本发明提供用于治疗血源性癌症、特别是aml的免疫检查点抑制剂。本发明还涉及包含所述免疫检查点抑制剂和能够分别接合t细胞的cart细胞或抗体构建体的药物组合物。
发明技术
激活治疗性抗肿瘤免疫的最有希望的方法之一是封闭免疫检查点。免疫检查点是指免疫系统固有的大量抑制途径，其对维持自身耐受性和调节外周组织中生理学免疫应答的持续时间和幅度至关重要，以使附带组织损伤最小化。
一般来讲，t细胞不会对这些配体-受体相互作用产生应答，除非它们首先通过tcr识别其同源抗原。许多配体结合至多种受体，其中一些递送共刺激信号，另一些递送抑制信号。一般来讲，结合相同的一种或多种配体(诸如cd28和细胞毒性t淋巴细胞相关抗原4(ctla4))的共刺激-抑制性受体对显示出与初始和静息t细胞上表达的共刺激受体不同的表达动力学，但是抑制性受体通常在t细胞活化后上调。结合共刺激受体和抑制性受体二者的一个重要的膜结合配体家族是b7家族。所有的b7家族成员及其已知的配体都属于免疫球蛋白超家族。最近确定的b7家族成员的许多受体尚未确定。与同源tnf受体家族分子结合的tnf家族成员代表调控性配体-受体对的第二个家族。这些受体主要在被其同源配体接合时递送共刺激信号。
调控t细胞活化的另一个主要信号种类来自微环境中的可溶性细胞因子。t细胞和apc之间的通讯是双向的。在一些情况下，这在配体自身将信号传导至apc时发生。在其它情况下，活化的t细胞上调接合apc上的同源受体的配体，诸如cd40l。
然而，肿瘤指定某些免疫检查点途径作为免疫抗性的主要机制，特别是针对肿瘤抗原特异性的t细胞。因为许多免疫检查点是由配体-受体相互作用引发的，所以它们可以被抗体封闭或受到重组形式的配体或受体的调节。ctla4抗体是第一种此类获得fda批准的免疫治疗剂。使用另外的免疫检查点蛋白封闭剂(诸如pd-1)的初步临床发现表明了存在广泛而多样的增强抗肿瘤免疫的机会，并且具有产生持久临床应答的潜力。
因此，癌症免疫疗法也集中在开发可使赘生性细胞和癌细胞更易于被免疫系统、特别是被t细胞杀死的药剂。例如，这可以通过使用干扰免疫检查点蛋白，即配体或受体或它们二者来实现。虽然免疫检查点分子的知识以及癌细胞所用的免疫检查点分子的知识不断增加，但是仍不知道赘生性细胞以及随后的癌细胞使用哪些来逃避免疫系统，从而获得不受控制的增长的能力。例如，同时已知血源性癌症，特别是急性骨髓性白血病(aml)也逃避免疫系统。虽然推测可能涉及免疫检查点蛋白，但还没有这方面的证据。因此，为了使血源性癌细胞更容易接近免疫系统的杀死机构，需要提供克服免疫检查点蛋白的影响的手段和方法，该需要未得到满足。
因此，本专利申请背后的技术问题是满足这种未满足的需要，即提供使血源性癌细胞、特别是aml细胞更易于被身体免疫系统杀死的手段和方法。一般来讲，解决方案是提供用于治疗血源性癌症、特别是aml的免疫检查点配体cd112、cd155、其受体tigit、免疫检查点配体半乳糖凝集素-9(galectin-9)和/或其受体tim-3的抑制剂。解决方案也反映在权利要求中，体现在说明书中，例示在所附实施例中并且示于附图中。
发明概述
本发明涉及调节免疫系统以用于治疗血源性癌症(诸如淋巴瘤或白血病，特别是aml)的化合物。此外，本发明涉及包含所述免疫调节化合物和嵌合抗原受体t细胞(cart细胞)的药物组合物。另外，本发明提供了包含所述免疫调节化合物和能够接合t细胞的抗体构建体的药物组合物。
就此而言，本发明注意到在血源性癌症治疗，特别是可受到各种抑制剂影响的aml治疗中提供新免疫检查点，以治疗已产生免疫逃避机制的癌细胞的需要。具体地讲，本发明人发现，cd112、cd155、tigit、半乳糖凝集素-9和tim-3作为新免疫检查点蛋白，可以特异性靶向治疗血源性癌症，特别是aml。因此，针对cd112、cd155、tigit、半乳糖凝集素-9和/或tim-3的抑制剂导致aml细胞的细胞裂解显著增加。另外，发明人发现，当与嵌合抗原受体t细胞(cart细胞)或能够接合t细胞的抗体构建体(诸如双特异性t细胞接合(bite)抗体构建体amg330，其具有对cd3和cd33的双重特异性)组合时，所述免疫检查点抑制剂的影响可以甚至更有效。因此，本发明的化合物和组合物为血源性癌症，特别是aml患者提供了新治疗选择，从而提供了使血源性癌细胞更易于被人体防御杀死的有希望的方法。因此，本发明表明了存在广泛而多样的增强抗肿瘤免疫的机会，并且提供了似乎具有实现持久临床应答潜力的化合物和组合物。
在第一方面，本发明涉及用于治疗血源性癌症(特别是急性骨髓性白血病(aml))的方法的针对cd112(连接蛋白-2、pvrl2)、cd155(pvr)、半乳糖凝集素-9、tim-3和/或tigit的抑制剂。如本文所述，第一组此类抑制剂抑制免疫检查点蛋白配体和受体之间的相互作用。因此设想本发明的针对cd112的抑制剂抑制cd112和tigit之间的相互作用。设想本发明的针对cd155的抑制剂抑制cd155和tigit之间的相互作用。设想本发明的针对tigit的抑制剂抑制tigit和cd112之间的相互作用。设想本发明的针对tigit的抑制剂抑制tigit和cd155之间的相互作用。设想本发明的针对半乳糖凝集素-9的抑制剂抑制半乳糖凝集素-9和tim-3之间的相互作用。设想本发明的针对tim-3的抑制剂抑制tim-3和半乳糖凝集素-9之间的相互作用。本发明的抑制剂可以是抗体构建体。
还设想本发明的抑制剂还可以包含cart细胞。本发明的抑制剂还可以包含能够接合t细胞的抗体构建体。能够接合t细胞的抗体构建体优选地包含cd3结合域和靶向在aml细胞上表达的表面分子的另外结合域。所述表面分子可以选自由cd33、cd19和flt3组成的组。能够接合t细胞的抗体构建体优选地是能够结合cd3ε的结合分子。本发明的抑制剂还可以包含免疫刺激剂。
如本文所述，另一组免疫检查点抑制剂减少免疫检查点蛋白的表达。因此，设想本发明的针对cd112的抑制剂减少cd112的表达。设想本发明的针对cd155的抑制剂减少cd155的表达。设想本发明的针对tigit的抑制剂减少tigit的表达。设想本发明的针对半乳糖凝集素-9的抑制剂增加半乳糖凝集素-9的表达。设想本发明的针对tim3的抑制剂增加tim-3的表达。设想本发明的抑制剂是irna。设想本发明的抑制剂敲除cd112、cd155、tigit、半乳糖凝集素-9和/或tim-3。敲除可以通过crispr/cas9技术来实现。
如本文所述，另一组免疫检查点抑制剂调节免疫检查点蛋白的细胞内信号传导。因此，设想本发明的针对cd112的抑制剂调节cd112的细胞内信号传导。设想本发明的针对cd155的抑制剂调节cd155的细胞内信号传导。设想本发明的针对tigit的抑制剂调节tigit的细胞内信号传导。设想本发明的针对半乳糖凝集素-9的抑制剂调节半乳糖凝集素-9的细胞内信号传导。设想本发明的针对tim-3的抑制剂调节tim-3的细胞内信号传导。
在另一个方面，本发明涉及包含针对cd112(连接蛋白-2、pvrl2)、cd155(pvr)、半乳糖凝集素-9、tim-3和/或tigit的抑制剂和cart细胞的药物组合物。所述针对cd112(连接蛋白-2、pvrl2)、cd155(pvr)、半乳糖凝集素-9、tim-3和/或tigit的抑制剂可以是抗体构建体。
在另一个方面，提供了包含针对cd112(连接蛋白-2、pvrl2)、cd155(pvr)、半乳糖凝集素-9、tim-3和/或tigit的抑制剂和能够接合t细胞的抗体构建体的药物组合物。所述能够接合t细胞的抗体构建体可以包含cd3结合域和靶向在aml细胞上表达的表面分子的另外结合域。
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必须注意的是，如本文所用，除非上下文另外清楚地指出，否则单数形式“一个”、“一种”和“所述”包括多个指代物。因此，例如，提及“一种试剂”包括一种或多种此类不同试剂，并且提及“所述方法”包括提及本领域的普通技术人员已知的可以为本文所述的方法而修改或替代的等同步骤和方法。
除非另外指明，否则在一系列要素之前的术语“至少”应理解为是指该系列中的每个要素。本领域的技术人员将会认识到，或仅仅使用常规实验就能够确定本文所述的本发明的具体实施方案的许多等同物。此类等同物旨在被本发明所涵盖。
术语“和/或”无论在本文何处使用，均包括“和”、“或”以及“由所述术语连接的要素的全部或任何其它组合”的含义。
如本文所用，术语“约”或“大约”意指在给定值或范围的20％内，优选地在10％内，更优选地在5％内。然而，它也包括具体的数字，例如约20包括20。
术语“小于”或“大于”包括具体的数字。例如，小于20意指小于或等于。类似地，多于或大于分别意指多于或等于或者大于或等于。
在整个说明书和随后的权利要求书中，除非上下文另有要求，否则词语“包括”以及诸如“包含”和“含有”的变化将被理解为意指包括所述整体或步骤或者整体或步骤的组，但不排除任何其它整体或步骤或者整体或步骤的组。当在本文中使用时，或者有时当在本文中与术语“具有”一起使用时，术语“包含”可以被术语“含有”或“包括”代替。
当在本文中使用时，“由......组成”排除权利要求要素中未指定的任何要素、步骤或成分。当在本文中使用时，“基本上由......组成”不排除对权利要求的基本和新颖特征无实质上影响的材料或步骤。
在本文的每种情况下，术语“包括”、“基本上由......组成”和“由......组成”中的任何一者可以被另外两个术语中的任一者代替。
应该理解的是，本发明不限于本文描述的具体方法、方案、材料、试剂和物质等，并且因此可以变化。本文所用的术语仅仅是出于描述具体实施方案的目的，并且不旨在限制仅由权利要求限定的本发明的范围。
本说明书全文中引用的所有出版物和专利(包括所有专利、专利申请、科学出版物、制造商的规格说明、说明书等)，无论是上文还是下文，全文均据此以引用的方式并入。本文中的任何内容都不应被理解为承认本发明由于在先发明而无权先于此类公开。就以引用的方式并入的材料与本说明书相矛盾或不一致而言，说明书将代替任何此类材料。
最后，应当理解，本文公开的本发明的实施方案是对本发明原理的示例。可以采用的其它修改在本发明的范围内。因此，作为示例而非限制，根据本文的教导可以利用本发明的替代配置。因此，本发明不限于正如所示和所描述的那样。
附图说明
图1：在不同aml细胞系上表达的pvr、pvrl2和半乳糖凝集素-9蛋白，相对于来自健康供体的pbmc。通过facs确定蛋白质表达。所有检查的aml细胞系均为pvr和pvrl2蛋白表达约100％阳性。相比之下，分别仅有52％和40％的来自健康供体的pbmc表达pvr和pvrl2。pvr和pvrl2的蛋白质密度(由mfi假定)非常高，相比之下pbmc的密度非常低。半乳糖凝集素-9蛋白的表达和密度很低，相当于来自健康供体的pbmc。左柱显示pvr表达，中柱显示pvrl2表达，右柱显示半乳糖凝集素-9表达。
图2：aml患者的原代母细胞的pvr和pvrl2蛋白表达。已分离初发性(denovo)aml患者的mnc，并且分别对cd33和pvr或pvrl2进行同时染色。此处描述了cd33群体内pvr或pvrl2阳性细胞的百分比份额。左柱显示pvrl2表达，右柱显示pvr表达。
图3：使用针对pvr和pvrl2的封闭性抗体与amg330组合对pbmc来源的细胞毒性进行测量的体外测定。
图4：pvr封闭性抗体在细胞毒性测定(细胞系mv441)中增强杀死作用。pvr封闭性抗体d171在24h后以剂量依赖性方式显著增强细胞杀死作用。下图显示实验1，上图显示实验2。
图5：pvr的封闭导致mv4-11细胞的细胞裂解显著增加。pvr-ab具有相当于单独amg330的效果。对于amg330和pvr-ab的组合，可以观察到叠加效应。
图6：pvr封闭性抗体在细胞毒性测定(细胞系kg-1)中增强杀死作用。pvr封闭性抗体d171在24h后以剂量依赖性方式显著增强细胞杀死作用。下图显示实验1，上图显示实验2。
图7：pvr的封闭导致kg-1细胞的细胞裂解显著增加。pvr-ab具有相当于单独amg330的效果。对于amg330和pvr-ab的组合，可以观察到叠加效应。
图8：pvrl2封闭性抗体在细胞毒性测定(细胞系mv4-11)中增强杀死作用。pvrl2抗体l-14在24h后显著增强细胞杀死。下图显示实验2，上图显示实验1。
