一种雅致放射毛霉羧肽酶Y基因及其应用的制作方法

本发明涉及一种雅致放射毛霉羧肽酶Y基因及其应用，属于生物技术领域。

背景技术：

羧肽酶Y(carboxypeptidase Y，CPY)是丝氨酸类蛋白酶，活性中心由丝氨酸、天门冬氨酸和组氨酸(Ser-Asp-His)组成，它可以水解肽链C末端氨基酸残基形成游离的氨基酸，其广泛的存在于细菌，真菌，植物与动物中。CPY具有很宽的底物谱，可以水解任何的羧基末端氨基酸，特别是对大部分其他羧肽酶来说难以水解的脯氨酸等残基，因此它可以应用于多肽的测序和质谱分析。

羧肽酶Y因其可以切割多肽C末端任意氨基酸的水解特性而被广泛应用，而不同来源的羧肽酶Y的酶学性质并不相同，目前已被报道的CPY主要来源于酿酒酵母、毕赤酵母与裂殖酵母等，其中酿酒酵母来源的CPY被研究的最为清楚。

雅致放射毛霉(Actinomucor elegans)是腐乳发酵生产的主要菌种之一，拥有非常丰富且高活性的胞外蛋白酶系，CPY也在其中，具有非常大的工业应用潜力。

技术实现要素：

本发明首先提供了一种编码羧肽酶Y的基因cpy，是以腐乳工业生产用菌雅致放射毛霉为出发菌株，分离其总RNA，反转录获得羧肽酶Y的cDNA，通过RACE获得基因全长信息。该cpy基因全长1557bp，如SEQ ID NO.1所示，编码518aa。成熟酶具有水解肽链C末端的氨基酸，使其变为游离氨基酸的功能。

本发明还将获得的基因与载体pPIC9K连接，构建重组表达载体pPIC9K-procpy，转化毕赤酵母，培养所得重组毕赤酵母，经过诱导后成功表达该基因，得到羧肽酶Y的酶原。将表达的酶原经过体外激活、纯化后测定酶活，结果表明SEQ ID NO.1所示基因表达的羧肽酶具有高催化活性的功能。

本发明所提供的羧肽酶Y在酸性条件下具有较高酶活，可以应用于蛋白水解液的脱苦，还可以用于多肽的测序和质谱分析。

附图说明

图1为cpy基因的的电泳图；M，标准Marker；1，CPY基因全长。

图2为重组酵母菌的分泌表达的羧肽酶的纯化结果；M，标准蛋白；0，携带pPIC9K的P.pastoris GS115发酵上清；1，重组菌发酵上清；2，纯化的proCPY；3，纯化的CPY。

图3为L-Tyr标样的HPLC图，出峰时间为3.4min。

图4 CPY催化反应过程中底物N-CBZ-Phe-Tyr的HPLC图。

图5 CPY催化反应过程中产物的HPLC图，出峰时间为3.4min。

具体实施方式

HPLC测定酶的活性：

取5μl激活纯化的CPY加入到1ml 2mmol/L N-CBZ-Phe-Tyr中，在37℃与pH6.0下反应10min，反应所得产物L-Tyr用HPLC进行检测。色谱柱为DIKMAC18(5μm，4.6×250mm)；流动相A为含55mmol/L醋酸钠的水，流动相B为含55mmol/L醋酸钠体积比1:2:2的水、甲醇与乙腈的混合物，pH都为7.2，线性洗脱梯度B的体积百分比为40％-70％，洗脱15min。紫外检测波长338nm，柱温40℃。所测得的产物峰面积换算为标准产物浓度，从而计算酶活。酶活定义：在25℃、pH 6.0磷酸钠缓冲液下，每分钟转化N-CBZ-Phe-Tyr生成1μmol L-Tyr所需的酶量为1U。

实施例1 cpy基因的获得

提取雅致放射毛霉总RNA，以RNA为模版制备RACE-Ready cDNA，以5'–RACE-Ready cDNA为模板，以简并引物进行PCR扩增，对目的产物进行胶回收后测序，获得约500bp的基因信息，通过NCBI库信息比对发现其为CPY部分序列。由获得的CPY部分序列设计RACE的特异性引物，进一步PCR获得cpy的序列。

A.elegans PEP001来源的羧肽酶Y的基因全长1557bp，如SEQ ID NO.1所示，编码518aa。

实施例2 cpy基因的表达

SingnalP预测结构表明AeCPY蛋白N端含有23个氨基酸的N端信号肽序列，最优剪切位点位于第23和第24位氨基酸之间。Expasy中的ProtParam预测proCPY的理论分子量与等电点分别为58.8kD与5.5。根据信号肽预测结果，设计引物扩增编码proCPY的基因。

上游引物：pPproCPY-F(5'–GGAATTCGAACCAGCCATGTTTCAGCAGCA–3')

下游引物：pPproCPY-R(5'–TAAACTATGCGGCCGCCTAATGATGATGATGATGATGGTTGAGTTCACCACGAACCC ATT–3')。

将PCR扩增得到的procpy基因用EcoR I和Not I限制性内切酶双酶切后连接到用同样限制性内切酶酶切的质粒载体pPIC9K上，构建的质粒pPIC9K-procpy转化到Escherichia coli JM109中，在含有氨苄青霉素抗性的LB固体培养基平板上挑选阳性重组子，测序验证。

