计算机可读格式的核苷酸/氨基酸序列表以其整体通过引用并入。含有所述序列表的文件是100k字节ascii文本文件，其创建于2016年11月15日且名为“24237wopctseq”。发明领域本发明部分涉及结合细胞毒性t淋巴细胞相关蛋白4(“ctla4”)(例如人ctla4)的氨基酸序列和多肽。具体而言，本发明部分涉及结合ctla4的改进的重链免疫球蛋白单一可变结构域(在本文也称为“isv”或“isvd”)，以及包含此类isvd的蛋白、多肽和其它构建体、化合物、分子或化学实体。基于本文的公开内容，本发明的其它方面、实施方案、特征、用途和优势将是技术人员清楚的。发明背景消除免疫调节分子(诸如细胞毒性t淋巴细胞抗原4(ctla-4))代表通过操纵免疫系统诱导肿瘤消退、稳定疾病和延长存活的新的且有前景的策略。抗ctla-4抗体伊匹单抗(ipilimumab)目前销售用于包括黑色素瘤在内的适应症。已经在接受ctla-4抗体的具有黑色素瘤的患者中看到肿瘤消退和至进展的时间延长的证据，并已用伊匹单抗，在具有黑色素瘤、卵巢癌、前列腺癌和肾细胞癌的患者中观察到持久应答。完全t细胞活化需要两种信号。第一种信号通过与抗原呈递细胞(apc)呈递的肿瘤相关抗原结合的t细胞受体经由主要组织相容性复合物i和ii引发。当t细胞上的主要共刺激受体cd28结合apc上的b7配体亚型cd80和cd86时，生成第二种信号。所得双重信号传导诱导变化，包括t细胞增殖和细胞因子释放，触发且然后扩增免疫应答。响应于t细胞活化，ctla-4上调且与cd28竞争apc上的cd80和cd86结合但具有显著较高亲和力，因此下调-或去活化-t细胞(图1)。因此，ctla-4下调t细胞应答和apc功能，导致降低的对肿瘤相关抗原的免疫应答和免疫耐受性。ctla4和pd1发挥其对t细胞活化的抑制效果的机制是多方面的。ctla4主要地发挥功能以限制t细胞活化和克隆扩增，而pd1主要地发挥功能以限制外周组织中的效应t细胞功能。其独特分子结构、调节、信号传导途径、配体分布和对treg和其他免疫细胞的功能表明ctla4和pd1的组合治疗性阻断可以协同作用以介导抗肿瘤免疫。intlekofer&thompson,j.leuko.biol.94(1):25-39(2013);hurwitz等人proc.natl.acad.sci.usa95:10067–10071(1998);parry等人mol.cell.biol.25(21):9543-9553(2005);callahan等人front.oncol.vol4,art.385(2015)。抑制ctla4介导的下调的一种方法是通过使其与纳米抗体结合，来干扰其与其配体的相互作用。存在下述的可能性，即源于美洲驼的纳米抗体可引起不需要的抗药物免疫应答，例如通过患者血清中预先存在的抗体与纳米抗体的结合。因此，使纳米抗体人源化以便减少或消除这种应答的新型方法是尤其有价值的，通过此类方法产生的纳米抗体也是如此。发明概述本发明提供了多特异性免疫球蛋白单一可变结构域(isvd)(诸如纳米抗体)，其通过在以下残基vrvtvl(seqidno:110的氨基酸33-38)、adsqvtevc(seqidno:110的氨基酸41-49)和ckvelmypppyylg(seqidno:110的氨基酸93-106)中的一个或多个(例如所有三个位点)处接触人ctla4而结合人ctla4。例如，所述结合剂防止残基在氘源(诸如d2o)存在的情况下进行氢-氘交换。在本发明的一个实施方案中，所述isvd结合人ctla4且生成基本上如图13中所述的结合热图(例如如在氢-氘交换测定中所生成)。本发明还提供了ctla4结合剂，其包含结合人ctla4的一个或多个(例如，2个)免疫球蛋白单一可变结构域(isvd)，所述isvd包含：包含氨基酸序列fygmg(seqidno:2的氨基酸6-10)或ggtfsfygmg(seqidno:2)的cdr1；包含氨基酸序列dirtsagrtyyadsvkg(seqidno:3)或dirtsagrty(seqidno:3的氨基酸1-10)的cdr2；包含氨基酸序列exsgisgwdy(seqidno:4)的cdr3；任选地，其中所述isvd包含在残基11和89处的突变(例如，l11v和/或v89l，例如(e1d、l11v、a14p、q45r、a74s、k83r、v89l、m96p、q108l)，其中所述残基编号是kabat残基编号。本发明提供了ctla4结合剂(例如isvd，例如纳米抗体)，其含有包含seqidno:1中所述的氨基酸序列的免疫球蛋白的cdr1、cdr2和cdr3，其中所述ctla4结合剂相对于seqidno:1中所述的氨基酸序列包含至少一个突变，其中所述至少一个突变在选自11、89、110和112的位置处，其中所述位置根据kabat编号；且任选地包括本文或另外所述的任何数目的额外突变，例如最多达10(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10)个额外突变(例如点突变、取代、缺失、插入)。例如，在本发明的一个实施方案中，cdr1包含氨基酸序列：fygmg(seqidno:2)或ggtfsfygmg(seqidno:5)；cdr2包含氨基酸序列：dirtsagrtyyadsvkg(seqidno:3)或dirtsagrty(seqidno:6)；且cdr3包含氨基酸序列：emsgisgwdy(seqidno:4)。例如，在本发明的一个实施方案中，所述ctla4结合剂相对于seqidno:1具有突变，其中位置11处的氨基酸残基选自l或v；位置89处的氨基酸残基合适地选自t、v或l；位置110处的氨基酸残基合适地选自t、k或q；和/或位置112处的氨基酸残基合适地选自s、k或q；例如，其中所述突变是89t；89l与11v的组合；89l与110k或110q的组合；89l与112k或112q的组合；89l与11v和110k或110q的组合；89l与11v和112k或112q的组合；11v与110k或110q；和/或11v与112k或112q的组合。在本发明的一个实施方案中，位置11、89、110和/或112处的突变如表b中所述。在本发明的一个实施方案中，所述ctla4结合剂相对于seqidno:1在位置1、14、45、74、83和/或108处进一步包含一个或多个突变。在本发明的一个实施方案中，所述ctla4结合剂具有1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸的c端延伸。例如，在本发明的实施方案中，所述c端延伸具有式-x(n)，其中x和n如下：(a)n=1且x=ala；(b)n=2且各x=ala；(c)n=3且各x=ala；(d)n=2且至少一个x=ala(其中剩余氨基酸残基x独立地选自任何天然存在的氨基酸)；(e)n=3且至少一个x=ala(其中剩余氨基酸残基x独立地选自任何天然存在的氨基酸)；(f)n=3且至少两个x=ala(其中剩余氨基酸残基x独立地选自任何天然存在的氨基酸)；(g)n=1且x=gly；(h)n=2且各x=gly；(i)n=3且各x=gly；(j)n=2且至少一个x=gly(其中剩余氨基酸残基x独立地选自任何天然存在的氨基酸)；(k)n=3且至少一个x=gly(其中剩余氨基酸残基x独立地选自任何天然存在的氨基酸)；(l)n=3且至少两个x=gly(其中剩余氨基酸残基x独立地选自任何天然存在的氨基酸)；(m)n=2且各x=ala或gly；(n)n=3且各x=ala或gly；(o)n=3且至少一个x=ala或gly(其中剩余氨基酸残基x独立地选自任何天然存在的氨基酸)；或(p)n=3且至少两个x=ala或gly(其中剩余氨基酸残基x独立地选自任何天然存在的氨基酸)。例如，在本发明的一个实施方案中，c端延伸是a、aa、aaa、g、gg、ggg、ag、ga、aag、agg、aga、gga、gaa或gag。本发明包括ctla4结合剂(例如isvd，诸如纳米抗体)，其包含与选自seqidno:8-43的成员中所述的氨基酸序列具有至少85%(例如85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5%、99.9%或100%)序列同一性的氨基酸序列，其中ctla4结合剂或isvd含有包含seqidno:1中所述的氨基酸序列的免疫球蛋白的cdr1、cdr2和cdr3，其中所述ctla4结合剂或isvd相对于seqidno:1中所述的氨基酸序列包含至少一个突变，其中所述至少一个突变在选自11、89、110和112的位置处，其中所述位置根据kabat编号。本发明还提供了包含选自seqidno:9-40的氨基酸序列的ctla4结合剂、isvd、纳米抗体或多肽。本发明还提供了多特异性结合剂，其包含结合ctla4的ctla4结合部分(例如isvd，诸如纳米抗体)，其连接至一个或多个结合不是ctla4结合部分结合的表位的表位(例如pd1、ctla4、lag3、btla和/或cd27)的分子。本发明还提供了与另外的治疗剂组合的任何此类ctla4结合剂、多肽、免疫球蛋白单一可变结构域(isvd)或多特异性结合剂。本发明还提供了注射装置(例如皮下注射针和注射器)或容器，其包含任选地与另外的治疗剂组合的ctla4结合剂、免疫球蛋白单一可变结构域(isvd)、纳米抗体、多肽或多特异性结合剂。本发明还提供了编码ctla4结合剂、免疫球蛋白单一可变结构域(isvd)、纳米抗体、多肽或多特异性结合剂的多核苷酸，例如其在载体中。本发明还提供了包含所述多核苷酸或载体的宿主细胞(例如cho细胞或毕赤酵母细胞)。本发明还提供了制备ctla4结合剂、免疫球蛋白单一可变结构域(isvd)、纳米抗体、多肽或多特异性结合剂的方法，其包括将编码ctla4结合剂、免疫球蛋白单一可变结构域(isvd)、纳米抗体、多肽或多特异性结合剂的多核苷酸引入宿主细胞(例如cho细胞或毕赤酵母细胞)中并在培养基中在有利于从所述多核苷酸表达所述免疫球蛋白的条件下培养宿主细胞，和任选地，从所述宿主细胞和/或所述培养基纯化免疫球蛋白。通过此类方法产生的任何免疫球蛋白单一可变结构域(isvd)、纳米抗体、多肽、多特异性结合剂或ctla4结合剂。本发明还提供了防止t细胞上的ctla4结合抗原呈递细胞上的cd80和/或cd86的方法，其包括使所述ctla4接触免疫球蛋白单一可变结构域(isvd)、纳米抗体、多肽、多特异性结合剂或ctla4结合剂，任选地与另外的治疗剂的组合。本发明还提供了用于增强受试者体内的免疫应答的方法，其包括向所述受试者(例如哺乳动物，诸如人)施用有效量的免疫球蛋白单一可变结构域(isvd)、纳米抗体、多肽、多特异性结合剂或ctla4结合剂，任选地与另外的治疗剂组合。本发明还提供了用于治疗或预防受试者体内的癌症或感染性疾病的方法，其包括向所述受试者施用有效量的免疫球蛋白单一可变结构域(isvd)、纳米抗体、多肽、多特异性结合剂或ctla4结合剂，任选地与另外的治疗剂组合。在本发明的一个实施方案中，所述癌症是转移性癌症、实体瘤、血液癌症、白血病、淋巴瘤、骨肉瘤、横纹肌肉瘤、神经母细胞瘤、肾癌、白血病、肾移行细胞癌、膀胱癌、wilm氏癌、卵巢癌、胰腺癌、乳腺癌、前列腺癌、骨癌、肺癌、非小细胞肺癌、胃癌、结直肠癌、宫颈癌、滑膜肉瘤、头颈癌、鳞状细胞癌、多发性骨髓瘤、肾细胞癌、视网膜母细胞瘤、肝母细胞瘤、肝细胞癌、黑素瘤、肾横纹肌样瘤、尤因氏肉瘤、软骨肉瘤、脑癌、胶质母细胞瘤、脑膜瘤、垂体腺瘤、前庭神经鞘瘤、原始性神经外胚层肿瘤、成神经管细胞瘤、星形细胞瘤、间变性星形细胞瘤、少突神经胶质瘤、室管膜瘤、脉络丛乳头状瘤、真性红细胞增多症、血小板增多症、特发性骨髓纤维化、软组织肉瘤、甲状腺癌、子宫内膜癌、类癌或肝癌、乳腺癌或胃癌。在本发明的一个实施方案中，所述感染性疾病是细菌感染、病毒感染或真菌感染。例如，在本发明的一个实施方案中，向受试者施用另外的治疗剂或治疗程序与免疫球蛋白单一可变结构域(isvd)、纳米抗体、多肽、多特异性结合剂或ctla4结合剂的组合。本发明提供了包含免疫球蛋白单一可变结构域(isvd)的ctla4结合剂(例如，多价结合剂)，其通过在以下残基vrvtvl(seqidno:110的氨基酸33-38)、adsqvtevc(seqidno:110的氨基酸41-49)和ckvelmypppyylg(seqidno:110的氨基酸93-106)中的一个或多个处接触人ctla4而结合人ctla4，其中所述isvd包含在残基11(例如，l11v)和89(例如，v89l)处的突变，其中所述残基编号是kabat残基编号。本发明还提供了包含结合ctla4的免疫球蛋白单一可变结构域(isvd)的ctla4结合剂(例如，多价结合剂)，其包含seqidno:1中所述的氨基酸序列，但在选自以下的位置处包含一个或多个突变：e1、l11、a14、q45、a74、n73、k83、v89、m96或q108l(例如，e1d、l11v、a14p、q45r、a74s、n73x(其中x是s、v、g、r、q、m、h、t、d、e、w、f、k、a、y或p)、k83r、v89l、m96p、q108l)；其中所述残基编号是kabat残基编号；并且任选地包含半衰期延长剂(例如，alb11002)和/或c端延长剂(例如，丙氨酸)。例如，在本发明的一个实施方案中，所述isvd包含氨基酸序列：其中x是d或e(seqidno:60)；任选地包含半衰期延长剂(例如，alb11002)和/或c端延长剂(例如，丙氨酸)。在本发明的一个实施方案中，所述ctla4结合剂包含包括选自seqidno:93-109的氨基酸序列的isvd；任选地缺乏其氨基酸aaadykdhdgdykdhdidykddddkgaahhhhhh。在本发明的一个实施方案中，所述ctla4结合剂包含结合ctla4的isvd，其包含seqidno:60中所述的氨基酸序列；其中x是d或e；肽接头(例如，ggggsggggsggggsggggsggggsggggsggggs(seqidno:65))；结合ctla4的isvd，其包含seqidno:60中所述的氨基酸序列；其中x是d或e；肽接头；半衰期延长剂；和任选地，c端延伸丙氨酸；或其中所述ctla4结合剂包含结合ctla4的isvd，其包含seqidno:60中所述的氨基酸序列；其中x是d或e；肽接头；半衰期延长剂；和任选地，c端延伸丙氨酸。在本发明的一个实施方案中，所述ctla4结合剂包含氨基酸序列：。本发明还提供了交叉阻断本文所述的ctla4结合剂结合ctla4的结合剂(例如，抗体)。本发明还提供了注射装置或容器，其包含本文所述(例如，包含seqidno:62或64中所述的氨基酸序列)的任何ctla4结合剂，任选地与另外的治疗剂的组合。本发明还提供了编码本文所述(例如，包含seqidno:62或64中所述的氨基酸序列)的任何ctla4结合剂的多核苷酸(例如，dna)；例如包含seqidno:61或63的核苷酸序列；或包含此类多核苷酸的载体；或包含此类多核苷酸或载体的宿主细胞。本发明还提供了用于制备本文所述(例如，包含seqidno:62或64中所述的氨基酸序列)的ctla4结合剂的方法，其包括将编码所述ctla4结合剂的多核苷酸引入宿主细胞(例如cho细胞或毕赤酵母细胞)中，并在培养基中在有利于从所述多核苷酸表达所述ctla4结合剂的条件下培养宿主细胞，和任选地，从所述宿主细胞和/或所述培养基纯化所述ctla4结合剂，以及通过此类方法产生的任何ctla4结合剂。本发明还提供了用于防止ctla4结合cd80或cd86(例如，在受试者体内)的方法，其包括使所述ctla4接触ctla4结合剂(例如，包含seqidno:62或64中所述的氨基酸序列)，任选地与另外的治疗剂的组合；以及用于增强受试者(例如人)体内的免疫应答的方法，其包括向所述受试者施用有效量的ctla4结合剂(例如，包含seqidno:62或64中所述的氨基酸序列)，任选地与另外的治疗剂(例如，派姆单抗)组合。此外，本发明提供了用于治疗或预防受试者体内的癌症或感染性疾病的方法，其包括向所述受试者施用有效量的ctla4结合剂(例如，包含seqidno:62或64中所述的氨基酸序列)，任选地与另外的治疗剂(例如，派姆单抗)组合。在本发明的一个实施方案中，所述癌症是转移性癌症、实体瘤、血液癌症、白血病、淋巴瘤、骨肉瘤、横纹肌肉瘤、神经母细胞瘤、肾癌、白血病、肾移行细胞癌、膀胱癌、wilm氏癌、卵巢癌、胰腺癌、乳腺癌、前列腺癌、骨癌、肺癌、非小细胞肺癌、胃癌、结直肠癌、宫颈癌、滑膜肉瘤、头颈癌、鳞状细胞癌、多发性骨髓瘤、肾细胞癌、视网膜母细胞瘤、肝母细胞瘤、肝细胞癌、黑素瘤、肾横纹肌样瘤、尤因氏肉瘤、软骨肉瘤、脑癌、胶质母细胞瘤、脑膜瘤、垂体腺瘤、前庭神经鞘瘤、原始性神经外胚层肿瘤、成神经管细胞瘤、星形细胞瘤、间变性星形细胞瘤、少突神经胶质瘤、室管膜瘤、脉络丛乳头状瘤、真性红细胞增多症、血小板增多症、特发性骨髓纤维化、软组织肉瘤、甲状腺癌、子宫内膜癌、类癌或肝癌、乳腺癌或胃癌；或其中所述感染性疾病是细菌感染、病毒感染或真菌感染。在本发明的一个实施方案中，向所述受试者施用另外的治疗剂(例如，派姆单抗)或治疗程序与所述ctla4结合剂的组合。附图描述图1.列出将在本文中特别提及的一些氨基酸位置和其根据一些替代编号系统(诸如aho和imgt)的编号的表格。图2.ctla4结合剂序列。图3(a-b).11f1序列与seqidno:8-43的序列的比对。图4.在中国仓鼠卵巢细胞中(chon-连接的聚糖)和在工程改造的酵母细胞中(工程改造的酵母n-连接的聚糖)产生的单克隆抗体的优势n-连接的聚糖：正方形：n-乙酰基葡糖胺(glcnac)；圆形：甘露糖(man)；菱形：半乳糖(gal)；三角形：岩藻糖(fuc)。图5(a-b).纳米抗体f023700912、f023700925或对照纳米抗体(irr00051；抗her2/erbb2(由35gs与白蛋白结合剂连接的二价抗her2))与表达hctla4的(a)jurkat和(b)cho-k1细胞的结合的bfacs分析。图6(a-b).纳米抗体f023700912或伊匹单抗与(a)cd80或(b)cd86之间的对于结合在cho-k1细胞上表达的人ctla4的竞争。图7(a-h).纳米抗体f023700912、f023700925或对照纳米抗体(irr00051)的结合btla、cd8、pd1、ctla4、lag3、cd28或对照细胞的特异性评价。测定纳米抗体与(a)阴性对照l细胞、(b)阴性对照cho-k1细胞、(c)hucd28+l细胞、(d)hucd8α+l细胞、(e)hulag-3+cho-k1细胞、(f)hubtla+cho-k1细胞、(g)huctla-4+cho-k细胞和(h)hupd-1+cho-k1细胞的结合。图8(a-b).纳米抗体f023700906、f023701051、f02371054或f023701061和(a)人cd80或(b)人cd86之间的对结合在cho-k1细胞上表达的人ctla-4的竞争。图9(a-j).纳米抗体对人源化小鼠中的panc08.13肿瘤的效果。在用同种型对照、伊匹单抗(n297a)、伊匹单抗、派姆单抗、伊匹单抗+派姆单抗、5mpk剂量下的f023700912(ctla4纳米抗体-5)、15mpk剂量下的f023700912(ctla4纳米抗体-15)或派姆单抗+ctla4纳米抗体-15处理的小鼠中的(a)平均肿瘤体积±sem和(b)在第37天的个体肿瘤体积；和在用(c)同种型对照抗体、(d)伊匹单抗(n297a)、(e)伊匹单抗、(f)派姆单抗、(g)伊匹单抗+派姆单抗、(h)ctla4纳米抗体-5、(i)ctla4纳米抗体-15或(j)ctla4纳米抗体-15+派姆单抗处理的小鼠中，在实验过程中小鼠个体中的肿瘤体积。图10(a-b).(a)健康人受试者血清和(b)癌症患者血清的血清预抗体对f023700912和f023700925和三价对照纳米抗体t013700112(缺乏减少预先存在的抗体结合的突变)的反应性。图11.ctla4结合剂构建体。图12.ctla4结合剂序列。图13.通过f023700912ctla4结合剂的人ctla4结合的氘标记差异热图。发明详述本发明提供了包含突变的isvd，所述突变阻断预先存在的抗体(预抗体)对isvd内的新表位的反应性。新表位是当蛋白被突变(例如截短)或其折叠被改变时呈现的蛋白内的表位。预先存在的抗体是在接受isvd前患者体内存在的抗体。本发明的isvd部分基于其c端恒定结构域已经移除的美洲骆抗体；因此，所得vhh的c端中的新表位暴露于预抗体结合。已发现残基11和89的突变的组合(例如l11v和i89l或v89l)导致预抗体结合的令人惊讶的缺乏。残基112中的突变也已显示显著减少预抗体结合。buyse&boutton(wo2015/173325)包括显示l11v和v89l突变的组合与仅l11v突变或仅v89l突变相比在减少预抗体结合中提供显著改善的数据。例如，buyse&boutton在第97页的表h显示仅具有v89l突变的isvd(有或无c端延伸)和具有v89l突变与l11v突变的组合的相同isvd(再次，有或无c端延伸)的比较数据。此外，尽管在两个单独实验中生成，与表b中对于仅l11v突变(在相同isvd中)给出的数据相比，表h中对于l11v/v89l组合显示的数据显示通过l11v/v89l组合获得的预抗体结合减少大于仅l11v突变。因为已知美洲骆抗体支架结构是非常高度保守的，对于任何isvd，位置11和89处的突变的效果非常可能都存在。事实上，在图10中，使用本发明结合剂f023700912和f023700925证实了所述效果，其显示展示出非常低水平的预抗体结合。在本申请中，免疫球蛋白重链可变结构域中的氨基酸残基/位置将用根据kabat的编号指示。为了方便起见，图1给出表格，其列出了将在本文中特别提及的一些氨基酸位置和其根据一些替代编号系统(诸如aho和imgt。注释：除非另外明确指示，否则对于本说明书和权利要求，kabat编号是决定性的；其它编号系统仅为了参考而给出)的编号。关于cdr，如本领域中众所周知，存在多种定义和描述vh或vhh片段的cdr的惯例，诸如kabat定义(其基于序列变异性且最常用)和chotia定义(其基于结构环区的位置)。参考例如网站www.bioinf.org.uk/abs/。出于本说明书和权利要求的目的，即使也可提及根据kabat的cdr，cdr最优选基于abm定义(其基于oxfordmolecular的abm抗体建模软件)来定义，因为这被视为kabat和chotia定义之间的最佳折衷。再次参考网站www.bioinf.org.uk/abs/。参见sequencesofproteinsofimmunologicalinterest,kabat,等人;nationalinstitutesofhealth,bethesda,md.;第5版;nih公开号91-3242(1991);kabat(1978)adv.prot.chem.32:1-75;kabat,等人,(1977)j.biol.chem.252:6609-6616;chothia,等人,(1987)jmol.biol.196:901-917或chothia,等人,(1989)nature342:878-883;chothia&lesk(1987)j.mol.biol.196:901-917;elvina.kabat,taitewu,carlfoeller,haroldm.perry,kays.gottesman(1991)sequencesofproteinsofimmunologicalinterest;proteinsequenceandstructureanalysisofantibodyvariabledomains.