一种展示VEGFR‑2的重组T4噬菌体的制备方法与流程

文档序号：12412078阅读：405来源：国知局

本发明属于医药工程技术领域，具体涉及一种能在表面展示VEGFR-2 蛋白的重组T4噬菌体的制备方法。

背景技术：

恶性肿瘤的生长、侵袭和转移依赖于血管生成。血管生成主要取决于促血管生成因子和抑制血管生成因子之间的平衡与失衡，肿瘤细胞产生促血管生成因子增多和 (或) 抑制血管生成因子的减少均可以启动肿瘤血管生成过程。目前，已经有超过20 个促血管生成因子和 300 个抑制血管生成因子被发现。促血管生成因子主要包括：血管内皮生长因子 (VEGF) 、血小板衍生生长因子 (PDGF) 、碱性成纤维细胞生长因子 (bFGF) 、转化生长因子 (TGF) 、胰岛素样生长因子 (IGF) 和表皮生长因子 (EGF) 等，而抑制因子主要有血管抑制素 (Angiostatin) 、内皮抑素 (Endostatin) 、凝血栓蛋白-1 (TSP-1) 、血小板因子-4 (PF-4)、基质金属蛋白酶 (MMPs) 抑制剂、生长抑素 (Somatostatin) 等。

VEGF是最重要的促血管生成因子，目前发现的 VEGF家族包括六大成员，即VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、VEGF-E和胎盘生长因子(PLGF)，都是二聚体糖蛋白。其中，VEGF-A 主要影响血管的生成，它是发现最早、研究最深入的 VEGF 家族成员，而 VEGF-C 和 VEGF-D 与淋巴管的形成关系更加密切。许多肿瘤组织和肿瘤细胞株均高表达VEGF，既能通过旁分泌作用于肿瘤血管内皮细胞，促进血管生成，同时又能通过自分泌刺激肿瘤细胞的增殖，从而促进肿瘤的生长、侵袭和转移。VEGF的生物活性主要通过 VEGF 受体 (VEGFR，Vascular Endothelial Growth Factor Receptor，血管内皮细胞生长因子受体) 介导，目前已发现 3 种 VEGF 受体：VEGFR-1、VEGFR-2和VEGFR-3。其中，VEGFR-3 在淋巴系统中表达，而 VEGFR-1 和 VEGFR-2 则位于血管内皮细胞上，均属于酪氨酸激酶III型受体，都有 7 个免疫球蛋白样胞外区、跨膜区和一个含酪氨酸激酶的细胞内功能区。人的 VEGFR-2 又名激酶插入区受体 (KDR)，是 VEGF 的主要功能受体。由于VEGF/VEGFR-2 信号通路在肿瘤血管生成过程中起关键作用，因此阻断该信号通路的策略可以被用于抗肿瘤血管生成。目前主要包括 VEGF 或 VEGFR-2 的单克隆抗体、可溶性 VEGFR-2 受体和小分子酪氨酸激酶抑制剂等。贝伐珠单抗 (Bevacizumab) 是人源化的 VEGF 单克隆抗体，2004 年2月获美国食品药品管理局(FDA)批准用于结直肠癌的治疗。雷莫罗单抗 (Ramucirumab) 是完全人源化的 VEGFR-2 单克隆抗体，2014年4月获 FDA批准用于治疗进展期胃癌或胃食管连接部腺癌。

T4 噬菌体表面展示技术 (T4 phage display) 是 1996 年建立起来的一种噬菌体展示技术，是利用 T4 噬菌体衣壳表面上的 2 个非必需外壳蛋白：小外壳蛋白 (SOC) 和高抗原性外壳蛋白 (HOC) 建立起来的蛋白表达展示系统。T4 噬菌体基因组很大，可以插入 1000~2000 氨基酸长度外源蛋白基因，表达分子量很大的蛋白质，并且将表达的外源蛋白以融合蛋白的形式展示在 T4 噬菌体的表面，并保持相对独立的空间构象和原有的生物活性。而且 T4 噬菌体是双股 DNA 噬菌体中唯一能够在体内产生空衣壳的噬菌体，这种缺乏 DNA 的可以展示外源蛋白的空衣壳，在生物安全性方面具有十分光明的前景。目前主要应用于抗原、抗体库的建立，双重展示肽库的建立，蛋白质相互作用研究，疫苗设计和诊断试剂的研制等方面，其中疫苗研制方面的应用最多，包括人类免疫缺陷病毒 (HIV) 疫苗，口蹄疫病毒 (FMDV) 疫苗，猪瘟病毒 (CSFV) 疫苗等。

