一种改变黑曲霉基因组局部结构提高纤维素酶表达量的方法与流程

文档序号：12412086阅读：243来源：国知局

技术领域

本发明属于基因工程领域，涉及一种改变黑曲霉基因组局部结构提高纤维素酶表达量的方法。

背景技术：

黑曲霉是生产纤维素酶的优异菌株，黑曲霉生产的纤维素酶具有生产安全性好、纤维素酶为胞外酶、表达量大、纤维素酶的耐热性好等一系列优点。黑曲霉生产纤维素酶工业化应用的瓶颈是黑曲霉纤维素酶的生产成本相对较高。因此，提高黑曲霉纤维素酶的表达量成为实现工业化应用的攻关目标之一。

已有的提高黑曲霉纤维素酶表达量的方法，一般是通过多克隆提高表达量；强启动子提高表达量；优化信号肽提高分泌效率；优化密码子提高表达效率。在黑曲霉的基因组形成超级螺旋结构的时候，DNA形成一种压缩结构。DNA压缩的状态以及基因在压缩基因组中的位置直接影响到表达效率。因为RNA聚合酶要结合到DNA上转录出mRNA，就必须让DNA形成一种松弛结构。基于这一点，基因在核酸上的相对位置直接决定了其形成松弛态的难易程度，以及与RNA聚合酶结合的难易程度。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种改变黑曲霉基因组局部结构提高纤维素酶表达量的方法，以及通过该方法得到的纤维素酶表达量提高的黑曲霉菌株。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

一种改变黑曲霉基因组局部结构提高纤维素酶表达量的方法，包括如下步骤：

（1）将两端有限制性内切酶识别位点且含有SEQ ID NO.1所示序列的同源重组片段通过相应限制性内切酶和DNA连接酶构建到载体上。同源重组片段的序列组成为：同源片段前段序列-外加片段序列-潮霉素B抗性表达单元盒序列-同源片段后段序列。

（2）将步骤（1）构建的重组载体转化到黑曲霉中，筛选同源重组成功的黑曲霉菌株。同源重组成功的黑曲霉菌株的纤维素酶表达量得到提高。

步骤（1）中所述的载体优选为pBluescript II SK(-)；所述的限制性内切酶优选为EcoRI。

步骤（2）中所述的黑曲霉优选为黑曲霉ATCC16404。

一种黑曲霉菌株，为上述同源重组成功的黑曲霉菌株。

本发明通过在调控目标基因的上方插入一定长度的DNA片段，以改变目的基因在基因组中的相对位置，进而调控其转录与表达效率。

本发明具有如下优点和有益效果：本发明把一段含有潮霉素B抗性表达单元盒和外加片段的序列通过同源重组的方式整合到黑曲霉基因组中。以潮霉素B为筛选标记，以外加片段和潮霉素B抗性表达单元盒的插入来改变整个基因组的长度，从而改变β-葡萄糖苷酶表达单元在整个基因组中的位置。β-葡萄糖苷酶表达单元在整个基因组中的位置的改变，会影响β-葡萄糖苷酶表达单元与核小体蛋白结合的状态，从而增强了β-葡萄糖苷酶的表达效率。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

实施例1

1. 材料

黑曲霉（Aspergillus niger）ATCC16404，大肠杆菌（Escherichia coli）DH5α，根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）AGL1，pBluescript II SK(-)质粒。

合成的两端有EcoRI酶切位点的同源重组片段1（SEQ ID NO.1），序列组成为：CCGAATTC（EcoRI酶切位点）-同源片段前段序列（SEQ ID NO.2）-外加片段序列（SEQ ID NO.3）-潮霉素B抗性表达单元盒序列（SEQ ID NO.4）-同源片段后段序列（SEQ ID NO.5）-GAATTCGG（EcoI酶切位点）。