于:antibodyengineeringlabmanual(编辑:duebel,s.和kontermann,r.,springer-verlag,heidelberg)。在本发明的一个实施方案中，根据kabat确定cdr，例如，其中vhh的fr1包含位置1-30处的氨基酸残基，vhh的cdr1包含位置31-35处的氨基酸残基，vhh的fr2包含位置36-49处的氨基酸，vhh的cdr2包含位置50-65处的氨基酸残基，vhh的fr3包含位置66-94处的氨基酸残基，vhh的cdr3包含位置95-102处的氨基酸残基，且vhh的fr4包含位置103-113处的氨基酸残基。在本发明的一个实施方案中，根据kontermann和dübel(编辑,antibodyengineering,vol2,springerverlagheidelbergberlin,martin,chapter3,pp.33-51,2010)确定cdr。术语“免疫球蛋白单一可变结构域”(也称为“isv”或“isvd”)通常用于指可以在不与另一可变结构域相互作用的情况下(例如在没有如常规4-链单克隆抗体的vh和vl结构域之间所需要的vh/vl相互作用的情况下)，形成功能性抗原结合位点的免疫球蛋白可变结构域(其可以是重链或轻链结构域，包括vh、vhh或vl结构域)。isvd的实例将是技术人员清楚的且例如包括纳米抗体(包括vhh、人源化vhh和/或骆驼化vh，诸如骆驼化人vh)、ignar、结构域、作为vh结构域或衍生自vh结构域的(单结构域)抗体(诸如dabs™)和作为vl结构域或衍生自vl结构域的(单结构域)抗体(诸如dabs™)。基于和/或衍生自重链可变结构域(诸如vh或vhh结构域)的isvd通常是优选的。最优选地，isvd将是纳米抗体。例如，f023700906是isvd。术语“纳米抗体”通常如wo2008/020079或wo2009/138519中所定义，且因此在一个特定方面，通常表示vhh、人源化vhh或骆驼化vh(诸如骆驼化人vh)，或通常表示序列优化的vhh(诸如例如，针对化学稳定性和/或溶解性、与已知人骨架区的最大重叠和最大表达进行优化)。应注意术语纳米抗体(nanobody或nanobodies)是ablynxn.v.的注册商标且因此也可称为nanobody®和/或nanobodies®)。多特异性结合剂是包含第一ctla4结合部分(例如isvd或纳米抗体)和一个或多个(例如1、2、3、4、5个)结合除了第一ctla4结合部分的表位以外的表位(例如ctla4的不同表位，或cd27、lag3、pd1或btla)的额外结合部分(例如isvd或纳米抗体)的分子。结合部分或结合结构域或结合单元是结合抗原(诸如ctla4)的分子，诸如isvd或纳米抗体(例如，seqidno:8-43或60中的任一种)。结合部分或结合结构域或结合单元可以是包括多于一个部分、结构域或单元的较大分子(诸如多价或多特异性结合剂)的一部分，其可以包含另一个功能元件(诸如例如半衰期延长剂(hle)、靶向单元和/或小分子(诸如聚乙二醇(peg))。单价ctla4结合剂(例如isvd，诸如纳米抗体)是包含单一抗原结合结构域的分子。二价ctla4结合剂(例如isvd，诸如纳米抗体)包含两个抗原结合结构域。多价ctla4结合剂包含多于一个(例如，1、2、3、4、5、6或7个)抗原结合结构域。单特异性ctla4结合剂(例如isvd，诸如纳米抗体)结合单一抗原(ctla4)；双特异性ctla4结合剂结合两种不同抗原且多特异性ctla4结合剂结合多于一种抗原。双互补位ctla4结合剂(例如isvd，诸如纳米抗体)是单特异性的，但结合同一抗原的两个不同表位。多互补位ctla4结合剂结合同一抗原，但结合抗原中的多于一个表位。如本文关于ctla4结合剂(例如isvd，诸如纳米抗体)或其它分子所用的术语“半衰期”可以通常如wo2008/020079的第57页的段落o)中所述来定义，并且如其中所提及的，是指氨基酸序列、ctla4结合剂、化合物或多肽的血清浓度在体内减少50%所花费的时间，例如由于通过天然机制，序列或化合物的降解和/或序列或化合物的清除或隔离(sequestration)。本发明的氨基酸序列、ctla4结合剂、化合物或多肽的体内半衰期可以本身已知的任何方式，诸如通过药代动力学分析测定。合适的技术将是本领域技术人员清楚的，且可例如通常如wo2008/020079的第57页的段落o)中所述。如还在wo2008/020079的第57页的段落o)中提及，半衰期可以使用诸如t1/2-α、t1/2-β和曲线下面积(auc)的参数表示。在这方面，应注意如本文所用的术语“半衰期”尤其是指t1/2-β或终端半衰期(其中可不考虑t1/2-α和/或auc或两者)。参考例如以下实验部分，以及标准手册，诸如kenneth,a等人:chemicalstabilityofpharmaceuticals:ahandbookforpharmacists和peters等人,pharmacokineteanalysis:apracticalapproach(1996)。还参考"pharmacokinetics",mgibaldi&dperron,由marceldekker出版,第2修订版(1982)。类似地，术语“半衰期增加”或“增加的半衰期”也如wo2008/020079的第57页的段落o)中所定义且尤其是指t1/2-β增加，伴随或不伴随t1/2-α和/或auc或两者增加。当术语在本文中未特别定义时，其具有其在本领域中的常用含义，其将是技术人员清楚的。参考例如标准手册，诸如sambrook等人,"molecularcloning:alaboratorymanual"(第2版),第1-3卷,coldspringharborlaboratorypress(1989);f.ausubel等人,编,"currentprotocolsinmolecularbiology",greenpublishingandwileyinterscience,newyork(1987);lewin,“genesii”,johnwiley&sons,newyork,n.y.,(1985);old等人.,“principlesofgenemanipulation:anintroductiontogeneticengineering”,第2版,universityofcaliforniapress,berkeley,ca(1981);roitt等人.,“immunology”(第6版),mosby/elsevier,edinburgh(2001);roitt等人.,roitt’sessentialimmunology,第10版blackwellpublishing,uk(2001);和janeway等人.,“immunobiology”(第6版),garlandsciencepublishing/churchilllivingstone,newyork(2005)，以及本文中引用的通用
背景技术：
：：。对于含有一个或多个纳米抗体的多价和多特异性多肽及其制备的一般描述，也参考conrath等人,j.biol.chem.,vol.276,10.7346-7350,2001;muyldermans,reviewsinmolecularbiotechnology74(2001),277-302;以及例如wo1996/34103、wo1999/23221、wo2004/041862、wo2006/122786、wo2008/020079、wo2008/142164或wo2009/068627。“分离的”ctla4结合剂(例如isvd，诸如纳米抗体))、多肽、多核苷酸和载体至少部分地不含有来自产生它们的细胞或细胞培养物的其它生物分子。此类生物分子包括核酸、蛋白、脂质、碳水化合物或其它材料诸如细胞碎片和生长培养基。“分离的”ctla4结合剂还可以至少部分地不含有表达系统组分诸如来自宿主细胞的生物分子或其生长培养基的生物分子。通常，术语“分离的”不意图指此类生物分子的完全不存在，或水、缓冲剂或盐的不存在，或包括抗体或片段的药物制剂的组分。短语“控制序列”是指可操作连接的编码序列在特定宿主生物体中的表达所必需的多核苷酸。适合于原核生物的控制序列例如包括启动子、任选操纵子序列和核糖体结合位点。已知真核细胞使用启动子、多腺苷酸化信号和增强子。当核酸或多核苷酸与另一个多核苷酸发生功能关联时，所述核酸或多核苷酸是“可操作连接的”。例如，如果其表达为参与多肽分泌的前蛋白，则前序列或分泌前导序列的dna与所述多肽的dna可操作连接；如果其影响序列的转录，则启动子或增强子与编码序列可操作连接；或如果其被定位为促进翻译，则核糖体结合位点与编码序列可操作连接。通常，但不总是，“可操作连接的”意指，所连接的dna序列是连续的，且在分泌前导序列的情况下，是连续的且在阅读相中。然而，增强子不必须是连续的。连接通过在方便的限制性位点处的连接来实现。如果此类位点不存在，则根据常规实践使用合成的寡核苷酸适体或接头。本发明的“人血清白蛋白结合剂”或“hsa结合剂”是本文描述的结合hsa的分子中的任一种(例如isvd，诸如纳米抗体)以及结合hsa且包括本文描述的hsa结合部分中的任一种的任何抗体或其抗原结合片段。如果单个hsa结合剂是较大分子(例如多价分子，诸如f023700912或f023700914)的一部分，则其可称为具有hsa结合部分。通常，基本抗体结构单元包含四聚体。每个四聚体包括两个相同的多肽链对，每对具有一个“轻”链(约25kda)和一个“重”链(约50-70kda)。每条链的氨基端部分包括主要负责抗原识别的约100-110个或更多个氨基酸的可变区。重链的羧基端部分可以限定主要负责效应子功能的恒定区。通常，将人轻链分类为κ和λ轻链。此外，通常将人重链分类为μ、δ、γ、α或ε，并将抗体的同种型分别定义为igm、igd、igg、iga和ige。在轻链和重链内，可变区和恒定区由约12个或更多个氨基酸的“j”区域连接，其中重链还包括约10个更多氨基酸的“d”区域。通常参见fundamentalimmunology第7章(paul,w.,编,第2版ravenpress,n.y.(1989)。抗原结合片段的实例包括，但不限于，fab、fab'、f(ab')2和fv片段以及单链fv分子。以下特征与ctla4结合剂11f01中的所示突变相关：e1d：防止在构建体e1的第一氨基酸中形成焦谷氨酸l11v：减少预抗体结合a14p：人源化q45r：突变以增加稳定性a74s：人源化k83r：人源化i89l：减少预抗体结合m96p、q或r：防止m96的氧化q108l：人源化。在本发明的一个实施方案中，ctla4是人ctla4。在本发明的一个实施方案中，人ctla4包含氨基酸序列：ctla4结合剂本发明旨在提供改进的ctla4结合剂，具体而言改进的ctla4isvd且更具体而言改进的ctla4纳米抗体。本发明的ctla4结合剂包括作为包含seqidno:1的氨基酸序列的多肽的变体、在位置诸如1、11、14、45、74、83、89、96、108、110和/或112处突变的多肽。ctla4结合剂或ctla4isvd或ctla4纳米抗体分别是指结合ctla4的结合剂、isvd或纳米抗体。本发明提供的改进的ctla4结合剂在本文中也称为“本发明的ctla4结合剂”或“ctla4结合剂”。这些术语涵盖包含本文所述的结合ctla4的分子的任何分子。例如，所述术语包括包含选自seqidno:8-43和60的成员中所述的氨基酸序列的isvd以及包括选自seqidno:8-43和60的成员中所述的氨基酸序列的任何多肽、纳米抗体、isvd、融合蛋白、常规抗体或其抗原结合片段；或包含选自seqidno:8-43和60的成员中所述的氨基酸序列的任何双特异性分子(例如isvd)，其结合ctla4以及结合另一抗原或另一表位，诸如cd27、lag3、pd1或btla。本发明的ctla4结合剂是f023700912或f023700914。本发明的范围包括任何ctla4结合剂，其包含图11中所述的结合部分的排列，任选地缺乏flag3和/或his6标签；以及图12中所述的任何氨基酸序列。wo2008/071447描述了可以结合ctla4的纳米抗体和其用途。wo2008/071447的seqidno:1306公开了ctla4特异性纳米抗体，称作11f01，其序列在本文中作为seqidno:1给出。该序列(在本文中也称为“参考a”)及其cdr还在下表a-1中给出。如本文进一步描述，在本发明的一个实施方案中，在本发明的多价和/或多特异性ctla4结合剂(例如，f023700914)中的本发明的ctla4结合剂优选具有与存在于11f01或包含11f01的序列(seqidno:1)的结合剂中相同的cdr的组合(即cdr1、cdr2和cdr3)。参见表a-1。本发明还包括ctla4结合剂，其为11f01的变体，其包含下表a-2中所述的氨基酸序列。本发明的范围包括ctla4结合剂，其包括下面表a-2中所述的所述变体的cdr1、cdr2和cdr3。此外，本发明包括多特异性和/或多价结合剂(例如，f023700914)，其包含ctla4结合部分，其包括下面表a-2中所述的11f01或其变体之一的cdr1、cdr2和cdr3或氨基酸序列。表a-1.ctla4纳米抗体11f1(11f01)表a-2.变体ctla4纳米抗体11f1*cdr加下划线和/或呈粗体。seqidno:60的残基1可以是d或e。如果残基1是d，则ctla4结合剂可称为1d且如果残基1是e，则ctla4结合剂可称为1e。在本发明的一个实施方案中，本发明的ctla4结合剂包含n73x突变，其中x是除了n以外的任何氨基酸，例如s、v、g、r、q、m、h、t、d、e、w、f、k、a、y或p(或除了n以外的任何氨基酸)。本发明包括ctla4结合剂，其包含ctla4结合剂的cdr中的一个、两个或三个，其中各自相对于表a-1或a-2的所述ctla4结合剂序列(例如11f01(e1d、l11v、a14p、q45r、a74s、k83r、v89l、m96p、q108l)或11f01)中所述或seqidno:2-7中所述的cdr包含0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸取代，例如保守性取代，和/或包含100%、99%、98%、97%、96%或95%序列同一性，其中具有此类cdr的ctla4结合剂保留结合ctla4的能力。本文所述的基于参考a的ctla4结合剂(例如isvd，诸如纳米抗体)的某些残基的kabat残基编号显示于以下序列中：本文所述的ctla4结合剂11f01(e1d、l11v、a14p、q45r、a74s、k83r、v89l、m96p、q108l)的某些残基的kabat残基编号显示于以下序列中：本发明包括包含seqidno:60的氨基酸序列或包含80%或更多(例如85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%)氨基酸序列同一性的氨基酸序列的任何ctla4结合剂，其中所述ctla4结合剂保留结合ctla4的能力。本发明包括这样的实施方案，其中ctla4结合剂的在kabat位置96处的cdr3甲硫氨酸被任何氨基酸，诸如脯氨酸(但不被cys、asp或asn)取代，例如被以下氨基酸中的任一种取代：leu、ile、val、ala、gly、tyr、trp、phe、glu、gln、ser、thr、his、arg、lys或pro。本发明的一些优选、但非限制性ctla4结合剂(例如isvd，诸如纳米抗体)是seqidno:60或在图2中作为seqidno:8-43列出。图3显示这些序列与参考a(seqidno:1)的比对。在这些ctla4结合剂中，seqidno:26-43的结合剂是具有c端丙氨酸延伸的本发明的ctla4结合剂的实例，所述c端丙氨酸延长即与通常c端序列vtvss(seqidno:57，如存在于参照a中)相比，在isvd-序列的c端末端(有时也称为“位置114”)处的丙氨酸残基。如wo2012/175741中(以及例如wo2013/024059和pct/ep2015/060643(wo2015/173325中))所述，该c端丙氨酸延长可以防止所谓的“预先存在的抗体”(假设为igg)与位于isv的c端区的推定表位结合。假设该表位尤其包括如下残基：c端序列vtvss(seqidno:57)的表面暴露的氨基酸残基以及位置14处的氨基酸残基(和在氨基酸序列中紧接着/接近其的氨基酸残基，诸如位置11、13和15)且也可以包含位置83处的氨基酸残基(和在氨基酸序列中紧接着/接近其的氨基酸残基，诸如位置82、82a、82b和84)和/或位置108处的氨基酸残基(和在氨基酸序列中紧接着/接近其的氨基酸残基，诸如位置107)。然而，尽管这种c端丙氨酸(或通常c端延伸)的存在可以大大地减少(并且在许多情况下，甚至基本上完全防止)可以在来自一系列受试者(健康受试者以及患者)的血清中发现的“预先存在的抗体”的结合，已发现来自一些受试者的血清(诸如来自具有一些免疫疾病(诸如sle)的患者的血清)可以含有可以结合isv的c端区(当暴露这种区域时)的预先存在的抗体，甚至当isv含有这种c端丙氨酸(或更通常，这种c端延伸)时。再次参考ablynxn.v.在2015年5月13日申请且名称为“improvedimmunoglobulinvariabledomains”的共同在审的未预先公开的pct申请pct/ep2015/060643(wo2015/173325)。因此，本发明的一个特定目标是提供ctla4结合部分(例如isvd，诸如纳米抗体)，其是被称为“参考a”的ctla4纳米抗体的改进的变体，且具有与所谓“预先存在的抗体”且特别是pct/ep2015/060643(wo2015/173325)中描述的种类(即，甚至在c端延伸存在的情况下，可以结合isv的暴露的c端区的那些预先存在的抗体)的减少的结合。本发明提供了包含作为seqidno:1的序列的变体的氨基酸序列的ctla4结合剂，其与seqidno:1的序列相比包含以下突变中的一个或多个：-1d或1e；-11v；-14p；-45r；-74s；-83r；-89l或89t；-96p；或-108l；例如，其中所述ctla4结合剂包含以下突变集合中的一种或多种：-89l与11v；14p；45r；74s；83r；86p；108l和1e或1d的组合；-89l与11v的组合；-89l与110k或110q的组合；-89l与112k或112q的组合；-89l与11v；14p；45r；74s；83r；86p；108l、110k或110q和1e或1d的组合；-89l与11v；14p；45r；74s；83r；86p；108l、112k或112q和1e或1d的组合；-89l与11v和110k或110q的组合；-89l与11v和112k或112q的组合；-11v与110k或110q的组合；和/或-11v与112k或112q的组合。具体而言，在本发明的一个实施方案中，ctla4结合剂(例如isvd，诸如纳米抗体)包含：-位置1处的氨基酸优选为e或d；-位置11处的氨基酸优选为l或v；-位置14处的氨基酸优选为a或p；-位置45处的氨基酸优选为q或r；-位置74处的氨基酸优选为a或s；-位置83处的氨基酸优选为k或r；-位置89处的氨基酸优选为t、v或l；-位置96处的氨基酸优选为m或p；-位置108处的氨基酸优选为q或l；-位置110处的氨基酸残基优选合适地选自t、k或q；且-位置112处的氨基酸残基优选合适地选自s、k或q；使得，例如，以下中的一种或多种是真实的：(i)位置89是t；(ii)位置89是l；(iii)位置1是d或e，位置11是v，位置14是p，位置45是r，位置74是s，位置83是r，位置89是l，位置96是p，且位置108是l；(iv)位置89是l且位置11是v；(v)位置89是l且位置110是k或q；(vi)位置89是l且位置112是k或q；(vii)位置1是d或e，位置11是v，位置14是p，位置45是r，位置74是s，位置83是r，位置89是l，位置96是p，位置108是l；且位置110是k或q；(viii)位置1是d或e，位置11是v，位置14是p，位置45是r，位置74是s，位置83是r，位置89是l，位置96是p，位置108是l；且位置112是k或q；(ix)位置89是l且位置11是v且位置110是k或q；(x)位置89是l且位置11是v且位置112是k或q；(xi)位置11是v且位置110是k或q；或(xii)位置11是v且位置112是k或q。在具体实施方案中，本发明的ctla4结合剂(例如isvd，诸如纳米抗体)包含作为seqidno:1的变体的氨基酸序列，其中位置89是t或其中位置1是d，位置11是v，位置14是p，位置45是r，位置74是s，位置83是r，位置89是l，位置96是p且位置108是l，或其中位置11是v且位置89是l(任选地与110k或110q突变和/或112k或112q突变合适的组合，且特别是与110k或110q突变组合)是特别优选的。甚至更优选这样的氨基酸序列，其中位置11是v且位置89是l，任选地具有110k或110q突变。如所提及，本文描述的ctla4结合剂(例如isvd，诸如纳米抗体)可以结合(且特别是，可以特异性结合)ctla4。在本发明的一个实施方案中，ctla4结合剂可以结合ctla4且由此防止抗原呈递细胞上的cd80和cd86结合t细胞上的ctla4。在本发明的一个实施方案中，所得的ctla-4信号传导的阻断延长t细胞活化，恢复t细胞增殖，且因此扩增t细胞介导的免疫性，其理论上增强患者建立抗肿瘤免疫应答的能力。在本发明的一个实施方案中，本发明的ctla4结合剂具有以下特性中的一种或多种：•结合ctla4(例如人和/或食蟹猴ctla4)(ctla4-fc融合蛋白)，例如kd为约1nm(例如，1.2nm)；•结合细胞(例如表达ctla4的cho细胞)的表面上的ctla4；•阻断cd80或cd86与ctla4(例如，cho细胞上表达的ctla4)的结合；•不结合btla、cd8、pd1、lag3和/或cd28；•在体外和/或体内结合人、恒河猴和小鼠血清白蛋白(当与一个或多个alb11002结合剂融合时)；•抑制(例如，胰腺肿瘤，例如携带人免疫细胞的小鼠中的人胰腺肿瘤的)肿瘤生长。表b列出了可存在于本发明的ctla4结合剂(例如isvd，诸如纳米抗体)中的(seqidno:1的)位置11、89、110和112处的氨基酸残基的一些非限制性的可能组合。表b：seqidno:1的ctla4结合剂变体中氨基酸位置11、89、110和112处的突变的可能组合本发明提供的ctla4结合剂(例如isvd，诸如纳米抗体)进一步如本文的说明书、实施例和附图中所述，即其具有如本文所述的cdr且与如本文所公开的seqidno:1的序列具有整体序列同一性程度(如本文所定义)和/或可以与这些参考序列(之一)具有有限数目的“氨基酸差异”(如本文所述)。