利用棉花GhPEPC基因创造棉花高油材料的方法与流程

本发明属于植物基因工程技术领域，具体涉及一种利用棉花GhPEPC基因创造棉花高油材料的方法。

背景技术：

目前我国食用油短缺，对外依存的比例已经达到60％以上，如果可以改善油料作物的种子含油量，将可以缓解我国食用油短缺问题。棉花是我国重要的战略经济作物，它不仅给人类提供了纤维，棉籽中也含有较为丰富的油脂和蛋白质。棉花一直被认为是种纤维作物，然而，棉花也是我国五大油料作物之一，即：油菜、大豆、芝麻、花生、棉籽。我国多数棉种的棉籽油含量在30％左右，如果能将油分提高一个百分点，那么产生的经济效益将相当可观。然而，长期以来我们主要把重点放在了纤维的产量和品质改良上，对棉籽的重视相对较少，导致理论研究和育种上都落后于棉纤维的研究。棉籽仁脂肪含量35％左右，蛋白质含量45％左右，精炼棉籽油一般呈橙黄色或棕色。棉籽油有较好的营养价值，是高质量的食用油(王彦霞，等.RNA干涉技术与棉花高油育种.棉花学报.2011,23(2)：178-183.)。

磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPCase)是控制丙酮酸生成草酰乙酸的酶，也是蛋白质合成过程中的第一个关键酶。乙酰辅酶A羧化酶(ACCase)是棉籽油脂肪酸合成途径中的第一个关键酶。陈锦清等人于1999年得到了磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPCase)与乙酰辅酶A羧化酶(ACCase)共同控制植物体中蛋白质合成和脂肪合成碳源的分配比例的结论(陈锦清，郎春秀，胡张华等.反义PEP基因调控油菜籽粒蛋白质/油脂含量比率的研究.农业生物技术学报.1999,7(4):316-320.)。因此，植物的碳源主要流向两个支路：蛋白质合成支路和油脂合成支路；如果降低蛋白质合成支路中的关键基因的表达，理论上会有更多的碳源会流向油脂合成支路，进而提高种子中的油分含量。

RNAi(RNA Interference)干涉技术是多种干涉技术中干涉效率较高的一项技术。RNAi本身也可分为两种，一种是带有内含子的发卡式双链RNA(ihpRNA)，一种是不带有内含子的发卡RNA(hpRNA)。就沉默效率而言，带有内含子结构的RNA沉默结构效率最高，最高可达90％-100％；不带内含子结构的沉默效率较低。pHellsgate 4载体是pHellsgate系列的一种，可以形成带有内含子的发卡式双链RNA，通过在目的基因的引物两端分别加上一个特殊的接头attB1：5’-GGGG ACA AGT TTG TAC AAA AAA GCA GGC TNN-3’，attB2：5’-GGGG AC CAC TTT GTA CAA GAA AGC TGG GTN-3’,扩增出带有这种特殊接头的目的基因，经过特殊BP酶反应，把原始载体上带有attP1和attP2的一段致死基因ccdB置换下来(Chris A，等.High-throughput vectors for efficient gene silencing in plants.Funct.Plant Biol.2002,29,1217-1225)我们简称此反应为BP反应。

张银波2005年克隆了油菜PEPC基因并构建了其对应RNA i载体(张银波等,.油菜PEPase基因的克隆及其对应RNA i载体的构建.中国油料作物学报.2005,27(1))。张勇2008年克隆了甘蓝型油菜PEPC保 守序列并构建了其对应RNA i载体(张勇等，甘蓝型油菜PEPC基因保守序列的克隆和种子特异性ihpRNA表达载体的构建.分子植物育种2008,6(4)：775-780)；Deng 2011年克隆了藻类PEPC2基因并构建了RNAi载体，使油分含量提高了14％-28％(Deng,等.The mRNA abundance of pepc2gene is negatively correlated with oil content in Chlamydomonas reinhardtii.BIOMASS&BIOENERGY.2011,35(5)1811-1817.)。目前国内对棉籽油重视还不够，本发明“新”在于用新的PEPC基因的保守序列和新型RNAi载体pHellsgate 4，功能验证表明此方法确实可以降低PEPC基因的表达量，也能达到降低蛋白质含量进而提高油份含量的目的，申请人认为如果油份含量得到提高，那么对我国食用油短缺问题将具有重要经济价值和战略意义。