技术实现要素：

本发明目的在于提供一种能够表面展示VEGFR-2 蛋白的重组T4噬菌体的制备方法，利用该方法所制备的重组后T4噬菌体，可以用于肿瘤及与血管增生有关的疾病治疗中。

本发明所提供的技术方案详述如下。

一种展示VEGFR-2的重组T4噬菌体的制备方法，该方法技术原理为：首先构建携带有VEGFR-2胞外区片段的重组质粒pJKS-VEGFR-2，然后转化大肠杆菌BL21，同时利用溶菌酶缺陷型噬菌体T4 e^-侵染大肠杆菌BL21，使T4 e^-噬菌体与pJKS-VEGFR-2发生同源重组，最终获得表面展示VEGFR-2蛋白的重组T4噬菌体；具体制备过程包括如下步骤：

（1）设计引物，并对VEGFR-2胞外区基因片段进行PCR扩增，具体为：

首先，人工设计含有SalI 和 NdeI酶切位点的系列引物序列如下：

Sal1-Ig1-F：5’-acgcgtcgacatggcctctgtgggtttgcct-3’，

Nde1-Ig4-R：5’- cggaattccatatgtgggacattcacaaccagagag-3’，

Nde1-Ig5-R：5’- cggaattccatatgacccctgatcacatggaagga-3’，

Nde1-Ig6-R：5’- cggaattccatatgtgccatgcgctctaggatgat-3’，

Nde1-Ig7-R：5’- cggaattccatatgttccaagttggtcttttcctgg-3’；

然后，以小鼠VEGFR-2细胞外片段核酸编码序列为模板，进行PCR扩增，

对PCR扩增产物进行电泳检测，并回收；

以不同引物序列组合进行PCR扩增时，可获得VEGFR-2胞外区不同免疫球蛋白样结构域的基因片段：VEGFR2-1-4、VEGFR2-1-5、VEGFR2-1-6、VEGFR2-1-7；

所述VEGFR2-1-4，包含1212bp，具体碱基序列如SEQ ID NO.1所示；

所述VEGFR2-1-5，包含1590bp，具体碱基序列如SEQ ID NO.2所示；

所述VEGFR2-1-6，包含1938bp，具体碱基序列如SEQ ID NO.3所示；

所述VEGFR2-1-7，包含2232bp，具体碱基序列如SEQ ID NO.4所示；

（2）酶切、连接，构建含有VEGFR-2 基因片段的pJKS重组质粒，具体为：

对步骤（1）中PCR扩增产物采用SalI 和 NdeI进行双酶切，并回收酶切产物备用；

对pJKS 质粒同样采用SalI 和 NdeI进行双酶切，并回收酶切产物；

用T4-DNA连接酶（DNA Ligation Kit）将上述所回收的PCR酶切产物与pJKS 质粒的酶切产物进行连接；

（3）转化，筛选获得阳性克隆菌株，扩增后，提取阳性重组质粒备用；具体为：

将步骤（2）中的连接产物转化DH5α感受态细胞；采用含100μg/mL氨苄青霉素的LB平板进行抗性筛选，并对筛选所获得的阳性菌株进行PCR鉴定；

对PCR鉴定正确的阳性克隆菌株进行扩增，并提取质粒备用，所提取的重组质粒分别命名为pJKS-VEGFR2-1-4，pJKS-VEGFR2-1-5，pJKS-VEGFR2-1-6，pJKS-VEGFR2-1-7，统称为pJKS-VEGFR2；

（4）将步骤（3）中筛选所得重组正确的质粒pJKS-VEGFR-2转化大肠杆菌BL21，扩增，备用，具体为：

将步骤（3）中阳性重组质粒pJKS-VEGFR2-1-4，pJKS-VEGFR2-1-5，pJKS-VEGFR2-1-6，pJKS-VEGFR2-1-7分别转化大肠杆菌BL21；

挑取阳性单克隆，接种于含100μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃振荡培养至OD₆₀₀约为0.6左右备用；