图9：pvrl2的封闭导致mv4-11细胞的细胞裂解显著增加。对于amg330和pvrl2-ab的组合，可以观察到叠加效应。
图10：pvrl2封闭性抗体在细胞毒性测定(细胞系kasumi-1)中增强杀死作用。pvrl2抗体l-14在24h后显著增强细胞杀死。下图显示实验1，中图显示实验3，上图显示实验2。
图11：pvrl2的封闭导致kasumi-1细胞的细胞裂解显著增加。与仅用amg330处理相比，pvrl2-ab对细胞裂解产生类似的效果。对于amg330和pvrl2-ab的组合，可以观察到叠加效应。
图12：pvrl2封闭性抗体在细胞毒性测定(细胞系uke-1)中增强杀死作用。pvrl2抗体l-14在24h后显著增强细胞杀死。下图显示实验2，上图显示实验1。
图13：amg330和pvrl2封闭性抗体的组合导致uke-1中细胞毒性显著增加。
图14：半乳糖凝集素-9的封闭导致mv4-11细胞的细胞裂解显著增加。对于amg330和9m1-3-ab的组合，可以观察到叠加效应。
图15：半乳糖凝集素-9的封闭导致kg-1细胞的细胞裂解显著增加。对于amg330和9m1-3-ab的组合，可以观察到叠加效应。
图16：pvr和pvrl2在aml细胞系和原代cd33+aml母细胞上高度表达。pvr和pvrl2蛋白表达如阳性cd33+细胞的百分比所示，并且中值荧光强度比例作为aml细胞系(n＝8；a、b)和来自未经治疗的患者的cd33+aml母细胞(n＝17；c、d)上表达强度的量度。黑色连接线表示中值。
图17：pvr和pvrl2的封闭增加了aml细胞系的裂解。在24h后测定hd-pbmc介导的aml细胞系mv4-11(a)、tf-1(b)、molm-13(c)、kasumi-1(d)的裂解。结果表示为归一化至无封闭性抗体的对照的死亡靶细胞的倍数变化(fc)的平均值±sd。对于统计分析，进行mann-whitneyu检验(#p≤0.05；*p≤0.001；n≥3)。
图18：通过另外施用pvr和pvrl2封闭性抗体，
图19：通过封闭pvr和pvrl2来增加细胞裂解是特异性的，而不是通过adcc介导的。a、b为了排除adcc的贡献，对来自相同健康供体的pbmc进行cd3+t细胞的抗白血病效应的比较分析，其中我们不通过细胞系mv4-11(a)和tf-1(b)另外施用amg330。结果表示为死亡靶细胞的平均值±sd(n＝2)。c、d在存在或不存在amg330(n＝2，+2μg/ml，++10μg/ml，+++50μg/ml)的情况下，将kasumi-1细胞与递增剂量的靶向cd117的抗体一起温育。结果表示为归一化至对照的死亡靶细胞的倍数变化(fc)的平均值±sd。e、fhd-pbmc上的fcγ受体使用多克隆人igg饱和，并且与未饱和的hd-pbmc进行比较，两者都用作针对mv4-11细胞的效应细胞。结果表示为死亡靶细胞的平均值±sd(n＝3)。
图20：pvr和pvrl2双敲除细胞在体外重现抗体效应，在体内延长使用人t细胞重建的nsg小鼠的存活期。a通过使用crispr/cas9，产生具有pvr和pvrl2双敲除的mv4-11的多克隆群体。在不存在或存在amg330的情况下，将mv4-11野生型或双敲除细胞与hd-pbmc一起温育24小时。对于统计分析，进行mann-whitneyu检验(#p≤0.05；*p≤0.001，n＝3)。b使用mv4-11野生型(wt)或pvr和pvrl2双敲除(ko)细胞移植免疫缺陷nsg小鼠并使用人类t细胞重建。治疗包括每天腹膜内施用安慰剂(对于wt，n＝13；对于ko，n＝12)或15μg/kgamg330(对于wt，n＝12；对于ko，n＝15)。进行对数秩检验：wt安慰剂对ko安慰剂，p＜0.001；wtamg330对koamg330，p＜0.001；wt安慰剂对wtamg330，p＝0.003；ko安慰剂对koamg330，p＝0.027。ccrispr/cas9产生的敲除细胞的增殖能力。将mv4-11pvr和pvrl2双敲除细胞的生长速率与mv4-11野生型细胞的增殖能力进行比较。使用vi-celltmxr自动细胞计数仪(beckmancoulter)在第2天和第4天测定细胞计数；n＝3。
图21：crispr/cas9介导的pvr和pvrl2双敲除细胞的基因组分析。为了在基因组水平上验证mv4-11细胞中crispr/cas9介导的pvr和pvrl2敲除，通过亚克隆和测序分析多个单细胞的对应基因片段。分别提供pvr(a)和pvrl2(b)的三种不同敲除克隆的基因组改变，包括对蛋白质序列的影响。顶部显示具有蓝色靶标位点和绿色pam序列的野生型序列。对于pvrl2，由于pvrl2指导rna识别反向平行dna链，靶向区域和pam序列处于反向互补方向。亚克隆内的缺失以红色破折号表示，插入以红色表示。wt＝野生型，ko＝双敲除，pam＝原间隔序列邻近基序，aa＝氨基酸。
详述
以下具体实施方式包括可以对理解陈述有用的信息。并非承认本文提供的任何信息是现有技术或与当前要求保护的发明相关，或者明确或暗示引用的任何出版物是现有技术。
本发明至少部分基于出乎意料的发现，即针对cd112(连接蛋白-2、pvrl2)、cd155(pvr)、半乳糖凝集素-9、tim-3和/或tigit的免疫检查点抑制剂可以有效地用于治疗血源性癌症，特别是具有免疫逃避机制的急性骨髓性白血病(aml)，从而在癌症治疗中提供新的、非常有效的免疫治疗方法。就此而言，发明人发现，在使用各种白血病细胞系的体外研究中，免疫检查点配体cd112和cd155及其受体tigit、免疫检查点配体半乳糖凝集素-9及其受体tim-3是非常合适的治疗血源性癌症，特别是aml的靶标。cd112是cd155免疫检查点蛋白配体，其受体是tigit。半乳糖凝集素-9也是配体，tim-3是其受体。
本发明人发现免疫检查点配体pvr和pvrl2及其受体tigit似乎对aml患者的总体存活率具有负面预后影响(数据未显示)。此外，本发明人揭示了pvl、pvrl2或tigit的封闭导致显著杀死aml细胞(图3-13)。因此，本发明人关注pvr、pvrl2和tigit作为血源性癌症治疗，特别是aml治疗中的新靶标，并且提供了有效地抑制pvr、pvrl2和/或tigit的免疫抑制信号的物质，从而通过t细胞免疫功能的恢复和活化机制抑制癌症增殖。此外，在描述免疫检查点配体半乳糖凝集素-9及其受体tim-3对t细胞活性和肿瘤发展的正面和负面预后影响的领域中存在相互矛盾的数据。尽管表达研究似乎强调了半乳糖凝集素-9和tim-3对癌症患者具有相当积极的预后影响(数据未显示)，但是本发明人揭示了半乳糖凝集素-9和tim-3的封闭导致显著杀死aml细胞(参见图14和15)。因此，本发明还提供有效地抑制半乳糖凝集素-9/tim-3相互作用的免疫抑制信号，从而通过t细胞的恢复和活化来抑制癌细胞增殖的物质。
如本发明人所示，所有检查的aml细胞系均为pvr和pvrl2蛋白表达约100％阳性。相比之下，分别仅有52％和40％的来自健康供体的pbmc表达pvr和pvrl2(图1)。此外，pvr和pvrl2的蛋白质密度非常高，相比之下pbmc的密度非常低。另外，半乳糖凝集素-9蛋白的表达和密度很低，相当于来自健康供体的pbmc。aml患者的原代母细胞也显示出pvr和pvrl2蛋白表达。据此，已分离初发性aml患者的mnc，并且分别对cd33和pvr或pvrl2进行同时染色。此处可以找到cd33群体内pvr或pvrl2阳性细胞的百分比份额(图2)。
如本文所公开，pvr和pvrl2与其受体tigit的相互作用以及半乳糖凝集素-9与其受体tim-3的相互作用充当免疫阻抑或甚至免疫抑制信号，因此在aml中作为免疫逃逸机制发挥功能。根据上述内容，预期本发明的针对cd112、cd155、tigit、半乳糖凝集素-9和/或tim-3的免疫检查点抑制剂应当抑制cd112和tigit、cd155和tigit和/或半乳糖凝集素-9和tim-3之间的相互作用或使其难以进行，从而促进癌症特异性免疫应答。同样，预期本发明的针对cd155的免疫检查点抑制剂抑制cd155和tigit之间的相互作用或使cd155和tigit之间的相互作用更难以进行。还预期本发明的针对tigit的免疫检查点抑制剂抑制tigit和cd112和/或cd155之间的相互作用或使tigit和cd112和/或cd155之间的相互作用更难以进行。此外，预期本发明的针对半乳糖凝集素-9的免疫检查点抑制剂抑制半乳糖凝集素-9和tim-3之间的相互作用或使半乳糖凝集素-9和tim-3之间的相互作用更难以进行。同样，预期本发明的针对tim-3的免疫检查点抑制剂抑制tim-3和半乳糖凝集素-9之间的相互作用或使tim-3和半乳糖凝集素-9之间的相互作用更难以进行。
如本文所用，术语“抑制(inhibit/inhibiting)”是指本发明的抑制剂封闭、部分封闭、干扰、降低、抑制、减少靶蛋白或使其失活的能力，所述靶蛋白即免疫检查点配体cd112和cd155和/或其受体tigit、免疫检查点配体半乳糖凝集素-9和/或其受体tim-3。因此，本领域的技术人员理解术语“抑制”可以涵盖所述配体或受体的全部和/或部分活性丧失。所述配体或受体的活性可以通过与配体/受体蛋白的活性位点结合的化合物，或通过其它方式，诸如使激活受抑制的第一蛋白的第二蛋白失活来阻抑或抑制。例如，cd112和tigit、cd155和tigit以及半乳糖凝集素-9和tim-3之间的相互作用的全部和/或部分抑制可以通过细胞裂解的显著增加，即血源性癌症靶细胞，特别是aml靶细胞的细胞死亡率显著增加来表示。
本文所用的术语“血源性癌症”包括特别是白血病和淋巴瘤，如霍奇金淋巴瘤或非霍奇金淋巴瘤。它还包括骨髓增生异常综合征(mds)和多发性骨髓瘤(mm)。
本专利申请的免疫检查点抑制剂除了用于治疗血源性癌症之外，还可以用于治疗实体瘤，诸如口腔癌或胰腺癌(thijssen等人(2015)，biochimbiophys1855，235-247)。
“急性骨髓性白血病”也称为急性髓细胞白血病、急性髓细胞性白血病、急性粒细胞性白血病、急性非淋巴细胞性白血病或仅称为“aml”，通常是指急性形式的白血病，其典型特征是癌性、未成熟的成髓细胞、红细胞或血小板产生过剩和/或积聚于骨髓中。“急性”意指如果不治疗，则这种白血病可以迅速进展，并且可能在几个月内致命。“骨髓性”是指这种白血病起始的细胞类型。大多数aml病例从可转变为白细胞的细胞(除淋巴细胞之外)发展而来，但有不同的aml亚型。aml从骨髓起始，但在大多数情况下，迅速进入血液。如本文所用，术语“aml”包括急性、难治性和复发的aml。本文所用的术语“难治性aml”意指aml对常规或标准aml治疗(诸如化学治疗和/或造血干细胞移植(hsct))的耐受性，即常规或标准aml治疗不能最终治愈所有aml患者。本文所用的术语“复发的aml”表示患者在缓解后恢复了aml疾病的体征和症状。例如，在使用化学治疗和/或hsct的常规aml治疗之后，aml患者可缓解为无aml的体征或症状，保持缓解期几年，但是会复发并且必须再次治疗aml。本文所用的术语“aml”还包括aml的患者中的微小残留疾病(mrd)，即在治疗期间或治疗之后患者处于缓解期间，患者中存在少量癌性骨髓细胞残留。
当在本文中使用时，术语“免疫检查点抑制剂”是指适于作用于免疫检查点蛋白cd112、cd155、tigit、半乳糖凝集素-9和/或tim-3的任何结合剂或化合物，从而抑制或阻抑cd112和tigit、cd155和tigit和/或半乳糖凝集素-9和tim-3之间相互作用的免疫抑制信号。当在本文中使用时，术语“免疫抑制信号”是指本发明的免疫检查点配体和受体之间的相互作用，从而减少所涉及的t细胞对所涉及的肿瘤细胞的免疫活性并且允许肿瘤细胞逃避有机体的免疫防御机制。本发明的抑制剂涉及cd112、cd155、tigit、半乳糖凝集素-9和/或tim-3，因此抑制本发明的免疫检查点配体和受体之间的该免疫抑制信号，从而允许t细胞攻击和消除所涉及的肿瘤细胞。因此，本发明的抑制剂能够降低或抑制本发明的免疫检查点配体与其受体之间的免疫抑制信号。因此，本发明的抑制剂通过激活对癌细胞的t细胞应答而表现出“免疫增强”活性。具体地讲，本发明的具有免疫增强活性的抑制剂能够降低或抑制cd112和tigit之间的免疫抑制信号的强度。还设想本发明的具有免疫增强活性的抑制剂能够降低或抑制cd155和tigit之间的免疫抑制信号的强度。还设想本发明的具有免疫增强活性的抑制剂能够降低或抑制半乳糖凝集素-9和tim-3之间的免疫抑制信号的强度。
