/a-pe和抗-p-选择素-fitc存在下，将洗涤的血液与指定的激动剂孵育15分钟。elisa如上所述制备洗涤的血小板，并在37℃用0.1u/ml凝血酶刺激15分钟。之后，将血小板悬浮液以2800rpm离心5分钟，将上清液转移到新的反应管中并再次以最大速度再次离心5分钟。将100μl凝血酶刺激的血小板上清液转移到预先用30μg89h11(抗gpv抗体)包被并用5％bsa/pbs封闭的96孔板中。孵育1小时后，洗涤96孔板并与hrp标记的89f12(第二种抗gpv抗体)孵育以检测切割的gpv。使用tmb显影hrp底物，用h2so4终止反应并在elisa读数器中在405nm处显影。血小板聚集将50μl洗涤的血小板(浓度为0.5x106血小板/μl)或肝素化的prp转移到含有110μltyrode缓冲液(含有2mmcacl2和100μg/ml人纤维蛋白原)的比色杯中。为了测定聚集，加入终浓度为10μg/ml的抗体，加入100倍浓度的激动剂，并在10分钟内在apact4通道光学聚集系统(apact，汉堡，德国)上记录光透射率。为了在加入激动剂之前校准每次测量，将tyrode缓冲液设定为100％聚集并将洗涤的血小板悬浮液或prp设定为0％聚集。血小板功能的体内分析血小板耗竭如上所述评估每只小鼠的初始血小板计数。这些值被认为是100％，随后的计数被归一化至这些值。将小鼠静脉内注射0.2μg抗gpib抗体/g小鼠以诱导fc非依赖性血小板减少症。在实验前1小时注射小鼠以实现5-10％的剩余血小板计数以诱导fcr非依赖性血小板减少症。注射后1小时，再次评估血小板计数。腹主动脉的机械损伤为了打开麻醉小鼠(10-16周龄)的腹腔，进行纵向中线切割并暴露腹主动脉。在主动脉周围放置多普勒超声波流量探头(transonicsystems，maastricht，netherlands)，并通过在流量探头上游以镊子单次紧压(15s)的机械损伤诱导血栓形成。监测血流直到发生完全闭塞或已过去30分钟。腹主动脉的机械损伤为了打开麻醉小鼠(10-16周龄)的腹腔，进行纵向中线切割并暴露腹主动脉。在主动脉周围放置多普勒超声波流量探头(transonicsystems，maastricht，netherlands)，并通过在流量探头上游以镊子单次紧压(15s)的机械损伤诱导血栓形成。监测血流直到发生完全闭塞或已过去30分钟。统计分析结果显示为来自每组至少三次单独实验的平均值±sd。适用时，fisher精确检验用于统计分析。否则，进行welcht检验进行统计分析。p值<0.05被认为是统计学显著的。序列表<110>朱利叶斯-马克西米利维尔次堡大学<120>glycoproteinvinhibitorsforuseascoagulants<130>2015_m003_a252<150>ep15202582.1<151>2015-12-23<160>6<170>patentinversion3.5<210>1<211>3493<212>dna<213>智人<220><221>cds<222>(32)..(1714)<400>1agttactttggagtgcagaaccatttcagacatgctgagggggactctactg52metleuargglythrleuleu15tgcgcggtgctcgggcttctgcgcgcccagcccttcccctgtccgcca100cysalavalleuglyleuleuargalaglnpropheprocyspropro101520gcttgcaagtgtgtcttccgggacgccgcgcagtgctcggggggcgac148alacyslyscysvalpheargaspalaalaglncysserglyglyasp253035gtggcgcgcatctccgcgctaggcctgcccaccaacctcacgcacatc196valalaargileseralaleuglyleuprothrasnleuthrhisile40455055ctgctcttcggaatgggccgcggcgtcctgcagagccagagcttcagc244leuleupheglymetglyargglyvalleuglnserglnserpheser606570ggcatgaccgtcctgcagcgcctcatgatctccgacagccacatttcc292glymetthrvalleuglnargleumetileseraspserhisileser758085gccgttgcccccggcaccttcagtgacctgataaaactgaaaaccctg340alavalalaproglythrpheseraspleuilelysleulysthrleu9095100aggctgtcgcgcaacaaaatcacgcatcttccaggtgcgctgctggat388argleuserargasnlysilethrhisleuproglyalaleuleuasp105110115aagatggtgctcctggagcagttgtttttggaccacaatgcgctaagg436lysmetvalleuleugluglnleupheleuasphisasnalaleuarg120125130135ggcattgaccaaaacatgtttcagaaactggttaacctgcaggagctc484glyileaspglnasnmetpheglnlysleuvalasnleuglngluleu140145150gctctgaaccagaatcagctcgatttccttcctgccagtctcttcacg532alaleuasnglnasnglnleuasppheleuproalaserleuphethr15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