技术实现要素：

本发明的目的是从陆地棉(Gossypium hirsutum)植物中分离克隆一个包含该功能蛋白同源基因保守编码区段的cDNA片段(在本发明中所述的“cDNA片段”与“核苷酸序列”以及“cDNA分子”同义)，这个基因参与蛋白质的合成过程。对这个基因的编码序列进行分析得到保守区域的碱基序列，为了区分于整个编码区域，我们把保守区域命名为GhPPC基因。利用这个基因可以降低蛋白质的含量，使棉籽油的含量提高3个百分点。

本发明的技术方案如下所述：

本发明包括陆地棉克隆的PEPC类基因和一种新型高效RNAi干涉载体pHellsgate 4的应用。本发明编码基因的cDNA序列如SEQ ID NO：1所示，通过农杆菌介导的遗传转化，该RNAi载体表达的双链RNA(dsRNA)能显著棉花内源的降低PEPC基因的表达量，从而降低蛋白质的合成，使光合作用的同化产物进入油脂的合成路径，进而提高棉花种子中油脂的含量。利用本发明的RNA干涉(RNAi)载体和PEPC基因保守域，通过农杆菌介导的遗传转化可应用于提高棉花种子中油脂的含量。

具体地，本发明涉及分离和应用部分GhPEPC1基因的cDNA片段，即GhPPC，该片段具有降低蛋白质合成的能力。其中，所述的GhPPC基因是下列核苷酸序列之一：

1)序列表SEQ NO：1中共308个碱基所示的cDNA序列(图1中A图)，对棉花基因组中的GhPPC同源基因进化分析发现，该基因与其它基因的同源性较低(图1中B图)

本发明克隆的基因cDNA可在降低棉花(优选为陆地棉)蛋白质含量提高油分含量上的应用，其应用步骤如下所述：

(1)通过NCBI数据库查找陆地棉PEPC1基因序列(GenBank:AF008939.1)，并Blast其全长cDNA区得到它的保守区域，在其保守区域内选择了一个长度为308bp的cDNA片段并用PCR(Polymerase Chain Reaction)方法进行基因克隆。将这一序列与高效RNAi表达载体pHellsgate 4连接后转化植株。

(2)携带有本发明GhPPC基因的表达载体可通过使用农杆菌介导的遗传转化等常规生物技术方法导入植物宿主细胞。具体转化步骤如下：挑选饱满、健康的棉花种子剥去种皮后，用0.1％的HgCl2浸泡10min，再用无菌水洗涤3次。接种于无菌苗萌发培养基上，黑暗条件下，置于28℃恒温箱中培养4-6d,取无菌苗下胚轴切成0.5-0.8cm小段接种于0.5OD的用农杆菌活化培养基(MGL)悬浮的农杆菌菌液中，侵染 10mim后，用无菌滤纸吸干下胚轴表面的菌液，将下胚轴接种在含有共培培养基的培养皿中，21℃共培养48h，最后将下胚轴放入含有头孢霉素500mg/L的无菌水中，冲洗3遍,吸干表面水份后，接种到选择培养基中，每1个月继代1次，获得的胚性愈伤组织转移到胚萌发及成苗培养基，直到获得胚性愈伤及体细胞胚胎发生。