将质粒pPIC9K-procpy用Sac I线性化，设置电转参数：1500v，400Ω，4-6ms，电转毕赤酵母。将转化子在MD平板上筛选，挑选阳性重组子并用MD与MM平板鉴定转化子是否为Mut+基因型。用G418浓度分别为0.25,0.5,0.75,2.0,3.0,4.0mg/mL的YPD平板筛选高拷贝转化子。

将重组质粒pET-22b(+)-procpy转化到Escherichia coli Rosetta(DE3)中，挑选单菌落至5mL含50mg/L氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃、200r/min培养10h后，取1mL培养物至100mL含50mg/L氨苄青霉素的2×YT培养基中，在37℃、200r/min培养至菌体的OD600为0.8时加入IPTG至终浓度为0.4mmol/L，20℃诱导12h后离心收集菌体。重组菌株经诱导表达后，表达产物几乎全部都是包涵体。这与之前报导的利用大肠杆菌表达酿酒酵母proCPY的结果相类似。

将毕赤酵母转化子单菌落至100ml BMGY中，30℃、200r/min培养至OD600约20左右，6,000×g离心5min收集菌体转入100ml BMMY中。30℃、200r/min下每隔24h加入1％的甲醇进行诱导，诱导144h，离心收集发酵上清。将收集的发酵上清，用30ku孔径的超滤管将发酵上清蛋白浓缩溶于100mM Tris/HCl(pH 7.5)中。用适量trypsin在37℃下处理1h后，加入胰蛋白酶抑制剂，可以获得较高活性的重组蛋白CPY。激活后的蛋白溶液，用30ku孔径的超滤管将缓冲液更换为结合缓冲液(20mM磷酸钠，500mM氯化钠，20mM咪唑，pH 7.4)，浓缩并除去部分杂蛋白。用His Trap FF crude,1mL镍柱对粗酶液进行纯化，用含150mmol/L咪唑的洗脱缓冲液洗脱目的蛋白，进行SDS-PAGE鉴定(图2)。

取5μl激活纯化的CPY加入到1ml 2mmol/L N-CBZ-Phe-Tyr中，在37℃与pH6.0下反应10min，反应所得产物L-Tyr用HPLC进行检测。色谱柱为DIKMAC18(5μm，4.6×250mm)；流动相A为含55mmol/L醋酸钠的水，流动相B为含55mmol/L醋酸钠体积比1:2:2的水、甲醇与乙腈的混合物，pH都为7.2，线性洗脱梯度B的体积百分比为40％-70％，洗脱15min。紫外检测波长338nm，柱温40℃。所测得的产物峰面积换算为标准产物浓度，从而计算酶活。L-Tyr标样、底物N-CBZ-Phe-Tyr与反应产物HPLC图如图3-5所示，酶活为157.20±1.80U/mg(p<0.01)。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

SEQUENCE LISTING

<110> 江南大学

<120> 一种雅致放射毛霉羧肽酶Y基因及其应用

<160> 3

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1557

<212> DNA

<213> 雅致放射毛霉PEP001

<400> 1

atgcccactt tattttcact tgccaaggtg gctgtagtag catcttgtgt atttggctta 60

ggctatgccg aaccagccat gtttcagcag caaggagcta ttgcagattt tggcgaaaag 120

gcctgggaca acgtgcagca cgtagtccat gatgctgctg ataaggtcca cagcgctacg 180

gataaattca agcaaatttt aagccatggc gctgatactt taaccacctt tacccaccct 240

gctttctctc aatacgcttt gagatacaag agacctactc tttgtgatcc tgatgtgaaa 300

caaatttccg gttacttgga cgttggaaaa gataagcatt tcttcttttg gttctttgaa 360

tcaagagata agcccaagga agatcccgtt gttttatggt tgaacggtgg cccaggctgt 420

tcttctttga ccggtctttt tatggaactt ggtccttgta cagtcaataa ggaaggcaat 480

gataccatca tcaacaagta ctcttggaac gataaagcca atattatctt cttggatcag 540

ccattgaatg tcggttattc tcatggtagc ggtggtgcct ccaataccga tgctgctgct 600

caagatgtat atgctttcct tcaactcttc ttcaaggaat tccctcaata tgccgatctt 660

gatttccata tttctggtga atcttatgca ggtcattaca ttcctgccat tggtggagtc 720

attaacaata ataataaggg caagttccag tcaatggaac tcttgaagaa gaagcatacc 780

ctctctgata tcaagctaaa gagtttgttg atcggtaatg gtttgactga tcctttggtt 840

caatacaagt actatgctga aatggcctgt aataattctt atggtcctgt cttggataaa 900

gctacctgtg ataacatgga agctcaattc cctgcttgtg ctcgcttgat caaaaactgt 960

tatgaaagta agaatgtatt ctcttgtttg cctgctgcta tgaagtgtaa caaggatcaa 1020

atccaacctt accaacaaac cggcatgaat ccttatgatg tccgcgaaaa gtgtaaaggt 1080

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aagaaagaag ttggtgccga gactgataaa tatgaaagct gtaacatgca aatcaacttt 1200

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<210> 2

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

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<210> 3

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<212> DNA

<213> 人工序列

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