本发明的ctla4结合剂(例如isvd，诸如纳米抗体)优选包含以下cdr(根据kabat惯例)：-cdr1(根据kabat)，其包含氨基酸序列fygmg(seqidno:2)；和-cdr2(根据kabat)，其包含氨基酸序列dirtsagrtyyadsvkg(seqidno:3)；和-cdr3(根据kabat)，其包含氨基酸序列epsgisgwdy(seqidno:4)；任选地，其中cdr1、cdr2和/或cdr3包含1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个取代，例如保守性取代。或者，当根据abm惯例给出cdr时，本发明的ctla4结合剂(例如isvd，诸如纳米抗体)优选包含以下cdr：-cdr1(根据abm)，其为氨基酸序列ggtfsfygmg(seqidno:5)；和-cdr2(根据abm)，其为氨基酸序列dirtsagrty(seqidno:6)；和-cdr3(根据abm)，其为氨基酸序列epsgisgwdy(seqidno:7，其与seqidno:4相同)；任选地，其中cdr1、cdr2和/或cdr3包含1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个取代，例如保守性取代。在本发明的一个实施方案中，本发明的ctla4结合剂(例如isvd，诸如纳米抗体)具有此类cdr和位置1、11、14、45、74、83、89、96、108、110和/或112处的突变，如本文所讨论，且任选地：-当通过blast算法进行比较时，与seqidno:1的氨基酸序列的至少85%、优选至少90%、更优选至少95%的序列同一性程度(其中对于测定序列同一性程度，不考虑cdr、任何可以存在的c端延伸以及涉及的特定方面所需的在位置1、11、14、45、74、83、89、96、108、110和/或112处的突变)，其中选择所述算法的参数以产生在各个参考序列的整个长度上在各个序列之间的最大匹配(例如，预期阈值：10；字长：3；在查询范围内的最大匹配：0；blosum62矩阵；间隙成本：存在11，延伸1；条件性组成评分矩阵调节)；和/或-不超过7个，诸如不超过5个，优选不超过3个，诸如仅3、2或1个与seqidno:1的氨基酸序列的“氨基酸差异”(其中所述氨基酸差异，如果存在，可以存在于骨架和/或cdr中，但优选仅存在于骨架中且不存在于cdr中；不考虑任何可以存在的c端延伸且不考虑涉及的特定方面所需的在位置1、11、14、45、74、83、89、96、108、110和/或112处的突变)。以下参考文献涉及通常用于序列分析的blast算法：blastalgorithms:altschul等人(2005)febsj.272(20):5101-5109;altschul,s.f.,等人,(1990)j.mol.biol.215:403-410;gish,w.,等人,(1993)naturegenet.3:266-272;madden,t.l.,等人,(1996)meth.enzymol.266:131-141;altschul,s.f.,等人,(1997)nucleicacidsres.25:3389-3402;zhang,j.,等人,(1997)genomeres.7:649-656;wootton,j.c.,等人,(1993)comput.chem.17:149-163;hancock,j.m.等人,(1994)comput.appl.biosci.10:67-70;alignmentscoringsystems:dayhoff,m.o.,等人,"amodelofevolutionarychangeinproteins."inatlasofproteinsequenceandstructure,(1978)vol.5,suppl.3.m.o.dayhoff(编辑),pp.345-352,natl.biomed.res.found.,washington,dc;schwartz,r.m.,等人,"matricesfordetectingdistantrelationships."inatlasofproteinsequenceandstructure,(1978)vol.5,suppl.3."m.o.dayhoff(编辑),pp.353-358,natl.biomed.res.found.,washington,dc;altschul,s.f.,(1991)j.mol.biol.219:555-565;states,d.j.,等人,(1991)methods3:66-70;henikoff,s.,等人,(1992)proc.natl.acad.sci.usa89:10915-10919;altschul,s.f.,等人,(1993)j.mol.evol.36:290-300;alignmentstatistics:karlin,s.,等人,(1990)proc.natl.acad.sci.usa87:2264-2268;karlin,s.,等人,(1993)proc.natl.acad.sci.usa90:5873-5877;dembo,a.,等人,(1994)ann.prob.22:2022-2039;和altschul,s.f."evaluatingthestatisticalsignificanceofmultipledistinctlocalalignments."intheoreticalandcomputationalmethodsingenomeresearch(s.suhai,编辑),(1997)pp.1-14,plenum,newyork。关于由本发明提供的本发明的ctla4结合剂(例如isvd，诸如纳米抗体)的各个方面和优选方面，就相对于seqidno:1的序列同一性程度和/或可以存在于本发明的此类结合剂中(即与seqidno:1的序列相比)的“氨基酸差异”的数目和种类而论，应注意，当据称(i)当通过blast算法进行比较时，本发明的氨基酸序列与seqidno:1的氨基酸序列具有至少85%、优选至少90%、更优选至少95%的序列同一性程度(其中对于测定序列同一性程度，不考虑cdr、任何可以存在的c端延伸以及涉及的特定方面所需的在位置1、11、14、45、74、83、89、96、108、110和/或112处的突变)，其中选择所述算法的参数以产生在各个参考序列的整个长度上在各个序列之间的最大匹配(例如，预期阈值：10；字长：3；在查询范围内的最大匹配：0；blosum62矩阵；间隙成本：存在11，延伸1；条件性组成评分矩阵调节)时；和/或当据称：(ii)本发明的氨基酸序列与seqidno:1的序列具有不超过7个，优选不超过5个，诸如仅3、2或1个“氨基酸差异”(再次，不考虑任何可以存在的c端延伸且不考虑涉及的特定方面所需的在位置1、11、14、45、74、83、89、96、108、110和/或112处的突变)时，则这还包括，除了涉及的特定方面所需的在位置1、11、14、45、74、83、89、96、108、110和/或112处的突变和任何可以存在的c端延伸以外，与seqidno:1的序列不具有氨基酸差异的序列。因此，在本发明的一个特定方面，本发明的ctla4结合剂(例如isvd，诸如纳米抗体)包含seqidno:1的氨基酸序列，但其中至少1个在位置1、11、14、45、74、83、89、96、108、110和/或112处的氨基酸突变被取代(例如保守取代)，且可以与seqidno:1具有100%序列同一性(包括cdr，但不考虑在本文公开的位置1、11、14、45、74、83、89、96、108、110和/或112处的突变或突变组合和/或任何可以存在的c端延伸)和/或可以不具有与seqidno:1的氨基酸差异(即除了在本文公开的位置1、11、14、45、74、83、89、96、108、110和/或112处的突变或突变组合和任何可以存在的c端延伸以外)。当存在任何氨基酸差异(即除了任何c端延伸和涉及的本发明的特定方面所需的在位置1、11、14、45、74、83、89、96、108、110和/或112处的突变以外)时，这些氨基酸差异可以存在于cdr和/或骨架区中，但其优选仅存在于骨架区中(如由abm惯例所定义，即不在如根据abm惯例所定义的cdr中)，即，使得本发明的ctla4结合剂(例如isvd，诸如纳米抗体)具有与seqidno:1或60中存在的相同的cdr(根据abm惯例定义)。此外，当根据本发明的任何方面的本发明的ctla4结合剂(例如isvd，诸如纳米抗体)与seqidno:1的序列具有一个或多个氨基酸差异(除了涉及的特定方面所需的在位置1、11、14、45、74、83、89、96、108、110和/或112处的突变以外)时，则可以存在的此类突变/氨基酸差异(即与seqidno:1的序列相比)的一些特定、但非限制性实例为例如e1d、p41a、p41l、p41s或p41t(且特别是p41a)和/或t87a(例如，e1d(任选的)、l11v、a14p、q45r、a74s、k83r、v89l、m96p和q108l)。突变的其它实例是一种或多种合适的“人源化”取代，诸如q108l(的合适组合)；参考例如wo2009/138519(或在wo2009/138519中引用的现有技术中)和wo2008/020079(或在wo2008/020079中引用的现有技术中)，以及来自wo2008/020079的表a-3至a-8(其为显示可能人源化取代的列表)。优选地，本发明的ctla4结合剂至少含有q108l人源化取代。此外，当本发明的ctla4结合剂(例如isvd，诸如纳米抗体)存在于和/或形成其所存在的ctla4结合剂的n端部分时，则其优选在位置1含有d(即与参考a相比的e1d突变)。此类n端ctla4结合剂的一些优选、但非限制性实例作为seqidno:24和25和60给出。因此，在一个进一步方面，本发明涉及在其n端末端具有本发明的ctla4结合剂(其如本文进一步描述)的本发明的多肽(其如本文进一步描述)，其中所述本发明的ctla4结合剂在位置1具有d，且优选选自seqidno:24和25和60的ctla4结合剂。类似地，当本发明的ctla4结合剂(例如isvd，诸如纳米抗体)以单价形式使用时，其优选具有如本文所述的c端延伸x(n)和在位置1的d。此类单价ctla4结合剂的一些优选但非限制性实例作为seqidno:42和43给出。因此，在进一步的方面，本发明涉及本发明的具有在位置1的d和c端延伸x(n)(其优选为单一ala残基)的单价ctla4结合剂(其如本文进一步描述)。在一个特定方面，所述单价ctla4结合剂选自seqidno:42或43。借助于优选、但非限制性实例，seqidno:22-25和40-42和60是具有与seqidno:1的另外的氨基酸差异(即，a14p、q45r、a74s、k83r和/或q108)的ctla4结合剂(例如isvd，诸如纳米抗体)的实例(此外，如先前段落中所示，seqidno:24、25、42和43还具有e1d突变)。因此，在一个特定方面，本发明涉及本发明的ctla4结合剂(即具有如本文所述的在位置11、89、110和/或112处的突变以及进一步如本文所述)，其至少具有任选的e1d突变、a14p突变、q45r突变、a74s突变、k83r突变和q108l突变的合适的组合，且优选q108l与其它a14p、q45r、a74s和k83r突变中的任一个的合适的组合，且优选与这些其他突变中的任何两个组合，更优选与这些突变中的任何三个(诸如与组合a14p、a74s和k83r或e1d、l11v、a14p、q45r、a74s、k83r、v89l、m96p和q108l)，诸如与所有这些突变的合适的组合(并且再次，当ctla4结合剂是单价或存在于本发明的ctla4结合剂的n端末端时，优选地，还具有e1d突变)。ctla4结合剂(例如isvd，诸如纳米抗体)，当其以单价形式使用时和/或当ctla4结合部分存在于和/或形成ctla4结合剂的c端末端时(或当它们另外在此类多肽中具有“暴露的”c端末端时，其总体意味着isvd的c端末端不与恒定结构域(诸如ch1结构域)结合或连接)；再次参考wo2012/175741和pct/ep2015/060643(wo2015/173325))，优选还具有式(x)n的c端延伸，其中n是1至10，优选1至5，诸如1、2、3、4或5(且优选1或2，诸如1)；且各x是(优选天然存在的)氨基酸残基，其独立地选自天然存在的氨基酸残基(尽管根据一个优选方面，其不包含任何半胱氨酸残基)，且优选独立地选自丙氨酸(a)、甘氨酸(g)、缬氨酸(v)、亮氨酸(l)或异亮氨酸(i)。根据此类c端延伸x(n)的一些优选、但非限制性实例，x和n可以如下：(a)n=1且x=ala；(b)n=2且各x=ala；(c)n=3且各x=ala；(d)n=2且至少一个x=ala(其中剩余氨基酸残基x独立地选自任何天然存在的氨基酸，但优选独立地选自val、leu和/或ile)；(e)n=3且至少一个x=ala(其中剩余氨基酸残基x独立地选自任何天然存在的氨基酸，但优选独立地选自val、leu和/或ile)；(f)n=3且至少两个x=ala(其中剩余氨基酸残基x独立地选自任何天然存在的氨基酸，但优选独立地选自val、leu和/或ile)；(g)n=1且x=gly；(h)n=2且各x=gly；(i)n=3且各x=gly；(j)n=2且至少一个x=gly(其中剩余氨基酸残基x独立地选自任何天然存在的氨基酸，但优选独立地选自val、leu和/或ile)；(k)n=3且至少一个x=gly(其中剩余氨基酸残基x独立地选自任何天然存在的氨基酸，但优选独立地选自val、leu和/或ile)；(l)n=3且至少两个x=gly(其中剩余氨基酸残基x独立地选自任何天然存在的氨基酸，但优选独立地选自val、leu和/或ile)；(m)n=2且各x=ala或gly；(n)n=3且各x=ala或gly；(o)n=3且至少一个x=ala或gly(其中剩余氨基酸残基x独立地选自任何天然存在的氨基酸，但优选独立地选自val、leu和/或ile)；或(p)n=3且至少两个x=ala或gly(其中剩余氨基酸残基x独立地选自任何天然存在的氨基酸，但优选独立地选自val、leu和/或ile)；其中特别优选方面(a)、(b)、(c)、(g)、(h)、(i)、(m)和(n)，优选其中n=1或2的方面且特别优选其中n=1的方面。还应注意，优选地，本发明的ctla4结合剂(例如isvd，诸如纳米抗体)中存在的任何c端延伸不含有(游离)半胱氨酸残基(除非所述半胱氨酸残基用于或意欲用于进一步官能化，例如用于peg化)。可用的c端延伸的一些特定、但非限制性实例是以下氨基酸序列：a、aa、aaa、g、gg、ggg、ag、ga、aag、agg、aga、gga、gaa或gag。当本发明的ctla4结合剂(例如isvd，诸如纳米抗体)含有在位置110或112处的突变(任选地与如本文所述的在位置1、11、14、45、74、83、89、96和/或108处的突变组合)(相对于seqidno:1的氨基酸序列)时，在本发明的一个实施方案中，骨架4的c端氨基酸残基(从位置109开始)可以如seqidno:1中所述，但其中5个c端残基可以如下取代：(i)如果不存在c端延伸：vtvks(seqidno:45)、vtvqs(seqidno:46)、vkvss(seqidno:47)或vqvss(seqidno:48)；或(ii)如果存在c端延伸：vtvksx(n)(seqidno:49)、vtvqsx(n)(seqidno:50)、vkvssx(n)(seqidno:51)或vqvssx(n)(seqidno:52)，诸如vtvksa(seqidno:53)、vtvqsa(seqidno:54)、vkvssa(seqidno:55)或vqvssa(seqidno:56)。当本发明的ctla4结合剂(例如isvd，诸如纳米抗体)不含在位置110或112处的突变(但仅如本文所述的在位置1、11、14、45、74、83、89、96和/或108处的突变)时，在本发明的一个实施方案中，骨架4的c端氨基酸残基(从位置109开始)可以如seqidno:1中所述，但其中5个c端残基可以如下取代：(i)当不存在c端延伸时：vtvss(seqidno:57)(如seqidno:1的序列中)；或(ii)当存在c端延伸时：vtvssx(n)(seqidno:58)，诸如vtvssa(seqidno:59)。在这些c端序列中，x和n如本文关于c端延伸所定义。本发明的ctla4结合剂(例如isvd，诸如纳米抗体)的一些优选、但非限制性实例以seqidno:9-43和60给出，且这些序列各自形成本发明的另一个方面(包含这些序列之一的蛋白、ctla4结合剂、多肽或其他化合物或构建体也如此)。在这些中，seqidno:9-25和60的ctla4结合剂不具有c端延伸，且seqidno:26-43的ctla4结合剂含有c端丙氨酸(其为如本文所述的c端延伸的优选、但非限制性实例)。本发明的ctla4结合剂(例如isvd，诸如纳米抗体)的实例包含seqidno:22、23、24、25、40、41、42、43和60的氨基酸序列。因此，在第一个方面，本发明涉及ctla4结合剂(例如免疫球蛋白单一可变结构域，诸如纳米抗体)，其具有：-cdr1(根据kabat)，其为氨基酸序列fygmg(seqidno:2)；和-cdr2(根据kabat)，其为氨基酸序列dirtsagrtyyadsvkg(seqidno:3)；和-cdr3(根据kabat)，其为氨基酸序列epsgisgwdy(seqidno:4)；且具有：-当通过blast算法进行比较时，与seqidno:1的氨基酸序列的至少85%、优选至少90%、更优选至少95%的序列同一性程度(其中对于测定序列同一性程度，不考虑cdr、任何可以存在的c端延伸以及涉及的特定方面所需的在位置1、11、14、45、74、83、89、96、108、110和/或112处的突变)，其中选择所述算法的参数以产生在各个参考序列的整个长度上在各个序列之间的最大匹配(例如，预期阈值：10；字长：3；在查询范围内的最大匹配：0；blosum62矩阵；间隙成本：存在11，延伸1；条件性组成评分矩阵调节)；和/或；和/或-不超过7个，诸如不超过5个，优选不超过3个，诸如仅3、2或1个与seqidno:1的氨基酸序列的“氨基酸差异”(如本文所定义，且不考虑以上列出的可以存在的在位置1、11、14、45、74、83、89、96、108、110和/或112处的突变中的任一个且不考虑任何可以存在的c端延伸)(其中所述氨基酸差异，如果存在，可以存在于骨架和/或cdr中，但优选仅存在于骨架中且不存在于cdr中)；且任选地具有：c端延伸(x)n，其中n是1至10，优选1至5，诸如1、2、3、4或5(且优选1或2，诸如1)；且各x是独立地选择的(优选天然存在的)氨基酸残基，且优选独立地选自丙氨酸(a)、甘氨酸(g)、缬氨酸(v)、亮氨酸(l)或异亮氨酸(i)；其中，在所述ctla4结合剂的氨基酸序列中：-位置1处的氨基酸残基优选选自e或d；-位置11处的氨基酸残基优选选自l或v；-位置14处的氨基酸残基优选选自a或p；-位置45处的氨基酸残基优选选自q或r；-位置74处的氨基酸残基优选选自a或s；-位置83处的氨基酸残基优选选自k或r；-位置89处的氨基酸残基优选合适地选自t、v或l；-位置96处的氨基酸残基优选选自m或p；-位置108处的氨基酸残基优选选自q或l；-位置110处的氨基酸残基优选合适地选自t、k或q；和/或-位置112处的氨基酸残基优选合适地选自s、k或q；使得，例如，以下中的一种或多种是真实的：(i)位置1是e或d；(ii)位置11是v；(iii)位置14是p；(iv)位置45是r；(v)位置74是s；(vi)位置83是r；(vii)位置89是t或l；(viii)位置96是p；(ix)位置108是l；和/或例如，其中所述ctla4结合剂包含以下突变集合中的一种或多种：a.位置11是v且位置110是k或q；b.位置11是v且位置112是k或q.c.位置89是l且位置11是v；d.位置89是l且位置110是k或q；e.位置89是l且位置112是k或q；f.位置89是l且位置11是v且位置110是k或q；g.位置89是l且位置11是v且位置112是k或q；h.位置1是e或d；位置11是v；位置14是p；位置45是r；位置74是s；位置83是r；位置89是l；位置96是p；且位置108是l；i.位置1是e或d；位置11是v；位置14是p；位置45是r；位置74是s；位置83是r；位置89是l；位置96是p；位置108是l；且位置110是k或q；j.位置1是e或d；位置11是v；位置14是p；位置45是r；位置74是s；位置83是r；位置89是l；位置96是p；位置108是l；且位置112是k或q；k.位置1是e或d；位置11是v；位置14是p；位置45是r；位置74是s；位置83是r；位置89是l；位置96是p；且位置108是l。在一个进一步方面，本发明涉及ctla4结合剂(例如免疫球蛋白单一可变结构域，诸如纳米抗体)，其具有：-cdr1(根据kabat)，其为氨基酸序列fygmg(seqidno:2)；和-cdr2(根据kabat)，其为氨基酸序列dirtsagrtyyadsvkg(seqidno:3)；和-cdr3(根据kabat)，其为氨基酸序列epsgisgwdy(seqidno:4)；且具有：-当通过blast算法进行比较时，与seqidno:1的氨基酸序列的至少85%、优选至少90%、更优选至少95%的序列同一性程度(其中对于测定序列同一性程度，不考虑cdr、任何可以存在的c端延伸以及涉及的特定方面所需的在位置1、11、14、45、74、83、89、96、108、110和/或112处的突变)，其中选择所述算法的参数以产生在各个参考序列的整个长度上在各个序列之间的最大匹配(例如，预期阈值：10；字长：3；在查询范围内的最大匹配：0；blosum62矩阵；间隙成本：存在11，延伸1；条件性组成评分矩阵调节)；和/或-不超过7个，诸如不超过5个，优选不超过3个，诸如仅3、2或1个与seqidno:1的氨基酸序列的“氨基酸差异”(如本文所定义，且不考虑以上列出的可以存在的在位置1、11、14、45、74、83、89、96、108、110和/或112处的突变中的任一个且不考虑任何可以存在的c端延伸)(其中所述氨基酸差异，如果存在，可以存在于骨架和/或cdr中，但优选仅存在于骨架中且不存在于cdr中)；且任选地具有：-c端延伸(x)n，其中n是1至10，优选1至5，诸如1、2、3、4或5(且优选1或2，诸如1)；且各x是独立地选择的(优选天然存在的)氨基酸残基，且优选独立地选自丙氨酸(a)、甘氨酸(g)、缬氨酸(v)、亮氨酸(l)或异亮氨酸(i)；所述ctla4结合剂(例如免疫球蛋白单一可变结构域，诸如纳米抗体)在所提及的位置(根据kabat的编号)处包含以下氨基酸残基中的一个或多个(即与seqidno:1的氨基酸序列相比的突变)：-1d或1e；-11v；-14p；-45r；-74s；-83r；-89t或89l；-96p；或-108l；例如，其中所述ctla4结合剂包含以下突变集合中的一种或多种：-1d或1e与11v；14p；45r；74s；83r；89l；96p；和108l的组合；-11v与110k或110q的组合；-11v与112k或112q的组合；-89l与11v的组合；-89l与110k或110q的组合；-89l与112k或112q的组合；-1d或1e与11v；14p；45r；74s；83r；89l；96p；108l和110k或110q的组合；-1d或1e与11v；14p；45r；74s；83r；89l；96p；108l和112k或112q的组合；-89l与11v和110k或110q的组合；或-89l与11v和112k或112q的组合。