本发明中的培养基组分及配比如下所示：

无菌苗萌发培养基：1/2MS大量元素，附加15g/L葡萄糖，2.5g/L的Phytagel。

愈伤诱导培养基：MSB+24-D 0.1mg/L+KT 0.1mg/L+3％Glucose+0.3％Phytagel

农杆菌活化培养基(MGL)：胰化蛋白胨5g/L+NaCl 5g/L+MgSO₄.7H₂O 0.1g/L+KH₂PO₄+0.25g/L+甘露醇5g/L+甘氨酸1.0g/L,pH值5.6

共培养培养基：MSB+2，4-D 0.1mg/l+KT 0.1mg/l+50mg/l AS+3％Glucose+0.25％Phytagel，pH5.6

选择培养基：MSB+2，4-D 0.1mg/L+KT 0.1mg/L+3％Glucose+0.3％Phytagel，卡那霉素50mg/L和头孢霉素400mg/L，pH 5.9

胚萌发及成苗培养基：1/2MS无机盐+B5有机物，附加15g/L葡萄糖，2.5g/L的Phytagel。

MSB的成分如下：MS培养基+B5维生素，简写为MSB.

上述培养基在添加完各组分后，补加蒸馏水定容至1L，在121℃高压蒸汽下灭菌15分钟。培养基中涉及到的抗生素的灭菌采用过滤灭菌，在超净工作台内的无菌环境下加入到冷却到60℃的高压灭菌后的培养基中使用。

培养物的培养条件，除愈伤组织诱导阶段不需要光照外，其他的培养阶段的培养条件为28±2℃，光照强度为冷光源135μmol m-2s-1，每天光照14h(特殊需要的培养条件除外)。

(3)对转基因后代反转录PCR(RT-PCR)进行检测其表达，具体步骤如下：提取转基因植株的总RNA并作反转录，以cDNA为模板通过荧光定量PCR对目的基因的表达量进行检测；

引物序列如下：

PPC引物：Q-RT-PPC-F:5’-AGGAGGGGGACCCACGC-3’；

Q-RT-PPC-R:5’-ATTTGGTGAGACAGGGGGATG-3’

PEPC1引物：Q-RT-PEPC1-F:5’-CTGGAAGACACCCTTATTTTGACC-3’；

Q-RT-PEPC1-R:5’-TGACGCAAAGCAACATCCATTA-3’

反应体系(20uL)：

(4)利用RT-PCR检测鉴定为阳性单株用于转录组分析，

具体步骤如下：

转基因棉花及阴性对照的叶片分离总RNA，然后获得mRNA,对mRNA进行片段化处理，然后随机合成双链cDNA,构建cDNA文库，进行PCR扩增，在Illumina HiSeq2000平台上进行高通量测序，每个样品获得5Gb的数据量。对获得的高通量数据进行生物信息学分析：步骤为：A.原始数据整理、过滤及质量评估；B.与参考基因组比对；C.蛋白编码基因的表达量分析；D.蛋白编码基因的表达量差异分析；E.差异表达基因的富集分析(GO、KEGG)；F.差异表达基因的聚类分析(热图)。通过转录组分析对棉花油份合成通路的所有基因进行解析。

(5)考察转基因材料的农艺性状和鉴定转基因材料种籽中油份含量。

分别对转基因材料和非转基因材料的棉纤维长度和百粒重等进行了测定，同时对转基因材料和非转基因材料的总蛋白质的含量、各脂肪酸含量和棉籽油总量的测量。具体步骤如下：取0.1g材料加入500uL蛋白提取液研磨充分，摇匀，在冰上放至沉淀，离心15min(4℃，13200rpm/min)；吸取上清，重复离心15min(4℃，13200rpm/min)，取上清于4℃冰箱保存。然后用考马斯亮蓝G-250和酶标仪定标测蛋白质浓度，结果如图10中的C图所示。