2. 方法

（1）质粒pBluescript II SK的提取

含有质粒pBluescript II SK的大肠杆菌DH5α在含有30μg/mL氨苄霉素的LB培养基中培养18h。质粒提取按照上海生工的一步法质粒DNA抽提试剂盒（产品编号B518188）的操作流程提取。具体如下：取0.5mL菌液，10000r/m离心3min收集菌体，倒尽或吸干培养基。在菌体沉淀中加入700μL Lysis Buffer UF，吸打或振荡至彻底悬浮菌体，室温放置3min。将裂解液全部小心移入吸附柱，室温放置1min，8000rpm离心2min。倒掉收集管中的液体，将吸附柱放入同一个收集管中，向吸附柱中加入500μL Prewash Solution，8000rpm离心2min。倒掉收集管中的液体，将吸附柱放入同一个收集管中，向吸附柱中加入500μL Wash Solution，8000rpm离心1min。倒掉收集管中的液体，将吸附柱放入同一个收集管中，再次向吸附柱中加入500μL Wash Solution，8000rpm离心1min。倒掉收集管中的液体，将吸附柱放入同一个收集管中，将空吸附柱和收集管放入离心机，8000rpm离心2min。将吸附柱放入干净的1.5mL离心管中，在吸附膜中央加入50μL Elution Buffer，室温静置2min，8000r/m离心2min。将所得到的质粒DNA溶液置于-20℃保存或用于后续试验。

（2）重组质粒的构建

1）pBluescript II SK质粒、同源重组片段1的酶切、回收

往20μL提取的pBluescript II SK质粒或用双蒸水稀释的同源重组片段中加入EcoRI（Takara）2μL、酶切缓冲液2.4μL，37℃水浴3h后，加入2μL Loading Buffer，终止反应。

酶切的质粒或同源重组片段1通过琼脂糖凝胶电泳后用上海生工的SanPrep核酸纯化套件（胶回收）试剂盒（B515103-0100）回收，得pBluescript II SK质粒酶切回收液、同源重组片段1酶切回收液。

2）连接和转化

连接体系为：pBluescript II SK质粒酶切回收液17.5μL，同源重组片段1酶切回收液2μL，DNA连接酶（Takara）2.5μL，2.4μL缓冲液。16 ℃连接24h，连接产物备用。

将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，挑取转化子培养，提质粒进行酶切、测序鉴定，鉴定正确的重组质粒命名为pBS-1。

（3）黑曲霉孢子原生质体制备及重组质粒的转化

1）斜面活化

在无菌操作台中，将保藏的黑曲霉ATCC16404菌种接入已灭菌的斜面培养基中，置于30℃恒温培养箱中培养3天，斜面长出孢子。

所用斜面培养基为PDA培养基，其配制方法为：取新鲜马铃薯60g，去皮切成细丝状，加入适量蒸馏水，置于蒸煮锅内煮沸并不断用玻璃棒搅拌至快成糊状，用八层纱布过滤取滤液，依次加入用天平称取的葡萄糖2g、琼脂2g，搅匀，最后用蒸馏水定容至100mL，加热溶解。分装于试管中，约至试管的三分之一，然后加塞包扎灭菌，灭菌温度为121℃，压强为0.1Mpa，灭菌20min。灭菌结束后摆斜面冷却待用。

2）孢子悬浮液的制备

将已活化的黑曲霉孢子从试管中刮到装有生理盐水的三角瓶中，置于30℃摇床上，150r/m震荡10min。取出用4层擦镜纸过滤，将滤液用3000r/m离心，弃上清液，用生理盐水洗涤1-2次。然后对悬浮液进行镜检和计数，调整孢子浓度约为5×10⁸个/mL，50℃热激1min，30℃培养8h，得到孢子萌发悬浮液。

3）原生质体悬液的制备

采用高渗溶液即0.8mol/L NaCl溶液配制0.5%蜗牛酶和1%纤维素酶的混合酶液10mL，加入10mL孢子萌发悬浮液，30℃水浴4h，用微孔滤膜过滤，再用0.8mol/L NaCl 溶液反复冲洗滤膜上的孢子，最后滤膜上的孢子溶解到10mL 0.8mol/L NaCl溶液中，得到原生质体悬液。

4）根癌农杆菌感受态的制备

挑取根癌农杆菌AGL1接种于3mL LB液体培养基中，28℃、180r/min培养过夜。取2mL 培养液接种于100mL LB液体培养基中继续培养，至OD₆₀₀为0.5左右。将培养液置冰浴中40min后4℃、5000r/min 离心10min，弃去上清液。用10mL 4℃预冷的无菌水离心洗涤1次，弃去上清液。再用10mL 4℃预冷的10%甘油悬浮菌体，4 ℃、5000r/min离心5min，弃去上清液。最后用1mL 4℃预冷的10%甘油悬浮，分装成每管70μL，-70 ℃保存。