如所提及，当本发明的ctla4结合剂(例如isvd，诸如纳米抗体)以单价形式使用时和/或当ctla4结合部分存在于本发明的ctla4结合剂(如本文所定义)的c端末端时，ctla4结合剂优选具有c端延伸x(n)，所述c端延伸可以如本文关于本发明的ctla4结合剂所述和/或如wo2012/175741或pct/ep2015/060643(wo2015/173325)中所述。本发明的ctla4结合剂(例如isvd，诸如纳米抗体)的一些优选、但非限制性实例以seqidno:8-43或60给出，且这些氨基酸序列各自个别形成本发明的一个进一步方面。如所提及，在本发明中，特别优选这样的氨基酸序列：其中位置89是t；或其中位置1是e或d，位置11是v，位置14是p，位置45是r，位置74是s，位置83是r，位置89是l，位置96是p且位置108是l；或其中位置11是v且位置89是l(任选地与110k或110q突变和/或112k或112q突变合适的组合，且特别是与110k或110q突变组合)。甚至更优选这样的氨基酸序列，其中位置11是v且位置89是l，任选地具有110k或110q突变。因此，在一个优选方面，本发明涉及ctla4结合剂(例如免疫球蛋白单一可变结构域，诸如纳米抗体)，其具有：-cdr1(根据kabat)，其为氨基酸序列fygmg(seqidno:2)；和-cdr2(根据kabat)，其为氨基酸序列dirtsagrtyyadsvkg(seqidno:3)；和-cdr3(根据kabat)，其为氨基酸序列epsgisgwdy(seqidno:4)；且具有：-当通过blast算法进行比较时，与seqidno:1的氨基酸序列的至少85%、优选至少90%、更优选至少95%的序列同一性程度(其中对于测定序列同一性程度，不考虑cdr、任何可以存在的c端延伸以及涉及的特定方面所需的在位置1、11、14、45、74、83、89、96、108、110和/或112处的突变)，其中选择所述算法的参数以产生在各个参考序列的整个长度上在各个序列之间的最大匹配(例如，预期阈值：10；字长：3；在查询范围内的最大匹配：0；blosum62矩阵；间隙成本：存在11，延伸1；条件性组成评分矩阵调节)；和/或；和/或-不超过7个，诸如不超过5个，优选不超过3个，诸如仅3、2或1个与seqidno:1的氨基酸序列的“氨基酸差异”(如本文所定义，且不考虑以上列出的可以存在的在位置1、11、14、45、74、83、89、96、108、110和/或112处的突变中的任一个且不考虑任何可以存在的c端延伸)(其中所述氨基酸差异，如果存在，可以存在于骨架和/或cdr中，但优选仅存在于骨架中且不存在于cdr中)；且任选地具有：-c端延伸(x)n，其中n是1至10，优选1至5，诸如1、2、3、4或5(且优选1或2，诸如1)；且各x是独立地选择的(优选天然存在的)氨基酸残基，且优选独立地选自丙氨酸(a)、甘氨酸(g)、缬氨酸(v)、亮氨酸(l)或异亮氨酸(i)；其中，在所述ctla4结合剂的氨基酸序列中：-位置1处的氨基酸残基优选选自e或d；-位置11处的氨基酸残基优选选自l或v；-位置14处的氨基酸残基优选选自a或p；-位置45处的氨基酸残基优选选自q或r；-位置74处的氨基酸残基优选选自a或s；-位置83处的氨基酸残基优选选自k或r；-位置89处的氨基酸残基优选选自t、l或v；-位置96处的氨基酸残基优选选自m或p；-位置108处的氨基酸残基优选选自l或q；-位置110处的氨基酸残基优选合适地选自t、k或q(且优选为t)；和/或-位置112处的氨基酸残基优选合适地选自s、k或q(且优选为s)。在另一个优选方面，本发明涉及ctla4结合剂(例如免疫球蛋白单一可变结构域，诸如纳米抗体)，其具有：-cdr1(根据kabat)，其为氨基酸序列fygmg(seqidno:2)；和-cdr2(根据kabat)，其为氨基酸序列dirtsagrtyyadsvkg(seqidno:3)；和-cdr3(根据kabat)，其为氨基酸序列epsgisgwdy(seqidno:4)；且具有：-当通过blast算法进行比较时，与seqidno:1的氨基酸序列的至少85%、优选至少90%、更优选至少95%的序列同一性程度(其中对于测定序列同一性程度，不考虑cdr、任何可以存在的c端延伸以及涉及的特定方面所需的在位置1、11、14、45、74、83、89、96、108、110和/或112处的突变)，其中选择所述算法的参数以产生在各个参考序列的整个长度上在各个序列之间的最大匹配(例如，预期阈值：10；字长：3；在查询范围内的最大匹配：0；blosum62矩阵；间隙成本：存在11，延伸1；条件性组成评分矩阵调节)；和/或-不超过7个，诸如不超过5个，优选不超过3个，诸如仅3、2或1个与seqidno:1的氨基酸序列的“氨基酸差异”(如本文所定义，且不考虑以上列出的可以存在的在位置1、11、14、45、74、83、89、96、108、110和/或112处的突变中的任一个且不考虑任何可以存在的c端延伸)(其中所述氨基酸差异，如果存在，可以存在于骨架和/或cdr中，但优选仅存在于骨架中且不存在于cdr中)；且任选地具有：-c端延伸(x)n，其中n是1至10，优选1至5，诸如1、2、3、4或5(且优选1或2，诸如1)；且各x是独立地选择的(优选天然存在的)氨基酸残基，且优选独立地选自丙氨酸(a)、甘氨酸(g)、缬氨酸(v)、亮氨酸(l)或异亮氨酸(i)；其中，例如，ctla4结合剂包含一种或多种根据以下的突变：-位置1处的氨基酸残基是e或d；-位置11处的氨基酸残基是v；-位置14处的氨基酸残基是p；-位置45处的氨基酸残基是r；-位置74处的氨基酸残基是s；-位置83处的氨基酸残基是r；-位置89处的氨基酸残基是l；-位置96处的氨基酸残基是p；-位置108处的氨基酸残基是l；-位置110处的氨基酸残基优选选自t、k或q；或-位置112处的氨基酸残基优选选自s、k或q。在一个特定、但非限制性方面，本发明的ctla4结合剂(例如isvd，诸如纳米抗体)在所提及的位置(根据kabat的编号)处包含以下突变(即与seqidno:1的序列相比的突变)集合中的一种或多种：-11v与89l的组合；-11v与110k或110q的组合；-11v与112k或112q的组合；-11v与89l和110k或110q的组合；-11v与89l和112k或112q的组合；-11v与1d或1e、14p、45r、74s、83r、89l、96p、108l和110k或110q的组合；-11v与1d或1e、14p、45r、74s、83r、89l、96p、108l和112k或112q的组合；或-11v与1d或1e、14p、45r、74s、83r、89l、96p和108l的组合，且具有表a的ctla4结合剂中，例如seqidno:1或seqidno:60中的cdr(例如根据kabat)且具有与如本文所述的seqidno:1的氨基酸序列的整体序列同一性程度。在另一个特定、但非限制性方面，本发明的ctla4结合剂(例如isvd，诸如纳米抗体)在所提及的位置(根据kabat的编号)处包含以下突变(即与seqidno:1的序列相比的突变)集合中的一种或多种：-89l与11v的组合；-89l与110k或110q的组合；-89l与112k或112q的组合；-89l与11v和110k或110q的组合；-89l与11v和112k或112q的组合；-89l与1d或1e、11v、14p、45r、74s、83r、96p和108l的组合；-89l与1d或1e、11v、14p、45r、74s、83r、96p、108l和110k或110q的组合；或-89l与1d或1e、11v、14p、45r、74s、83r、96p、108l和112k或112q的组合，且具有表a的ctla4结合剂中，例如seqidno:1或seqidno:60中的cdr(例如根据kabat)且具有与如本文所述的seqidno:1的氨基酸序列的整体序列同一性程度。在另一个特定、但非限制性方面，本发明的ctla4结合剂(例如isvd，诸如纳米抗体)在所提及的位置(根据kabat的编号)处包含以下氨基酸突变(即与seqidno:1的序列相比的突变)集合中的一种或多种：-110k或110q与11v的组合；-110k或110q与89l的组合；-110k或110q与11v和89l的组合；-110k或110q与1d或1e、11v、14p、45r、74s、83r、89l、96p和108l的组合，且具有表a的ctla4结合剂中，例如seqidno:1或seqidno:60中的cdr(例如根据kabat)且具有与如本文所述的seqidno:1的氨基酸序列的整体序列同一性程度。在另一个特定、但非限制性方面，本发明的ctla4结合剂(例如isvd，诸如纳米抗体)在所提及的位置(根据kabat的编号)处包含以下突变(即与seqidno:1的序列相比的突变)集合中的一种或多种：-112k或112q与11v的组合；-112k或112q与89l的组合；或-112k或112q与11v和89l的组合；或-112k或112q与1d或1e、11v、14p、45r、74s、83r、89l、96p和108l的组合，且具有表a的ctla4结合剂中，例如seqidno:1或seqidno:60中的cdr(例如根据kabat)且具有与如本文所述的seqidno:1的氨基酸序列的整体序列同一性程度。在另一个方面，本发明的ctla4结合剂(例如isvd，诸如纳米抗体)在位置89处包含t且具有cdr诸如seqidno:60中所述的那些(例如根据kabat)且具有与如本文所述的seqidno:1的氨基酸序列的整体序列同一性程度。在另一个方面，本发明的ctla4结合剂(例如isvd，诸如纳米抗体)包含位置11处的v和位置89处的t且具有cdr诸如seqidno:1或60中所述的那些(例如根据kabat)且具有与如本文所述的seqidno:1的氨基酸序列的整体序列同一性程度。如所提及，根据上述方面的本发明的ctla4结合剂(例如isvd，诸如纳米抗体)优选进一步含有e1d突变、l11v突变、a14p突变、q45r突变、a74s突变、k83r突变、v89l突变、m96p突变和q108l突变的合适的组合，并且在本发明的一个实施方案中，q108l与其它a14p、q45r、a74s和k83r突变中的任一个的合适的组合，并且在本发明的一个实施方案中，与这些其它突变中的任两个组合，更优选与这些突变中的任三个(诸如与组合a14p、a74s和k83r)，诸如与这些突变中的所有四个组合(并且再次，当ctla4结合剂是单价或存在于本发明的ctla4结合剂的n端末端时，优选地，还具有e1d突变)。在另一个方面，本发明涉及ctla4结合剂(例如免疫球蛋白单一可变结构域，诸如纳米抗体)，其具有：-cdr1(根据abm)，其为氨基酸序列ggtfsfygmg(seqidno:5)；和-cdr2(根据abm)，其为氨基酸序列dirtsagrty(seqidno:6)；和-cdr3(根据abm)，其为氨基酸序列epsgisgwdy(seqidno:4)；且具有：-当通过blast算法进行比较时，与seqidno:1的氨基酸序列的至少85%、优选至少90%、更优选至少95%的序列同一性程度(其中对于测定序列同一性程度，不考虑cdr、任何可以存在的c端延伸以及涉及的特定方面所需的在位置1、11、14、45、74、83、89、96、108、110和/或112处的突变)，其中选择所述算法的参数以产生在各个参考序列的整个长度上在各个序列之间的最大匹配(例如，预期阈值：10；字长：3；在查询范围内的最大匹配：0；blosum62矩阵；间隙成本：存在11，延伸1；条件性组成评分矩阵调节)；和/或-不超过7个，诸如不超过5个，优选不超过3个，诸如仅3、2或1个与seqidno:1的氨基酸序列的“氨基酸差异”(如本文所定义，且不考虑以上列出的可以存在的在位置1、11、14、45、74、83、89、96、108、110和/或112处的突变中的任一个且不考虑任何可以存在的c端延伸)(其中所述氨基酸差异，如果存在，可以存在于骨架和/或cdr中，但优选仅存在于骨架中且不存在于cdr中)；且任选地具有：-c端延伸(x)n，其中n是1至10，优选1至5，诸如1、2、3、4或5(且优选1或2，诸如1)；且各x是独立地选择的(优选天然存在的)氨基酸残基，且优选独立地选自丙氨酸(a)、甘氨酸(g)、缬氨酸(v)、亮氨酸(l)或异亮氨酸(i)；其包含这样的氨基酸序列，其中：-位置1处的氨基酸残基是e或d；-位置11处的氨基酸残基是l或v；-位置14处的氨基酸残基是p；-位置45处的氨基酸残基是r；-位置74处的氨基酸残基是s；-位置83处的氨基酸残基是r；-位置89处的氨基酸残基优选选自t、v或l；-位置96处的氨基酸残基是p；-位置108处的氨基酸残基是l；-位置110处的氨基酸残基优选选自t、k或q；且-位置112处的氨基酸残基优选选自s、k或q；例如，使得，以下中的一种或多种是真实的：(i)位置1是d或e；(ii)位置11是v；(iii)位置14是p；(iv)位置45是r；(v)位置74是s；(vi)位置83是r；(vii)位置89是l或t；(viii)位置96是p；或(ix)位置108是l；例如，其中所述ctla4结合剂包含以下突变集合中的一种或多种：a.位置11是v且位置110是k或q；b.位置11是v且位置112是k或q；c.位置89是l且位置11是v；d.位置89是l且位置110是k或q；e.位置89是l且位置112是k或q；f.位置89是l且位置11是v且位置110是k或q；或g.位置89是l且位置11是v且位置112是k或q。在一个进一步方面，本发明涉及ctla4结合剂(例如免疫球蛋白单一可变结构域，诸如纳米抗体)，其具有：-cdr1(根据abm)，其为氨基酸序列ggtfsfygmg(seqidno:5)；和-cdr2(根据abm)，其为氨基酸序列dirtsagrty(seqidno:6)；和-cdr3(根据abm)，其为氨基酸序列epsgisgwdy(seqidno:4)；且具有：-当通过blast算法进行比较时，与seqidno:1的氨基酸序列的至少85%、优选至少90%、更优选至少95%的序列同一性程度(其中对于测定序列同一性程度，不考虑cdr、任何可以存在的c端延伸以及涉及的特定方面所需的在位置1、11、14、45、74、83、89、96、108、110和/或112处的突变)，其中选择所述算法的参数以产生在各个参考序列的整个长度上在各个序列之间的最大匹配(例如，预期阈值：10；字长：3；在查询范围内的最大匹配：0；blosum62矩阵；间隙成本：存在11，延伸1；条件性组成评分矩阵调节)；和/或-不超过7个，诸如不超过5个，优选不超过3个，诸如仅3、2或1个与seqidno:1的氨基酸序列的“氨基酸差异”(如本文所定义，且不考虑以上列出的可以存在的在位置1、11、14、45、74、83、89、96、108、110和/或112处的突变中的任一个且不考虑任何可以存在的c端延伸)(其中所述氨基酸差异，如果存在，可以存在于骨架和/或cdr中，但优选仅存在于骨架中且不存在于cdr中)；且任选地具有：-c端延伸(x)n，其中n是1至10，优选1至5，诸如1、2、3、4或5(且优选1或2，诸如1)；且各x是独立地选择的(优选天然存在的)氨基酸残基，且优选独立地选自丙氨酸(a)、甘氨酸(g)、缬氨酸(v)、亮氨酸(l)或异亮氨酸(i)；所述ctla4结合剂(例如免疫球蛋白单一可变结构域，诸如纳米抗体)在所提及的位置(根据kabat的编号)处包含以下氨基酸残基中的一个或多个(即与seqidno:1的氨基酸序列相比的突变)：-1d或1e；-11v；-14p；-45r；-74s；-83r；-89l或89t；-96p；或-108l；例如，其中所述ctla4结合剂包含以下突变集合中的一种或多种：-11v与110k或110q的组合；-11v与112k或112q的组合；-89l与11v的组合；-89l与110k或110q的组合；-89l与112k或112q的组合；-89l与11v和110k或110q的组合；或-89l与11v和112k或112q的组合。如所提及，当本发明的ctla4结合剂(例如isvd，诸如纳米抗体)以单价形式使用时和/或其中ctla4结合部分存在于本发明的ctla4结合剂(如本文所定义)的c端末端时，ctla4结合剂优选具有c端延伸x(n)，所述c端延伸可以如本文关于本发明的ctla4结合剂所述和/或如wo2012/175741或pct/ep2015/060643(wo2015/173325)中所述。本发明的ctla4结合剂(例如isvd，诸如纳米抗体)的一些优选、但非限制性实例以seqidno:8-43和60给出，且这些氨基酸序列各自个别形成本发明的一个进一步方面。如所提及，在本发明中，特别优选这样的氨基酸序列：其中位置89是t；或其中位置1是e或d，位置11是v，位置14是p，位置45是r，位置74是s，位置83是r，位置89是l，位置96是p，或位置108是l；或其中位置11是v且位置89是l(任选地与110k或110q突变和/或112k或112q突变合适的组合，且特别是与110k或110q突变组合)。甚至更优选这样的氨基酸序列，其中位置11是v且位置89是l，任选地具有110k或110q突变。因此，在一个优选方面，本发明涉及ctla4结合剂(例如免疫球蛋白单一可变结构域，诸如纳米抗体)，其具有：-cdr1(根据abm)，其为氨基酸序列ggtfsfygmg(seqidno:5)；和-cdr2(根据abm)，其为氨基酸序列dirtsagrty(seqidno:6)；和-cdr3(根据abm)，其为氨基酸序列epsgisgwdy(seqidno:4)；且具有：-当通过blast算法进行比较时，与seqidno:1的氨基酸序列的至少85%、优选至少90%、更优选至少95%的序列同一性程度(其中对于测定序列同一性程度，不考虑cdr、任何可以存在的c端延伸以及涉及的特定方面所需的在位置1、11、14、45、74、83、89、96、108、110和/或112处的突变)，其中选择所述算法的参数以产生在各个参考序列的整个长度上在各个序列之间的最大匹配(例如，预期阈值：10；字长：3；在查询范围内的最大匹配：0；blosum62矩阵；间隙成本：存在11，延伸1；条件性组成评分矩阵调节)；和/或-不超过7个，诸如不超过5个，优选不超过3个，诸如仅3、2或1个与seqidno:1的氨基酸序列的“氨基酸差异”(如本文所定义，且不考虑以上列出的可以存在的在位置1、11、14、45、74、83、89、96、108、110和/或112处的突变中的任一个且不考虑任何可以存在的c端延伸)(其中所述氨基酸差异，如果存在，可以存在于骨架和/或cdr中，但优选仅存在于骨架中且不存在于cdr中)；且任选地具有：-c端延伸(x)n，其中n是1至10，优选1至5，诸如1、2、3、4或5(且优选1或2，诸如1)；且各x是独立地选择的(优选天然存在的)氨基酸残基，且优选独立地选自丙氨酸(a)、甘氨酸(g)、缬氨酸(v)、亮氨酸(l)或异亮氨酸(i)；其包含具有一个或多个根据以下的突变(相对于seqidno:1的氨基酸序列)的氨基酸序列：-位置1处的氨基酸残基优选选自e和d；-位置11处的氨基酸残基优选选自l和v；-位置14处的氨基酸残基优选选自a和p；-位置45处的氨基酸残基优选选自q和r；-位置74处的氨基酸残基优选选自a和s；-位置83处的氨基酸残基优选选自k和r；-位置89处的氨基酸残基优选选自t、l和v；-位置96处的氨基酸残基优选选自m或p；-位置108处的氨基酸残基优选选自l或q；-位置110处的氨基酸残基优选选自t、k或q(且优选为t)；且-位置112处的氨基酸残基优选选自s、k或q(且优选为s)。在另一个优选方面，本发明涉及ctla4结合剂(例如免疫球蛋白单一可变结构域，诸如纳米抗体)，其具有：-cdr1(根据abm)，其为氨基酸序列ggtfsfygmg(seqidno:5)；和-cdr2(根据abm)，其为氨基酸序列dirtsagrty(seqidno:6)；和-cdr3(根据abm)，其为氨基酸序列epsgisgwdy(seqidno:4)；且具有：-当通过blast算法进行比较时，与seqidno:1的氨基酸序列的至少85%、优选至少90%、更优选至少95%的序列同一性程度(其中对于测定序列同一性程度，不考虑cdr、任何可以存在的c端延伸以及涉及的特定方面所需的在位置1、11、14、45、74、83、89、96、108、110和/或112处的突变)，其中选择所述算法的参数以产生在各个参考序列的整个长度上在各个序列之间的最大匹配(例如，预期阈值：10；字长：3；在查询范围内的最大匹配：0；blosum62矩阵；间隙成本：存在11，延伸1；条件性组成评分矩阵调节)；和/或-不超过7个，诸如不超过5个，优选不超过3个，诸如仅3、2或1个与seqidno:1的氨基酸序列的“氨基酸差异”(如本文所定义，且不考虑以上列出的可以存在的在位置1、11、14、45、74、83、89、96、108、110和/或112处的突变中的任一个且不考虑任何可以存在的c端延伸)(其中所述氨基酸差异，如果存在，可以存在于骨架和/或cdr中，但优选仅存在于骨架中且不存在于cdr中)；且任选地具有：-c端延伸(x)n，其中n是1至10，优选1至5，诸如1、2、3、4或5(且优选1或2，诸如1)；且各x是独立地选择的(优选天然存在的)氨基酸残基，且优选独立地选自丙氨酸(a)、甘氨酸(g)、缬氨酸(v)、亮氨酸(l)或异亮氨酸(i)；其中所述ctla4结合剂包含以下突变中的一种或多种：-位置1处的氨基酸残基是d或e；-位置11处的氨基酸残基是v；-位置14处的氨基酸残基是p；-位置45处的氨基酸残基是r；-位置74处的氨基酸残基是s；-位置83处的氨基酸残基是r；-位置89处的氨基酸残基是l；-位置96处的氨基酸残基是p；-位置108处的氨基酸残基是l；-位置110处的氨基酸残基优选合适地选自t、k或q；或-位置112处的氨基酸残基优选合适地选自s、k或q。