脂肪酸的测定方法为：

(1)将组织充分研磨，称总重，转移到10mL玻璃试管。

(2)向试管中加入1.5mL硫酸、甲醇混合溶液(比例1:39，内含0.01％的BHT)和400uL二甲苯溶液，向试管中充入氮气，拧紧盖子。

(3)90℃，水浴1h。加入4mL ddH2O和500uL正戊烷，混匀，1000rpm/min，离心5min。

(4)吸取600uL上清转移到测样瓶中，常温放置。脂肪酸测定结果如图10中的D图。

棉籽油总量的测量：

(1)将浓硫酸脱绒后的种子晾晒2-3d。

(2)取饱满的种子用核磁共振分析仪测量。首先，打开仪器，使其运行稳定；其次，定标曲线；最后称量种重进行测量。结果如图10中的E图。

本发明的优点在于：

本发明克隆的GhPPC基因可以降低蛋白质的含量，并提高棉籽油的含量，同时能够利用基因工程技术有目的提高其他油料作物(优选为陆地棉)的含油量。

本发明所使用的干涉表达载体pHellsgate 4能够高效率的沉默GhPPC基因，使提高棉籽油份含量成为可能。

附图说明

序列表SEQ ID NO：1是本发明克隆的陆地棉GhPPC基因的核苷酸序列，序列长度为308bp。

图1：利用ClustalX软件(公开使用软件)对克隆的GhPPC编码序列与陆地棉PEPC1保守序列进行比对结果示意图。图1中的A图显示本发明所克隆的GhPPC基因和已经公布的陆地棉PEPC1在核苷酸水平的比对结果，它们的同源性为100％；图1中的B图为GhPPC基因在棉花基因组中的其它拷贝的同源性比较，结果表明我们克隆的这个基因与其它同源基因的相似性较低。

图2：本发明克隆基因的TA克隆和所使用的干涉表达载体p35S-GhPPC的构建示意图。图中：图2中的A图是含有GhPPC基因的pGEM-T Easy质粒图谱，将该质粒命名为pGEM-T-GhPPC；图2中的B图是表达载体pHellsgate 4质粒图谱；图2中的C图是含有GhPPC基因的p35S-GhPPC重组表达载体T-DNA区段图谱。

图3：为本发明中的涉及的农杆菌介导的遗传转化，进而获得转基因的棉花植株。图3中的A:图棉花下胚轴与农杆菌共培养后，转入抗性筛选培养基中；图3中的B图:抗性愈伤组织形成；图3中的C图:抗性愈伤组织分化成胚状体；图3中的D图:棉花细胞通过体细胞胚胎发生获得再生植株；图3中的E图:T0代再生植株移栽到温室中生产；图3中的F图:T1代转基因群体移栽到大田，进行农艺性状考察。

图4：干涉表达转基因陆地棉T0植株GhPPC基因阳性检测和表达量检测示意图。图4中的A图各泳道情况：第1-5泳道为转基因陆地棉的5个不同株系，第7泳道为野生型陆地棉对照。图4中的B图为普通PCR检测不同转基因株系中基因的表达量差异，其中Actin1是陆地棉的肌动蛋白基因，作为内参基因以参考各样品的上样量是否一致。图4中的C图为real-time PCR检测转基因株系中基因的表达量差异。

图5：转基因株系的T0southern杂交结果与GhPPC-1株系T1southern杂交结果。图5中的A图为转基因株系的T0southern杂交结果；图5中的B图为GhPPC-1株系T1southern杂交结果，可见分离出两个相同单拷贝单株，后续把这两株相同的单拷贝作为另一个新株系，标记为GhPPC-7。

图6：通过转录组测序，比较基因的转录水平，鉴定出获得上调及下调的基因数目。

图7：对GhPPC基因在整个棉花基因组中的表达水平进行检测后获得的数据。

图8：对非转基因对照和转基因材料的转录水平的差异绘制的热图(heat-map)。

图9：根据转录组数据绘制的植物油脂合成路径图。

图10：GhPPC-1和GhPPC-7株系T1代的性状考察。图10中的A图为纤维长度的测量。图10中的B图为脱绒后的棉籽百粒重。图10中的C图为叶片蛋白质总量。图10中的D图为棉籽各种脂肪酸含量。图10中的E图为棉籽油总量。