（5）噬菌体重组及培养，具体为：

取步骤（4）中含有重组质粒的大肠杆菌BL21培养液1mL，接种感染复数为0.5的T4 e^-噬菌体；优选情况下，间隔15min左右，重复接种一次；

接种完成后，37℃继续振荡培养，即可获得重组的T4噬菌体；

对重组的T4噬菌体可用含有大肠杆菌BL21菌液的双层S.C培养基平板进行筛选鉴定；

所获得的重组的T4噬菌体，分别命名为T4-VEGFR2-1-4，T4-VEGFR2-1-5，T4-VEGFR2-1-6和T4-VEGFR2-1-7，统称为T4-VEGFR2。

利用所述展示VEGFR-2的重组T4噬菌体的制备方法所制备的重组T4噬菌体，其中VEGFR-2蛋白与T4噬菌体的SOC蛋白组成融合蛋白，展示于重组T4噬菌体的头部表面；

所展示的VEGFR-2蛋白为VEGFR-2胞外区1-4免疫球蛋白样结构域（对应编码碱基如SEQ ID NO.1所示）、1-5免疫球蛋白样结构域（对应编码碱基如SEQ ID NO.2所示）、1-6免疫球蛋白样结构域（对应编码碱基如SEQ ID NO.3所示）、1-7免疫球蛋白样结构域（对应编码碱基如SEQ ID NO.4所示）中的一个；

所制备的重组T4噬菌体，可为T4-VEGFR2-1-4、T4-VEGFR2-1-5、T4-VEGFR2-1-6、T4-VEGFR2-1-7中一个或几个任意比例的混合物；

优选的，仅利用1-7免疫球蛋白样结构域构建重组T4 噬菌体。

还需进一步解释的是，VEGFR-2蛋白的胞外区1-7免疫球蛋白样结构域为VEGFR-2蛋白全长的20~762氨基酸片段；1-6免疫球蛋白样结构域为VEGFR-2蛋白全长的20~664氨基酸片段；1-5免疫球蛋白样结构域为VEGFR-2蛋白全长的20~548氨基酸片段；1-4免疫球蛋白样结构域为VEGFR-2蛋白全长的20~422氨基酸片段。

利用所述展示VEGFR-2的重组T4噬菌体的制备方法所制备的重组T4噬菌体在包括肿瘤在内的多种与血管增生有关的疾病中应用。

本发明的主要技术原理如图1所示，首先通过克隆获得VEGFR-2胞外区片段，进而通过重组技术将VEGFR-2胞外区片段与T4噬菌体的SOC蛋白组成融合蛋白，并在噬菌体头部表面获得了展示。初步试验表明，所获得的重组T4噬菌体头部表面所展示的VEGFR-2蛋白，保持了较好的生物活性，具有与VEGF结合并且抑制其功能的生物活性，可以用于治疗包括肿瘤在内的多种与血管增生有关的疾病。进一步地生物学试验证明，该重组噬菌体能够阻止VEGF与VEGFR-2的结合，具有显著的抗肿瘤血管生成活性，具有很好的应用前景。

附图说明

图1为表面展示 VEGFR-2 蛋白的重组T4噬菌体构建模式图；

图2为重组T4噬菌体的鉴定；其中(A) 重组T4噬菌体的PCR 鉴定；(B) 重组T4噬菌体的免疫印迹 (Western Blot )鉴定；

图3为重组T4噬菌体与VEGF结合能力测定，其中(A) 酶联免疫吸附-噬菌体滴定试验( ELISA-Phage-Titer)检测重组T4噬菌体与VEGF结合能力测定；(B) 噬菌体-酶联免疫吸附试验(Phage-ELISA) 检测重组T4噬菌体与VEGF结合能力；

图4为重组T4噬菌体对血管内皮细胞增殖和迁移的抑制作用；其中(A) 重组T4噬菌体对VEGF诱导的血管内皮细胞增殖的抑制作用；(B) 重组T4噬菌体对VEGF诱导的血管内皮细胞迁移的抑制作用；

图5为重组T4噬菌体的体内抗肿瘤活性，其中(A) 小鼠Lewis 肺癌3LL 细胞移植瘤模型的在体肿瘤体积和生存时间；(B) 小鼠结肠癌细胞CT-26移植瘤模型的在体肿瘤体积和生存时间；

图6为小鼠Lewis 肺癌微血管密度测定，其中(A) PBS治疗对照组；(B) 野生型T4噬菌体(T4-W) 治疗组；(C) 重组T4噬菌体(T4-VEGFR2) 治疗组；（D）微血管数统计结果。