在一个特定、但非限制性方面，本发明的ctla4结合剂(例如isvd，诸如纳米抗体)在所提及的位置(根据kabat的编号)处包含以下突变(即与seqidno:1的序列相比的突变)集合中的一种或多种：-11v与89l的组合；-11v与1d、14p、45r、74s、83r、89l、96p、108l的组合；-11v与1e、14p、45r、74s、83r、89l、96p、108l的组合；-11v与110k或110q的组合；-11v与110k或110q,和1d或1e和14p、45r、74s、83r、89l、96p,和108l的组合；-11v与112k或112q的组合；-11v与112k或112q,和1d或1e和14p、45r、74s、83r、89l、96p,和108l的组合；-11v与89l和110k或110q的组合；或-11v与89l和112k或112q的组合，且具有表a的ctla4结合剂中，例如seqidno:1或seqidno:60中的cdr(例如根据abm)且具有与如本文所述的seqidno:1的氨基酸序列的整体序列同一性程度。在另一个特定、但非限制性方面，本发明的ctla4结合剂(例如isvd，诸如纳米抗体)在所提及的位置(根据kabat的编号)处包含以下突变(即与seqidno:1的序列相比的突变)集合：-89l与11v的组合；-89l与1d或1e、11v、14p、45r、74s、83r、96p和108l的组合；-89l与110k或110q的组合；-89l与110k或110q和1d或1e和11v、14p、45r、74s、83r、96p和108l的组合；-89l与112k或112q的组合；-89l与112k或112q和1d或1e和11v、14p、45r、74s、83r、96p和108l的组合；-89l与11v和110k或110q的组合；或-89l与11v和112k或112q的组合；且具有表a的ctla4结合剂中，例如seqidno:1或seqidno:60中的cdr(例如根据abm)且具有与如本文所述的seqidno:1的氨基酸序列的整体序列同一性程度。在另一个特定、但非限制性方面，本发明的ctla4结合剂(例如isvd，诸如纳米抗体)在所提及的位置(根据kabat的编号)处包含以下突变(即与seqidno:1的序列相比的突变)集合：-110k或110q与11v的组合；-110k或110q与89l的组合；-110k或110q与11v和89l的组合；或-110k或110q与1d或1e和11v、14p、45r、74s、83r、89l、96p和108l的组合，且具有表a的ctla4结合剂中，例如seqidno:1或seqidno:60中的cdr(例如根据abm)且具有与如本文所述的seqidno:1的氨基酸序列的整体序列同一性程度。在另一个特定、但非限制性方面，本发明的ctla4结合剂(例如isvd，诸如纳米抗体)在所提及的位置(根据kabat的编号)处包含以下突变(即与seqidno:1的序列相比的突变)集合：-112k或112q与11v的组合；-112k或112q与89l的组合；-112k或112q与11v和89l的组合；或-112k或112q与1d或1e和11v、14p、45r、74s、83r、89l、96p和108l的组合，且具有表a的ctla4结合剂中，例如seqidno:1或seqidno:60中的cdr(例如根据abm)且具有与如本文所述的seqidno:1的氨基酸序列的整体序列同一性程度。在另一个方面，本发明的ctla4结合剂(例如isvd，诸如纳米抗体)在位置89处包含t且具有cdr诸如seqidno:1或60中所述的那些(例如根据abm)且具有与如本文所述的seqidno:1的氨基酸序列的整体序列同一性程度。在另一个方面，本发明的ctla4结合剂(例如isvd，诸如纳米抗体)包含位置11处的v和位置89处的t且具有cdr诸如seqidno:60中所述的那些(例如根据abm)且具有与如本文所述的seqidno:1的氨基酸序列的整体序列同一性程度。如所提及，根据上述方面的本发明的ctla4结合剂(例如isvd，诸如纳米抗体)优选进一步使得其含有任选的e1d突变、l11v突变、a14p突变、q45r突变、a74s突变、k83r突变、v89l突变、m96p突变和q108l突变的合适的组合，且优选q108l与其他a14p、q45r、a74s和k83r突变中的任一个的合适的组合，且优选与这些其他突变中的任何两个的组合，更优选与这些突变中的任何三个(诸如与组合a14p、a74s和k83r)，诸如与这些突变中的所有的合适的组合(并且再次，当ctla4结合剂是单价或存在于本发明的ctla4结合剂的n端末端时，优选地，还具有e1d突变)。在本发明的一个实施方案中，本发明的ctla4结合剂包含突变e1d(或缺乏此类突变，其中残基1是e)、l11v、a14p、q45r、a74s、k83r、v89l、m96p、q108l。在另一个特定、但非限制性方面，本发明涉及ctla4结合剂(例如免疫球蛋白单一可变结构域，诸如纳米抗体)，其为选自以下氨基酸序列之一的氨基酸序列或基本上由其组成：seqidno:8、seqidno:9、seqidno:10、seqidno:11、seqidno:12、seqidno:13、seqidno:14、seqidno:15、seqidno:16、seqidno:17、seqidno:18、seqidno:19、seqidno:20、seqidno:21、seqidno:22、seqidno:23、seqidno:24、seqidno:25、seqidno:26、seqidno:27、seqidno:28、seqidno:29、seqidno:30、seqidno:31、seqidno:32、seqidno:33、seqidno:34、seqidno:35、seqidno:36、seqidno:37、seqidno:38、seqidno:39、seqidno:40、seqidno:41、seqidno:42、seqidno:43或seqidno:60。在另一个特定、但非限制性方面，本发明涉及ctla4结合剂(例如免疫球蛋白单一可变结构域，诸如纳米抗体)，其为选自以下氨基酸序列之一的氨基酸序列或基本上由其组成：seqidno:22、seqidno:23、seqidno:24、seqidno:25、seqidno:40、seqidno:41、seqidno:42、seqidno:43或seqidno:60。此外，如本文中已经指示，ctla4结合剂(例如isvd，诸如纳米抗体)的氨基酸残基根据kabat等人(“sequenceofproteinsofimmunologicalinterest”,uspublichealthservices,nihbethesda,md,出版号91)给出的用于vh的通用编号来编号，如在riechmann和muyldermans,j.immunol.methods2000jun23；240(1-2):185-195的文章中应用于来自骆驼的vhh结构域；或在本文所提及。应当注意，如本领域中对于vh结构域和vhh结构域所众所周知，cdr各自中的氨基酸残基的总数可变化且可不对应于由kabat编号所示的氨基酸残基的总数(即，在实际序列中可以不占据一个或多个根据kabat编号的位置，或实际序列可以含有比kabat编号所允许的数目更多的氨基酸残基)。这意味着，通常，根据kabat的编号可以对应于或可以不对应于实际序列中的氨基酸残基的实际编号。将vh结构域的氨基酸残基编号的替代方法(所述方法也可以类似方式应用于来自骆驼的vhh结构域和纳米抗体)是由chothia等人(nature342,877-883(1989))描述的方法，所谓的“abm定义”和所谓的“接触定义”。然而，在本说明书、方面和附图中，除非另外指示，否则将遵循如riechmann和muyldermans应用于vhh结构域的，根据kabat的编号。本发明还涉及ctla4结合剂(例如isvd，诸如纳米抗体)；用于表达/产生本发明的ctla4结合剂的方法；包含本发明的ctla4结合剂的组合物和产品(诸如药物组合物和产品)；编码本发明的ctla4结合剂的多核苷酸；和本发明的ctla4结合剂的用途(特别是治疗、预防和诊断用途)。本发明的这些和其它方面、实施方案、优点、应用和用途将从本文中的进一步描述变得清楚。因此，在一个进一步方面，本发明涉及包含至少一个(诸如一个、两个或三个)本文所述的ctla4结合部分或基本上由其组成的多肽或其他化学实体。这些分子自身可以称为“ctla4结合剂”或“本发明的化合物”或“本发明的多肽”。本发明的ctla4结合剂(例如isvd，诸如纳米抗体)可以含有一个或多个其他氨基酸序列、化学实体或部分。这些其他氨基酸序列、化学实体或部分可以向本发明的所得ctla4结合剂赋予一种或多种期望特性和/或可以期望方式改变本发明的所得ctla4结合剂的特性，例如以向本发明的所得ctla4结合剂提供期望生物和/或治疗活性(例如，以向本发明的所得ctla4结合剂提供针对另一治疗相关靶标的亲和力且优选功效，使得就ctla4和该其它治疗相关靶标(诸如pd1、lag3、btla和/或cd27)而言所得多肽变为“双特异性”)，以提供期望半衰期和/或另外改变或改进药代动力学和/或药效动力学特性，以将ctla4结合剂靶向至特定细胞、组织或器官(包括癌细胞和癌组织)，以提供细胞毒性效果和/或充当可检测标签或标记。此类其它氨基酸序列、化学实体或部分的一些非限制性实例为：-一个或多个合适的接头(诸如9gs、15gs或35gs接头(9、15或35个g和s氨基酸的任何组合，诸如例如ggggsggggsggggsggggsggggsggggsggggs))(seqidno:65)。在本发明的一个实施方案中，所述接头是(ggggs)n(seqidno:118)，其中n是1、2、3、4、5、6、7、8、9或10；和/或-一个或多个针对除了ctla4以外的治疗相关靶标的结合部分、结合结构域或结合单元(即以便提供本发明的对ctla4和其它治疗相关靶标(诸如ctla4的不同表位、pd1、cd27、lag3、btla、tim3、icos、b7-h3、b7-h4、cd137、gitr、pd-l1、pd-l2、ilt1、ilt2ceacam1、ceacam5、tim3、tigit、vista、ilt3、ilt4、ilt5、ilt6、ilt7、ilt8、cd40、ox40、cd137、kir2dl1、kir2dl2、kir2dl3、kir2dl4、kir2dl5a、kir2dl5b、kir3dl1、kir3dl2、kir3dl3、nkg2a、nkg2c、nkg2e、il-10、il-17、tslp)双特异性的ctla4结合剂)，和/或-一个或多个提供半衰期增加的结合结构域或结合单元(例如，可以针对血清蛋白(诸如血清白蛋白)结合的结合结构域或结合单元)；和/或-一个或多个将ctla4结合剂(例如isvd，诸如纳米抗体)靶向至期望细胞、组织或器官(诸如癌细胞)的结合部分、结合结构域或结合单元；和/或-一个或多个提供针对ctla4的增加的特异性的结合部分、结合结构域或结合单元(通常，这些将能够结合ctla4，但将通常自身基本上针对ctla4没有功能性)；和/或-允许ctla4结合剂内化至(期望)细胞中的结合部分、结合结构域、结合单元或其他化学实体(例如，如wo2005/044858中所述的内化抗egfr纳米抗体)；和/或-改善半衰期的部分，诸如合适的聚乙二醇基团(即聚乙二醇化)，或提供增加的半衰期的氨基酸序列，诸如人血清白蛋白或其合适的片段(即白蛋白融合体)或例如如wo2008/068280中所述的血清白蛋白结合肽；和/或-有效载荷，诸如细胞毒性有效载荷；和/或-可检测标记或标签，诸如放射性标记或荧光标记；和/或-可以帮助固定化、检测和/或纯化ctla4结合剂的标签，诸如his或flag3标签；和/或-可以官能化的标签，诸如c端ggc或gggc标签；和/或-c端延伸x(n)，其可以如本文关于本发明的ctla4结合剂进一步描述和/或如wo2012/175741或pct/ep2015/060643(wo2015/173325)中所述。这样的ctla4结合剂(例如isvd，诸如纳米抗体)是本发明的一部分，其含有(优选人)常规抗体的一个或多个部分或片段(诸如fc部分或其功能片段或一个或多个恒定结构域)和/或来自骆驼仅重链抗体的一个或多个部分或片段(诸如一个或多个恒定结构域)。多特异性结合剂本发明包括可以融合在也结合ctla4或另一多肽的单个多价(例如多特异性)分子中的ctla4结合剂，并且在本发明的一个实施方案中，此类结合剂连接至一种或多种增加结合剂在受试者体内的半衰期的半衰期延长剂。在本发明的一个实施方案中，所述半衰期延长剂是特异性结合人血清白蛋白(hsa)的isvd(例如纳米抗体)，例如alb11002。在本发明的一个实施方案中，所述多特异性结合剂是如本文所述的f023700912或f023700914。多肽可以直接、在无接头的情况下或通过接头(诸如肽接头，例如35gs)“融合至”另一分子。多特异性结合剂可以包括ctla4结合剂以及一种或多种结合额外抗原的结合剂，所述额外抗原诸如cd27、pd1、:lag3、btla、tim3、icos、b7-h3、b7-h4、cd137、gitr、pd-l1、pd-l2、ilt1、ilt2ceacam1、ceacam5、tim3、tigit、vista、ilt3、ilt4、ilt5、ilt6、ilt7、ilt8、cd40、ox40、cd137、kir2dl1、kir2dl2、kir2dl3、kir2dl4、kir2dl5a、kir2dl5b、kir3dl1、kir3dl2、kir3dl3、nkg2a、nkg2c、nkg2e、il-10、il-17或tslp。对于此类基于isvd或基于纳米抗体的生物制剂的一些特定、但非限制性实例，参考ablynxn.v.的各种申请，诸如例如且不限于wo2004/062551、wo2006/122825、wo2008/020079和wo2009/068627，以及例如，且不限于诸如以下的申请：wo2006/038027、wo2006/059108、wo2007/063308、wo2007/063311、wo2007/066016和wo2007/085814。此外，如本文进一步描述，可以是在上文所提及的申请中所述的分子的一部分的另外的部分可以是如本文所述的针对(人)血清蛋白(诸如(人)血清白蛋白)的isvd或纳米抗体，且此类isvd或纳米抗体(例如alb11002)也可尤其在延长本文描述的ctla4结合剂(和包含其的多肽)的半衰期中和/或对于延长本文描述的ctla4结合剂(和包含其的多肽)的半衰期具有治疗性用途。参考例如wo2004/041865、wo2006/122787和wo2012/175400，其通常描述血清白蛋白结合纳米抗体用于半衰期延长的用途。wo2009/138519(或在wo2009/138519中引用的现有技术中)或wo2008/020079(或在wo2008/020079中引用的现有技术中)通过引用并入。此外，当方法或技术不在本文中特定描述时，在本发明的一个实施方案中，其可以如wo2009/138519中(或wo2009/138519中引用的现有技术中)或wo2008/020079中(或wo2008/020079中引用的现有技术中)所述来进行。当ctla4结合剂(例如isvd，诸如纳米抗体)含有一个或多个另外结合部分、结合结构域或结合单元(例如提供针对ctla4的增加特异性的针对ctla4的另外基本上非功能性结合部分、结合结构域或结合单元；针对除了ctla4以外的治疗靶标的结合部分、结合结构域或结合单元；提供增加半衰期的针对靶标诸如人血清白蛋白的结合部分、结合结构域或结合单元；和/或将ctla4结合剂靶向至特定细胞、组织或器官和/或允许ctla4结合剂内化至细胞中的结合部分、结合结构域或结合单元)时，这些其他结合部分、结合结构域或结合单元优选包含一个或多个isvd，且更优选都是isvd。例如且非限制性地，这些一个或多个另外结合结构域或结合单元可以是一种或多种纳米抗体(包括vhh、人源化vhh和/或骆驼化vhs，诸如骆驼化的人vhs)、作为vh结构域或衍生自vh结构域的(单一结构域)抗体、作为vh结构域或基本上由vh结构域组成或衍生自vh结构域的dab，或甚至作为vl结构域或基本上由vl结构域组成的(单一)结构域抗体或dab。具体而言，当存在时，这些一个或多个结合结构域或结合单元可以包含一个或多个纳米抗体，且更具体地都是纳米抗体。当本发明的ctla4结合剂在其c端末端具有isvd(该c端isvd可以是本文描述的ctla4结合部分或如果存在于ctla4结合剂中，可以例如是提供针对ctla4的增加的特异性的针对ctla4的另外基本上非功能isvd、针对除了ctla4以外的治疗靶标的isvd、提供增加的半衰期的针对靶标诸如人血清白蛋白的isvd或将ctla4结合剂靶向至特定细胞、组织或器官和/或允许ctla4结合剂内化至细胞中的isvd)时，则ctla4结合部分(即所述c端isvd)优选具有c端延伸x(n)，该c端延伸可以如本文关于本发明的ctla4结合剂所述和/或如wo2012/175741或pct/ep2015/060643(wo2015/173325)中所述。当除了本文描述的一个或多个ctla4结合部分以外，ctla4结合剂(例如isvd，诸如纳米抗体)含有任何另外isvd(该一个或多个另外isvd可以如所提及，是提供针对ctla4的增加的特异性的针对ctla4的另外的基本上非功能isvd、针对除了ctla4以外的治疗靶标的isvd、提供增加的半衰期的针对靶标诸如人血清白蛋白的isvd和/或将ctla4结合剂靶向至特定细胞、组织或器官和/或允许ctla4结合剂内化至细胞中的isvd)时，且当此类另外isvd是纳米抗体或者是作为vh序列、基本上由vh序列组成和/或衍生自vh序列的isvd时，则根据本发明的一个优选方面，所述一个或多个(且优选所有)存在于ctla4结合剂中的另外isvd将在其序列内含有一个或多个减少预先存在的抗体的结合的骨架突变。具体而言，根据本发明的该方面，此类另外的isvd可以含有如pct/ep2015/060643(wo2015/173325)中所述和/或基本上如本文关于本发明的ctla4结合剂所述的在位置11、89、110和/或112处的氨基酸残基/突变(的合适的组合)。在一个特定方面，当ctla4结合剂在其c端末端具有此类isvd(即在其c端末端不具有本发明的ctla4结合部分)时，则至少存在于c端末端和/或形成c端末端的所述isvd具有减少预先存在的抗体的结合的骨架突变(且所述c端isvd将优选还具有如本文所述的c端延伸x(n))。如所提及，当ctla4结合剂(例如isvd，诸如纳米抗体)将具有增加的半衰期(即与本发明的单价ctla4结合剂相比)时，ctla4结合剂优选含有至少一个(诸如一个)提供此类增加的半衰期的isvd(且具体而言纳米抗体)。此类isvd将通常针对合适的血清蛋白(诸如转铁蛋白)且具体而言针对(人)血清白蛋白。具体而言，此类isvd或纳米抗体可以是如例如ep2139918、wo2011/006915、wo2012/175400、wo2014/111550中所述的针对人血清白蛋白的(单一)结构域抗体或dab，且具体而言可以是如wo2004/041865、wo2006/122787、wo2012/175400或pct/ep2015/060643(wo2015/173325)中所述的血清白蛋白结合纳米抗体。尤其优选的血清白蛋白结合isvd是纳米抗体alb-1(参见wo2006/122787)、或其人源化变体(诸如alb-8(wo2006/122787，seqidno:62)、alb-23(wo2012/175400，seqidno:1))和alb-1的其他人源化(且优选还是序列优化的)变体和/或alb-8或alb-23的变体(或更通常，具有基本上与alb-1、alb-8和alb-23相同的cdr的isvd)。在本发明的一个实施方案中，isvd(例如纳米抗体)是结合人血清白蛋白的alb11002。alb11002下面在表c中概述。本发明包括本发明的包含hsa结合剂的ctla4结合剂，例如具有与存在于alb11002或包含seqidno:66的序列的结合剂中相同的cdr的组合(即，cdr1、cdr2和cdr3)。参见表c。表c.人血清白蛋白(hsa)结合剂alb11002任选地，alb11002缺乏c端丙氨酸。在本发明的一个实施方案中，所述hsa结合剂包含seqidno:66的氨基酸序列，但在位置1、1、89、110或112处包括突变，例如包含在本文的表b中所述的突变集合。seqidno:66的残基1可以是d或e。如果残基1是d，则hsa结合剂可称为1d且如果残基1是e，则hsa结合剂可称为1e。本发明包括hsa结合剂，其包含hsa结合剂的cdr中的一个、两个或三个，其中相对于表c的所述hsa结合剂序列中或seqidno:67-69中所述的cdr，各自包含0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸取代，例如保守性取代，和/或包含100%、99%、98%、97%、96%或95%序列同一性，其中具有此类cdr的hsa结合剂保留结合hsa的能力。在本发明的一个实施方案中，半衰期延长剂是包含以下的抗hsaisvd(例如纳米抗体)：-包含氨基酸序列gftfssfgms(seqidno:67)的cdr1；和-包含氨基酸序列sisgsgsdtl(seqidno:68)的cdr2；和-包含氨基酸序列ggslsr(seqidno:69)的cdr3；且，任选地，具有：-与seqidno:66的氨基酸序列的至少85%、优选至少90%、更优选至少95%的序列同一性程度(其中对于测定序列同一性程度，不考虑任何可以存在的c端延伸以及cdr)(其中对于测定序列同一性程度，不考虑cdr、任何可以存在的c端延伸以及涉及的特定方面所需的在位置1、11、89、110和/或112处的突变)；和/或-不超过7个，诸如不超过5个，优选不超过3个，诸如仅3、2或1个与seqidno:66的氨基酸序列的“氨基酸差异”(如本文所定义，且不考虑以上列出的可以存在的在位置1、11、89、110和/或112处的突变中的任一个且不考虑任何可以存在的c端延伸)(其中所述氨基酸差异，如果存在，可以存在于骨架和/或cdr中，但优选仅存在于骨架中且不存在于cdr中)；且任选地具有：-c端延伸(x)n，其中n是1至10，优选1至5，诸如1、2、3、4或5(且优选1或2，诸如1)；且各x是独立地选择的(优选天然存在的)氨基酸残基，且优选独立地选自丙氨酸(a)、甘氨酸(g)、缬氨酸(v)、亮氨酸(l)或异亮氨酸(i)。再次，如所提及，当存在时，此类人血清白蛋白结合isvd可以在其序列内含有一个或多个减少预先存在的抗体的结合的骨架突变。具体而言，当此类血清白蛋白结合isvd是纳米抗体或作为vh结构域、基本上由vh结构域组成和/或衍生自vh结构域的(单一)结构域抗体时，血清白蛋白结合isvd可以含有如pct/ep2015/060643(wo2015/173325)中所述和/或基本上如本文关于本发明的ctla4结合剂所述的在位置11、89、110和/或112处的氨基酸残基/突变(的合适组合)。例如，pct/ep2015/060643(wo2015/173325)描述了许多alb-1、alb-8和alb-23的变体，其含有在位置11、89、110和/或112处的减少预先存在的抗体的结合的可以在本发明的ctla4结合剂中使用的氨基酸残基/突变。