具体实施方式

以下实施例定义了本发明，并描述了本发明在克隆含有GhPPC基因保守编码区段的DNA片段，以及验证GhPPC基因功能的方法。根据以下的描述和这些实施例，本领域技术人员可以确定本发明的基本特征，并且在不偏离本发明精神和范围的情况下，可以对本发明做出各种改变和修改，以使其适用不同的用途和条件。

实施例1 GhPPC基因的克隆

本申请人从陆地棉(Gossypium hirsutum)中克隆得到了一段308bp的序列【所用引物为：GhPPC-F：(5’-TTGAATACTTCCGCCTAGCA-3’),GhPPC-R：(5’-AGCGATTCCAGGGTCTCC-3’)】。对得到的DNA片段进行TA克隆测序，并与NCBI上的序列进行比对，验证是否是GhPPC基因序列(见图1中的A图),同时我们将GhPPC基因在棉花中的同源基因进行了进化分析，发现有多个拷贝，我们选取了其中两个拷贝为RNA干涉的靶标，即GhPPC1和GhPPC2基因(见图1中的B图)。

1.提取陆地棉叶片的总RNA(改良的异硫氰酸胍法)及cDNA的获得：

改良的异硫氰酸胍法：

1.1将新鲜的叶片或-70度冷冻的叶片用液氮研磨成粉末，称取0.10-0.15g粉末与2.0mL离心管中，加入1.0mL RNA裂解液，再加入100uL的2.0mol/L醋酸钠，充分混匀，于冰上静置15min。

1.2向离心管中加入700uL的氯仿，盖紧离心管盖，剧烈摇动10min，冰上静置5min，离心10min(4℃，13200r/min).

1.3离心结束后取上清与新的离心管中，加入700uL的氯仿再抽提一次(与步骤1.2相同)。

1.4离心后取上层水相于1.5mL离心管中，加入等体积预冷的异丙醇，混匀，-20℃放置20min，离心10min(4℃，13200r/min)，管壁上的白色沉淀即为RNA。

1.5RNA沉淀经75％乙醇清洗两次再风干，加入适量的ddH₂O(DEPC)彻底溶解RNA。

1.6在每份样品中加入DNAase(1U/1uL,购自Promega公司)3uL，37℃温预30min，再加入ddH₂O(DEPC)至900uL。

1.7加入500uLTE饱和酚：氯仿(体积比1：1)，剧烈摇动15min，离心10min(4℃，13200r/min)。

1.8取上层水相于1.5mL离心管中，加入500uL的氯仿再抽提一次(与步骤1.7相同)。

1.9取上层水相于1.5mL离心管中，加入等体积预冷的异丙醇和1/10体积的2.0mol/L醋酸钠，充分混匀。-20℃放置20min，离心10min(4℃，13200r/min)，管壁上的白色沉淀即为RNA。

1.10RNA沉淀经75％乙醇清洗两次再风干，加入适量的ddH₂O(DEPC)彻底溶解RNA，保存于-20℃备用。

cDNA的获得：利用反转录酶(购自Promega公司,USA)将其反转录合成cDNA，反应条件为：70℃5min，42℃60min,70℃10min。

2.陆地棉GhPPC基因序列的获得：

设计引物序列：GhPPC-F：(5’-TTGAATACTTCCGCCTAGCA-3’),GhPPC-R：(5’-AGCGATTCCAGGGTCTCC-3’)。PCR条件为95℃5min；95℃30sec，55℃30sec，72℃20sec，32个循环；72℃10min。将扩增获得的PCR产物连入pGEM-T Easy载体(购自美国promega公司)，筛选阳性克隆并测序，得到如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。