根据本发明，本发明的免疫检查点抑制剂与各自的免疫检查点靶蛋白的结合调节所述靶蛋白的细胞内信号传导。因此，设想针对cd112的抑制剂调节cd112的细胞内信号传导。同样，设想针对cd155的抑制剂调节cd155的细胞内信号传导。同样，设想针对tigit的抑制剂调节tigit的细胞内信号传导。同样，设想针对半乳糖凝集素-9的抑制剂调节半乳糖凝集素-9的细胞内信号传导。同样，设想针对tim-3的抑制剂调节tim-3的细胞内信号传导。当在本文中使用时，术语“调节”或“调整”包括增加、减少或者以另外方式改变本发明的免疫检查点蛋白(即cd112、cd155、tigit、半乳糖凝集素-9和/或tim-3)的细胞内信号。就此而言，与该免疫检查点蛋白偶联的细胞内信号途径可被增强、阻止或完全阻止，从而改变包括细胞活化、增殖和恶性生长的下游信号传导元件的水平、量和/或活性。
如本文所公开，本发明的针对cd112、cd155、tigit、半乳糖凝集素-9和/或tim-3的抑制剂可用于治疗血源性癌症，特别是急性骨髓性白血病(aml)。血源性癌症是在骨髓中起始的血细胞癌症，通常包括白血病和淋巴瘤。就血源性癌症而言，骨髓开始产生异常细胞，从而排挤正常血细胞。同样，本文公开的抑制剂特别适用于治疗任何种类的以肿瘤细胞上cd112、cd155和/或半乳糖凝集素-9的表达增加为特征的血源性癌症。具体地讲，本文公开的抑制剂特别适用于治疗任何种类的以为特征的血源性癌症。因此，设想本发明的抑制剂还可以用于治疗以肿瘤细胞上cd112、cd155和/或半乳糖凝集素-9的表达增加为特征的其它血源性癌症，诸如慢性骨髓性白血病(cml)、急性淋巴性白血病(all)、骨髓增生异常综合征(ms或骨髓发育不良)和骨髓增殖性肿瘤(mpn)。还设想本发明的抑制剂可用于治疗以cd112、cd155和/或半乳糖凝集素-9表达增加为特征的实体瘤。就此而言，本文公开的抑制剂可用于在肿瘤细胞上表达的免疫检查点配体cd112、cd155和/或半乳糖凝集素-9与其在t细胞上表达的免疫检查点受体tigit和tim-3之间相互作用，如在本文别处所述。
如本发明通过各种白血病细胞系的facs分析和体外细胞毒性测定试验所示，针对pvr和pvrl2的抗体非常适合于封闭这些免疫检查点配体，从而显著增加aml细胞的细胞裂解(图3-13)。因此，本发明的抑制剂为抗体构建体是优选的。在本公开的意义上，术语“抗体构建体”表示能够(特异性)结合本发明的免疫检查点分子、与其相互作用或识别其的基于抗体的“结合分子”或“结合剂”。抗体构建体可以与aml癌症靶细胞上的表面分子或t细胞上的受体复合物结合/与其相互作用。优选的结合分子是抗体。
术语“抗体”是指其中结构和/或功能是基于抗体(例如全长或完整免疫球蛋白分子)的结构和/或功能的分子。根据本发明，用于治疗血源性癌症，特别是aml的抗体是特异性地抑制本发明的免疫检查点配体和免疫检查点受体之间的相互作用的抑制性抗体。就此而言，设想本文公开的抗体特异性地抑制cd112和tigit之间的相互作用。还设想本文公开的抗体特异性地抑制cd155和tigit之间的相互作用。还设想本文公开的抗体特异性地抑制半乳糖凝集素-9和tim-3之间的相互作用。具体地讲，当本发明的抗体抑制本发明的免疫检查点配体和免疫检查点受体之间的相互作用时，其抑制cd112/tigit、cd55/tigi和/或半乳糖凝集素-9/tim-3之间的免疫抑制相互作用，从而抑制配体-受体相互作用的信号。因此，本文公开的抗体自身结合本发明的免疫检查点配体或受体，使得获得所述配体和受体之间的免疫抑制信号即使不是不可能，也是难以实现。根据上述内容，可用于本发明的方法和用途的示例性抗体包括抗cd112抗体、抗cd112抗体、抗tigit抗体、抗半乳糖凝集素-9抗体和抗tim-3抗体。技术人员知道许多不同的抑制性抗体可以根据本发明使用，从而抑制免疫检查点配体和受体之间的相互作用，如本文别处所公开。
术语“抗体”的定义包括诸如单克隆抗体、嵌合抗体、单链抗体、人源化抗体和人抗体，以及抗体片段尤其是例如fab片段的实施方案。抗体片段或衍生物还包括f(ab′)2、fv、scfv片段或单域抗体诸如域抗体或纳米抗体、单可变域抗体或仅包含一个可变域的免疫球蛋白单可变域，所述可变域可以是独立于其它v区或域而特异性结合抗原或表位的vhh、vh或vl；参见例如harlow和lane(1988)和(1999)，同上；kontermann和dübel，antibodyengineering，springer，第2版，2010和little，recombinantantibodiesforimmunotherapy，cambridgeuniversitypress2009。此类免疫球蛋白单可变域不仅涵盖分离的抗体单可变域多肽，而且还涵盖包含抗体单可变域多肽序列的一个或多个单体的较大多肽。符合上述定义的单价抗体片段描述了与本发明有关的结合域的实施方案。此类单价抗体片段结合至特定的抗原，也可以称为“抗原结合域”、“抗原结合片段”或“抗体结合区”。
根据本文提供的此定义，术语抗体可以归入术语“抗体构建体”之下。所述术语还包括双抗体或双亲和重定向(dart)抗体。还设想了(双特异性)单链双抗体、串联双抗体(tandab′s)、“微抗体”，其结构示例如下：(vh-vl-ch3)2、(scfv-ch3)2或(scfv-ch3-scfv)2、“fcdart”抗体和“iggdart”抗体以及多抗体诸如三抗体。免疫球蛋白单可变域不仅涵盖分离的抗体单可变域多肽，而且还涵盖包含抗体单可变域多肽序列的一个或多个单体的较大多肽。
各种程序是本领域已知的，并且可用于产生此类抗体构建体(抗体和/或片段)。因此，(抗体)衍生物可以通过肽模拟物产生。此外，所述用于产生单链抗体的技术(参见尤其是美国专利4,946,778，kontermann和dübel(2010)，同上以及little(2009)，同上)可适于产生对选择的多肽具有特异性的单链抗体。另外，转基因动物可以用于表达对本发明的多肽和融合蛋白具有特异性的人源化抗体。为了制备单克隆抗体，可以使用提供由连续细胞系培养物产生的抗体的任何技术。此类技术的实例包括杂交瘤技术(
此外，本文所用的术语“抗体”还涉及显示出与所述抗体具有相同特异性的本文所述的抗体的衍生物或变体。“抗体变体”的实例包括非人抗体的人源化变体、“亲和力成熟的”抗体(参见例如hawkins等人，j.mol.biol.254，889-896(1992)和lowman等人，biochemistry30，10832-10837(1991))以及具有改变的效应子功能的抗体突变体(参见例如美国专利5,648,260，kontermann和dübel(2010)，同上以及little(2009)同上)。
当在本文中使用时，术语“抗原结合域”、“抗原结合片段”和“抗体结合区”是指包含负责抗体和抗原之间的特异性结合的氨基酸的抗体分子的一部分。抗体特异性识别和结合的抗原的一部分称为如上文所述的“表位”。如上文所述，抗原结合域通常可以包含抗体轻链可变区(vl)和抗体重链可变区(vh)；然而，抗原结合域不一定包含这两者。例如，fd片段具有两个vh域，并且通常保留了完整抗原结合域的一些抗原结合功能。抗体的抗原结合片段的实例包括(1)fab片段，具有vl、vh、cl和ch1域的单价片段；(2)f(ab′)2片段，具有在铰链区通过二硫桥连接的两个fab片段的二价片段；(3)具有两个vh和ch1域的fd片段；(4)具有抗体单臂的vl和vh域的fv片段，(5)具有vh域的dab片段(ward等人，(1989)nature341：544-546)；(6)分离的互补决定区(cdr)，以及(7)单链fv(scfv)。虽然fv片段的两个域vl和vh由单独的基因编码，但是可以使用重组方法通过合成接头将它们连接起来，使得它们可以形成单个蛋白链，其中vl和vh区域对形成单价分子(称为单链fv(scfv)；参见例如huston等人(1988)proc.natl.acad.sciusa85：5879-5883)。使用本领域的技术人员已知的常规技术获得这些抗体片段，并且以与完整抗体相同的方式评估片段的功能。
在使用(合成)接头的情况下，该接头优选地具有足以确保第一和第二域中的每者可以彼此独立地保持其差异结合特异性的长度和序列。最优选地并且如所附实施例中所记载，本发明的抗体构建体是“双特异性单链抗体构建体”，更优选地双特异性单链fv(scfv)。双特异性单链分子是本领域已知的，并且如wo99/54440，mack，j.immunol.(1997)，158，3965-3970，mack，pnas，(1995)，92，7021-7025，kufer，cancerimmunol.immunother.，(1997)，45，193-197，
对于连接本发明的抗体构建体中的至少两个结合域的肽接头，优选的是仅包含几个氨基酸残基，例如12个氨基酸残基或更少的肽接头。因此，12、11、10、9、8、7、6或5个氨基酸残基的肽接头是优选的。设想的具有小于5个氨基酸的肽接头包含4、3、2或1个氨基酸，其中富含gly的接头是优选的。在所述“肽接头”的语境中，特别优选的“单个”氨基酸是gly。因此，所述肽接头可以由单个氨基酸gly构成。
如本文所用，术语“单克隆抗体”是指从基本上同质的抗体群获得的抗体，即构成该群的单个抗体是相同的，不同的是可以少量存在可能天然存在的突变和/或翻译后修饰(例如异构化、酰胺化)。单克隆抗体是针对单个抗原位点高度特异性的。此外，与通常包含针对不同决定簇(表位)的不同抗体的常规(多克隆)抗体制剂相比，每种单克隆抗体针对抗原上的单个决定簇。除了特异性之外，单克隆抗体的优点在于它们通过杂交瘤培养物合成，未被其它免疫球蛋白污染。修饰语“单克隆”表示从基本上同质的抗体群获得的抗体的特征，并不被解释为需要通过任何特定方法产生抗体。例如，根据本发明使用的单克隆抗体可以通过kohler等人，nature，256：495(1975)首先描述的杂交瘤方法制备，或者可以通过重组dna方法制备(参见例如美国专利号4,816,567)。“单克隆抗体”也可以使用例如clackson等人，nature，352：624-628(1991)和marks等人，j.mol.biol.，222：581-597(1991)中描述的技术从噬菌体抗体文库分离。
术语“人抗体”包括具有基本上对应于本领域已知的人生殖系免疫球蛋白序列的可变区和恒定区的抗体，包括例如kabat等人(参见kabat等人(1991)同上)所述的那些。本发明的人抗体可以包括不由人生殖系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如通过体外随机或定点诱变或通过体内体细胞突变引入的突变)，例如在cdr特别是cdr3中。人抗体可以具有至少一个、两个、三个、四个、五个或更多个被不由人生殖系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基置换的位置。需要强调的是，如本文所使用的人抗体的定义还设想了完全人抗体，其仅包括非人工和/或遗传改变的抗体的人序列，如可以通过使用系统(诸如xenomice)的技术衍生的那些。
“抗体变体”的实例包括非人抗体的人源化变体、“亲和力成熟的”抗体(参见例如hawkins等人，j.mol.biol.254，889-896(1992)和lowman等人，biochemistry30，10832-10837(1991))和具有改变的效应子功能的抗体突变体(参见例如美国专利5,648,260，kontermann和dübel(2010)，同上和little(2009)，同上)。如本文所用，“体外产生的抗体”是指其中全部或部分可变区(例如，至少一个cdr)在非免疫细胞选择(例如，体外噬菌体展示、蛋白质芯片或其中可以测试候选序列结合抗原的能力的任何其它方法)中产生的抗体。因此该术语优选地排除在免疫细胞中通过基因组重排产生的序列。vh和vl配对在一起形成单个抗原结合位点。最靠近vh的ch域称为ch1。每条l链通过一个共价二硫键连接至h链，而两条h链根据h链同种型通过一个或多个二硫键彼此连接。vh和vl域由称为框架区(fr1、fr2、fr3和fr4)的相对保守序列的四个区构成，其形成高变区序列(互补决定区，cdr)的三个区域的支架。cdr含有大部分负责抗体与抗原的特异性相互作用的残基。cdr称为cdr1、cdr2和cdr3。因此，重链上的cdr成分称为h1、h2和h3，而轻链上的cdr成分称为l1、l2和l3。