具体实施方式

下面结合实施例对本申请做进一步的解释说明。在介绍具体实施例前，就下述实施例中所涉及部分生物材料、实验试剂、实验设备等基本情况简要介绍说明如下。

生物材料：

小鼠VEGFR-2细胞外片段核酸编码序列，由Takara公司合成提供；

质粒pJKS和T4 e^-噬菌体，由美国Versatile公司赠送；

大肠杆菌BL21，购自北京全式金生物技术有限公司；

引物，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成提供；

小鼠结肠癌细胞系CT-26、小鼠血管内皮细胞系EOMA，购自美国ATCC；

小鼠肺癌细胞系3LL，购自上海胸科医院；

C57BL/6小鼠、BALB/c小鼠，购自北京维通利华北京维通利华实验动物技术有限公司。

实验试剂：

SalI 酶、NdeI酶、T4-DNA连接酶（DNA Ligation Kit）、PrimeSTAR® HS DNA聚合酶，购自Takara公司；

质粒提取试剂盒、琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒，购自天根生化科技北京有限公司；

Noble Agar，购自美国BD公司；

LB培养基，常规配制及灭菌即可；

SM buffer，配方为： NaCl 5.8g，MgSO₄·7H₂O 2.0g，1M Tris-HCL(PH7.5) 50mL，2% 明胶溶液 5mL，加水至1 L，高压灭菌；

M9S培养基，配方为：0.7% Na₂HPO₄、0.3% KH₂PO₄、0.05% NaCl、0.1% NH₄Cl、0.4% Glucose（葡萄糖）、0.5 % Casamino acids (酪蛋白氨基酸)、0.1mM CaCl、lmM MgSO₄；

兔抗鼠VEGFR-2 多克隆抗体，购自武汉三鹰生物技术有限公司；

增强化学发光法 (ECL)试剂盒，购自碧云天生物技术有限公司；

小鼠VEGF164重组蛋白、羊抗小鼠CD31多克隆抗体，购自美国R&D公司；

生物素化羊抗鼠VEGF164 多克隆抗体、亲和素-过氧化物酶复合物工作液，购自武汉博士德生物公司；

胎牛血清、RPMI 1640细胞培养液，购自Gibco(Life Technologies) 公司。

实验设备：

PCR仪，型号为T100，Bio-Rad公司；

化学发光凝胶成像系统，型号为ChemiDoc XRS+，Bio-Rad公司；

酶标仪，型号为Multiskan FC，美国Thermo Fisher公司；

二氧化碳培养箱，型号为3111，美国Thermo Fisher公司。

实施例1

本实施例就表面展示VEGFR-2的重组T4噬菌体的制备过程简要介绍如下。

（1）设计引物，并对VEGFR-2胞外区基因片段进行PCR扩增，具体为：

首先，人工设计含有SalI 和 NdeI酶切位点的系列引物序列如下：

Sal1-Ig1-F：5’-acgcgtcgacatggcctctgtgggtttgcct-3’，

Nde1-Ig4-R：5’- cggaattccatatgtgggacattcacaaccagagag-3’，

Nde1-Ig5-R：5’- cggaattccatatgacccctgatcacatggaagga-3’，

Nde1-Ig6-R：5’- cggaattccatatgtgccatgcgctctaggatgat-3’，

Nde1-Ig7-R：5’- cggaattccatatgttccaagttggtcttttcctgg-3’；

然后，以Takara公司合成提供的小鼠VEGFR-2细胞外片段核酸编码序列（序列如SEQ ID NO.1所示）为模板，进行PCR扩增，50μL扩增体系如下：

5× PrimeSTAR 缓冲液，10μL；

dNTP 混合物，4μL；

上游引物（Sal1-Ig1-F），1μL；

下游引物（Nde1-Ig4-R、或者Nde1-Ig5-R、或者Nde1-Ig6-R、或者Nde1-Ig6-R），1μL；

模板，1μL；

PrimeSTAR® HS DNA聚合酶，0.5μL；

灭菌水，32.5μL；

PCR反应条件为：98℃、3分钟，98℃、10秒，55℃、15秒，72℃、2分钟，30个循坏，72℃、5分钟；

对PCR扩增产物进行电泳检测，并回收。

PCR扩增获得的VEGFR-2胞外区不同免疫球蛋白样结构域的基因片段分别为：VEGFR2-1-4、VEGFR2-1-5、VEGFR2-1-6和VEGFR2-1-7。