实施例2：GhPPC基因植物干涉载体的构建

根据得到的SEQ ID NO：1设计引物用于构建表达载体，在引物两端分别加上BP反应的接头碱基，引物序列分别为GhPPC-BP-F：(5’-GGGG ACA AGT TTG TAC AAA AAA GCA GGC TNNTTGAATACTTCCGCCTAGCA-3’),GhPPC-BP-R：(5’-GGGG AC CAC TTT GTA CAA GAAAGC TGG GTNAGCGATTCCAGGGTCTCC-3’)。以pGEM-T-GhPPC质粒为模板进行PCR扩增，PCR条件为95℃5min；95℃30sec，55℃30sec，72℃20sec，32个循环；72℃10min。经PCR扩增得到正确的含有BP接头的GhPPC片段。PCR产物经BP反应连接至pHellsgate 4载体上(BP酶购自Invitrogen公司，美国，25℃4小时)后转化大肠杆菌Top10感受态细胞，以GhPPC的特异引物(GhPPC-F和GhPPC-R)进行PCR检测来挑取阳性克隆，PCR反应条件为：95℃5min；95℃30sec，55℃30sec，72℃20sec，32个循环；72℃10min。并活化提取质粒。提取的质粒分别用Xhol 1(NEB公司)和Xbal 1(NEB公司)单酶切6h验证酶切片段大小是否相同，相同则证明p35S-GhPPC重组表达载体构建成功，本发明所用载体结构如图2所示。

实施例3 GhPPC基因的遗传转化及筛选鉴定

1、无菌苗的准备

供试材料为野生型陆地棉YZ1(豫早1号，中国农业科学院棉花研究所)。在离体培养条件下播种棉花无菌苗：在超净工作台上将去壳后的种仁用0.1％升汞消毒8min，再用无菌水清洗3-4次，将所得的无菌种仁(或称外植体)接种于无菌苗培养基中，2天后扶苗，去种皮，5天后可以得到下胚轴。

2、农杆菌的活化与侵染

从超低温冰箱内取出保存的含有目标基因的表达载体p35S-GhPPC，通过电击转化农杆菌LBA4404，涂皿spe⁺抗性，2天后挑取单克隆，菌液PCR挑取阳性克隆，PCR反应条件为：95℃5min；95℃30sec，55℃30sec，72℃20sec，32个循环；72℃10min。后于含spe⁺抗性LB固体培养基上划线，28℃暗培养36-48h，待皿内长出清晰的单菌落，挑取单菌落在含spe⁺抗性LB液体培养基中过夜培养(28℃，200rpm)待后续使用。将菌液5000rpm离心5min，弃上清培养基。加入10ml MGL培养基(活化液)和25uL As，重悬农杆菌LBA4404，在摇床中复苏1-2小时(28℃，200rpm)。将下胚轴切成大小约0.8cm切段，用活化后的农杆菌侵染8min，倒出风干，转入共培养基中于28℃下暗培养。

3、农杆菌介导的转化过程

具体转化步骤为常用方法，转化过程的测试参见图10。

4、转基因植株的阳性检测

取转基因T0植株新鲜叶片提取DNA(使用植物基因组DNA提取试剂盒，购自天根生化科技(北京)有限公司产品)，用35s启动子的上游引物(35s-F:5’-CTGACGTAAGGGATGACGC-3’)和目的基因GhPPC的下游引物(5’-AGCGATTCCAGGGTCTCC-3’)进行PCR阳性检验，结果见图4中的A图和图4中的B图所示。