术语“可变”是指免疫球蛋白域在其序列中表现出可变性并且涉及确定特定抗体的特异性和结合亲和力的部分(即，“可变域”)。变异性不是均匀分布在整个抗体的可变域中；它集中在每个重链和轻链可变区的子域中。这些子域称为“高变”区或“互补决定区”(cdr)。可变域的更保守的(即，非高变的)部分称为“框架”区(frm)。天然存在的重链和轻链的可变域各自包含四个frm区，大部分采用β-折叠构型，通过三个高变区连接，这三个高变区形成环连接，并且在一些情况下形成β-折叠结构的一部分。每条链中的高变区通过frm紧密保持在一起，并且另一条链的高变区有助于形成抗原结合位点(参见kabat等人，同上)。恒定域不直接参与抗原结合，但表现出各种效应子功能，诸如例如抗体依赖性、细胞介导的细胞毒性和补体活化。
术语“cdr”及其复数是指其中三个构成轻链可变区(cdrl1、cdrl2和cdrl3)的结合特征，三个构成重链可变区(cdrh1、cdrh2和cdrh3)的结合特征的互补决定区(cdr)。cdr有助于抗体分子的功能活性，并且被包含支架或框架区的氨基酸序列分开。准确定义的cdr边界和长度受到不同分类和编号系统的限制。因此，cdr可与kabat、chothia、contact或任何其它边界定义(包括本文所述的编号系统)相关。尽管有不同的边界，但是这些系统中的每个在构成可变序列内所谓的“高变区”方面具有某种程度的重叠。因此，根据这些系统的cdr定义可以在相对于邻近框架区的长度和边界区域方面有所不同。参见例如kabat、chothia和/或maccallum(kabat等人，同上；chothia等人，j.mol.biol，1987，196：901；和maccallum等人，j.moi.biol，1996，262：732)。然而，根据所谓的kabat系统的编号是优选的。轻链的cdr3，特别是重链的cdr3可构成轻链和重链可变区内抗原结合中最重要的决定簇。在一些抗体构建体中，重链cdr3似乎构成抗原和抗体之间的主要接触区域。其中cdr3单独改变的体外选择方案可用于改变抗体的结合性质或确定哪些残基有助于抗原的结合。
在一些实施方案中，本文所述的结合分子是分离的蛋白质或基本上纯的蛋白质。“分离的”蛋白质不伴随有通常其天然状态下相关的至少一些材料，例如构成给定样品中总蛋白的至少约5重量％或至少约50重量％。可以理解的是，根据情况，分离的蛋白质可构成总蛋白含量的5至99.9重量％。例如，蛋白质可以通过使用诱导型启动子或高表达启动子以显著更高的浓度制备，使得蛋白质以增加的浓度水平制备。该定义包括在本领域已知的许多生物体和/或宿主细胞中产生抗原结合蛋白。
如本文所公开，本发明的实验结果特别示出了针对免疫检查点cd112、cd155、tigit、半乳糖凝集素-9和tim-3的抗体的抑制效果。然而，任何其它能够抑制cd112和tigit、cd155和tigit和/或半乳糖凝集素-9和tim-3之间的免疫抑制信号的物质也具有类似的效果。具有此类效果的物质包括例如可溶性cd112、可溶性cd155、可溶性tigit、可溶性半乳糖凝集素-9、可溶性tim-3、c112拮抗剂、cd155拮抗剂、tigit拮抗剂、半乳糖凝集素-9拮抗剂、tim-3拮抗剂、抑制cd112和tigit、cd155和tigit和/或半乳糖凝集素-9和tim-3之间的相互作用的物质、cd112产生抑制剂、cd155产生抑制剂、tigit产生抑制剂、tigit产生抑制剂、tim-3产生抑制剂和通过tigit或tim-3发挥作用的细胞内抑制信号抑制剂。
因此，本发明的cd112、cd155、tigit、半乳糖凝集素-9和/或tim-3抑制剂包含蛋白质或非蛋白质化合物或药剂。就此而言，结合至cd112、cd15、tigit、半乳糖凝集素-9和/或tim-3的蛋白质和多肽或衍生物包括d112、cd155、tigit、半乳糖凝集素-9或tim-3的每个部分蛋白质，其中cd112和tigit、cd155和tigit和/或半乳糖凝集素-9和tim-3之间的免疫抑制信号未诱导。对于诱导tigit或tim-3的免疫抑制信号，tigit或tim-3存在于免疫检查点受体附近是必不可少的，出于该目的它通过在肿瘤或癌细胞中与cd112、cd155(tigit)或半乳糖凝集素-9(tim-3)相互作用而受到抑制。因此，可溶性cd112、cd155或半乳糖凝集素-9具有仅为胞外域并且与tigit或tim-3相互作用的部分，可以抑制cd112、cd155或半乳糖凝集素-9的免疫抑制信号。在另一个方面，可溶性tigit或tim-3具有类似的结构并且可以与cd122、cd155或半乳糖凝集素-9相互作用的部分，可以抑制免疫抑制信号。这些可溶性蛋白质只需要包括必须和足以结合cd122、cd155、tigit、半乳糖凝集素-9或tim-3的胞外区，并且可以通过熟知的表达和精制技术来制备。
如果cd112、cd155、tigit、半乳糖凝集素-9或tim-3的相互作用抑制剂是蛋白质或多肽，并且相互作用的必要区域仅由多肽组成，并且相互作用的必要区域仅由连续多肽组成，则此类多肽片段可以成为相互拮抗剂。另外，具有更强活性的拮抗剂可以从其中该多肽片段是经化学修饰的分子组鉴定，或根据多肽片段的空间结构通过计算机设计。另外，最好的拮抗剂可以从分子组更有效地选择，所述分子组根据相互作用区域的蛋白质立体分析数据通过计算机设计。
还设想用于治疗血源性癌症特别是本文公开的aml的抑制剂是小分子抑制剂。术语“小分子”意指具有低分子量，通常小于1000da的分子。本文所用的此类小分子是指具有低分子量的有益剂，其通常通过有机化学合成，但也可以从天然来源诸如植物、真菌和微生物分离。当用于治疗本发明范围内的血源性癌症时，此类小分子也称为小分子药物。递送小分子药物的常见途径是口服、注射、肺部和经皮给药。
还设想本发明的针对cd112的抑制剂减少cd112的表达。同样，本发明的针对cd155的抑制剂减少cd155的表达。同样，本发明的针对tigit的抑制剂减少tigit的表达。同样，本发明的针对半乳糖凝集素-9的抑制剂减少半乳糖凝集素-9的表达。同样，本发明的针对tim-3的抑制剂减少tim-3的表达。因此，本文还公开了使用核酸序列(例如治疗性核酸分子，例如反义寡核苷酸，编码其的dna或产生其的载体)制备适合于减少靶基因(例如编码cd112、cd155、tigit、半乳糖凝集素-9和tim-3的基因)表达的反义分子的用途。当在本文中使用时，术语“减少表达”是指本发明的抑制剂以特异性和转录后方式减少或封闭靶基因(即编码cd112、cd155、tigit、半乳糖凝集素-9和tim-3的基因)的表达的能力。就此而言，本发明涉及能够减少癌细胞中cd112、cd155、tigit、半乳糖凝集素-9和/或tim-3表达的核苷酸。所述核苷酸可以通过靶向mrna的序列，以及通过与靶mrna具有至少50％序列同一性，或至少70％序列同一性，或至少80％序列同一性，或至少90％序列同一性来表征。对此目的特别有用的是可以用于制备基于核苷酸的抑制剂的rna序列。具有～2个核苷酸的3′突出(的21-23个核苷酸的rna双链称为小干扰rna或sirna)已显示出在哺乳动物细胞中通过转录后基因沉默(ptgs)机制(称为rna干扰(rnai))介导基因表达的序列特异性抑制。因此，通过致病基因的体内沉默，rnai被认为是最有希望的新治疗策略之一。因此，在本发明的优选实施方案中，能够减少cd112、cd155、tigit、半乳糖凝集素-9和/或tim-3表达的核苷酸是rnai(irna)。本领域的技术人员知道几种合成rnai以及将这些构建体体内递送至肿瘤细胞的技术，从而使用例如如例如santel等人，2006，genetherapy13，1360-1370中描述的脂质体制剂。就此而言，双链rna首先使用与所关注的基因互补的序列合成，并引入细胞或生物体，其在该处被识别为外源性遗传物质并激活rnai途径。由于rnai不能完全消除基因的表达，所以该技术有时称为“基因敲低”，以区别于其中基因的表达完全消除的“http：//en.wikipedia.org/wiki/gene_knockout”程序。
因此，还设想减少cd112、cd155、tigit、半乳糖凝集素-9和/或tim-3表达的本发明的抑制剂敲除cd112、cd155、tigit、半乳糖凝集素-9和/或tim-3。当在本文中使用时，术语“敲除”是指与野生型动物相比，完全减少内源性基因(编码单个细胞、选择的细胞或哺乳动物的全部细胞的cd112、cd155、tigit、半乳糖凝集素-9和/或tim-3)编码的多肽的至少一部分的表达。哺乳动物可以是“杂合敲除”，其中内源性基因的一个等位基因已破坏。或者，哺乳动物可以是“纯合敲除”，其中内源性基因的两个等位基因已破坏。还设想编码cd112、cd155、tigit、半乳糖凝集素-9和/或tim-3的超过一个基因，优选地两个基因被“敲除”。在这种情况下，哺乳动物是“双敲除”哺乳动物。根据本发明，本发明人示出了当使用crispr/cas9技术时，pvr和pvrl2可以在aml细胞系中特异性地单敲除或双敲除。因此，本发明还涉及敲除cd112、cd155、tigit、半乳糖凝集素-9和/或tim-3的针对cd112、cd155、tigit、半乳糖凝集素-9和/或tim-3抑制剂的抑制剂，其中所述敲除通过crispr/cas9技术实现。然而，本领域的技术人员知道适用于敲除血源性癌细胞特别是aml细胞中的免疫检查点的各种不同技术。因此，本发明范围内的敲除技术包括改变基因序列从而产生失活基因的任何技术，或其中在发育期间的选择时间可以使表达失活从而导致基因的功能丧失的技术。
本发明的免疫检查点抑制剂还可以包含嵌合抗原受体(car)t细胞。cart细胞表现出工程化受体(嵌合抗原受体)，它将单克隆抗体的特异性移植到t细胞，并且转移逆转录病毒载体促进的编码序列。这些car允许t细胞识别肿瘤细胞上的特定蛋白质(抗原)。根据本发明，cart细胞优选地表现出car，其允许t细胞识别血源性癌细胞上的特定蛋白质。优选地，本发明的cart细胞能够识别血源性癌细胞(特别是aml细胞)表面上的cd33。就此而言，加入涉及在血源性癌细胞上表达的特异性表面分子(诸如cd33)的cart细胞可以增强针对cd112、cd155、tigit、半乳糖凝集素-9和/或tim-3的抑制剂的细胞毒性效应。因此，设想本发明的针对cd112、cd155、tigit、半乳糖凝集素-9和/或tim-3的抑制剂包含cart细胞。所述cart细胞优选地包含靶向在血源性癌细胞特别是aml细胞上表达的表面分子的结合域。所述表面分子优选地是cd33、cd19或flt3。因此，本发明的抑制剂可以包含具有靶向cd33的结合域的cart细胞。本发明的抑制剂还可以包含具有靶向cd19的结合域的cart细胞。本发明的抑制剂也可以包含具有靶向flt3的结合域的cart细胞。本领域的技术人员知道产生所谓的第一代、第二代和第三代cart细胞的多种技术涉及所述表面分子。
在一些实施方案中，如本文别处所述的免疫检查点抑制剂还可以包含接合t细胞的抗体构建体。此类接合t细胞的抗体构建体优选地是双特异性t细胞接合体(bite抗体构建体)，即结合至t细胞抗原和肿瘤抗原的双特异性抗体。bite抗体构建体已显示出诱导靶肿瘤细胞的定向裂解，因此也为癌症和其它病症的治疗提供了巨大潜力。一种可能的方法是双特异性t细胞接合抗体构建体amg330，其对cd3和唾液酸结合凝集素cd33具有双重特异性，且经常在aml母细胞和白血病干细胞的表面上表达。amg330被开发用于治疗急性骨髓性白血病(aml)，并且不久将在i期研究中进行评估(friedrich等人，2014，americanassociationforcancerresearch，1549-1557)。