（2）酶切、连接，构建含有VEGFR-2 基因片段的pJKS重组质粒，具体为：

对步骤（1）中PCR扩增产物采用SalI 和 NdeI进行双酶切，50μL酶切体系设计如下：

Sal I，1μL；

Nde I，1μL；

10×H Buffer，5μL；

DNA，5μL；

灭菌水，38μL；

37℃水浴中，酶切1小时。

酶切产物经1%琼脂糖凝胶电泳进行分离，然后用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收DNA片段。

对pJKS 质粒同样采用SalI 和 NdeI进行双酶切，并回收酶切产物。

用T4-DNA连接酶（DNA Ligation Kit）将上述所回收的PCR酶切产物与pJKS 质粒的酶切产物进行连接，12μL连接体系设计如下：

Solution I，6μL；

PCR产物，4μL；

pJKS 质粒，2μL；

16℃条件下连接30min。

（3）转化，筛选获得阳性克隆菌株，扩增后，提取阳性重组质粒备用；具体为：

常规操作，将步骤（2）中的连接产物转化DH5α感受态细胞；

转化后，涂布于含有100μg/mL氨苄青霉素的LB平板上，37℃培养过夜，以进行筛选；

分别挑取10~20个单菌落重悬于10μL的LB液体培养基中，制备成菌悬液；取1μL作为模板，进行菌液PCR扩增鉴定，扩增反应体系和条件同步骤（1）。

对菌液进行PCR扩增结果为阳性的菌落，即可认为目的基因正确重组进入质粒中，然后取其对应的菌悬液1μL接种于5mL含有100μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃振荡培养12小时；

培养结束后，采用质粒提取试剂盒提取质粒备用，质粒分别命名为pJKS-VEGFR2-1-4，pJKS-VEGFR2-1-5，pJKS-VEGFR2-1-6，pJKS-VEGFR2-1-7，统称为pJKS-VEGFR2。

（4）将步骤（3）中筛选所得重组正确的质粒pJKS-VEGFR-2转化大肠杆菌BL21，扩增，备用，具体为：

按照常规操作步骤，将步骤（3）中阳性重组质粒pJKS-VEGFR2-1-4，pJKS-VEGFR2-1-5，pJKS-VEGFR2-1-6，pJKS-VEGFR2-1-7分别转化大肠杆菌BL21；

挑取单克隆，接种于1mL含100μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃振荡培养至OD₆₀₀约为0.6左右备用。

（5）噬菌体重组及培养，具体为：

取步骤（4）中含有重组质粒的大肠杆菌BL21培养液1mL，接种感染复数为0.5的T4 e^-噬菌体；间隔15min左右，重复接种一次；接种完成后，37℃振荡培养过夜；

次日6000rpm、离心5min，取上清，用SM buffer按照10²、10⁴的稀释比例对上清液进行稀释，备用。

配制顶层S.C培养基：称量1g Tryptone（胰蛋白胨）、0.5g NaCl和0.7g Noble Agar，加入到100mL去离子水中，高压灭菌后冷却至55℃，再加入已灭菌的5mL 1M Tris-HCl (pH=8.0) 、1mL的25% 柠檬酸钠·2H₂O，充分混匀，冷却并4℃保存备用，使用时微波炉加热熔化；

配制底层S.C培养基：称量10g Tryptone、5g NaCl和12g Noble Agar，加入到1L去离子水中，高压灭菌后冷却至55℃，加入已灭菌的50mL 1M Tris-HCl (pH=8.0)、10mL的25% 柠檬酸钠·2H₂O，充分混匀，倒于直径为90mm的平皿上，即为底层S.C培养基平板。

取0.3mL 采用LB培养基过夜培养的大肠杆菌BL21菌液，加入3mL熔化并冷却至45℃的顶层S.C培养基，立即倒于底层S.C培养基平板上，常温放置待顶层培养基凝固后即为双层S.C培养基平板。