5）根癌农杆菌的转化和培养

取1μL重组质粒pBS-1加到70μL根癌农杆菌AGL1感受态细胞中，混匀，吸取并加到间距0.2cm电转杯中，擦拭干净，调节电击电压为2.5kV，电击5ms。将电转化后的根癌农杆菌涂布于LB平板（含100μg/mL氨苄霉素）上进行筛选。筛选得到的阳性克隆子在LB平板（含100μg/mL氨苄霉素）上划线，28℃培养2d。挑取单菌落接种于5mL LB液体培养基（含100μg/mL氨苄霉素）中，28℃、180r/min培养16～20h。取1mL根癌农杆菌菌液接种于含有相应抗性的100mL LB液体培养基中，28℃、180r/min培养至OD₆₀₀为0.8左右时备用。

6）诱导培养和转化

根癌农杆菌的诱导培养：取4mL（OD₆₀₀＝0.8）的根癌农杆菌菌液5000r/min离心5min 收集菌体，用6mL含有400μmol/L乙酰丁香酮的IM培养基悬浮菌体，28℃悬浮培养5h。IM培养基：KH₂PO₄ 1.45g，K₂HPO₄ 2.05g，NH₄NO₃ 0.5g，CaCl₂ 0.01g，MgSO₄·7H₂O 0.6g，NaCl 0.3g，葡萄糖2g，甘油5g，100mL水，盐酸调节pH 5.4。

转化：黑曲霉原生质悬液250μL，调节诱导后的根癌农杆菌菌液的浓度，按黑曲霉孢子与根癌农杆菌1:100的数量比例等体积混合均匀，涂布在转化媒介醋酸硝酸混合膜的IM固体培养基上。

7）转化子的筛选

涂布在转化媒介醋酸硝酸混合膜的IM固体培养基上的黑曲霉24℃避光培养48h，转移到含有150μg/mL潮霉素B的PDA平板上进行初筛，培养2d，菌丝转接至200μg/mL潮霉素B的PDA平板上进行复筛，得到同源重组成功的转化子。

（4）β-葡萄糖苷酶的表达活性

产酶培养基配制：麸皮10g，蛋白胨1g，牛肉膏1g，自来水1L，115℃灭菌30min。在250mL三角瓶中装入150mL液体产酶培养基。

产酶培养：在无菌操作台中，将出发菌株黑曲霉ATCC16404或筛选的同源重组成功的转化子（最终转化子）接入已灭菌的斜面PDA培养基中，置于30℃恒温培养箱中培养3d，得到斜面孢子。斜面孢子接入到产酶培养基中，接种量为 1×10⁵孢子/mL，150r/m、30℃培养36h，培养液用滤纸过滤，测定滤液β-葡萄糖苷酶的酶活。黑曲霉ATCC16404的酶活为13.9U/mL，最终转化子的酶活为19.8U/mL。β-葡萄糖苷酶酶活测定按照文献（冯月，蒋建新，朱莉伟，菅红磊。纤维素酶活力及混合纤维素酶协同作用的研究。北京林业大学学报，2009，第31卷，增刊1）。

实施例2

对比试验1：除同源重组片段的外加片段序列末尾少了碱基AAGAA外，其余操作同实施例1，最后筛选的同源重组成功的转化子测定的β-葡萄糖苷酶酶活为18.3U/mL。

对比试验2：除同源重组片段的外加片段序列末尾多了碱基CAAAA外，其余操作同实施例1，最后筛选的同源重组成功的转化子测定的β-葡萄糖苷酶酶活为16.2U/mL。

对比试验3：除同源重组片段没有外加片段外，其余操作同实施例1，最后筛选的同源重组成功的转化子测定的β-葡萄糖苷酶酶活为17.8U/mL。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 湖北工业大学