再次，当此类血清白蛋白结合isvd存在于本发明的ctla4结合剂(例如isvd，诸如纳米抗体)的c端末端时，血清白蛋白结合isvd(且作为，本发明的ctla4结合剂)优选具有c端延伸x(n)，该c端延伸可以如本文关于本发明的ctla4结合剂所述和/或如wo2012/175741或pct/ep2015/060643(wo2015/173325)中所述。其优选还具有减少预先存在的抗体的结合的突变，如pct/ep2015/060643(wo2015/173325)中描述的在位置11、89、110和/或112处的氨基酸残基/突变(的合适组合)。然而，如所提及，其他增加本发明的ctla4结合剂的半衰期的方式(诸如聚乙二醇化、与人白蛋白或其合适片段融合或使用合适的血清白蛋白结合肽)也包括于本发明的范围中。通常，当本发明的ctla4结合剂(例如isvd，诸如纳米抗体)具有增加的半衰期(例如通过增加半衰期的isvd的存在或增加半衰期的任何其他合适的方式)时，所得ctla4结合剂优选具有比本发明的单价ctla4结合剂的半衰期长至少2倍、优选至少5倍、例如至少10倍或大于20倍的半衰期(如本文所定义)(如在人和/或合适的动物模型(诸如小鼠或食蟹猴)中所测量)。具体而言，本发明的ctla4结合剂优选具有在人受试者中至少1天、优选至少3天、更优选至少7天，诸如至少10天的半衰期(如本文所定义)。将从本文的公开内容清楚的是，本发明的ctla4结合剂(例如基于一个或多个isvd，诸如纳米抗体)可以具有不同“形式”，即基本上为单价、二价或三价，可以是单特异性、双特异性、三特异性等，并且可以是双互补位(如本文和例如wo2009/068625中所定义)。例如，本发明的ctla4结合剂可以是：-(基本上)单价，即(基本上)包含本发明的单个ctla4结合部分。如所提及，当以单价形式使用时，本发明的ctla4结合剂优选具有如本文进一步描述的c端延伸x(n)。本发明的此类ctla4结合剂也可以是半衰期延长的；-(基本上)二价或三价和单特异性的。本发明的此类ctla4结合剂将包含两个或更多个针对ctla4的结合部分(例如isvd)，其可以相同或不同且当不同时可以针对ctla4上的同一表位或针对ctla4上的不同表位(在后一情况中，以便提供本发明的双互补位或多互补位ctla4结合剂)。本发明的此类ctla4结合剂也可以是半衰期延长的；-(基本上)二价、三价(或多价)和双特异性或三特异性(或多特异性)。本发明的此类ctla4结合剂将针对ctla4和至少一种其他靶标。如本文所述，所述其他靶标可以是例如另一治疗相关靶标(即除了ctla4以外)，诸如例如pd1、lag3、btla和/或cd27，以便提供对ctla4和所述其他治疗靶标双特异性的ctla4结合剂。所述另一靶标也可以是提供增加的半衰期的靶标(诸如人血清白蛋白)，以便提供本发明的具有增加的半衰期的ctla4结合剂。还如本文所提及，此类另一靶标也可以允许本发明的ctla4结合剂靶向至特定细胞、组织或器官或可以允许本发明的ctla4结合剂内化至细胞中。还可能组合这些方法/isvd，例如以提供本发明的对于ctla4和至少一种其他治疗相关靶标双特异性且半衰期延长的ctla4结合剂。再次，优选地，当本发明的这些ctla4结合剂(例如isvd，诸如纳米抗体)含有一个或多个除了至少一个本发明的ctla4结合剂以外的结合部分(例如isvd)时，这些其他isvd中的至少一个且优选所有将在其序列内含有一个或多个减少预先存在的抗体的结合的骨架突变(诸如具体而言，如本文关于本发明的ctla4结合剂所述和/或如pct/ep2015/060643(wo2015/173325)中一般描述的在位置11、89、110和/或112处的氨基酸残基/突变的组合)。此外，当本发明的此类ctla4结合剂在其c端末端分别具有ctla4结合部分时，则所述c端ctla4结合部分(且作为结果，本发明的ctla4结合剂)将优选具有如本文所述的c端延伸x(n)。类似地，当本发明的此类ctla4结合剂在其c端末端具有另一isvd(即不是本发明的ctla4结合部分，但例如是半衰期延长isvd)时，则所述c端isvd(且作为结果，本发明的ctla4结合剂)将优选具有如本文所述的c端延伸x(n)和/或将在其序列内含有一个或多个减少预先存在的抗体的结合的骨架突变(再次，如本文进一步和pct/ep2015/060643(wo2015/173325)中所述)。如技术人员将清楚，当本发明的ctla4结合剂(例如isvd，诸如纳米抗体)意欲用于局部用途(即皮肤上或眼睛中)或例如意欲在例如胃肠道中(即在经口施用或通过栓剂施用之后)或在肺中(即在通过吸入施用之后)某处具有(局部)治疗作用或另外意欲直接施用至其预期作用位置(例如，通过直接注射)时，本发明的ctla4结合剂可以不需要半衰期延长。此外，对于治疗某些急性病况或适应症，优选不具有延长的半衰期。在这些情况下，优选使用无半衰期延长的本发明的单价ctla4结合剂或本发明的ctla4结合剂(包含本发明的ctla4结合部分)(例如，就ctla4而言二价或双互补位的本发明的ctla4结合剂)。此类本发明的ctla4结合剂(例如isvd，诸如纳米抗体)的一些优选、但非限制性实例示意性表示在下表c-1中，且这些中的每一种形成本发明的一个进一步方面。基于本文的公开内容，本发明的无半衰期延长的适合ctla4结合剂的其它实例将是技术人员清楚的。表c-1：一些本发明的无半衰期延长isvd的ctla4结合剂的示意性代表。如技术人员将清楚，当本发明的ctla4结合剂(例如isvd，诸如纳米抗体)意欲用于全身性施用和/或预防和/或用于治疗慢性疾病或病症时，将通常优选本发明的所述ctla4结合剂具有增加的半衰期(如本文所定义)。更优选地，本发明的这种ctla4结合剂将含有延长半衰期的isvd，诸如优选地，结合人血清白蛋白的isvd且特别是详言之纳米抗体(如本文所述)。本发明的此类ctla4结合剂(例如isvd，诸如纳米抗体)的一些优选、但非限制性实例示意性地表示在下表c-2中，且这些各自形成本发明的另一个方面。本发明的具有半衰期延长的合适ctla4结合剂的其它实例将是技术人员基于本文的公开内容清楚的。通常，对于本发明的具有半衰期延长的ctla4结合剂，存在c端延伸优选得多。表c-2：本发明的一些具有半衰期延长isvd的ctla4结合剂的示意性代表。。本发明还提供了ctla4isvd，f023700912，其包含氨基酸序列：(seqidno:62；35gs接头用虚线加下划线；cdr加下划线和/或呈粗体)。任选地，所述分子中的任何结合剂部分的第一残基在适当时被d或e取代。任选地，ctla4isvd包含信号肽，诸如：f023700912可以由包含以下核苷酸的多核苷酸编码：(seqidno:61；任选地缺乏核苷酸1-255的信号序列)。f023700912包含以下部分：·ctla4结合剂11f01(e1d、l11v、a14p、q45r、a74s、k83r、v89l、m96p、q108l)·35gs接头·ctla4结合剂11f01(l11v、a14p、q45r、a74s、k83r、v89l、m96p、q108l)·35gs接头·人血清白蛋白结合剂alb11002；·c端延伸丙氨酸。例如：·ctla4结合剂seqidno:60·35gs接头seqidno:65·ctla4结合剂seqidno:60(d1e)·35gs接头seqidno:65·人血清白蛋白结合剂seqidno:66·丙氨酸(本发明包括任何包括此类部分排列的结合剂)。本发明还提供了ctla4isvd，f023700914，其包含氨基酸序列：(seqidno:64；35gs接头用虚线加下划线；cdr加下划线和/或呈粗体)。任选地，所述分子中的任何结合剂部分的第一残基在适当时被d或e取代。任选地，ctla4isvd包含信号肽，诸如：f023700914可以由包含以下核苷酸的多核苷酸编码：(seqidno:63；任选地缺乏核苷酸1-255的信号序列)。f023700912包含以下部分：·ctla4结合剂11f01(e1d,l11v,a14p,q45r,a74s,k83r,v89l,m96p,q108l)；·35gs接头；·人血清白蛋白结合剂alb11002；·c端延伸丙氨酸。例如：·ctla4结合剂seqidno:60·35gs接头seqidno:65·人血清白蛋白结合剂seqidno:66·丙氨酸(本发明包括任何包括此类部分排列的结合剂)。本发明包括包含seqidno:62或64的氨基酸序列或包含80%或更多(例如85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%)氨基酸序列同一性的氨基酸序列的任何多特异性ctla4结合剂，其中所述ctla4结合剂保留结合ctla4且任选结合hsa的能力。表位结合和交叉阻断本发明提供了本文所述的ctla4结合剂(例如f023700912或f023700914)以及结合此类结合剂的相同ctla4表位的结合剂(例如包含ctla4isvd(例如纳米抗体))。例如，本发明包括通过接触与f023700912或f023700914相同的残基而结合人ctla4的结合剂。例如，本发明提供了在人ctla4的残基vrvtvl(seqidno:110的残基33-38)、adsqvtevc(seqidno:110的残基41-49)和/或ckvelmypppyylg(seqidno:110的残基93-106)(例如所有三个位点)处结合人ctla4的结合剂。在本发明的一个实施方案中，所述结合剂在氢-氘交换测定中表明在这些残基处的与人ctla4的结合，例如防止残基在氘(诸如d2o)存在的情况下用氢交换氘，例如如由基本上如图13中所述的结合热图所示。本发明包括ctla4结合剂(例如，f023700912或f023700914或11f01或本文所述的其变体中的任一种)，其结合肽序列vrvtvl(seqidno:110的残基33–38)、adsqvtevc(seqidno:110的残基41-49)和/或ckvelmypppyylg(seqidno:110的残基93-106)的多肽，例如，ctla4。任选地，所述多肽在细胞(例如t细胞)的表面上，且所述多肽由所述ctla结合剂结合。本发明还提供了能够交叉阻断本文公开的结合剂(例如f023700912或f023700914)中的任一种的结合的交叉阻断结合剂。此类交叉阻断结合剂可以是任何表现出此类交叉阻断的分子，例如isvd、纳米抗体、抗体或其抗原结合片段。通常，“交叉阻断”参考结合剂的结合剂(例如isvd，诸如纳米抗体)或抗体或其抗原结合片段是指在竞争测定中将参考结合剂与其抗原的结合阻断50%或更多的结合剂(例如isvd，诸如纳米抗体)或抗体或其抗原结合片段，且相反，参考结合剂在竞争测定中将结合剂(例如isvd，诸如纳米抗体)或抗体或其抗原结合片段与其抗原的结合阻断50%或更多。交叉阻断可以使用本领域中已知的任何测定(包括表面等离振子共振(spr)、elisa和流式细胞术)测定。在本发明的一个实施方案中，交叉阻断通过使用biacore测定法测定。为了方便起见，参考两种结合剂，然而，本发明的范围包括交叉阻断本发明的结合剂的抗体和其抗原结合片段，例如fab片段。根据制造商的推荐操作biacore机器(例如biacore3000)。因此，在一个交叉阻断测定中，使用标准胺偶联化学法将ctla4偶联至cm5biacore芯片以生成ctla4包被的表面。例如，200-800共振单位的ctla4将偶联至芯片(或给出结合的可容易测量的水平、但可容易通过使用的测试试剂的浓度饱和的任何量)。将待评价其彼此交叉阻断的能力的两种结合剂(称为a*和b*)在合适的缓冲液中以结合位点的1:1摩尔比混合以产生测试混合物。各结合剂在测试混合物中的浓度应足够高以容易地使在biacore芯片上捕获的ctla4分子上该结合剂的结合位点饱和。混合物中的结合剂在相同摩尔浓度下。还制备仅含有结合剂a*和仅含有结合剂b*的单独溶液。这些溶液中的结合剂a*和结合剂b*应在相同缓冲液中并在与测试混合物中相同的浓度下。将测试混合物穿过ctla4包被的biacore芯片并记录总结合量。然后以使得移除结合的结合剂而不损坏芯片结合的ctla4的方式处理芯片。在本发明的一个实施方案中，这通过用30mmhcl处理芯片60秒来进行。然后将仅结合剂a*的溶液穿过ctla4包被的表面并记录结合量。再次处理芯片以移除所有结合的结合剂而不损坏芯片结合的ctla4。然后将仅结合剂b*的溶液穿过ctla4包被的表面并记录结合量。接下来计算结合剂a*和结合剂b*的混合物的最大理论结合，并且是当仅穿过ctla4表面时各结合剂的结合的总和。如果混合物的实际记录的结合小于该理论最大值，则两种结合剂彼此交叉阻断。因此，通常，根据本发明的交叉阻断结合剂是这样的结合剂，其将在以上biacore交叉阻断测定中结合ctla4，使得在测定期间和在第二结合剂存在的情况下，记录的结合在组合的两种结合剂的例如最大理论结合的80%和0.1%之间(例如80%至4%)，例如最大理论结合的75%和0.1%之间(例如75%至4%)，例如最大理论结合的70%和0.1%之间(例如70%至4%)(正如上文所定义)。在本发明的一个实施方案中，elisa测定用于确定根据本发明的ctla4结合剂是否交叉阻断或能够交叉阻断。测定的通用原理是将ctla4结合剂包被至elisa板的孔上。以溶液(即不结合至elisa板)添加过量的第二、潜在交叉阻断的ctla4结合剂。然后向孔中添加有限量的ctla4。包被的结合剂和溶液中的结合剂竞争有限数目的ctla4分子的结合。洗涤板以移除尚未由包被的结合剂结合的ctla4且还移除第二、溶液相结合剂以及任何在第二、溶液相结合剂和ctla4之间形成的复合物。然后使用适当的ctla4检测试剂测量结合的ctla4的量。能够交叉阻断包被的结合剂的溶液中的结合剂将能够引起包被的结合剂可以结合的ctla4分子的数目相对于包被的结合剂可以在第二、溶液相结合剂不存在的情况下结合的ctla4分子的数目减少。表达方法本发明包括用于制备本发明的ctla4结合剂(例如isvd，诸如纳米抗体)(例如f023700912或f023700914)的重组方法，其包括(i)引入编码所述ctla4结合剂的氨基酸序列的多核苷酸，例如，其中所述多核苷酸是在载体中和/或可操作连接至启动子；(ii)在有利于多核苷酸的表达的条件下培养宿主细胞(例如，cho或毕赤酵母属或巴斯德毕赤酵母)，和，(iii)任选地，从所述宿主细胞和/或所述宿主细胞在其中生长的培养基分离ctla4结合剂。参见例如，wo04/041862、wo2006/122786、wo2008/020079、wo2008/142164或wo2009/068627。本发明还涉及编码如本文所述的本发明的ctla4结合剂(例如isvd，诸如纳米抗体)(例如f023700912或f023700914)的多核苷酸。在本发明的一个实施方案中，多核苷酸可操作连接至一个或多个控制序列。多核苷酸可以呈质粒或载体的形式。再次，此类多核苷酸可以通常如ablynxn.v.的公开的专利申请，诸如例如wo04/041862、wo2006/122786、wo2008/020079、wo2008/142164或wo2009/068627中所述。本发明还涉及含有本文所述的此类多核苷酸、载体和/或ctla4结合剂(例如f023700912或f023700914)的宿主或宿主细胞。再次，此类宿主细胞可以通常如ablynxn.v.的公开的专利申请，诸如wo04/041862、wo2006/122786、wo2008/020079、wo2008/142164或wo2009/068627中所述。下面讨论特定宿主细胞的实例。真核和原核宿主细胞(包括哺乳动物细胞)，作为用于表达ctla4结合剂(例如isvd，诸如纳米抗体)的宿主是本领域众所周知的，且包括许多可从美国典型培养物保藏中心(atcc)得到的永生化的细胞系。这些尤其包括中国仓鼠卵巢(cho)细胞、nso、sp2细胞、hela细胞、幼仓鼠肾(bhk)细胞、猴肾细胞(cos)、人肝细胞癌细胞(例如，hepg2)、a549细胞、3t3细胞、hek-293细胞和许多其它细胞系。哺乳动物宿主细胞包括人、小鼠、大鼠、狗、猴、猪、山羊、牛、马和仓鼠细胞。通过确定哪些细胞系具有高表达水平，选择特别优选的细胞系。可以使用的其它细胞系是昆虫细胞系(例如，草地贪夜蛾(spodopterafrugiperda)或粉纹夜蛾(trichoplusiani))、两栖动物细胞、细菌细胞、植物细胞和真菌细胞。真菌细胞包括酵母和丝状真菌细胞，包括例如巴氏毕赤酵母(pichiapastoris)、芬兰毕赤酵母(pichiafinlandica)、喜海藻糖毕赤酵母(pichiatrehalophila)、pichiakoclamae、膜醭毕赤酵母(pichiamembranaefaciens)、微小毕赤酵母(pichiaminuta)(ogataeaminuta,pichialindneri)、仙人掌毕赤酵母(pichiaopuntiae)、耐热毕赤酵母(pichiathermotolerans)、柳毕赤酵母(pichiasalictaria)、栎毕赤酵母(pichiaguercuum)、皮杰普氏毕赤酵母(pichiapijperi)、具柄毕赤酵母(pichiastiptis)、甲醇毕赤酵母(pichiamethanolica)、毕赤酵母属种(pichiasp.)、酿酒酵母(saccharomycescerevisiae)、酵母属种(saccharomycessp.)、多形汉逊酵母(hansenulapolymorpha)、克鲁维酵母属种(kluyveromycessp.)、乳酸克鲁维酵母(kluyveromyceslactis)、白色念珠菌(candidaalbicans)、构巢曲霉(aspergillusnidulans)、黑曲霉(aspergillusniger)、米曲霉(aspergillusoryzae)、里氏木霉(trichodermareesei)、拉氏金孢菌(chrysosporiumlucknowense)、镰孢菌属种(fusariumsp.)、禾谷镰孢菌(fusariumgramineum)、镰孢霉(fusariumvenenatum)、小立碗藓(physcomitrellapatens)和粗糙链孢霉(neurosporacrassa)、毕赤酵母属种(pichiasp.)、任何酵母属种(saccharomycessp.)、多形汉逊酵母(hansenulapolymorpha)、任何克鲁维酵母属种(kluyveromycessp.)、白色念珠菌(candidaalbicans)、任何曲霉菌属种(aspergillussp.)、里氏木霉(trichodermareesei)、拉氏金孢菌(chrysosporiumlucknowense)、任何镰孢菌属种(fusariumsp.)、解脂耶氏酵母(yarrowialipolytica)和粗糙链孢霉(neurosporacrassa)。本发明包括任何含有本发明的ctla4结合剂(例如f023700912或f023700914)或含有编码此类结合剂的多核苷酸或包含含有所述多核苷酸的载体的宿主细胞(例如cho细胞或毕赤酵母细胞，例如巴斯德毕赤酵母)。此外，使用许多已知技术，可以增强ctla4结合剂(例如isvd，诸如纳米抗体)从生产细胞系的表达。例如，谷氨酰胺合成酶基因表达系统(gs系统)是用于增强在特定条件下的表达的常见方案。与欧洲专利号0216846、0256055和0323997和欧洲专利申请号89303964.4关联地完整地或部分地讨论了gs系统。因此，在本发明的一个实施方案中，所述哺乳动物宿主细胞(例如，cho)缺乏谷氨酰胺合成酶基因，并在没有谷氨酰胺存在下在培养基中生长，然而，其中，编码免疫球蛋白链的多核苷酸包含谷氨酰胺合成酶基因，其补足宿主细胞中该基因的缺乏。此类含有如本文所讨论的结合剂或多核苷酸或载体的宿主细胞以及如本文所讨论的用于使用此类宿主细胞制备结合剂的表达方法是本发明的一部分。本发明包括用于纯化ctla4结合剂(例如isvd，诸如纳米抗体)的方法，其包括将包含所述ctla4结合剂的样品(例如，培养基、细胞裂解物或细胞裂解物级分，例如，裂解物的可溶性级分)引入纯化介质(例如，阳离子交换介质、阴离子交换介质、疏水交换介质、亲和纯化介质(例如，蛋白-a、蛋白-g、蛋白-a/g、蛋白-l))，和从不结合所述介质的所述样品的流通级分收集纯化的ctla4结合剂；或者，丢弃所述流通级分并从所述介质洗脱结合的ctla4结合剂和收集所述洗脱液。在本发明的一个实施方案中，所述介质是在所述样品所应用的柱中。在本发明的一个实施方案中，在宿主细胞中重组表达抗体或片段之后进行所述纯化方法，例如，其中首先裂解所述宿主细胞，并任选地在介质上纯化之前纯化裂解物的不溶物；或其中宿主细胞将ctla4结合剂分泌进培养基中并将所述介质或其级分应用于纯化介质。通常，在特定细胞系或转基因动物中产生的糖蛋白将具有在所述细胞系或转基因动物中产生的糖蛋白所特有的糖基化模式。因此，ctla4结合剂(例如isvd，诸如纳米抗体)的特定糖基化模式将取决于用于产生所述ctla4结合剂的特定细胞系或转基因动物。仅包含未岩藻糖基化的n-聚糖的ctla4结合剂是本发明的一部分，并且可能是有利的，因为未岩藻糖基化的抗体已经被显示通常在体外和在体内表现出比它们的岩藻糖基化的相应物更有效的效力(参见例如，shinkawa等人,j.biol.chem.278:3466-3473(2003)；美国专利号6,946,292和7,214,775)。这些具有未岩藻糖基化的n-聚糖的ctla4结合剂不可能是免疫原性的，因为它们的碳水化合物结构是存在于人血清igg中的群体的正常组分。本发明包括包含n-连接的聚糖的ctla4结合剂(例如isvd，诸如纳米抗体)，所述n-连接的聚糖通常添加至在中国仓鼠卵巢细胞中产生的免疫球蛋白(chon-连接的聚糖)或添加至工程改造的酵母细胞(工程改造的酵母n-连接的聚糖)，例如，巴斯德毕赤酵母。例如，在本发明的一个实施方案中，所述ctla4结合剂(例如isvd，诸如纳米抗体)包含在图4中所示的“工程改造的酵母n-连接的聚糖”或“chon-连接的聚糖”中的一种或多种(例如，g0和/或g0-f和/或g1和/或g1-f和/或和/或g2-f和/或man5)。在本发明的一个实施方案中，所述ctla4结合剂包含工程改造的酵母n-连接的聚糖，即，g0和/或g1和/或g2，任选地，还包括man5。在本发明的一个实施方案中，所述ctla4结合剂包含chon-连接的聚糖，即，g0-f、g1-f和g2-f，任选地，还包括g0和/或g1和/或g2和/或man5。在本发明的一个实施方案中，在ctla4结合剂上的所有n-连接的聚糖的约80%至约95%(例如，约80-90%、约85%、约90%或约95%)是工程改造的酵母n-连接的聚糖或chon-连接的聚糖。参见nett等人.yeast.28(3):237-252(2011);hamilton等人.science.313(5792):1441-1443(2006);hamilton等人.curropinbiotechnol.18(5):387-392(2007)。例如，在本发明的一个实施方案中，工程改造的酵母细胞是gfi5.0或ygly8316或在美国专利号7,795,002或zha等人.methodsmolbiol.988:31-43(2013)中所述的菌株。