分别取10μL稀释后的噬菌体，点于预先制备的双层S.C培养基平板上，自然风干，随后置于37℃恒温培养箱过夜培养。

次日，观察双层S.C培养基平板上是否有噬菌体单斑的出现，如果出现噬菌体单斑，说明重组噬菌体制备成功。重组成功的T4 噬菌体分别命名为T4-VEGFR2-1-4，T4-VEGFR2-1-5，T4-VEGFR2-1-6和T4-VEGFR2-1-7，统称为T4-VEGFR2。

检验例

对所出现的噬菌体单斑（即重组的T4噬菌体），进行进一步鉴定，以鉴定是否重组正确，具体鉴定过程如下。

挑取噬菌体单斑，以1cm直径大小的圆形状点于含有BL21细菌的双层S.C 培养基平板上，37℃过夜培养；

次日，待噬菌斑长出后，用移液器吸头蘸取平板上的少量噬菌体作为模板，噬菌斑PCR鉴定重组噬菌体，扩增反应体系和条件同步骤（1）。

经鉴定为阳性的重组噬菌体于M9S培养基中扩大培养，CsCl密度梯度离心纯化噬菌体。

Western blot检测VEGFR2蛋白表达，具体为：取10¹²pfu/mL经CsCl密度梯度离心纯化的噬菌体10μL，加入等体积的2×loading buffer，煮沸5~10分钟后进行12% SDS-PAGE电泳，依次进行转膜、封闭、加入兔抗鼠VEGFR-2 多克隆抗体、HRP标记的羊抗兔酶标二抗，增强化学发光法 (ECL) 进行检测。

结果如图2所示，可以看出，重组噬菌体T4-VEGFR2-1-4，T4-VEGFR2-1-5，T4-VEGFR2-1-6和T4-VEGFR2-1-7经噬菌斑PCR扩增出1212bp至 2232bp 4条阳性条带（图2A所示）；经Western blot检测到60KD 至120KD的共4条阳性条带（图2B所示），说明VEGFR-2基因成功重组到T4噬菌体基因组，重组噬菌体成功表达VEGFR2-1-4、VEGFR2-1-5、VEGFR2-1-6 和VEGFR2-1-7结构域。

实施例2

对于实施例1所制备的重组的T4噬菌体，本实施例主要利用酶联免疫吸附-噬菌体滴定试验对其与VEGF结合能力，以及利用噬菌体-酶联免疫吸附试验对其与VEGF的结合能力进行了检测，具体检测情况简要介绍如下。

（1）酶联免疫吸附-噬菌体滴定试验检测重组T4噬菌体与VEGF结合能力

以0.1mL的度分别为0.01ng/mL、0.1ng/mL、1ng/mL、10ng/mL的小鼠VEGF164重组蛋白包被96孔酶标板，4℃包被过夜；

1% BSA封闭l小时，用PBS (0.01M，pH7.4) 洗涤3次，除去残余液体；

按每孔0.1mL量加入10¹⁰ pfu/mL的T4噬菌体（实施例1所制备的重组T4噬菌体，以野生T4噬菌体作为对照），37℃摇床上孵育 2小时；

用PBS洗涤4次，除去残余液体，按每孔0.1mL加入10 mg/mL的胰蛋白酶溶液，室温摇床上孵育1小时。

收获噬菌体，按照10²、10⁴、10⁶、10⁸倍数进行稀释，然后从低浓度至高浓度依次各取10μL接种于制备好的双层S.C培养基平板上；

待液体风干后，37℃过夜培养。

次日，记录最高稀释倍数接种的噬斑数，按下面公式计算噬菌体的滴度：

噬菌体滴度(pfu/ml) =噬斑数×10²×稀释倍数。

以被吸附噬菌体的滴度高低判定重组噬菌体与VEGF结合能力的强弱。

结果如图3A所示，从图中可以看出，在0.01ng/mL、0.1ng/mL、1ng/mL、10 ng/mL浓度VEGF蛋白包被情况下，野生T4噬菌体均未被VEGF164重组蛋白包被的酶标板吸附，而T4-VEGFR2-1-4，T4-VEGFR2-1-5，T4-VEGFR2-1-6和T4-VEGFR2-1-7噬菌体均被吸附，随着包被VEGF164重组蛋白浓度的增高，重组噬菌体吸附的数量也明显增加。