实施例4：转基因植株的表达量分析和拷贝数检测

GhPPC基因表达量分析

取转基因T0植株叶片提取RNA，RNA的抽提方法参考改良的异硫氰酸胍法，为常规方法。

cDNA的合成步骤为：以2ug总RNA为模版，与2ul 500ug/ml oligo-dT(15)引物(购自Promega公司)，DEPC-water混合，总体积为15μl；然后70℃变性5min冰上骤冷，短暂离心，使溶液归于管底；再加5μl M-MLV 5×Reaction Buffer，1.25uL dNTP,0.625uL重组RNasin核酸酶抑制剂,1uL M-MLV反转录酶(购自Promega公司，USA)，补水至25uL。轻弹离心管混合溶液，42℃温浴1h合成第一链；反应结束后70℃处理10min，使反转录酶失活。稀释到200uL，-20℃备用。以上述反转录合成的cDNA为模板，用引物Q-RT-PPC-F(5'-AGGAGGGGGACCCACGC-3')和Q-RT-PPC-R(5'-ATTTGGTGAGACAGGGGGATG-3')对GhPPC基因进行特异的PCR扩增(扩增产物大小为190bp)，PCR反应体系：95℃5min；95℃30sec，60℃30sec，72℃12sec，32个循环；72℃10min。同时用陆地棉UB7(Genebank:DQ11644)作为内参基因，其引物分别为Q-RT-UB7-F(5'-GAAGGCATTCCACCTGACCAAC)和Q-RT-UB7-R(5'-CTTGACCTTCTTCTTCTTGTGCTTG-3')，PCR反应体系为：95℃5min；95℃30sec，60℃30sec，72℃20sec，30个循环；72℃10min。获得的PCR产物取10μl以0.8％琼脂糖凝胶电泳检测。电泳检测结果如图3中的B图。结果表明：本发明克隆的GhPPC基因在不同转基因系中的表达量有差异，即干涉效率不一样。其中，PPC-6干涉的就不明显。后续做了转基因株系T0植株的real-time PCR，结果如图3中的C图。结果表明，除PPC-6没被干涉掉，其余株系干涉效率较高。另外，对GhPPC-1和GhPPC-7的T1也做了real-time PCR，结果见图4中的C图和图4中的D图。

转基因植株的拷贝数检测：

1.棉花基因组DNA的提取

1.1称取0.25g棉花叶片，加入800uL DNA抽提液(DNA抽提试剂盒，天根生化科技(北京)有限公司)，研磨充分后转入离心管中，用枪头吸打混匀，离心8min(室温，12000rpm)。

1.2弃上清，加入65℃预热的GP1700uL，用牙签像一个方向旋转轻轻搅拌，至无块状。65℃水浴20min，中间每隔几分钟颠倒混匀一次，离心8min(室温，12000rpm)。

1.3取上清加入到新的离心管中，加酚氯仿800uL，轻摇15min，离心8min(室温，12000rpm)。

1.4再取上清，加入800uL氯仿，轻摇15min，离心8min(室温，12000rpm)。

1.5将上一步所得上层水相转入新的离心管中，加入700uL的GP2，充分混匀。

1.6将混匀的液体转入吸附柱CB3中，12000rpm离心30sec，弃掉废液。

1.7向吸附柱CB3中加入500uL的缓冲液GD(DNA抽提试剂盒，天根生化科技(北京)有限公司)，12000rpm离心30sec，弃掉废液。

1.8向吸附柱CB3中加入600uL的PW(使用前检查是否加无水乙醇)，12000rpm离心30sec，弃掉废液。再重复一遍。然后空离心2min；将吸附柱置于室温晾干。

1.9将吸附柱CB3转移到新的1.5mL的离心管中，想吸附膜中间部位加入50uL洗脱液TE,室温放置 3min，12000rpm离心2min，将DNA收集到离心管中。

2、拷贝数分析：southern杂交

流程如下：

DNA酶切，检测酶切情况，电泳分离，转膜，洗膜，预杂交，探针制备，探针标记，杂交，洗膜，压磷屏，最后扫描。

转基因各株系T0,T1代的拷贝数鉴定见图5中的A图和图5中的B图。

实施例5：利用RNA-SEQ技术对转基因和非转基因对照的转录组进行比较研究

1、利用高通量测序(RNA-SEQ)的手段，对非转基因阴性对照和转基因株系进行转录水平的比较。通过分离相同时期的叶片总RNA，获得mRNA,最后反转成cDNA，然后加上接头，或者先将RNA反转成cDNA，然后再片段化并加上接头.获得的cDNA片段随机打断，进入Illumina公司的Hiseq 2000测序仪进行序列测定。RNA-SEQ测序的初步结果如表1所示，6个测序样品一共获得了30G的数据，每个样品获得的读长数均超过千万，以陆地棉基因组为参考序列，所获得读长有92％以上可以比对到棉花基因组上，说明我本发明的测序质量很高。