根据本发明的双特异性t细胞接合体可以具有不同的抗体构建体形式，此类形式包括例如di-scfv或bi(s)-scfv、(scfv)2-fc、scfv-拉链、(scfab)2、fab2、fab3、双抗体、单链双抗体、串联双抗体(tandab′s)、串联di-scfv、串联tri-scfv、“微抗体”(其结构示例如下：(vh-vl-ch3)2、(scfv-ch3)2、((scfv)2-ch3+ch3)、((scfv)2-ch3)或(scfv-ch3-scfv)2)、多抗体诸如三抗体或四抗体以及双特异性单域抗体诸如纳米抗体或双特异性单可变域抗体(其在一个或两个结合域中仅包含一个可变域，所述可变域可以是独立于其它v区或域而特异性结合抗原或表位的vhh、vh或vl)。t细胞接合分子/双特异性抗体内的结合域通常可以包含抗体轻链可变区(vl)和抗体重链可变区(vh)；但是，结合域不一定包含这两者。例如，fd片段具有两个vh域，并且通常保留了完整抗原结合域的一些抗原结合功能。抗体片段、抗体变体或结合域的形式的另外实例包括(1)fab片段，具有vl、vh、cl和ch1域的单价片段；(2)f(ab′)2片段，具有在铰链区通过二硫桥连接的两个fab片段的二价片段；(3)具有两个vh和ch1域的fd片段；(4)具有抗体单臂的vl和vh域的fv片段，(5)具有vh域的dab片段(ward等人，(1989)nature341：544-546)；(6)分离的互补决定区(cdr)，以及(7)单链fv(scfv)，后者是优选的(例如，来源于scfv文库)。根据本发明的抗体构建体的实施方案的实例例如在wo00/006605、wo2005/040220、wo2008/119567、wo2010/037838、wo2013/026837、wo2013/026833、us2014/0308285、us2014/0302037、wo2014/144722、wo2014/151910和wo2015/048272中有所描述。
就此而言，本发明人在体外杀死测定中研究了另外在存在amg330的情况下pvr和pvrl2封闭的治疗效果(图3-13)。从而出乎意料地发现amg330可显著增强pvr和/或pvrl2封闭性抗体的细胞毒性。因此，设想本发明的针对cd112、cd155、tigit、半乳糖凝集素-9和/或tim-3的抑制剂还可包含能够接合t细胞的抗体构建体。所述抗体构建体优选地包含cd3结合域和靶向在血源性癌细胞特别是aml细胞上表达的表面分子的另外结合域。所述表面分子选自由cd33、cd19和flt3组成的组。根据上述内容，本发明提供了用于治疗血源性癌症(特别是aml)的方法的针对cd112、cd155、半乳糖凝集素-9、tim-3和/或tigit的抑制剂，所述抑制剂包括具有cd3结合域和cd33结合域的抗体构建体。本发明还提供了用于治疗血源性癌症(特别是aml)的方法的针对cd112、cd155、半乳糖凝集素-9、tim-3和/或tigit的抑制剂，所述抑制剂包括具有cd3结合域和cd19结合域的抗体构建体。本发明还提供了用于治疗血源性癌症(特别是aml)的方法的针对cd112、cd155、半乳糖凝集素-9、tim-3和/或tigit的抑制剂，所述抑制剂包括具有cd3结合域和flt3结合域的抗体构建体。所述抗体构建体优选地是能够结合cd3ε的结合分子。
因此，设想本文所述的cd33、cd19或flt3靶向抗体构建体，除了其结合血源性癌症靶细胞上的细胞表面分子cd33、cd19或flt3和t细胞的细胞表面上的cd3的功能之外，还具有另外的功能。在该形式中，化合物是多功能化合物，通过结合癌症靶细胞表面上的cd33、cd19或flt3来靶向细胞，通过cd3结合来介导细胞毒性t细胞活性并提供另外的功能，诸如完全功能的fc恒定域通过募集效应细胞如nk细胞来介导抗体依赖性细胞毒性，半衰期延长域诸如白蛋白结合域或修饰的fc恒定域缺乏抗体依赖性细胞毒性，但增加了化合物的分子量，标记(荧光等)、治疗剂诸如例如毒素或放射性核素的介导作用和/或增加血清半衰期的手段等。靶向血源性癌症靶细胞表面上的cd33、cd19或flt3和t细胞的细胞表面上的cd3的双特异性抗体构建体的实例为例如seqidno：15至37所示的分子。
术语“(能够)结合至”、“特异性地识别”、“针对”和“与...反应”意指根据本发明结合域能够与表位的一个或多个，优选地至少两个，更优选地至少三个以及最优选地至少四个氨基酸特异性地相互作用。如本文所用，术语“特异性地相互作用”、“特异性地结合”或“特异性结合”意指结合域对特定蛋白质或抗原表现出明显的亲和力，并且通常不表现出对除cd33、cd19、flt3或cd3之外的蛋白质或抗原的显著反应性。“明显的亲和力”包括约10-6m(kd)或更强的结合亲和力。优选地，当结合亲和力为约10-12至10-8m、10-12至10-9m、10-12至10-10m、10-11至10-8m，优选地约10-11至10-9m时，结合被认为是特异性的。结合域是否特异性地与靶标反应或结合可以容易地通过尤其是将所述结合域与靶蛋白或抗原的反应与所述结合域与除cd33、cd19、flt3或cd3之外的蛋白质或抗原的反应比较来测试。优选地，本发明的结合域不实质上结合或不能够结合除cd33、cd19、flt3或cd3以外的蛋白质或抗原(即第一结合域不能够结合除cd33、cd19或flt3之外的蛋白质，并且第二结合域不能够结合除cd3之外的蛋白质)。术语“不实质上结合”或“不能结合”意指本发明的结合域不结合除cd33、cd19、flt3或cd3之外的另一种蛋白质或抗原，即显示出与除cd33、cd19、flt3或cd3之外的蛋白质或抗原的反应性不超过30％，优选地不超过20％，更优选地不超过10％，特别优选地不超过9％、8％、7％、6％或5％，由此分别与cd33、cd19、flt3或cd3的结合设定为100％。本文所述的cd33、cd19或flt3靶向化合物还可以包含另外的域，其例如有助于分离该分子或涉及该分子的改适的药代动力学特征。
本文所述的结合cd33、cd19或flt3和cd3的靶向化合物可以在细菌中产生。在表达后，靶向化合物优选地抗体构建体从可溶性级分中的大肠杆菌(e.coli)细胞浆分离，并且可通过例如亲和层析和/或分子大小排阻来纯化。最终纯化可以类似于例如在cho细胞中表达的抗体的纯化过程来进行。除原核生物之外，真核微生物诸如丝状真菌或酵母是本文所述的cd33、cd19或flt3靶向化合物的合适克隆或表达宿主。棉花、玉米、马铃薯、大豆、矮牵牛、番茄、拟南芥和烟草的植物细胞培养物也可以用作宿主。用于在植物细胞培养物中产生蛋白质的克隆和表达载体是本领域的技术人员已知的。参见例如hiatt等人，nature(1989)342：76-78，owen等人(1992)bio/technology10：790-794，artsaenko等人(1995)theplantj8：745-750和fecker等人(1996)plantmolbiol32：979-986。
可以直接筛选本文所述的抑制cd112和tigit、cd155和tigit和/或半乳糖凝集素-9和tim-3的相互作用的物质。此类物质可以例如从蛋白质、多肽、肽、多核苷酸或多核苷、非肽化合物、有机合成化合物或天然产物(例如发酵产物、细胞提取物、植物提取物和动物组织提取物)的文库鉴定。因此，本文还公开了筛选针对cd112、cd155、tigit、半乳糖凝集素-9和/或tim-3的抑制剂的方法，该抑制剂用于治疗血源性癌症特别是aml的方法。所述筛选方法可以通过测定血源性癌细胞特别是aml细胞的细胞功能的方法来执行。就此而言，表面上表达cd112、cd155或半乳糖凝集素-9的细胞可用于筛选方法。此类细胞包括白细胞、单核细胞、巨噬细胞或抗原呈递细胞、上皮细胞、肿瘤细胞、癌细胞或其细胞系。
本文还公开了本发明的抑制剂，其包含免疫刺激剂。如本文所用，术语“免疫刺激剂”是指另外刺激本发明的抑制剂的免疫增强效应，从而增强所涉及的t细胞针对所涉及的肿瘤细胞的细胞毒性活性的任何佐剂。有相当多的证据表明，癌症患者具有能够攻击其肿瘤细胞的t细胞，并且癌症的出现是免疫监视：一旦出现癌细胞，患者的自身免疫系统即将其破坏的能力的失效。免疫刺激剂是调节人体免疫防御的非特异性药剂。就此而言，已描述一些成功的实例：将类似于佐剂的药剂直接注入肿瘤、左旋咪唑、白介素-2(il-2)、t细胞的强效生长因子、白介素-15(il-15)或α-干扰素(ifn-α)的口服治疗等等。
如本文所述，针对cd112、cd155、tigit、半乳糖凝集素-9和/或tim-3的抑制剂可以非常适用于治疗血源性癌症特别是aml的方法。因此，本发明在本文中还公开了用于治疗患有血源性癌症特别是aml的受试者的方法，所述方法包括将治疗有效量的针对cd112、cd155、tigit、半乳糖凝集素-9和/或tim-3的抑制剂施用于有此需要的受试者。
本文所用的术语“治疗(treat/treating/treatment)”意指减少、稳定或抑制血源性癌症特别是aml的进展。那些需要治疗的人包括那些已患有所述疾病的人。优选地，治疗减少或抑制血源性癌细胞的增殖活性，从而导致所述癌细胞的裂解增强。“治疗”是指治疗性处理，其中目标是减缓(减轻)或至少部分缓解或消除生物体的病理状况。那些需要治疗的人包括那些已患有该疾病的人，以及那些怀疑患有该疾病的人。术语“施用”涉及将化合物掺入生物体的细胞或组织的方法。
用于治疗患有本发明所述的血源性癌症，特别是aml的受试者的化合物通常以治疗有效量施用于受试者。所述治疗有效量足以抑制或缓解血源性癌症特别是aml的症状。“治疗效果”或“治疗有效”意指所用的化合物将引起研究人员、兽医、医生或其它临床医生所寻求的组织、系统、动物或人的生物或医学响应。术语“治疗有效”还指对导致或促成疾病的因素的抑制。术语“治疗有效量”包括当施用时化合物的量足以显著改善正在治疗的疾病的进展。治疗有效量将根据化合物、疾病及其严重程度以及受试者的个体因素等等而变化。因此，本发明的化合物将不会在所有情况下被证明是治疗有效的，因为本文公开的方法不能提供100％安全的预测，无论受试者是否对所述化合物产生响应，因为还涉及个体因素。预期年龄、体重、一般健康状况、性别、饮食、药物相互作用等等可以对用于治疗患有血源性癌症特别是aml的受试者的化合物是否为治疗有效的具有一般影响。优选地，用于治疗患有血源性癌症特别是aml的受试者的化合物的治疗有效量在约0.01mg/kg体重和约1g/kg体重之间，诸如约0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、100、200、300、400、500、600、700、800或约900mg/kg体重。甚至更优选地，用于治疗患有血源性癌症特别是aml的受试者的化合物的治疗有效量在约0.01mg/kg体重和约100mg/kg体重之间，诸如约0.1mg/kg体重和约10mg/kg体重之间。化合物的治疗有效量将根据待治疗患者的种类关于其中含有的活性化合物的重量而变化。
本文所用的术语“受试者”也称为个体，是指哺乳动物。哺乳动物可以是小鼠、大鼠、豚鼠、兔、猫、狗、猴、马或人中的任一者。因此，本发明的哺乳动物可以是人或非人哺乳动物。因此，本文档所述的方法、用途和组合物通常适用于人和非人哺乳动物二者。当受试者是可以接受本文所述的疾病治疗的人时，其也被称为“患者”。本文公开的“患者”也比照适用于一组患者。
用于治疗患有根据本发明的血源性癌症特别是aml的受试者的抑制剂的施用可以通过本领域已知的任何方法进行。在一些实施方案中，施用通过口服、肠胃外、皮下、静脉内、肌肉内、腹膜内、通过鼻内滴注、通过移植、通过腔内或膀胱内滴注、眼内、动脉内、病灶内、经皮或通过施用至粘膜或它们的组合等等进行。
在本发明的范围内，例如设想使用本领域可用的技术，例如使用白细胞(wbc或白血球)计数和分类，通过评估患者中血源性癌细胞的数量来检测所用抑制剂的治疗效果。白细胞可以在血细胞计数器(neubauerchamber)中手动计数或使用自动计数器计数。为了确定差别，可以将一滴血在载玻片上涂成薄层，空气干燥，并且用romanofsky染色剂染色(最常见的是wright或may-grunewald-giemsa技术)。然后如blumenreichmsthewhitebloodcellanddifferentialcount.载于：walkerhk、hallwd、hurstjw编clinicalmethods：thehistory，physicals，andlaboratoryexaminations.第3版boston：butterworths；1990.第153章所述使用形态学检查和/或组织化学对细胞进行计数和分类。或者，从血样分离白细胞，使用针对白细胞表面标记物的荧光标记抗体染色，随后通过流式细胞术分析以计算每个白细胞亚群的绝对细胞数。另外或替代地，还可以评估各个患者的整体外观，这也将帮助熟练从业者评估该治疗是否有效。本领域的技术人员知道许多其它方式，它们将允许从业者观察在本发明的方法或用途的语境中用于治疗本文公开的血源性癌症特别是aml的化合物的治疗效果。