也参见国际专利申请公开号wo2013/066765。组合在具体实施方案中，ctla4结合剂(例如isvd，诸如纳米抗体)可以单独使用，或与其它另外治疗剂和/或治疗操作组合使用，用于治疗或预防需要这种治疗或预防的受试者中的任何疾病诸如癌症，例如，如本文所讨论。组合物或试剂盒，例如，包含药学上可接受的载体、包含与其它治疗剂组合的此类ctla4结合剂的药物组合物也是本发明的一部分。术语“与……组合”指示，本发明的组分ctla4结合剂(例如isvd，诸如纳米抗体)与另一种药剂诸如派姆单抗或尼鲁单抗一起可以配制成单一组合物(例如，用于同时递送)，或单独配制成两种或更多种组合物(例如，试剂盒)。每种组分可以在施用其它组分时不同的时间施用于受试者；例如，可以在给定时间段内间隔性地非同时地(例如，单独地或依次地)给予每次施用。此外，可以将单独组分通过相同或不同的途径施用于受试者(例如，其中胃肠外地施用本发明的ctla4结合剂，且口服施用紫杉醇)。在具体实施方案中，所述ctla4结合剂(例如isvd，诸如纳米抗体)可以与抗癌治疗剂或免疫调节性药物诸如免疫调节性受体抑制剂(例如，特异性结合所述受体的抗体或其抗原结合片段)组合使用。在本发明的一个实施方案中，ctla4结合剂(例如isvd，诸如纳米抗体)与一种或多种抑制剂(例如，小有机分子或抗体或其抗原结合片段)组合，所述抑制剂诸如：mtor(雷帕霉素的哺乳动物靶标)抑制剂、细胞毒性剂、铂试剂、braf抑制剂、cdk4/6抑制剂、egfr抑制剂、vegf抑制剂、微管稳定剂、紫杉烷、cd20抑制剂、cd52抑制剂、cd30抑制剂、rank(核因子κ-b的受体活化剂)抑制剂、rankl(核因子κ-b配体的受体活化剂)抑制剂、erk抑制剂、map激酶抑制剂、akt抑制剂、mek抑制剂、pi3k抑制剂、her1抑制剂、her2抑制剂、her3抑制剂、her4抑制剂、bcl2抑制剂、cd22抑制剂、cd79b抑制剂、erbb2抑制剂或法呢基蛋白转移酶抑制剂。在本发明的一个实施方案中，ctla4结合剂(例如isvd，诸如纳米抗体)与以下中的一种或多种组合：抗ctla4抗体或其抗原结合片段(例如伊匹单抗)、抗pd1抗体或其抗原结合片段(例如，派姆单抗、尼鲁单抗、ct-011)、抗-pdl1、抗-ctla4、抗-tim3、抗-cs1、(例如，依洛珠单抗)、抗-kir2dl1/2/3(例如，利瑞鲁单抗)、抗-cd27、抗-cd137(例如，乌鲁单抗(urelumab))、抗-gitr(例如，trx518)、抗-pd-l1(例如，bms-936559、msb0010718c或mpdl3280a)、抗-pd-l2、抗-ilt1、抗-ilt2、抗-ilt3、抗-ilt4、抗-ilt5、抗-ilt6、抗-ilt7、抗-ilt8、抗-cd40、抗-ox40、抗-cd137、抗-kir2dl1、抗-kir2dl2/3、抗-kir2dl4、抗-kir2dl5a、抗-kir2dl5b、抗-kir3dl1、抗-kir3dl2、抗-kir3dl3、抗-nkg2a、抗-nkg2c、抗-nkg2e或这样的靶标的任何小有机分子抑制剂；il-10、抗-il10、抗-tslp(胸腺间质淋巴细胞生成素)或peg化的il-10。在本发明的一个实施方案中，在peg化的il-10分子上的聚乙二醇(peg)部分的分子量是约12,000道尔顿或约20,000道尔顿。在本发明的一个实施方案中，聚乙二醇化的il-10(例如，聚乙二醇化的人il-10)包含一个或多个聚乙二醇分子，所述聚乙二醇分子通过接头(例如，c2-12烷基诸如--ch2ch2ch2--)共价地连接至il-10的单个亚基的单个氨基酸残基，其中所述氨基酸残基是n-端氨基酸残基的α氨基或赖氨酸残基的ε氨基。在本发明的一个实施方案中，聚乙二醇化的il-10是：(peg)b-l-nh-il-10；其中b是1-9且l是共价地连接至il-10的单个氨基酸残基的氮(n)的c2-12烷基接头部分。在本发明的一个实施方案中，聚乙二醇化的il-10的il-10具有下式：[x--o(ch2ch2o)n]b-l-nh-il-10，其中x是h或c1-4烷基；n是20-2300；b是1-9；且l是共价地连接至在一个il-10亚基的氨基端处的α氨基的氮(n)的c1-11烷基接头部分；前提条件是，当b大于1时，n的总和不超过2300。参见us7,052,686。在本发明的一个实施方案中，所述抗il-10抗体或其抗原结合片段(例如，人源化抗体)包含下述的cdr：(参见us7,662,379)。在本发明的一个实施方案中，所述抗tslp抗体或其抗原结合片段(例如，人源化抗体)包含下述的cdr：(参见wo2008/76321)。在本发明的一个实施方案中，所述抗cd27抗体或其抗原结合片段(例如，人源化抗体)包含下述的cdr：(参见wo2012/04367)。因此，本发明包括组合物，其包含与派姆单抗组合的ctla4结合剂(例如isvd，诸如纳米抗体)；以及用于治疗或预防受试者中的癌症的方法，所述方法包括向所述受试者施用与派姆单抗(例如，以200mg每3周1次施用派姆单抗)组合的有效量的ctla4结合剂。任选地，还与另一种其它治疗剂组合地施用于受试者。在本发明的一个实施方案中，ctla4结合剂(例如isvd，诸如纳米抗体)与派姆单抗抗体组合，所述派姆单抗抗体包含含有以下氨基酸序列的免疫球蛋白重链(或其cdr-h1、cdr-h2和cdr-h3)：和含有以下氨基酸序列的免疫球蛋白轻链(或其cdr-l1、cdr-l2和cdr-l3)：。在本发明的一个实施方案中，ctla4结合剂(例如isvd，诸如纳米抗体)与抗体组合，所述抗体包含含有以下氨基酸序列的免疫球蛋白重链(或其cdr-h1、cdr-h2和cdr-h3)：和含有以下氨基酸序列的免疫球蛋白轻链(或其cdr-l1、cdr-l2和cdr-l3)：。在本发明的一个实施方案中，ctla4结合剂与以下中的任何一种或多种组合：13-顺式-视黄酸、3-[5-(甲基磺酰基哌啶甲基)-吲哚基]-喹诺酮、4-羟基他莫昔芬、5-脱氧尿苷、5'-脱氧-5-氟尿苷、5-氟尿嘧啶、6-巯基嘌呤、7-羟基星形孢菌素、a-443654、醋酸阿比特龙、abraxane、abt-578、阿考比芬、ads-100380、阿柏西普、alt-110、六甲蜜胺、阿米福汀、氨鲁米特、氨柔比星、安吖啶、阿那格雷、阿那曲唑、血管生成抑制因子、ap-23573、arq-197、阿佐昔芬、as-252424、as-605240、天门冬酰胺酶、ati3387、at-9263、阿曲生坦、阿昔替尼、azd1152、卡介苗(bcg)疫苗、巴他布林、bc-210、besodutox、贝伐珠单抗、bgj398、比卡鲁胺、bio111、bio140、bkm120、博来霉素、bms-214662、bms-247550、bms-275291、bms-310705、硼替佐米、布舍瑞林、白消安、骨化三醇、喜树碱、卡纽替尼、卡培他滨、卡铂、卡莫司汀、cc8490、cea(重组牛痘-癌胚抗原疫苗)、西地尼布、cg-1521、cg-781、查米多星、苯丁酸氮芥、氯毒素、西仑吉肽、西咪替丁、顺铂、克拉屈滨、氯膦酸盐、cobimetnib、col-3、cp-724714、环磷酰胺、环丙孕酮、乙酸环丙孕酮、阿糖胞苷、胞嘧啶阿糖胞苷、达拉菲尼、达卡巴嗪、达西司他、更生霉素、dalotuzumab、达鲁舍替、达沙替尼、道诺霉素、地卡塔尼(decatanib)、鱼藤素、地尼白介素、脱氧助间型霉素、缩酚酸肽、二芳基丙腈、二乙基己烯雌酚、diftitox、dne03、多西他赛、多韦替尼、多柔比星、屈洛昔芬、艾特咔林、钇-90标记的艾多替德、艾多替德、ekb-569、emd121974、encorafenib、内皮抑素、恩杂鲁胺、恩扎妥林、表柔比星、埃博霉素b、era-923、爱必妥、厄洛替尼、雌二醇、雌氮芥、依托泊苷、依维莫司、依西美坦、ficlatuzumab、非那雄胺、夫拉平度、氟尿苷、氟达拉滨、氟氢可的松、氟甲睾酮、氟他胺、folfox方案、氟维司群、galeterone、ganetespib、吉非替尼、吉西他滨、吉马替康、吡喃葡萄糖基脂质a、戈舍瑞林、乙酸戈舍瑞林、棉酚、gsk461364、gsk690693、hmr-3339、己酸羟孕酮、羟基脲、ic87114、伊达比星、idoxyfene、异环磷酰胺、im862、伊马替尼、imc-1c11、咪喹莫特、inc280、incb24360、ino1001、干扰素、白介素-2、白介素-12、伊匹单抗、伊立替康、jnj-16241199、酮康唑、krx-0402、拉帕替尼、拉索昔芬、lee011、来曲唑、亚叶酸、亮丙瑞林、醋酸亮丙瑞林、左旋咪唑、脂质体包覆的紫杉醇、洛莫司汀、氯那法尼、硫蒽酮、ly292223、ly292696、ly293646、ly293684、ly294002、ly317615、ly3009120、马立马司他、氮芥、甲羟孕酮乙酸酯、甲地孕酮乙酸酯、mek162、美法仑、巯基嘌呤、美司钠、甲氨蝶呤、普卡霉素、丝裂霉素、米托坦、米托蒽醌、热杀死的奥布分枝杆菌(mycobacteriumobuense)的混悬液、陶扎色替、mln8054、癌立消(neovastat)、新伐司他、来那替尼、neuradiab、尼洛替尼、尼鲁米特、诺拉曲塞、nvp-bez235、奥利美生、奥曲肽、奥法木单抗、奥戈伏单抗、ornatuzumab、orteronel、奥沙利铂、紫杉醇、帕博西尼、帕米膦酸盐、帕尼单抗、帕唑帕尼、pd0325901、pd184352、peg-干扰素、培美曲塞、喷司他丁、哌立福新、苯丙氨酸氮芥、pi-103、pictilisib、pik-75、哌喷昔芬、pki-166、普卡霉素、聚-iclc、卟菲尔钠、泼尼松、丙卡巴肼、孕酮、psk蛋白结合的多糖(源自担子菌纲杂色革盖菌(basidiomycetecoriolusversicolor)))、plx8394、px-866、r-763、雷洛昔芬、雷替曲塞、雷佐生、地磷莫司、利妥昔单抗、罗米地新、rta744、鲁比替康、scriptaid、sdx102、塞利西利、司美替尼、司马沙尼(semaxanib)、sf1126、西罗莫司、sn36093、索拉非尼、螺内酯、角鲨胺、sr13668、链脲菌素、su6668、辛二酰苯胺异羟肟酸(suberoylanalidehydroxamicacid)、舒尼替尼、合成的雌激素、他仑帕奈、塔利拉维(talimogenelaherparepvec)、他莫昔芬、替莫唑胺、坦罗莫司、替尼泊苷、替米利芬、睾酮、粉防己碱、tgx-221、沙利度胺、6-硫鸟嘌呤、噻替派、替西木单抗、替吡法尼、替沃扎尼(tivozanib)、tki-258、tlk286、tnfα(肿瘤坏死因子α)、拓朴替康、柠檬酸托瑞米芬、曲贝替定、曲美替尼、曲妥珠单抗、维甲酸、曲古抑菌素a、曲西立滨磷酸盐单水合物、双羟萘酸曲普瑞林、tse-424、尿嘧啶氮芥、丙戊酸、戊柔比星、凡德他尼、瓦他拉尼、vegf捕获物、威罗菲尼、长春碱、长春新碱、长春地辛、长春瑞滨、vitaxin、vitespan、伏立诺他(vorinostat)、vx-745、渥曼青霉素、xr311、结核杆菌(bacillustuberculosis)的z-100热水提取物、扎木单抗、zk186619、zk-304709、zm336372或zstk474。在本发明的一个实施方案中，ctla4结合剂(例如isvd，诸如纳米抗体)与一种或多种止吐药组合，所述止吐药包括，但不限于：卡索匹坦(glaxosmithkline)、奈妥吡坦(netupitant)(mgi-helsinn)和其它nk-1受体拮抗剂、帕洛诺司琼(由mgipharma作为aloxi销售)、阿瑞匹坦(由merckandco.作为emend销售；rahway,nj)、苯海拉明(由pfizer作为benadryl®销售；newyork,ny)、安泰乐(由pfizer作为atarax®销售；newyork,ny)、甲氧氯普胺(由ahrobinsco.作为reglan®销售；richmond,va)、劳拉西泮(由wyeth作为ativan®销售；madison,nj)、阿普唑仑(由pfizer作为xanax®销售；newyork,ny)、氟哌啶醇(由ortho-mcneil作为haldol®销售；raritan,nj)、氟哌利多(inapsine®)、屈大麻酚(由solvaypharmaceuticals,inc.作为marinol®销售；marietta,ga)、地塞米松(由merckandco.作为decadron®销售；rahway,nj)、甲基泼尼龙(由pfizer作为medrol®销售；newyork,ny)；丙氯拉嗪(由glaxosmithkline作为compazine®销售；researchtrianglepark,nc)、格拉司琼(由hoffmann-larocheinc.作为kytril®销售；nutley,nj)、昂丹司琼(由glaxosmithkline作为zofran®销售；researchtrianglepark,nc)、多拉司琼(由sanofi-aventis作为anzemet®销售；newyork,ny)、托烷司琼(由novartis作为navoban®销售；easthanover,nj)。癌症治疗的其它副作用包括红和白血细胞缺乏。因此，在本发明的一个实施方案中，ctla4结合剂(例如isvd，诸如纳米抗体)与治疗或预防这种缺乏的药剂(诸如例如，非格司亭、peg-非格司亭、促红细胞生成素、阿法依泊汀(epoetinalfa)或阿法达贝泊汀(darbepoetinalfa))组合。在本发明的一个实施方案中，ctla4结合剂(例如isvd，诸如纳米抗体)与疫苗组合。在本发明的一个实施方案中，所述疫苗是抗癌疫苗、肽疫苗或dna疫苗。例如，在本发明的一个实施方案中，所述疫苗是肿瘤细胞(例如，照射的肿瘤细胞)或树突细胞(例如，用肿瘤肽脉冲处理的树突细胞)。在本发明的一个实施方案中，ctla4结合剂(例如isvd，诸如纳米抗体)与治疗程序组合施用。治疗程序是由医师或临床医师在治疗受试者中进行的一个或多个步骤，其意图减轻治疗的受试者中的一种或多种症状(例如，癌症和/或传染性疾病的一种或多种症状)，无论是通过诱导此类症状的消退或消除，还是通过抑制此类症状(例如，癌症症状诸如肿瘤生长或转移)的进展，达到任何临床上可测量的程度。在本发明的一个实施方案中，治疗程序是抗癌辐射疗法。例如，在本发明的一个实施方案中，所述辐射疗法是外线束疗法(ebt)：一种用于将高能x-射线束递送至肿瘤位置的方法。所述束在患者外产生(例如，由直线加速器)且在肿瘤部位处靶向。这些x-射线可以破坏癌细胞，且小心的治疗计划允许豁免周围的正常组织。在患者体内没有放置放射源。在本发明的一个实施方案中，所述辐射疗法是质子束疗法：一类用质子而不是x-射线轰击患病组织的适形疗法。在本发明的一个实施方案中，所述辐射疗法是适形外线束辐射疗法：一种使用高级技术根据个体的身体结构定制辐射疗法的操作。在本发明的一个实施方案中，所述辐射疗法是短距离放射治疗：将放射性物质暂时放置在体内，经常用于向一个区域提供额外剂量—或增强剂量—的辐射。在本发明的一个实施方案中，与ctla4结合剂(例如isvd，诸如纳米抗体)组合施用的外科手术是外科手术肿瘤切除术。治疗用途本发明包括用于预防和/或治疗至少一种可以通过使用本发明的ctla4结合剂(例如isvd，诸如纳米抗体)，任选地与另外的治疗剂或治疗程序的组合，来预防或治疗的疾病或病症的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用药学活性量的ctla4结合剂和/或包含其的药物组合物。“治疗(treat)”或“治疗(treating)”是指将本发明的ctla4结合剂(例如isvd，诸如纳米抗体)施用于具有疾病的一种或多种症状的受试者(例如哺乳动物诸如人)，所述ctla4结合剂对所述疾病是有效的，例如，在具有癌症或传染性疾病、或者被怀疑具有癌症或传染性疾病的受试者的治疗中，所述药剂对所述癌症或传染性疾病具有治疗活性。通常，以会减轻治疗的受试者或群体中的一种或多种症状(例如，癌症或传染性疾病的一种或多种症状)的“有效量”或“有效剂量”施用所述ctla4结合剂，无论是通过诱导此类症状的消退或消除，还是通过抑制此类症状(例如，癌症症状诸如肿瘤生长或转移)的进展，达到任何临床上可测量的程度。所述ctla4结合剂的有效量可以随诸如以下的因素变化：患者的疾病阶段、年龄和重量，和药物在受试者中引起期望的应答的能力。待治疗的受试者可以是任何温血动物，但具体而言为哺乳动物，且更具体而言为人类。如技术人员将清楚，待治疗的受试者将具体而言是患有本文提及的疾病和病症或处于其风险下的受试者。通常，将遵循治疗方案，直至实现期望的治疗效果和/或持续与维持期望治疗效果一样长的时间。再次，这可以由临床医师确定。本文所述的ctla4结合剂(例如isvd，诸如纳米抗体))、多肽、化合物和多核苷酸(例如载体)优选向循环施用。因此，其可以以允许ctla4结合剂、多肽、化合物和多核苷酸进入循环的任何合适的方式(诸如静脉内、经由注射或输注)施用，或以允许ctla4结合剂、多肽、化合物和多核苷酸进入循环的任何其他合适的方式(包括经口施用、皮下施用、肌肉内施用、通过皮肤施用、鼻内施用、经由肺施用等)施用。合适的施用方法和途径将是技术人员清楚的，同样例如还来自ablynxn.v.的公开的专利申请，诸如wo04/041862、wo2006/122786、wo2008/020079、wo2008/142164或wo2009/068627的教导。为了制备本发明的ctla4结合剂(例如isvd，诸如纳米抗体)的药物组合物或无菌组合物，将所述ctla4结合剂与药学上可接受的载体或赋形剂混合。参见，例如，remington'spharmaceuticalsciencesandu.s.pharmacopeia:nationalformulary,mackpublishingcompany,easton,pa(1984)或remington'spharmaceuticalsciences。此类组合物是本发明的一部分。本发明的范围包括干燥的(例如，冷冻干燥的)包含ctla4结合剂(例如isvd，诸如纳米抗体)的组合物或其药物组合物，所述药物组合物包括药学上可接受的载体，但是基本上缺乏水。可以通过与可接受的载体、赋形剂或稳定剂混合，以制备例如冻干的粉剂、浆、水溶液或混悬液的形式的治疗剂和诊断剂的制剂(参见，例如，hardman,等人(2001)goodmanandgilman'sthepharmacologicalbasisoftherapeutics,mcgraw-hill,newyork,ny;gennaro(2000)remington:thescienceandpracticeofpharmacy,lippincott,williams,andwilkins,newyork,ny;avis,等人(编)(1993)pharmaceuticaldosageforms:parenteralmedications,marceldekker,ny;lieberman,等人(编)(1990)pharmaceuticaldosageforms:tablets,marceldekker,ny;lieberman,等人(编)(1990)pharmaceuticaldosageforms:dispersesystems,marceldekker,ny;weiner和kotkoskie(2000)excipienttoxicityandsafety,marceldekker,inc.,newyork,ny)。通常，为了预防和/或治疗本文提及的疾病和病症且取决于待治疗的特定疾病或病症、待使用的特定融合蛋白或构建体的功效和/或半衰期、使用的特定施用途径和特定药物制剂或组合物，本发明的纳米抗体和多肽将通常以每日每千克体重1克和0.01微克之间，优选每日每千克体重0.1克和0.1微克之间，诸如每日每千克体重约1、10、100或1000微克的量持续(例如通过输注)、作为单一日剂量或作为在一天期间的多个分剂量施用。临床医师将通常能够根据本文提及的因素确定合适的日剂量。还将清楚，在特定情况下，临床医师可以例如基于上文所引用的因素和其专业判断选择偏离这些量。通常，一些关于待施用的量的指南可以获自经由基本上相同途径施用的针对相同靶标的相当常规抗体或抗体片段通常所施用的量，然而考虑亲和力/亲合力、效力、生物分布、半衰期和技术人员众所周知的类似因素中的差异。向受试者施用ctla4结合剂(例如isvd，诸如纳米抗体)的模式可以变化。施用途径包括口服、直肠、透粘膜、肠、胃肠外；肌肉内、皮下、真皮内、骨髓内、鞘内、直接心室内、静脉内、腹膜内、鼻内、眼内、吸入、吹入法、局部、皮肤、透皮或动脉内。适当剂量的确定由临床医师做出，例如，使用本领域已知或疑似影响治疗的参数或因素。通常，在确定剂量时，所述剂量开始于稍微小于最适剂量的量，并且它在此后增加小增量，直到与任何负面副作用相比达到期望的或最适的效果。重要的诊断措施包括例如炎症的症状的诊断措施或产生的炎症性细胞因子的水平的诊断措施。通常，合乎需要的是，要使用的生物剂源自与治疗的靶向动物相同的物种，由此使对所述药剂的任何免疫应答最小化。在人受试者的情况下，例如，嵌合抗体、人源化抗体和全人抗体可能是合乎需要的。在选择适当剂量中的指导是可得到的(参见，例如，wawrzynczak(1996)antibodytherapy,biosscientificpub.ltd,oxfordshire,uk;kresina(编)(1991)monoclonalantibodies,cytokinesandarthritis,marceldekker,newyork,ny;bach(编)(1993)monoclonalantibodiesandpeptidetherapyinautoimmunediseases,marceldekker,newyork,ny;baert等人(2003)newengl.j.med.348:601-608;milgrom等人(1999)newengl.j.med.341:1966-1973;slamon等人(2001)newengl.j.med.344:783-792;beniaminovitz等人(2000)newengl.j.med.342:613-619;ghosh等人(2003)newengl.j.med.348:24-32;lipsky等人(2000)newengl.j.med.343:1594-1602)。可以通过医师或其他熟练的健康护理提供者通常用于评价该症状的严重程度或进展状态的任何临床测量，来评价疾病症状是否已经减轻。尽管本发明的一个实施方案(例如，治疗方法或制品)可能不会有效地减轻每个受试者中的靶疾病症状，但其应当减轻统计上显著数目的受试者中的靶疾病症状，如通过本领域已知的任何统计检验来确定，诸如student氏t-检验、chi2-检验、根据mann和whitney的u-检验、kruskal-wallis检验(h-检验)、jonckheere-terpstra-检验和wilcoxon-检验。通常，将遵循治疗方案，直至实现期望的治疗效果和/或持续与维持期望治疗效果一样长的时间。