<120> 一种改变黑曲霉基因组局部结构提高纤维素酶表达量的方法

<130> 1

<160> 5

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 4392

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 同源重组片段

<400> 1

atacagagtg tttacggaaa tcgagatggt ctactagggt tggacattcc aagaggcgac 60

gctctcatca cgacggcttc tattctccga cacaagagtt ttctatgaat gttccaacca 120

caaaaacata aaagatgagt taactggtga ctaccccaat actgctgaaa ccgcaggggc 180

tgcgctattg agttacgcca aggtggtgag ccggttcacg aaaaggaaac taacttggga 240

gtgtgatgta cttcgcgcat tcgcaggcgt tctacacaca ggatggggac ccgagaatta 300

ttatggcata cccctgaata tcttcagtga tgcaattctc tggaggacgg tgaaaaagaa 360

tccgtattcc acgaggcatg cagctcctgg tgatgcattt ccttcctggt cgtggtcttc 420

catcaaaggt cgcataacag tcgaaccatc agccagggaa ggtggcatat ttgcagaaat 480

gcgggcttct ctagcaattt gggcgatccc tcgtagggcg agacagcgac tagaacttca 540

gataatcgca aataccctgg ggaaaccaga gaagcccaac aaactagatg atgtgaagtc 600

gcccaacaac atgaacgaga aggaagtaac acatactgca catgagttgt atgctccttg 660

taatttcagg gacttacgta cacgacttgg cgttgtgatg gcctggagat gtggatgttt 720

ctcgggatct ctaccgggca tactcaacac tccatttacg tggggcgaat acaaggtttt 780

tgctaggaaa tggagaaccc ttgggcatct ctgcgatgag gctcatggaa tgtcacaggg 840

tagcatgtct gaacaagata tagaagcgcg atttccttcg aatatgcgtc aaggatgtcc 900

tccaggatcc atctttgtct acactcaatc acttaatctc aacccattac aactaagcct 960

gaagaaatgt ctgaacaaga tatagaagcg cgatttcctt cgaatatgcg tcaaggatgt 1020

cctccaggat ccatctttgt ctacactcaa tcacttaatc tcaacccatt acaactaagc 1080

ctgaagaaag agatagattt gtagagagag actggtgatt tcagcgtgtc ctctccaaat 1140

gaaatgaact tccttatata gaggaaggtc ttgcgaagga tagtgggatt gtgcgtcatc 1200

ccttacgtca gtggagatat cacatcaatc cacttgcttt gaagacgtgg ttggaacgtc 1260

ttctttttcc acgatgctcc tcgtgggtgg gggtccatct ttgggaccac tgtcggcaga 1320

ggcatcttga acgatagcct ttcctttatc gcaatgatgg catttgtagg tgccaccttc 1380

cttttctact gtccttttga tgaagtgaca gatagctggg caatggaatc cgaggaggtt 1440

tcccgatatt accctttgtt gaaaagtctc aatagccctt tggtcttctg agactgtatc 1500

tttgatattc ttggagtaga cgagagtgtc gtgctccacc atgttatcac atcaatccac 1560

ttgctttgaa gacgtggttg gaacgtcttc tttttccacg atgctcctcg tgggtggggg 1620

tccatctttg ggaccactgt cggcagaggc atcttgaacg atagcctttc ctttatcgca 1680

atgatggcat ttgtaggtgc caccttcctt ttctactgtc cttttgatga agtgacagat 1740

agctgggcaa tggaatccga ggaggtttcc cgatattacc ctttgttgaa aagtctcaat 1800

agccctttgg tcttctgaga ctgtatcttt gatattcttg gagtagacga gagtgtcgtg 1860

ctccaccatg ctatttcttt gccctcggac gagtgctggg gcgtcggttt ccactatcgg 1920

cgagtacttc tacacagcca tcggtccaga cggccgcgct tctgcgggcg atttgtgtac 1980

gcccgacagt cccggctccg gatcggacga ttgcgtcgca tcgaccctgc gcccaagctg 2040

catcatcgaa attgccgtca accaagctct gatagagttg gtcaagacca atgcggagca 2100

tatacgcccg gagtcgtggc gatcctgcaa gctccggatg cctccgctcg aagtagcgcg 2160