（2）噬菌体-酶联免疫吸附试验检测重组T4噬菌体与VEGF结合能力

以0.1mL的滴度为10⁶、10⁷、10⁸、10⁹ pfu/mL的野生和重组噬菌体包被96孔酶标板，4℃包被过夜；

1% BSA封闭l小时，用PBS (0.01M，pH7.4) 洗涤3次，除去残余液体；

按每孔0.1mL加入浓度为 100ng/ml 的小鼠VEGF164重组蛋白，37℃孵育 2小时；

用PBS洗涤3次，按每孔0.1mL加入生物素化羊抗鼠VEGF164 多克隆抗体(1：100)，37℃孵育 1小时；

PBS洗涤3次，然后加入亲和素-过氧化物酶复合物工作液，37℃孵育 30分钟，PBS洗涤5次；

按每孔0.1mL依次加入TMB显色液，37℃避光反应20-25分钟，然后按每孔0.1mL依次加入TMB终止液；

用酶标仪在450nm测定OD值，将TMB空白显色孔设为对照。

以OD值大小判定重组噬菌体与VEGF结合能力的强弱。

结果如图3B所示，在滴度为10⁶、10⁷、10⁸、10⁹ pfu/mL的噬菌体包被情况下，野生T4噬菌体包被的酶标板均不能吸附VEGF164重组蛋白，而T4-VEGFR2-1-4，T4-VEGFR2-1-5，T4-VEGFR2-1-6和T4-VEGFR2-1-7噬菌体包被的酶标板均能吸附VEGF164重组蛋白，随着包被噬菌体滴度的增高，VEGF164重组蛋白的吸附量增加，检测到的OD_450nm值增加。

综合图3A和图3B的结果，说明T4-VEGFR2-1-4，T4-VEGFR2-1-5，T4-VEGFR2-1-6和T4-VEGFR2-1-7重组噬菌体菌均可以与VEGF结合，其中T4-VEGFR2-1-7重组噬菌体与VEGF结合能力相对最强，因此以其用于后续实验。

实施例3

本实施例主要介绍一下实施例1中所制备的重组T4噬菌体在VEGF诱导血管内皮细胞增殖、迁移，及抗肿瘤活性中的应用的相关实验，从而为本申请的进一步推广应用及深入研究奠定一定基础，相关实验简要介绍如下。

（1）重组T4噬菌体对VEGF诱导血管内皮细胞增殖的抑制作用

小鼠血管内皮细胞系EOMA培养于含10%胎牛血清的DMEM培养液中，用胰蛋白酶消化后，调整细胞浓度为5×10⁴个/mL，按每孔0.1mL(5×10³个) 接种于96孔板中；

待细胞贴壁后，吸去培养基上清，加入0.1mL含10ng/ml 小鼠VEGF164重组蛋白和10⁹pfu/ml T4-VEGFR2-1-7重组噬菌体的DMEM培养液；对照孔分别仅加入0.1mL含10ng/mL 小鼠VEGF164重组蛋白的DMEM培养液或者0.1mL的DMEM培养液；

置于37℃、饱和湿度、5% CO₂的细胞培养箱内培养。

分别在培养24、48和72小时以后，加入5mg/mL 的MTT溶液20μL，继续培养4h以后，小心吸去孔内培养上清液，每孔加入150μL二甲基亚砜(DMSO)，置摇床上低速振荡10分钟，用酶标仪在490nm测定OD值。OD_490nm值可以反映内皮细胞的增殖数量。

如附图4A所示，加入10ng/ml 小鼠VEGF164重组蛋白刺激的内皮细胞在培养24、48和72小时以后，同时加入T4-VEGFR2-1-7重组噬菌体和VEGF164重组蛋白的内皮细胞的OD_490nm 值高于未加入VEGF164重组蛋白刺激的内皮细胞的OD_490nm值，但是低于单纯加入VEGF164重组蛋白刺激的内皮细胞的OD_490nm值，说明T4-VEGFR2-1-7重组噬菌体可以抑制VEGF诱导的血管内皮细胞的增殖。

（2）重组T4噬菌体对血管内皮细胞迁移的抑制作用

小鼠血管内皮细胞系EOMA培养于含10%胎牛血清的DMEM培养液中，用胰蛋白酶消化后，调整细胞浓度为10⁵个/mL；

在24 孔板中加入 500μL含 10ng/ml 的小鼠VEGF164重组蛋白和10⁹ pfu/mL T4-VEGFR2-1-7重组噬菌体的DMEM培养液，对照孔分别仅加入500μL含10ng/ml 小鼠VEGF164重组蛋白的DMEM培养液或者500μLDMEM培养液；