再次，这可以由临床医师确定。由于本发明的ctla4结合剂(例如isvd，诸如纳米抗体)能够结合ctla4，它们尤其可用于治疗或预防癌症、转移性癌症、实体瘤、血液癌症、白血病、淋巴瘤、骨肉瘤、横纹肌肉瘤、神经母细胞瘤、肾癌、白血病、肾移行细胞癌、膀胱癌、wilm氏癌、卵巢癌、胰腺癌、乳腺癌、前列腺癌、骨癌、肺癌、非小细胞肺癌、胃癌、结直肠癌、宫颈癌、滑膜肉瘤、头颈癌、鳞状细胞癌、多发性骨髓瘤、肾细胞癌、视网膜母细胞瘤、肝母细胞瘤、肝细胞癌、黑素瘤、肾横纹肌样瘤、尤因氏肉瘤、软骨肉瘤、脑癌、胶质母细胞瘤、脑膜瘤、垂体腺瘤、前庭神经鞘瘤、原始性神经外胚层肿瘤、成神经管细胞瘤、星形细胞瘤、间变性星形细胞瘤、少突神经胶质瘤、室管膜瘤、脉络丛乳头状瘤、真性红细胞增多症、血小板增多症、特发性骨髓纤维化、软组织肉瘤、甲状腺癌、子宫内膜癌、类癌或肝癌、乳腺癌和胃癌。本发明的ctla4结合剂(例如isvd，诸如纳米抗体)可用于治疗或预防感染性疾病，诸如例如病毒感染、细菌感染、真菌感染或寄生虫感染。在本发明的一个实施方案中，所述病毒感染是选自以下病毒的病毒感染：人免疫缺陷病毒(hiv)、埃博拉病毒、肝炎病毒(甲型、乙型或丙型)、疱疹病毒(例如，vzv、hsv-i、hav-6、hsv-ii和cmv、爱泼斯坦-巴尔病毒)、腺病毒、流感病毒、黄病毒、艾柯病毒、鼻病毒、柯萨奇病毒、冠状病毒、呼吸道合胞体病毒、腮腺炎病毒、轮状病毒、麻疹病毒、风疹病毒、细小病毒、牛痘病毒、htlv病毒、登革热病毒、乳头状瘤病毒、软疣病毒、脊髓灰质炎病毒、狂犬病病毒、jc病毒或虫媒病毒性脑炎病毒。在本发明的一个实施方案中，所述细菌感染是选自以下细菌的细菌感染：衣原体属(chlamydia)、立克次氏体属细菌、分枝杆菌属(mycobacteria)、葡萄球菌属(staphylococci)、链球菌属(streptococci)、肺炎球菌属(pneumonococci)、脑膜炎球菌(meningococci)和淋球菌(gonococci)、克雷伯氏菌属(klebsiella)、变形菌属(proteus)、沙雷氏菌属(serratia)、假单胞菌属(pseudomonas)、军团杆菌属(legionella)、白喉棒杆菌(corynebacteriumdiphtheriae)、沙门氏菌属(salmonella)、芽胞杆菌(bacilli)、霍乱弧菌(vibriocholerae)、破伤风梭菌(clostridiumtetan)、肉毒梭状芽孢杆菌(clostridiumbotulinum)、炭疽芽孢杆菌(bacillusanthricis)、鼠疫耶尔森氏菌(yersiniapestis)、麻风分枝杆菌(mycobacteriumleprae)、弥漫型麻风分枝杆菌(mycobacteriumlepromatosis)和borriella。在本发明的一个实施方案中，所述真菌感染是选自以下真菌的真菌感染：念珠菌属(candida)(白色念珠菌(candidaalbicans)、克鲁斯氏念珠菌(candidakrusei)、光滑念珠菌(candidaglabrata)、热带念珠菌(candidatropicalis)等)、新型隐球菌(cryptococcusneoformans)、曲霉菌属(aspergillus)(烟曲霉(aspergillusfumigatus)、黑曲霉(aspergillusniger)等)、毛霉菌属(mucorales)(mucor、absidia、rhizopus)、申克孢子丝菌(sporothrixschenkii)、皮炎芽生菌(blastomycesdermatitidis)、巴西副球孢子菌(paracoccidioidesbrasiliensis)、粗球孢子菌(coccidioidesimmitis)和荚膜组织胞浆菌(histoplasmacapsulatum)。在本发明的一个实施方案中，所述寄生虫感染是选自以下寄生虫的寄生虫感染：溶组织内阿米巴(entamoebahistolytica)、结肠小袋纤毛虫(balantidiumcoli)、福氏耐格里原虫(naegleriafowleri)、棘阿米巴属(acanthamoeba)、篮氏贾第鞭毛虫(giardialambia)、隐孢子虫属(cryptosporidium)、卡氏肺孢子虫(pneumocystiscarinii)、间日疟原虫(plasmodiumvivax)、微小巴贝虫(babesiamicroti)、布鲁斯锥虫(trypanosomabrucei)、克氏锥虫(trypanosomacruzi)、杜氏利什曼原虫(leishmaniadonovani)、刚地弓形虫(toxoplasmagondii)、巴西日本圆线虫(nippostrongylusbrasiliensis)。本发明还包括通过向受试者施用ctla4结合剂(例如f023700912或f023700914)；或体外通过使ctla4与ctla4结合剂接触，而用于在受试者体内进行如下的方法：·防止ctla4介导的对以下的抑制：t细胞共刺激信号传导、t细胞活化、t细胞增殖；·防止ctla4结合b7-1(cd80)或b7-2(cd86)；和/或·增强t细胞活化。此类活性可以经由ctla4结合剂介导。因此，此类方法还可以用任何包括ctla4结合剂的结合剂进行。本发明还涉及治疗前述疾病和病症的方法，其通常包括向有需要(即患有前述疾病之一)的受试者施用治疗有效量的本发明的ctla4结合剂(例如isvd，诸如纳米抗体)。本发明还涉及本发明的ctla4结合剂，其用于预防或治疗前述疾病或病症之一。本发明还提供了注射装置，其包含本文所述的ctla4结合剂(例如isvd，诸如例如纳米抗体))、多肽或多核苷酸或其药物组合物中的任一种。注射装置是经由胃肠外途径(例如，肌肉内、皮下或静脉内)将物质引入患者体内的装置。例如，注射装置可以是注射器(例如，预填充了药物组合物，诸如自动注射器)，其例如包括用于容纳待注射的流体(例如，包含所述ctla4结合剂或其药物组合物)的筒或桶，用于刺穿皮肤和/或血管以注射所述流体的针头；和用于将所述流体推出所述筒并穿过所述针头腔的柱塞。在本发明的一个实施方案中，包含ctla4结合剂或其药物组合物的注射装置是静脉内(iv)注射装置。这种装置包括在插管或套针/针头中的所述ctla4结合剂或其药物组合物，所述插管或套针/针头可以连接至管，所述管可以连接至用于容纳流体(例如，盐水；或含乳酸盐的林格溶液，其包含nacl、乳酸钠、kcl、cacl2且任选地包括葡萄糖)的袋或蓄池，所述流体通过所述插管或套针/针头引入受试者体内。在本发明的一个实施方案中，一旦将所述套针和插管插入受试者的静脉中并将所述套针从插入的插管取出，可以将所述ctla4结合剂或其药物组合物引入所述装置中。例如，可以将iv装置插入周围静脉(例如，在手或臂中)；上腔静脉或下腔静脉，或在心脏的右心房内(例如，中枢iv)；或插入锁骨下、颈内静脉或股静脉，且，例如，朝向心脏前进直到它到达上腔静脉或右心房(例如，中央静脉系)。在本发明的一个实施方案中，注射装置是自动注射器；喷射注射器或外部输液泵。喷射注射器使用液体的高压狭窄喷射，其穿透表皮以将所述ctla4结合剂或其药物组合物引入患者的身体。外部输液泵是将所述ctla4结合剂或其药物组合物以受控的量递送进患者的身体的医疗装置。外部输液泵可以由电或机械提供动力。不同的泵以不同的方式操作，例如，注射泵将流体容纳在注射器的蓄池中，且可移动的活塞控制流体递送，弹性体泵将流体容纳在有弹性的囊蓄池中，且来自所述囊的弹性壁的压力驱动流体递送。在蠕动泵中，一组滚子沿着柔性管道的长度向下挤压，从而向前推动流体。在多通道泵中，可以以多个速率从多个蓄池递送流体。还应注意，除非本文中另外明确指示，否则附图、任何序列表和实验部分/实施例仅为了进一步说明本发明而给出，且不应解释或理解为以任何方式限制本发明和/或所附权利要求的范围。本发明的其它方面、实施方案、优点和应用将从本文中的进一步描述变得显而易见。实施例这些实施例意图举例说明本发明而不是本发明的限制。在实施例中阐述的组合物和方法形成本发明的一部分。实施例1：f023700906纳米抗体与ctla-4-fc的结合单价f023700906纳米抗体11f01(l11v、a14p、q45r、a74s、k83r、v89l、m96p、q108l)-flag3-his6)(f023700912的构建嵌段)表现出与来自人和食蟹猴的ctla-4-fc融合分子的结合。在proteonxpr36(biorad670br0166)上，使用人ctla4-hfc和食蟹猴ctla4-hfc测定缔合速率、解离速率和亲和力(下表d)。这些结果证明纳米抗体对人和食蟹猴ctla-4的高亲和力结合，表明纳米抗体调节ctla-4的功能的潜能且食蟹猴可用作毒理学物种。表d-1.纳米抗体与人或食蟹猴ctla-4-fc的结合表d-2.试剂实施例2：f023700912纳米抗体与细胞表面ctla4的结合f023700912表现出与在细胞表面上表达的人ctla-4的结合。通过流式细胞术研究f023700912(11f01(e1d,l11v,a14p,q45r,a74s,k83r,v89l,m96p,q108l)-35gs-11f01(l11v,a14p,q45r,a74s,k83r,v89l,m96p,q108l)-35gs-alb11002-a])(实心圆)、f023700925(pd1结合剂-35gs-pd1结合剂-35gs-11f01(l11v,a14p,q45r,a74s,k83r,v89l,m96p,q108l)-35gs-11f01(l11v,a14p,q45r,a74s,k83r,v89l,m96p,q108l)-35gs-alb11002-a])(实心正方形)和无关纳米抗体(实心三角形)的批次与(a)批次分选的过表达hctla4的jurkatje6.2.11细胞或(b)过表达hctla4的cho-k1细胞的结合。经由alb11002结合mababh0074检测纳米抗体。在这些实验中生成的数据记载于图5(a-b)中。这些结果证明f023700912和f023700925与在细胞表面上表达的ctla-4的结合，表明这些纳米抗体调节ctla-4的功能。图5(a-b)是半衰期延长的(alb0011构建嵌段)纳米抗体f023700912(实心圆)、f023700925(实心正方形)和阴性对照纳米抗体irr00051(实心三角形)的批次于200μlfacs缓冲液(pbs(lifetechnologies，14190-094)、10%热灭活胎牛血清(sigma，f7524)、0.05%nan3(thermoscientific，19038))中的系列稀释液(起始浓度1μm，1/4系列稀释，12pts)，将其添加至(a)2e4个批次分选的过表达人ctla4的jurkatje6.2.11细胞/孔或(b)2e4个过表达人ctla4的cho-k1细胞/孔并在4℃下孵育30分钟。在三个洗涤步骤(1个洗涤步骤=移除纳米抗体稀释液，添加100μl冷facs缓冲液，在250g下离心5分钟)之后，将细胞在4℃下与3μg/ml抗alb11002小鼠mababh00074/冷facs缓冲液孵育30分钟，用于检测半衰期延长的纳米抗体。在三个洗涤步骤之后，将细胞在4℃下与pe山羊f(ab')2抗小鼠igg(jacksonimmunoresearch，115-116-071)于冷facs缓冲液中的1/100稀释液孵育30分钟。在三个洗涤步骤之后，使细胞再悬浮于补充有5nmto-pro-3(molecularprobes，t3605)的50μl冷facs缓冲液中并用facscanto分析。首先，基于fsc-ssc分布选择p1群体。将终止门控设定在p1中10000个细胞上。从该群体中排除to-pro-3+细胞(死亡细胞)。对于该p1/to-pro-3-阴性群体，计算中值pe值。实施例3：f023700912纳米抗体阻断ctla-4与cd80和cd86的结合。f023700912阻断人ctla-4与其配体cd80和cd86的结合。过表达hctla4的cho-k1细胞上，f023700912(实心圆)和伊匹单抗(实心正方形)与固定浓度(10×ec30)的(a)hcd80-hfc或(b)hcd86-hfc的竞争实验的流式细胞术分析。经由人iggfc融合蛋白检测配体。在这些实验中生成的数据记载于图6(a-b)中。这些结果表明f023700912阻断ctla-4与其配体cd80和cd86的结合的能力，说明f023700912影响通过ctla-4及其与cd80和cd86的相互作用调节的免疫反应的能力。图6(a-b)是纳米抗体f023700912(实心圆)和伊匹单抗(实心正方形)于100μlfacs缓冲液(pbs(lifetechnologies，14190-094)、10%热灭活胎牛血清(sigma，f7524)、0.05%nan3(thermoscientific，19038))中的系列稀释液(起始浓度1μm，1/3系列稀释液，12pts)，在固定浓度的(a)fitc标记的人cd80-hfc-his6或(b)fitc标记的人cd86-hfc-his6(分别在3.6和2的标记度下进行fitc标记；浓度=10xec30，分别为3.71e-08m或4.35e-08m)存在的情况下，将其添加至1e5个过表达人ctla4的chok1细胞/孔，并在4℃下孵育90分钟。在三个洗涤步骤(1个洗涤步骤=移除纳米抗体稀释液，添加100μl冷facs缓冲液，在250g下离心5分钟)之后，使细胞再悬浮于补充有5nmto-pro-3(molecularprobes，t3605)的50μl冷facs缓冲液中并用facscanto分析。首先，基于fsc-ssc分布选择p1群体。将终止门控设定在p1中10000个细胞上。从该群体中排除to-pro-3+细胞(死亡细胞)。对于该p1/to-pro-3-阴性群体，计算中值fitc值。实施例4：f023700912特异性评价特异性评价f023700912证明与ctla-4的选择性结合。在过表达细胞上使用流式细胞术进行针对btla、cd8、pd1、ctla4、lag3、cd28的特异性评价，而icos结合在elisa中作为重组蛋白(hicos-hfc)评估。经由直接标记的靶标特异性抗体证实btla、cd8、pd1、ctla4、lag3、cd28的表达。抗hicos和抗hctla4/抗hpd1阳性对照均为阳性。在elisa测定中未观察到与hicos的结合。图7(a-h)分别评价与阴性对照l细胞、阴性对照cho-k1细胞、hucd28+l细胞、hucd8α+l细胞、hulag-3+cho-k1细胞、hubtla+cho-k1细胞、huctla-4+cho-k细胞和hupd-1+cho-k1细胞的结合。对于f023700912，没能观察到与btla、cd8、pd1、lag3、cd28的结合，而在ctla-4+cho-k1细胞上观察到f023700912的有效结合。在这些实验中生成的数据记载于图7(a-h)中。这些结果说明f023700912与ctla-4的选择性结合，预测在体内施用后的最小脱靶效果。图7(a-h)是半衰期延长的(alb0011构建嵌段)纳米抗体f023700912(实心圆)、f023700925(实心正方形)和阴性对照纳米抗体irr00051(实心三角形)的批次于200μlfacs缓冲液(pbs(lifetechnologies，14190-094)、10%热灭活胎牛血清(sigma，f7524)、0.05%nan3(thermoscientific，19038))中的系列稀释液(起始浓度1μm，1/4系列稀释，12pts)，将其添加至(a)2e4个l细胞/孔、(b)2e4个cho-k1细胞/孔、(c)过表达人cd28的l细胞或(d)过表达人cd8α的l细胞、(e)2e4个过表达人lag3的cho-k1/孔、(f)2e4个过表达人btla的cho-k1细胞/孔、(g)过表达人ctla4的cho-k1细胞/孔或(h)过表达人pd1的cho-k1细胞/孔，并在4℃下孵育30分钟。在三个洗涤步骤(1个洗涤步骤=移除纳米抗体稀释液，添加100μl冷facs缓冲液，在250g下离心5分钟)之后，将细胞在4℃下与3μg/ml抗alb11002小鼠mababh00074/冷facs缓冲液孵育30分钟用于检测半衰期延长的纳米抗体。在三个洗涤步骤之后，将细胞在4℃下与pe山羊f(ab')2抗小鼠igg(jacksonimmunoresearch，115-116-071)于冷facs缓冲液中的1/100稀释液孵育30分钟。在三个洗涤步骤之后，使细胞再悬浮于补充有5nmto-pro-3(molecularprobes，t3605)的50μl冷facs缓冲液中并用facscanto分析。首先，基于fsc-ssc分布选择p1群体。将终止门控设定在p1中10000个细胞上。从该群体中排除to-pro-3+细胞(死亡细胞)。对于该p1/to-pro-3-阴性群体，计算中值pe值。实施例5：f023700912纳米抗体与人、恒河猴和小鼠白蛋白的结合f023700912与人、恒河猴和小鼠白蛋白结合，预测当与非白蛋白结合纳米抗体相比时延长的半衰期。当使用表面等离子共振(spr)分析时，观察到与人、恒河猴和小鼠血清白蛋白的结合。数据描述于下表e中。预期在体内施用后f023700912的白蛋白结合降低纳米抗体的清除率，改善其治疗潜能。表e.纳米抗体与白蛋白的结合仪器：biacoret100(gehealthcare)；传感器芯片：cm5(idt160713-2,gehealthcare,批号10242599)。实施例6：纳米抗体f023700906n73变体比较变体f023701051(11f01(l11v、a14p、q45r、n73q、a74s、k83r、v89l、m96p、q108l)-flag3-his6)、f023701054(11f01(l11v、a14p、q45r、n73t、a74s、k83r、v89l、m96p、q108l)-flag3-his6)和f023701061(11f01(l11v、a14p、q45r、n73y、a74s、k83r、v89l、m96p、q108l)-flag3-his6)与f023700906的阻断(a)cd80或(b)cd86与表达ctla-4的cho-k1细胞的结合的能力。所有这些变体都能够阻断cd80和cd84与ctla-4的结合。针对几种变体测定ctla4与cd80和cd86的阻断。这些阻断数据阐述于图8(a-b)中。这些结果说明改变位置n73中的氨基酸而没有对纳米抗体阻断cd80或cd86与ctla-4的结合的能力的主要影响的可行性。此类变体将允许避免n73处的去酰胺。实施例7：f023700912根除人源化小鼠中的确立的实体瘤将panc08.13肿瘤细胞(人胰腺癌)植入人源化小鼠(jacksonlaboratories)。如下处理具有确立的肿瘤(~100mm3，n=9-10/组)的小鼠：1-同种型对照(higg1-2mg/kg和higg4-3mg/kg)；2-伊匹单抗-n297a(3mg/kg)；3-伊匹单抗(3mg/kg)；4-派姆单抗(2mg/kg)；5-伊匹单抗(3mg/kg)+派姆单抗(2mg/kg)；6-f023700912(5mg/kg；表示为ctla4-nab5)，7-f023700912(15mg/kg；表示为ctla4-nab-15)，和8-f023700912(15mg/kg)+派姆单抗(2mg/kg)。所有抗体每7天皮下注射，进行6个剂量。f023700912每3.5天皮下施用，进行11个剂量。每4-5天测量肿瘤体积和体重。图9(a–b)中显示了平均肿瘤体积±sem、第37天的个体肿瘤体积和在实验过程中小鼠个体中的肿瘤体积。各处理组的肿瘤体积还显示于图9(c-j)中。还测量各处理组中的平均(平均值±sem)和个体体重变化(图9(k-s))。发现死亡或由于体重减轻而人道安乐死的小鼠的数目指示为“#”。“↑”指示抗体且“*”指示纳米抗体给药时间表。这些数据说明f023700912在携带人免疫细胞的动物中体内诱导抗人肿瘤应答的能力。这些数据支持f023700912在治疗人癌症中的潜能。实施例8：f023700912和f023700925与来自健康受试者和癌症患者的预先存在抗体的结合三价参考纳米抗体013700112(未经修饰用于减少预先存在抗体的结合)表现出与来源于(图10a)健康受试者或(图10b)癌症患者的几种血清样品的结合。类似尺寸的序列优化的三价纳米抗体f023700912表现出与相同血清样品的较低频率的结合。f023700925包含与f023700912相同的构建嵌段。尽管尺寸较大，但五价f023700925纳米抗体表现出不超过参考纳米抗体013700112的与预先存在抗体的结合。使用proteonxpr36(bio-radlaboratories,inc.)评价预先存在抗体与在人类血清白蛋白(hsa)上捕获的纳米抗体的结合。使用pbs/tween(磷酸盐缓冲盐水，ph7.4，0.005%tween20)作为运行缓冲液，并在25℃下进行实验。用edc/nhs(流动速率30μl/min)活化proteonglc传感器芯片的配体泳道，且注射proteon乙酸盐缓冲液ph4.5(流动速率100μl/min)中10μg/ml的hsa，以给出近似3600ru的固定化水平。在固定化之后，表面用乙醇胺hcl(流动速率30μl/min)去活化。在hsa表面上以45μl/min注射纳米抗体持续2分钟以使得三价f023700912的纳米抗体捕获水平为近似600ru且五价f023700925的纳米抗体捕获水平为近似1000ru。含有预先存在抗体的样品在pbs-tween20(0.005%)中1：10稀释，然后以45μl/min注射2分钟，接下来为随后400秒解离步骤。在各循环之后(即在新纳米抗体捕获和血液样品注射步骤之前)，用45μl/min的2分钟hcl(100mm)注射，再生hsa表面。用proteon管理器3.1.0(bio-radlaboratories,inc.)进行传感图处理和数据分析。通过减去1)纳米抗体-hsa解离和2)与仅含有hsa的参考配体泳道的非特异性结合，在双重参考之后，获得显示预先存在抗体结合的传感图。通过将报道点设定在125秒(缔合结束之后5秒)来测定预先存在抗体的结合水平。作为参考，还测试含有预先存在抗体的样品与未经修饰用于减少这些预先存在抗体的结合的三价纳米抗体(t013700112)的结合。实施例9：通过氢氘交换质谱进行的抗hctla4纳米抗体的表位作图通过使用氢氘交换质谱(hdx-ms)分析测定抗hctla4纳米抗体f023700912之间的接触区域。hdx-ms测量氘至蛋白的酰胺骨架中的并入且该并入的变化受氢的溶剂暴露影响。在仅抗原样品和纳米抗体结合样品中，进行氘交换水平的比较，以鉴定可与纳米抗体接触的抗原区域。受纳米抗体f023700912最强保护免于氘化的人ctla4残基为vrvtvl(seqidno:110的残基33-38)、adsqvtevc(seqidno:110的残基41-49)和ckvelmypppyylg(seqidno:110的残基93-106)。证实f023700912与ctla4的结合的热图阐述于图13中。表f.氨基酸序列(seqidno:110)当前第1页12当前第1页12