尽管可以直接施用本发明的抑制剂而不需要任何配制，但是在本发明的另一个方面，化合物优选地以药物或兽用制剂组合物的形式利用，所述组合物包含药学上或兽医上可接受的载剂、稀释剂或赋形剂以及本发明的化合物，优选地本发明的免疫球蛋白。与本发明的化合物组合使用的载剂是水基的并且形成水溶液。含有本发明的化合物的油基载剂溶液是载剂水溶液的替代物。水基或油基溶液还含有增稠剂以使组合物具有搽剂、乳膏、软膏、凝胶等等的粘度。合适的增稠剂是本领域的技术人员熟知的。本发明的替代实施方案也可以使用含有该化合物的固体载剂治疗本文别处公开的s100a12：tlr4/md2/cd14介导的炎性病症。这使得替代实施方案能够通过棒状施涂器、贴剂或栓剂应用。固体载剂还含有增稠剂以使组合物具有蜡或石蜡的稠度。
还想到将另外的aml治疗与本发明的抑制剂组合用于治疗患有血源性癌症特别是aml的受试者。另外的aml治疗通常可以预先、同时和/或随后应用于本发明的用途和方法。
造血干细胞移植(hsct)是常见的aml治疗。该术语通常是指通常来源于骨髓或血液的造血干细胞的移植，并且包括自体(即，干细胞来源于患者)和同种异体(即，干细胞来源于供体)hsct。对于aml治疗，同种异体hsct通常是优选的。还设想本发明的用途和方法可以在hsct之前或之后或它们两者或在两次hsct治疗之间应用。
根据本发明的方法治疗的患者(或患者组)也可以接受化学治疗处理。在本发明的语境中，“化学治疗处理”是指使用抗肿瘤剂或超过一种这些药剂的组合进行标准化治疗方案的治疗。在本发明的语境中，术语“化学治疗处理”包括任何抗肿瘤剂，所述抗肿瘤剂包括小有机分子、肽、寡核苷酸等等。包括在化学治疗定义中的药剂为但不限于烷化剂，例如二氯甲基二乙胺、环磷酰胺、美法仑、苯丁酸氮芥、异环磷酰胺、白消安、n-亚硝基-n-甲基脲(mnu)、卡莫司汀(bcnu)、洛莫司汀(ccnu)、司莫司汀(meccnu)、福莫司汀、链脲佐菌素、达卡巴仁、米托唑胺、替莫唑胺、噻替哌、丝裂霉素、地吖醌(azq)、顺铂、卡铂、奥沙利铂、甲基苄肼和六甲蜜胺；抗代谢物，例如甲氨蝶呤、培美曲塞、氟尿嘧啶、卡培他滨、阿糖胞苷、吉西他滨、地西他滨、维达扎、氟达拉滨、奈拉滨、克拉屈滨、克罗拉滨、喷司他丁、硫鸟嘌呤、巯嘌呤；微管抑制剂，例如长春新碱、长春碱、长春瑞滨、长春地辛、长春氟宁、紫杉醇、多西他赛、鬼臼毒素；拓扑异构酶抑制剂，例如伊立替康、拓扑替康、依托泊苷、阿霉素、米托蒽醌、替尼泊苷、新生霉素、莫巴酮(merbarone)、阿柔比星；细胞毒素抗生素，例如放线菌素、博来霉素、普卡霉素、丝裂霉素、阿霉素、柔红霉素、表柔比星、伊达比星、吡柔比星、阿柔比星和米托蒽醌等等。然而，本领域的普通技术人员将会理解，本发明不限于这些化学治疗剂，也可以涉及使用其它dna损伤剂。根据本发明的所述组合可以作为组合制剂或彼此单独施用。
另外的aml治疗还包括放射治疗。还设想了cns治疗或预防，以防止恶性细胞在cns中扩散，例如通过脑和脊髓的鞘内化学治疗和/或放射治疗。
由于本发明人推测本文公开的抑制剂的治疗成功可以(部分)基于所述抑制剂的免疫增强活性，其通过抑制本文所述的免疫检查点，从而产生增强的t细胞抗癌活性，因此还设想了t细胞活化和/或增殖的诱导剂和增强剂、cart细胞、供体t细胞、抗细胞毒性t淋巴细胞相关抗原-4(ctla-4)抗体等等。
根据另一个方面，本发明提供了药物组合物，其包含本文别处所述的针对cd112(连接蛋白-2、pvrl2)、cd155(pvr)、半乳糖凝集素-9、tim-3和/或tigit的免疫检查点抑制剂和本文别处所述的cart细胞。在另一个方面，本发明提供了药物组合物，其包含本文别处所述的针对cd112(连接蛋白-2、pvrl2)、cd155(pvr)、半乳糖凝集素-9、tim-3和/或tigit的免疫检查点抑制剂和本文别处所述的能够接合t细胞的抗体构建体。
所述药物组合物可以包含治疗有效量的本文所述的一种或多种免疫检查点抑制剂、cart细胞和/或抗体构建体以及药学上有效的稀释剂、载剂、增溶剂、乳化剂、防腐剂和/或佐剂。本文所述的药物组合物包括但不限于液体、冷冻和冻干组合物。优选地，制剂材料在所利用的剂量和浓度下对接受者是无毒的。
如本文所用，术语“药物组合物”涉及施用于患者优选地人患者的组合物。优选地，药物组合物包含合适的载剂、稳定剂和/或赋形剂的制剂。在一个优选的实施方案中，药物组合物包含肠胃外、经皮、腔内、动脉内、鞘内和/或鼻内施用或直接注射到组织中的组合物。特别设想所述组合物通过输注或注射施用于患者。合适的组合物的施用可以通过不同的方式进行，例如静脉内、腹膜内、皮下、肌肉内、局部或真皮内施用。具体地讲，本发明提供了合适组合物的不间断施用。作为非限制性实例，不间断(即连续)施用可以通过患者佩戴的小泵系统来实现，以测量流入患者体内的治疗剂，如wo2015/036583所述。
本发明的组合物还可以包含药学上可接受的载剂。合适的药物载剂的实例在本领域中是熟知的，并且包括溶液，例如磷酸盐缓冲盐溶液、水、乳液诸如油/水乳液、各种类型的润湿剂、无菌溶液、脂质体等。包含此类载剂的组合物通过熟知的常规方法配制。制剂可以包含碳水化合物、缓冲溶液、氨基酸和/或表面活性剂。碳水化合物可以是非还原糖，优选地海藻糖、蔗糖、八硫酸盐、山梨糖醇或木糖醇。通常，如本文所用，“药学上可接受的载剂”意指与药物施用相容的任何和所有溶剂、分散介质、包衣、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂。将此类介质和药剂用于药物活性物质在本领域中是熟知的。可接受的载剂、赋形剂或稳定剂在所利用的剂量和浓度下对接受者是无毒的，并且包括：另外的缓冲剂；防腐剂；共溶剂；抗氧化剂，包括抗坏血酸和甲硫氨酸；螯合剂诸如edta；金属复合物(例如zn-蛋白质复合物)；可生物降解的聚合物，诸如聚酯；成盐抗衡离子，诸如钠、多元糖醇；氨基酸，诸如丙氨酸、甘氨酸、天冬酰胺、2-苯丙氨酸和苏氨酸；糖或糖醇，诸如海藻糖、蔗糖、八硫酸盐、山梨糖醇或木糖醇水苏糖、甘露糖、山梨糖、木糖、核糖、肌糖(myoinisitose)、半乳糖、乳糖醇、核糖醇、中肌醇(myoinisitol)、半乳糖醇、甘油、环多醇(例如，肌醇)、聚乙二醇；含硫还原剂，诸如谷胱甘肽、硫辛酸、巯基乙酸钠、硫代甘油、α-单硫代甘油和硫代硫酸钠；小分子量蛋白质，诸如人血清白蛋白、牛血清白蛋白、明胶或其它免疫球蛋白；以及亲水聚合物，诸如聚乙烯吡咯烷酮。此类制剂可以用于连续施用，其可以是使用和/或不使用泵系统的静脉内或皮下施用。氨基酸可以是带电氨基酸，优选地赖氨酸、乙酸赖氨酸、精氨酸、谷氨酸和/或组氨酸。表面活性剂可以是洗涤剂(优选地具有＞1.2kd的分子量)和/或聚醚(优选地具有＞3kd的分子量)。优选的洗涤剂的非限制性实例是tween20、tween40、tween60、tween80或tween85。优选的聚醚的非限制性实例是peg3000、peg3350、peg4000或peg5000。用于本发明的缓冲体系可以具有5-9的优选ph，并且可以包含柠檬酸、琥珀酸、磷酸、组氨酸和乙酸。
本发明的药物组合物可以以合适的剂量施用于受试者，所述剂量可以例如通过剂量递增研究来确定，所述剂量递增研究将增加剂量的本文所述的多肽施用于非黑猩猩灵长类，例如猕猴，所述多肽表现出本文所述的跨物种特异性。如上所述，表现出本文所述的种间特异性的本文所述的cd33靶向组合物可以有利地以相同的形式用于非黑猩猩灵长类的临床前试验以及作为人类的药物。组合物或这些组合物也可以与另外的其它蛋白质和非蛋白质药物组合施用。这些药物可以与包含如本文定义的本文所述多肽的组合物同时施用，或者在以确定的时间间隔和剂量施用所述多肽之前或之后单独施用。给药方案由主治医生和临床因素确定。如医学领域所熟知，任何一个患者的剂量取决于许多因素，包括患者的体型、体表面积、年龄、待施用的具体化合物、性别、施用的时间和途径、一般健康状况以及同时施用的其它药物。
肠胃外给药制剂包括无菌水溶液或非水溶液剂、混悬剂和乳剂。非水溶剂的实例是丙二醇、聚乙二醇、植物油诸如橄榄油以及可注射的有机酯诸如油酸乙酯。水性载剂包括水、醇/水溶液、乳液或悬浮液，包括盐水和缓冲介质。肠胃外媒介物包括氯化钠溶液、林格氏右旋糖、葡萄糖和氯化钠、乳酸林格氏液或不挥发性油。静脉内媒介物包括流体和营养补充剂、电解质补充剂(例如基于林格氏右旋糖的那些)等等。也可以存在防腐剂和其它添加剂，诸如例如抗微生物剂、抗氧化剂、螯合剂、惰性气体等等。此外，本发明的组合物可以包含优选地人类来源的蛋白质载剂，例如血清白蛋白或免疫球蛋白。设想本发明的组合物，除了如本文定义的本文所述多肽之外，还可以包含其它生物活性剂，取决于组合物的预期用途。此类药剂可以是作用于胃肠系统的药物、充当细胞抑制剂的药物、预防高尿酸血症的药物、抑制免疫反应的药物(例如皮质类固醇)、调节炎性响应的药物、作用于循环系统的药物和/或药剂诸如本领域已知的细胞因子。还设想在单独或分开的制剂中包含cd33靶向化合物和至少一种表观遗传因子的本发明组合物以另外的联合疗法，即与另一种抗癌药物组合应用。
本文定义的药物组合物的生物学活性可以例如通过细胞毒性测定来确定，如以下实施例、wo99/54440或schlereth等人(cancerimmunol.immunother.20(2005)，1-12)所述。本文所用的“功效”或“体内功效”是指使用例如标准化nci响应标准的对本发明的药物组合物治疗的响应。使用本发明的药物组合物的治疗的成功或体内功效是指组合物出于其预期目的的效力，即组合物引起其所需效果(即消耗病理性细胞，例如肿瘤细胞)的能力。体内功效可以通过各个疾病实体的既定标准方法来监测，包括但不限于白细胞计数、分类、荧光活化细胞分选、骨髓穿刺。此外，可以使用各种疾病特异性临床化学参数和其它既定标准方法。此外，可以使用计算机辅助断层摄影术、x射线、核磁共振断层摄影术(例如，用于基于美国国家癌症研究所(nationalcancerinstitute)标准的响应评估[chesonbd、horningsj、coiffierb、shippma、fisherri、connorsjm、listerta、vosej、grillo-lopeza、hagenbeeka、cabanillasf、klippenstend、hiddemannw、castellinor、harrisnl、armitagejo、carterw、hopper、canellosgp.reportofaninternationalworkshoptostandardizeresponsecriteriafornon-hodgkin′slymphomas.ncisponsoredinternationalworkinggroup.jclinoncol.1999年4月；17(4)：1244])、正电子发射断层扫描、白细胞计数、分类、荧光活化细胞分选、骨髓穿刺、淋巴结活检/组织学和各种淋巴瘤特异性临床化学参数(例如乳酸脱氢酶)和其它既定标准方法。
药物诸如本发明的药物组合物的开发中的另一个主要挑战是药代动力学性质的可预测调节。为此，可以建立候选药物的药代动力学曲线，即影响特定药物治疗给定病症的能力的药代动力学参数曲线。影响药物治疗某些疾病实体的能力的药物的药代动力学参数包括但不限于：半衰期、分布体积、肝脏首过代谢和血清结合程度。给定药剂的功效可以受到上述每个参数的影响。“半衰期”意指通过生物过程例如代谢、排泄等消除50％所施用的药物的时间。所谓“肝脏首过代谢”意指在首次接触肝脏时，即在第一次通过肝脏期间，代谢药物的倾向。“分布体积”意指药物在身体的各个隔室，例如细胞内和细胞外空间、组织和器官等的滞留程度，以及药物在这些隔室内的分布。“血清结合程度”意指药物与血清蛋白诸如白蛋白相互作用和结合，导致药物的生物活性的减少或丧失的倾向。