tctgctgctc catacaagcc aaccacggcc tccagaagaa gatgttggcg acctcgtatt 2220

gggaatcccc gaacatcgcc tcgctccagt caatgaccgc tgttatgcgg ccattgtccg 2280

tcaggacatt gttggagccg aaatccgcgt gcacgaggtg ccggacttcg gggcagtcct 2340

cggcccaaag catcagctca tcgagagcct gcgcgacgga cgcactgacg gtgtcgtcca 2400

tcacagtttg ccagtgatac acatggggat cagcaatcgc gcatatgaaa tcacgccatg 2460

tagtgtattg accgattcct tgcggtccga atgggccgaa cccgctcgtc tggctaagat 2520

cggccgcagc gatcgcatcc atagcctccg cgaccggttg tagaacagcg ggcagttcgg 2580

tttcaggcag gtcttgcaac gtgacaccct gtgcacggcg ggagatgcaa taggtcaggc 2640

tctcgctaaa ctccccaatg tcaagcactt ccggaatcgg gagcgcggcc gatgcaaagt 2700

gccgataaac ataacgatct ttgtagaaac catcggcgca gctatttacc cgcaggacat 2760

atccacgccc tcctacatcg aagctgaaag cacgagattc ttcgccctcc gagagctgca 2820

tcaggtcgga gacgctgtcg aacttttcga tcagaaactt ctcgacagac gtcgcggtga 2880

gttcaggctt tttcatcgtt caaacatttg gcaataaagt ttcttaagat tgaatcctgt 2940

tgccggtctt gcgatgatta tcatataatt tctgttgaat tacgttaagc atgtaataat 3000

taacatgtaa tgcatgacgt tatttatgag atgggttttt atgattagag tcccgcaatt 3060

atacatttaa tacgcgatag aaaacaaaat atagcgcgca aactaggata aattatcgcg 3120

cgcggtgtca tctatgttac tagatcgggg atatgtcgct ccaaaaagac atacttgcta 3180

ttgaagttgg cgattttctt gccctcgtca tcgatggctc catcaacatc gagcgaatca 3240

accatgttcg ccaacataat cccgaatctt gtttcagtct gcttgctatc tcactctcag 3300

aaccttggga ctccgagaca gagcacttga aaccaagaac tgaagacttc tggtatgatt 3360

ctgcaggagt tccattgggt caaaatccgc atgatcccca tgcgatcgac cttatgcttg 3420

ttgagacgga aaatggcatt agtcggcgtg ctggactggc acggggttat ttaaaacgat 3480

ggatagacca gaaccctcag ttccagacat tccaccttgt atagatagca tgggcagagc 3540

tgacacatag agaaaaaaga aaaaaaaaat catcctggaa ttaggaaact gtcattgagc 3600

tcatcaggcc ctgatagacg gtaccacaca tgtaaatttc gcggctccca ttgggttact 3660

cctggtaaat aaccctcggt cagagtatgg ctcgacagaa ggaacagaat ttggccattc 3720

attttattgc ccgttctaca gtagtactta ctaagtacta actatgaaag ccactcatta 3780

ccccggccta accttccttc tccttcccga ttatctttcc ccaaccactc aactaacttt 3840

gccccttgta cgtaacaaaa tagtttgtag atactgtaag gtgccgcacc ccaattctgc 3900

agagcacaca gaatggaaaa atacccatta gatacccact tggcctctag aataattcga 3960

gaagttatta tctcgtttta gctgttgtcg tcatgtatct ctagtgcgtg attggccagt 4020

ttcatggtga ccgacgggcc gagccatccc tcccactccc gcgtcgagat tggctactca 4080

gtgactgaat cagggcagtt tactcggtag tactactgtc tgtctgtctt caaagagtct 4140

ttttgatata agttgttgct aaggatgaca acggtgcggt tatataactc gcgctttatg 4200

ggattctctt tatcttgttt ttcataccct taactattta cttgacttca atgtgaatac 4260

cgtagcgagc agccgctcta ggtctaccgc accagcattc cttagttatt ccaaaacggc 4320

cctccaacaa atatcgatcg cctgagattg gggcacctct ccagcgcccc ccacctgaca 4380

actaaaaact gc 4392

<210> 2

<211> 966

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 同源片段前段

<400> 2