将预先处理好的Transwell小室放入24 孔板中，并且在上室中加入 200 μL EOMA细胞悬液，置于37℃、饱和湿度、5% CO2的细胞培养箱内培养；

培养 24小时后，取出小室，用棉签擦去基质胶和上室内的细胞，将小室彻底晾干，然后将小室浸没于含有 0.1%结晶紫溶液的24孔板中，室温放置20分钟；

染色结束后，取出小室，用去离子水洗涤小室，自然干燥后移入另外一个含有 33%醋酸溶液的24孔板中，充分振荡脱色。

脱色结束后，每孔吸取150 μL脱色液加入到96孔板上，用酶标仪在570nm处测定脱色液的OD值。OD_570nm值可以反映迁移内皮细胞的数量。

如附图4B所示，加入VEGF164重组蛋白诱导的内皮细胞在培养24小时后，迁移细胞染色并洗脱，测定并且比较OD_570nm值，结果显示同时加入T4-VEGFR2-1-7重组噬菌体和VEGF164重组蛋白的内皮细胞的OD_570nm值高于未加入VEGF164重组蛋白诱导的内皮细胞的OD_570nm值，但是低于单纯加入VEGF164重组蛋白诱导的内皮细胞的OD_570nm值，说明T4-VEGFR2-1-7重组噬菌体可以抑制VEGF诱导的血管内皮细胞的迁移。

（3）重组T4噬菌体的体内抗肿瘤活性

常规方法复苏小鼠肺癌细胞系3LL 和小鼠结肠癌细胞系CT-26，将细胞培养于含10%胎牛血清的RPMI 1640细胞培养液中，置于37℃、饱和湿度、5% CO₂的细胞培养箱内培养并传代；

收集细胞，用生理盐水调整3LL和CT-26细胞浓度至1×10⁷个/mL，分别在C57BL/6小鼠和BALB/c小鼠右腋皮下接种细胞悬液100μL/只，细胞数量为1×10⁶个/只；

模型建立后15天，尾静脉注射重组噬菌体 T4-VEGFR-2进行治疗，野生型 T4 噬菌体（T4-W）和 PBS 作为对照；

每隔5天用游标卡尺测量肿瘤的长短径，计算肿瘤体积，计算公式为：

V (mm³)=0.5ab²，，

其中a为长径(mm)，b为短径(mm) ；

记录各组小鼠的自然死亡时间，比较各组小鼠累计生存率，制作累计函数生存曲线。

接种肿瘤细胞大约4周后，当第一只小鼠死亡时，引颈法处死各组荷瘤小鼠，分离并取出肿瘤组织；

4%多聚甲醛固定肿瘤标本，石蜡包埋后切片。

肿瘤组织采用抗 CD31单克隆抗体标记，免疫组化方法检测微血管密度 (Microvascular Density，MVD) 。

如附图5所示，在小鼠肺癌细胞系3LL（图5A）和小鼠结肠癌细胞系CT-26（图5B）皮下移植瘤模型中，重组噬菌体 T4-VEGFR-2治疗组的肿瘤体积小于野生型 T4 噬菌体（T4-W）和PBS治疗组的肿瘤体积，而重组噬菌体T4-VEGFR-2治疗组的荷瘤小鼠生存时间较野生型 T4 噬菌体（T4-W）和PBS治疗组的荷瘤小鼠生存时间长。说明重组噬菌体 T4-VEGFR-2可以抑制小鼠皮下抑制瘤生长，并且可以延长荷瘤小鼠的生存期。

微血管密度情况如附图6所示，可以看出，重组噬菌体 T4-VEGFR-2的微血管密度小于野生型T4 噬菌体（T4-W）和PBS治疗组。

综合图5、图6结果，说明重组噬菌体T4-VEGFR-2的体内抗肿瘤活性主要是通过抑制肿瘤血管生成而发挥作用。

SEQUENCE LISTING

<110> 河南大学淮河医院

<120> 一种展示VEGFR-2的重组T4噬菌体的制备方法

<130> none

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1212

<212> DNA

<213> Mus musculus

<400> 1

atggcctctg tgggtttgcc tggcgatttt ctccatcccc ccaagctcag cacacagaaa 60

gacatactga caattttggc aaatacaacc cttcagatta cttgcagggg acagcgggac 120

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