药代动力学参数还包括给定量的施用药物的生物利用率、滞后时间(tlag)、tmax、吸收率、更高的起效和/或cmax。“生物利用率”意指血液隔室中的药物量。“滞后时间”意指药物的施用及其在血液或血浆中的检测和可测定性之间的时间延迟。“tmax”是达到最大血药浓度的时间，“cmax”是使用给定药物最大获得的血液浓度。达到药物的生物学效应所需的血液或组织浓度的时间受到所有参数的影响。
本文所用的术语“毒性”是指在不良事件或严重不良事件中表现的药物的毒性效应。这些副作用可以指一般药物缺乏耐受性和/或施用后缺乏局部耐受性。毒性还可包括药物引起的致畸或致癌效应。
本文所用的术语“安全性”、“体内安全性”或“耐受性”定义为在给药后(局部耐受)和药物施用的较长时间期间，药物的施用不引起严重不良事件。“安全性”、“体内安全性”或“耐受性”可以例如在治疗和随访期间定期评估。测定包括临床评估，例如器官表现，以及实验室异常的筛查。可以进行临床评估，并且根据nci-ctc和/或meddra标准来记录/编码与正常结果的偏差。器官表现可以包括诸如过敏/免疫学、血液/骨髓、心律不齐、凝血等等的标准，例如不良事件通用术语标准3.0版(commonterminologycriteriaforadverseeventsv3.0(ctcae))所述。可以测试的实验室参数包括例如血液学、临床化学、凝血特征和尿液分析以及其它体液诸如血清、血浆、淋巴或脊髓液、液体等等的检查。因此，可以例如通过身体检查、成像技术(即超声波、x射线、ct扫描、磁共振成像(mri))、使用技术装置(即心电图)进行的其它测定、生命体征，通过测定实验室参数和记录不良事件来评估安全性。例如，根据本发明的用途和方法中的非黑猩猩灵长类的不良事件可以通过组织病理学和/或组织化学方法来检查。
术语“有效剂量”或“有效用量”被定义为足以实现或至少部分实现所需效果的量。术语“治疗有效剂量”被定义为足以治愈或至少部分阻止已患有疾病的患者的疾病及其并发症的量。对该用途有效的量将取决于疾病的严重性和受试者自身免疫系统的一般状态。术语“患者”包括接受预防性或治疗性处理的人和其它哺乳动物受试者。本文所用的术语“有效和无毒剂量”是指药物组合物(即在单独或分开制剂中包含针对cd112、cd155、tigit、半乳糖凝集素-9和/或tim-3的抑制剂和cart细胞或接合t细胞的抗体构建体的药物组合物)的耐受剂量，其足够高以引起病理细胞消耗、肿瘤消除、肿瘤缩小或疾病稳定，而没有或基本上没有大量毒性效应。此类有效和无毒剂量可以例如通过本领域中描述的剂量递增研究来确定，并且应低于诱导严重不良副作用的剂量(剂量限制性毒性，dlt)。
上述术语还例如在生物技术衍生药物s6的临床前安全性评估；ich三方协调指南(ichharmonisedtripartiteguideline)；1997年7月16日举行的ich指导委员会(ichsteeringcommittee)会议中提及。包含本发明的抑制剂和本文别处所述的cart细胞或抗体构建体的药物组合物的适当剂量或治疗有效量将取决于待治疗的病症、病症的严重性、先前治疗以及患者的临床病史和对治疗剂的响应。适当的剂量可以根据主治医生的判断调整，使得可以通过一次或一系列给药施用于患者。药物组合物可以作为单独的治疗剂或与另外的治疗(诸如根据需要的抗癌治疗)组合施用。
本发明的药物组合物特别适用于肠胃外施用，即皮下、肌肉内、静脉内、关节内和/或滑膜内施用。肠胃外施用可以通过弹丸注射或连续输注进行。如果药物组合物已冻干，则在施用之前首先在适当的液体中复原冻干材料。可以在例如抑菌性注射用水(bwfi)、生理盐水、磷酸盐缓冲盐水(pbs)或蛋白质在冻干之前所用的相同制剂中复原冻干材料。
结合本发明出乎意料地发现，与通过封闭单独针对cd112和cd155的抗体来单独减少的细胞裂解相比，本发明的抑制剂和双特异性抗体构建体amg330的组合以剂量依赖性方式显著增加aml细胞的细胞裂解(图3-13)。该发现支持了针对cd112、cd155、tigit、半乳糖凝集素-9和/或tim-3的抑制剂与cd33、cd19或flt3定向的t细胞接合体的组合的协同治疗将比单独施用的任何一种治疗更有效。因此，一种或多种针对cd112、cd155、tigit、半乳糖凝集素-9和/或tim-3的抑制剂与本文所述的cd33、cd19或flt3定向t细胞接合体组合的所述施用可允许较低剂量的双特异性t细胞接合体在给定的时间点有效。通过多特异性、至少双特异性构建体募集t细胞来进行的靶细胞的重定向裂解涉及细胞裂解突触形成和穿孔素和粒酶的递送。接合的t细胞能够进行连续靶细胞裂解，并且不受干扰肽抗原加工和呈递的免疫逃逸机制的影响，或克隆t细胞分化；参见例如wo2007/042261或wo2008/119567。
本文所述的制剂在如本文所述的有此需要的患者的病理医学状况的治疗、改善和/或预防中可用作药物组合物。术语“治疗”是指治疗处理和预防或防止措施二者。治疗包括将制剂应用或施用于具有疾病/病症、疾病/病症的症状或疾病/病症的倾向的患者的身体、分离的组织或细胞，目的是治愈、痊愈、缓解、减轻、改变、补救、改善、改进或影响疾病、疾病的症状或疾病的倾向。那些“需要治疗”的人包括那些已患有该疾病的人，以及其中要预防病症的那些人。术语“疾病”是将受益于使用本文所述的蛋白质制剂治疗的任何病症。这包括慢性和急性病症或疾病，包括使哺乳动物易患所讨论疾病的那些病理状况。本文待治疗的疾病/病症的非限制性实例包括本文所述的血源性癌症，特别是骨髓性白血病诸如aml。
药物组合物可以含有用于改变、维持或保持例如组合物的ph、渗透压、粘度、透明度、颜色、等渗性、气味、无菌性、稳定性、溶解或释放速率、吸附或渗透的制剂材料。在此类实施方案中，合适的制剂材料包括但不限于氨基酸(诸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸、脯氨酸或赖氨酸)；抗微生物剂；抗氧化剂(诸如抗坏血酸、亚硫酸钠或亚硫酸氢钠)；缓冲剂(诸如硼酸盐、碳酸氢盐、tris-hcl、柠檬酸盐、磷酸盐或其它有机酸)；填充剂(诸如甘露糖醇或甘氨酸)；螯合剂(诸如乙二胺四乙酸(edta))；络合剂(诸如咖啡因、聚乙烯吡咯烷酮、β-环糊精或羟丙基-β-环糊精)；填料；单糖；双糖；和其它碳水化合物(诸如葡萄糖、甘露糖或糊精)；蛋白质(诸如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白)；着色剂、调味剂和稀释剂；乳化剂；亲水聚合物(诸如聚乙烯吡咯烷酮)；小分子量多肽；成盐抗衡离子(诸如钠)；防腐剂(诸如苯扎氯铵、苯甲酸、水杨酸，硫柳汞、苯乙醇、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、氯己定、山梨酸或过氧化氢)；溶剂(诸如甘油、丙二醇或聚乙二醇)；糖醇(诸如甘露糖醇或山梨糖醇)；悬浮剂；表面活性剂或润湿剂(例如普朗尼克(pluronics)、peg、脱水山梨糖醇酯、聚山梨醇酯诸如聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯、triton、氨基丁三醇、卵磷脂、胆固醇、泰洛沙泊)；稳定增强剂(诸如蔗糖或山梨糖醇)；张力增强剂(诸如碱金属卤化物，优选地氯化钠或氯化钾、甘露糖醇山梨糖醇)；递送媒介物；稀释剂；赋形剂和/或药物佐剂。参见remington′spharmaceuticalsciences，第18版(a.r.genrmo编)，1990年，mackpublishingcompany。
本领域的技术人员将根据例如预期的给药途径、递送形式和所需的剂量确定最佳药物组合物。参见例如remington′spharmaceuticalsciences，出处同上。在某些实施方案中，此类组合物可影响本文所述的抗原结合蛋白的物理状态、稳定性、体内释放速率和体内清除速率。在某些实施方案中，药物组合物中的主要媒介物或载剂本质上可以是水性的或非水性的。例如，合适的媒介物或载剂可以是注射用水、生理盐水溶液或人造脑脊液、可能补充有用于肠胃外施用的组合物中常见的其它物质。中性缓冲盐水或与血清白蛋白混合的盐水是另外的示例性媒介物。在具体实施方案中，药物组合物包含约ph7.0-8.5的tris缓冲液或约ph4.0-5.5的乙酸盐缓冲液，因此还可包含山梨糖醇或合适的替代物。在本发明的某些实施方案中，本文所述的人抗体或其抗原结合片段或本文所述的抗体构建体，可以通过将具有所需纯度的选择组合物与任选的制剂试剂(remington′spharmaceuticalsciences，出处同上)以冻干饼或水溶液的形式混合来制备组合物以用于储存。另外，在某些实施方案中，可使用合适的赋形剂诸如蔗糖将针对cd112、cd155、tigit、半乳糖凝集素-9和/或tim-3的抑制剂和cart细胞或接合t细胞的抗体构建体配制为冻干物。
本文所述的药物组合物可以选择用于肠胃外递送。或者，可以选择用于吸入或通过消化道递送如口服的组合物。此类药学上可接受的组合物的制备在本领域的技术范围内。制剂组分优选地以施用部位可接受的浓度存在。在某些实施方案中，使用缓冲剂将组合物维持在生理ph或稍低的ph下，通常在约5至约8的ph范围内。
本领域的技术人员将清楚另外的药物组合物，包括作为持续或控制递送制剂的涉及本文所述的针对cd112、cd155、tigit、半乳糖凝集素-9和/或tim-3的抑制剂和cart细胞或接合t细胞的抗体构建体的制剂。用于配制各种其它持续或控制递送手段(诸如脂质体载剂、可生物侵蚀的微粒或多孔珠粒和储库注射剂)的技术也是本领域的技术人员已知的。参见例如国际专利申请no.pct/us93/00829，其以引用的方式并入，并且描述了用于递送药物组合物的多孔聚合物微粒的控制释放。持续释放制剂可以包括成型制品形式的半渗透性聚合物基质，例如膜或微胶囊。持续释放基质可以包括聚酯、水凝胶、聚交酯(如美国专利no.3,773,919和欧洲专利申请公开no.ep058481所公开，每个专利以引用的方式并入)、l-谷氨酸和γ-乙基-l-谷氨酸的共聚物(sidman等人，1983，biopolymers2：547-556)、聚(2-羟乙基-甲基丙烯酸酯)(langer等人，1981，j.biomed.mater.res.15：167-277和langer，1982，chem.tech.12：98-105)、乙烯乙酸乙烯酯(langer等人，1981，出处同上)或聚-d(-)-3-羟丁酸(欧洲专利申请公开no.ep133,988)。持续释放组合物还可以包括可以通过本领域已知的几种方法中的任何一种制备的脂质体。参见例如eppstein等人，1985，proc.natl.acad.sci.u.s.a.82：3688-3692；欧洲专利申请公开no.ep036,676、ep088,046和ep143,949，它们以引用的方式并入。
用于体内施用的药物组合物通常以无菌制剂提供。灭菌可以通过无菌滤膜过滤实现。当冻干组合物时，可以在冻干和复原之前或之后进行使用该方法的灭菌。用于肠胃外施用的组合物可以以冻干形式或溶液储存。通常将肠胃外组合物置于具有无菌入口的容器中，例如具有可被皮下注射针头刺穿的塞子的静脉内溶液袋或小瓶。盐可以根据本发明的某些实施方案使用，以便例如根据本发明调整制剂的离子强度和/或等渗性和/或改善组合物的蛋白质或其它成分的溶解度和/或物理稳定性。众所周知，离子可以通过结合至蛋白质表面的带电残基，通过屏蔽蛋白质中的带电和极性基团，以及降低其静电相互作用、吸引力和排斥相互作用的强度来稳定蛋白质的天然状态。离子还可以通过结合至特别是蛋白质的变性肽键(--conh)来稳定蛋白质的变性状态。此外，与蛋白质中的带电和极性基团的离子相互作用还可以减少分子间静电相互作用，从而防止或减少蛋白质聚集和不溶解。
已开发许多离子及其对蛋白质的作用的分类排序，该分类排序可用于配制根据本发明的药物组合物。一个实例是hofmeister系列，它通过对溶液中蛋白质的构象稳定性的影响对离子和极性非离子溶质进行排序。稳定化的溶质称为“稳液剂(kosmotropic)”。去稳定化的溶质称为“离液剂”。稳液剂通常以高浓度(例如，＞1摩尔硫酸铵)使用，以便从溶液沉淀蛋白质(“盐析”)。离液剂通常用于使蛋白质变性和/或溶解(“盐溶”)。离子对“盐溶”和“盐析”的相对有效性确定了它们在hofmeister系列中的位置。