表1 对照和非转基因材料的RNA-seq的结果统计

2、对非转基因阴性对照和转基因的三个转系的差异表达基因分析。

对RNA-SEQ获得不同基因的表达量水平差异进行检测，对表达量有2倍差异的基因进行统计分析，结果如图6所示，表达上调的基因数目是57个，而下调的基因数目为22个，见图6。由于PPC基因有多个同源基因，因此我们对17个PPC基因的同源基因的表达量(转录水平)进行比较分析，发现只有本研究中的基因有显著的下调，说明本发明的RNAi载体效果显著，而且特异性较高(图7)。通过比较转基因材料和非转基因材料中的和能量代谢相关基因的表达差异分析，获得了heat-map(热图，见图8所示)。从图8中很明显地发现两类材料中，与碳水化合物合成及脂类合成相关基因的表达呈现明显差异，这种差异的形成正是我们成功干涉PPC基因引起的。

3、通过整合转录组数据，证实RNAi技术能调节棉花初生代谢路径

植物的碳源主要流向两个支路：蛋白质合成支路和油脂合成支路；如果降低蛋白质合成支路中的关键基因的表达，理论上会有更多的碳源会流向油脂合成支路，进而提高种子中的油分含量。PPC基因处于植物能量代谢的关键位置(图9中A图)，主要调节蛋白质合成，本发明通过RNAi技术，抑制(下调)PPC基因的表达，降低了植物细胞中蛋白质的合成，从而提高油脂合成的能力(图9中的B图)，转录组数据充分说明了这一推断的正确性。棉花油份的新思路，新途径！

实施例6：利用转基因株系对转基因GhPPC棉花植株的农艺性状及种子蛋白及油份进行考察

1.GhPPC干涉表达和野生型陆地棉纤维长度和百粒重。

纤维长度如图10中A图。

百粒重称量为随机挑取100粒饱满的脱绒棉籽，称量总重量。三次重复。结果如图10中的B图。

2.GhPPC干涉表达和野生型陆地棉总蛋白质的含量测量。

取0.1g材料加入500uL蛋白提取液研磨充分，摇匀，在冰上放至沉淀，离心15min(4℃，13200rpm/min)；吸取上清，重复离心15min(4℃，13200rpm/min)，取上清于4℃冰箱保存。然后用考马斯亮蓝G-250和酶标仪，定标测蛋白质浓度，结果如图10中的C图。

3.GhPPC干涉表达和野生型陆地棉各脂肪酸含量和棉籽油总量的测量。

脂肪酸的测定方法：

(1)将组织充分研磨，称总重，转移到10mL玻璃试管。

(2)向试管中加入1.5mL硫酸、甲醇混合溶液(体积比1:39，内含0.01％的BHT)和400uL二甲苯溶液，向试管中充入氮气，拧紧盖子。

(3)90℃，水浴1h。

(5)加入4mL ddH2O和500uL正戊烷，混匀，1000rpm/min，离心5min。

(6)吸取600uL上清转移到测样瓶中，常温放置。脂肪酸测定结果如图10中D图。

棉籽油总量的测量：

(1)将浓硫酸脱绒后的种子晾晒2-3d。

(2)取饱满的种子用核磁共振分析仪测量。首先，打开仪器，使其运行稳定；其次，定标曲线；最后称量种重进行测量。结果如图10中的E图。

以上结果说明陆地棉GhPPC基因具有降低蛋白质含量和提高油份含量的能力，利用本发明克隆的基因和所使用的载体可用于棉花或其他油料作物的蛋白质或油脂的改良。