根据本发明的各种实施方案，游离氨基酸可以在制剂中用作填充剂、稳定剂和抗氧化剂以及其它标准用途。赖氨酸、脯氨酸、丝氨酸和丙氨酸可用于稳定制剂中的蛋白质。甘氨酸可用于冻干以确保饼的结构和性质正确。在液体和冻干制剂二者中，精氨酸可用于抑制蛋白质聚集。甲硫氨酸可用作抗氧化剂。多元醇包括糖，例如甘露糖醇、蔗糖和山梨糖醇，以及多羟基醇，诸如例如甘油和丙二醇，以及出于本文讨论的目的，聚乙二醇(peg)和相关物质。多元醇是稳液剂。它们在液体和冻干制剂二者中是有用的稳定剂，以保护蛋白质免受物理和化学降解过程的影响。多元醇也可用于调整制剂的张力。
该制剂还可以包含一种或多种抗氧化剂。在某种程度上，药物制剂中蛋白质的有害氧化可以通过维持适当水平的环境氧气和温度以及通过避免暴露于光线来防止。也可以使用抗氧化剂赋形剂来防止蛋白质的氧化降解。就此而言，可用的抗氧化剂是还原剂、除氧剂/自由基清除剂和螯合剂。用于根据本发明的治疗性蛋白质制剂的抗氧化剂优选地是水溶性的并且在产品的整个保质期内保持其活性。就此而言，edta是根据本发明的优选的抗氧化剂。
抗氧化剂可以破坏蛋白质。例如，还原剂，特别是诸如谷胱甘肽，可以破坏分子内二硫键。因此，除此之外选择用于本发明的抗氧化剂来消除或充分降低其本身破坏制剂中的蛋白质的可能性等等。根据本发明的制剂可以包括金属离子，所述金属离子是蛋白质辅因子并且是形成蛋白质配位络合物必需的，诸如形成某些胰岛素悬浮液必需的锌。金属离子也可以抑制一些降解蛋白质的过程。然而，金属离子还催化降解蛋白质的物理和化学过程。
正如所预期，含有防腐剂的液体制剂的开发比冻干制剂更具挑战性。冷冻干燥的产物可以在无防腐剂的情况下冻干，并且在使用时使用含有防腐剂的稀释剂复原。这缩短了防腐剂与蛋白质接触的时间，使相关的稳定性风险显著降至最小。使用液体制剂时，应在整个产物保质期(约18至24个月)内保持防腐剂有效性和稳定性。重要的是，防腐剂有效性应在含有活性药物和所有赋形剂组分的最终制剂中显示出来。
药物组合物一旦配制，即可作为溶液、悬浮液、凝胶、乳液、固体、晶体或作为脱水或冻干粉末储存于无菌小瓶中。此类制剂可以以即用的形式或以施用前复原的形式(例如冻干)储存。本发明还提供用于产生单剂量施用单元的试剂盒。在本发明的某些实施方案中，提供了含有单腔和多腔预填充注射器(例如，液体注射器和冻干剂注射器(lyosyringe))的试剂盒。包含针对cd112、cd155、tigit、半乳糖凝集素-9和/或tim-3的抑制剂和cart细胞或接合t细胞的抗体构建体的药物组合物的治疗有效量将取决于例如治疗背景和目标。本领域的技术人员将会理解，用于治疗的合适剂量水平将部分取决于所递送的分子、正在使用的本文所述的组合物的适应症、给药途径以及患者的体型(体重、身体表面或器官大小)和/或状况(年龄和一般健康状况)。在某些实施方案中，临床医生可以滴定该剂量并且修改施用途径以获得最佳治疗效果。根据上述因素，典型的剂量可以在约0.1μg/kg至最高约30mg/kg或更高的范围内。在具体实施方案中，剂量可以在1.0μg/kg最高至约20mg/kg，任选地10μg/kg最高至约10mg/kg或100μg/kg最高至约5mg/kg的范围内。
治疗有效量的包含针对cd112、cd155、tigit、半乳糖凝集素-9和/或tim-3的抑制剂和本文别处所述的cart细胞或接合t细胞的抗体构建体的本发明的药物组合物优选地使得疾病症状的严重性减少、无疾病症状期的频率或持续时间增加或由于疾病折磨而受到的损伤或残疾得以预防。对于治疗表达cd112、cd155和/或半乳糖凝集素-9的肿瘤，相对于未治疗的患者，治疗有效量的本文公开的组合物优选地抑制细胞生长或肿瘤生长至少约20％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％或至少约90％。可以在预测人肿瘤功效的动物模型中评估化合物抑制肿瘤生长的能力。
本发明的药物组合物可以使用医疗装置来施用。用于施用药物组合物的医疗装置的实例在美国专利no.4,475,196、4,439,196、4,447,224、4,447,233、4,486,194、4,487,603、4,596,556、4,790,824、4,941,880、5,064,413、5,312,335、5,312,335、5,383,851和5,399,163中有所描述，这些专利均以引用的方式并入本文。
值得注意的是，本文所述的免疫检查点抑制剂以及本文所述的与其有关的所有实施方案可以应用于治疗血源性癌症(诸如白血病或淋巴瘤，特别是aml)的方法，所述方法包括将治疗有效量的所述抑制剂施用于有此需要的受试者。
类似地，本文所述的免疫检查点抑制剂以及本文所述的与其有关的所有实施方案可用于制备用于治疗血源性癌症(诸如白血病或淋巴瘤，特别是aml)的药物组合物。
实施例
提供了以下实施例以说明本发明的具体实施方式或特征。这些实施例不应解释为限制本发明的范围。包括实施例是出于说明目的，并且本发明仅受到权利要求书的限制。
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通过rt-qpcr分析来自140名新诊断为aml(amlsg07-04，nct00151242)的未接受治疗的患者的样品的免疫检查点分子pvr、pvrl2和半乳糖凝集素-9(gal-9)的表达。通过多变量cox回归将表达与患者人口统计学(年龄、核型、flt3突变状态)和临床存活数据相关联。大多数患者显示出pvr(94％)、pvrl2(95％)和gal-9(92％)的mrna表达。在总体存活的多变量逐步cox回归中，将不利的核型、高pvr和高gal-9表达鉴定为非依赖性预后标记物(对于核型，p＜0.001，hr：2.10，ci1.39-3.15；对于pvr，p＝0.001，hr：1.64，ci1.21-2.21和对于gal-9，p＜0.001，hr：0.67，ci0.54-0.84)。由于pvr和pvrl2之间的高度相关性(皮尔森氏rho(pearson’srho)＝0.827，p＜0.001)，pvrl2在逐步过程期间被移除。然而，如果将pvr排除在多变量cox回归之外，则除了核型和gal-9之外，pvrl2在逐步程序中仍然是重要的术语(对于pvrl2，p＝0.003，hr：1.58，ci1.17-2.13)。在第二个非依赖性患者群组中，包含291名aml患者的基于微阵列的基因表达和临床数据(verhaak等人，haematologica2009；94)，与cd80、cd86或pd-l1的表达相比，高pvr和pvrl2表达与总体存活差相关(分别地，对数秩检验p＝0.003和p＝0.032)。在体外杀死测定中，使用7-aad染色通过facs研究pvr和pvrl2封闭的治疗效果。将aml细胞系mv4-11、kasumi-1和molm-13与针对pvr、pvrl2或它们二者的封闭性抗体一起预温育，并且在存在或不存在amg330的情况下与健康供体的外周血单核细胞(pbmc)共培养24h。
在不存在amg330的情况下，mv4-11的细胞杀死从12.6±4.7％(对照)增加至33.0±8.8％(pvr)、至40.4±10.4％(pvrl2)以及至56.0±12.0％(两者均为pvr+pvrl2)。在存在次优选浓度的amg330(0.1ng/mlmv4-11)的情况下，细胞裂解为29.4±9.0％(单独amg330)、49.7±12.6％(amg330+pvr)、57.9±11.3％(amg330+pvrl2)和70.0±9.8％(amg330+pvr+pvrl2；对于所有比较，n＝4，p＜0.05)。观察到kasumi-1和molm-13的可比较结果，其中两种检查点抑制剂的封闭都是最有效的治疗，但是在所有情况下都无法证实针对pvr和pvrl2的抗体的叠加效应(数据未显示)。为了确定该方法的特异性并且排除抗体依赖性细胞毒性(adcc)导致的影响，通过crispr/cas-9产生细胞系mv4-11的pvr和pvrl2双敲除。与野生型细胞相比，在pvr和pvrl2双敲除细胞中观察到杀死显著增加(40.5±8.1％对比25.9±9.1；n＝3，p＜0.001)。另外的实验使用不相关的针对cd117的抗体或通过纯化的igg抗体封闭fcγ受体排除了adcc，从而确认了了pvr/pvrl2封闭的功能相关性。
免疫检查点配体pvr和pvrl2的表达赋予可能由于免疫逃避而导致的aml患者的预后不良。我们还显示，通过pbmc杀死aml细胞可以通过封闭这些新检验点抑制剂来增强。此外，将pvr和/或pvrl2封闭性抗体添加至amg330可增强细胞毒性。因此，pvr和pvrl2的封闭表示有前景的治疗aml的靶标。
pvr、pvrl2和半乳糖凝集素-9在aml中的预后影响
使用lightcycler96(roche，basel，switzerland)在定量rt-pcr中分析140名患有初发性aml的患者的pvr、pvrl2和半乳糖凝集素-9mrna表达。甘油醛-3-磷酸脱氢酶(gapdh)用作参考基因。使用以下引物：pvr正向5’-agcaggagcgtggatatctg-3’(seqidno：1)、pvr反向5’-gactgtgccagacaggaacc-3’(seqidno：2)、pvrl2正向5’-gaggacgagggcaactacac-3’(seqidno：3)、pvrl2反向5’-agggatgagagccaggagat-3’(seqidno：4)、半乳糖凝集素-9正向5’-gtctccaggacggacttcag-3’(seqidno：5)、半乳糖凝集素-9反向5’-caggaagcagaggtcaaagg-3’(seqidno：6)、gapdh正向5’-gtcagtggtggacctgacct-3’(seqidno：7)、gapdh反向5’-tgctgtagccaaattcgttg-3’(seqidno：8)。对于将aml患者群组分为低表达者对比高表达者的每个基因定义了截止值。使用多变量cox回归将基因表达与患者人口统计学(年龄、核型、flt3突变状态)和临床存活数据相关联。统计分析使用spss17(spssinc，chicago，il)完成。
pvr、pvrl2和半乳糖凝集素-9的蛋白质表达
使用以下抗体在流式细胞术(facscalibur和cellquestpro软件，bdbiosciences)中分析aml细胞系和原代aml细胞中pvr和pvrl2的蛋白质表达：小鼠抗pvr克隆d171(thermoscientifictmlabvision，waltham，ma)和小鼠抗pvrl2克隆l14(bottino等人，jexpmed2003；198：557-567)作为一抗，且抗小鼠apc抗体作为二抗。半乳糖凝集素-9直接用apc标记的小鼠抗人抗体(克隆9m1-3；biozol，eching，germany)染色。
t细胞诱导的aml细胞裂解
来自健康供体的血沉棕黄层作为t细胞来源。使用ficoll-paque离心分离单核细胞(mnc)级分。aml细胞用celltrackertmgreencmfdadye(lifetechnologies)预染色一小时，并用细胞培养基洗涤两次。将预染色的aml靶细胞与含有mnc级分的t细胞以1∶6的比例混合，并涂铺于96孔板(200.000个细胞/孔)中。
将细胞混合物与pvr封闭性抗体克隆d171(4-20μg/ml；thermoscientifictmlabvision)、pvrl2封闭性抗体克隆l14(5-20μl细胞培养物上清液；bottino等人，jexpmed2003；198：557-567)、半乳糖凝集素-9封闭性抗体9m3-1(10-50μg/ml；biozol，eching，germany)一起或不加抗体温育2小时。在2小时后，将100-500pg/mlamg330加入培养物。
在24小时后，将细胞混合物使用7-aad染色并使用facscalibur和cellquestpro软件(bdbiosciences)通过流式细胞术进行分析。根据celltrackertmgreencmfda染料染色对aml靶细胞进行门控。杀死比例被确定为靶细胞门内7-aad阳性细胞的比例。