一种从水牛乳汁中分离培养水牛乳腺上皮细胞的方法与流程

本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种从水牛乳汁中分离培养水牛乳腺上皮细胞的方法。

背景技术：

荷斯坦奶牛乳汁固体物(蛋白质、脂肪、矿物质)含量为13-16％，而水牛乳汁高达18-23％；水牛奶的乳脂率平均为8.5％，是荷斯坦牛奶的2倍多，通过长期选育，虽然水牛的产奶量有了很大的提高，但是仍旧远远低于荷斯坦奶牛，因此，乳腺生物学及泌乳功能的基础性研究对提高水牛的产奶量具有十分重要的意义。但是，目前仍旧没有成熟的商品化水牛乳腺上皮细胞，只能通过原代分离的方法获得。奶牛的原代乳腺上皮细胞分离的方法有4种，分别为组织块贴壁法、酶消化法、机械剪切法和乳汁分离法，目前，水牛乳腺上皮细胞已通过组织块贴壁法、胰酶消化法和机械剪切法成功分离，但是，组织块贴壁法、胰酶消化法和机械剪切法都需要水牛乳腺组织，而水牛乳腺组织的获得主要有两种途径，一种通过对健康高产奶水牛进行穿刺或手术，另一种取自屠宰场。前者可以选择供体水牛，但对水牛有伤害，经济成本高；后者水牛一般为淘汰母牛，其生产性能和生理状态都较差，不能排除是否患有乳腺炎，严重影响细胞的分离。且此三种分离方法在分离过程中对细胞损伤较大。

目前，利用乳汁分离法分离乳腺上皮细胞的研究，主要还是在奶牛乳汁中进行，对水牛乳汁的乳腺上皮细胞分离未见相关报道，例如，申请号为201410412690.1的中国专利，公开了从乳汁中分离和培养奶牛乳腺上皮细胞的方法及专用培养基,该方法主要是对奶牛乳汁进行乳腺上皮细胞进行分离；又例如，《生物技术通报》2013年第3期第107-113页，《牛奶中乳腺上皮细胞的分离培养及鉴定》一文中也指出了从奶牛乳汁纯化分离和培养乳腺上皮细胞，但是，目前还没有关于从水牛乳汁中直接分离培养水牛乳腺上皮细胞的报道，而且，也没有公开如何培养可以提高水牛乳腺上皮细胞的存活率；水牛乳汁中的固体物比奶牛乳汁中的固体物含量要多，乳脂率更大，乳汁中含有更多的脂肪，乳腺上皮细胞含量少，因此，分离乳腺上皮细胞的难度更大，由于水牛的乳腺上皮细胞在水牛乳汁中含量少，因此，体外培养时如何进行分离、避免细胞氧化损伤，提高细胞活力也成了水牛乳腺上皮细胞培养必须解决的技术难题。

技术实现要素：

鉴于上述内容，有必要提供一种从水牛乳汁中分离培养水牛乳腺上皮细胞的方法，能有效的从水牛乳汁中分离水牛乳腺上皮细胞，同时还能提高乳腺上皮细胞在体外培养时的活力，避免细胞损伤。

为达到上述目的，本发明所采用的技术方案是：

一种从水牛乳汁中分离培养水牛乳腺上皮细胞的方法，所述方法包括如下步骤：

(1)收集水牛乳汁：选取乳汁体细胞数为2万/mL-20万/mL的高产泌乳期的水牛，用体积百分数为75％(v/v)-90％(v/v)的酒精浸泡纱布，用完全浸湿后的纱布对水牛的乳房进行消毒，消毒时纱布从乳头向乳房基部擦拭3-5次，弃去前2-3把乳汁，然后将乳汁直接挤入400mL-800mL的无菌玻璃瓶内，拧紧瓶盖，将乳汁保藏后立刻带回实验室，得到新鲜水牛乳汁；

(2)分离水牛乳汁：水牛乳汁经过第一次、第二次离心分离获得水牛乳腺上皮细胞；所述第一次离心分离方法为：将步骤(1)的新鲜水牛乳汁与A培养液按体积比为1-2:1混合均匀后进行第一次离心，离心后除去上层半凝固状的脂肪层和中层乳白色浑浊液体，直至中层白色浑浊液体剩余4mL-5mL停止，完成第一次离心分离，得到第一次离心剩余混合物；所述第二次离心分离方法为：将第一次离心剩余混合物与A培养液按体积比为1-2:1的比例重悬后进行第二次离心，离心后除去上层环状的脂肪层和中层乳白色浑浊液体，直至中层白色浑浊液体剩余0.5mL-1.5mL停止，完成第二次离心分离，得到第二次离心分离剩余混合物；

(3)水牛乳腺上皮细胞培养和纯化：将步骤(2)第二次离心分离剩余混合物接种于含有5ml-8mlB培养液的培养皿中，接种后将培养皿放在温度为35℃-37℃，5％CO₂饱和湿度的培养箱内进行培养，11h-13h后，观察培养皿内的液体，取液体外观呈粉红浑浊状且无蜡样物质的培养皿，将磷酸缓冲盐溶液加入培养皿中对培养皿内的液体进行清洗直至液体由粉红浑浊状转为澄清透明；然后再加入4mL的B培养液，然后每两天更换一次B培养液，培养至第6d时，将培养皿放在显微镜下观察、并刮除培养皿内的非乳腺上皮细胞并去除培养皿内的B培养液，再用磷酸缓冲盐溶液对去B培养液后的液体进行清洗3次-5次，清洗后将培养皿放在温度为35℃-37℃，5％CO₂饱和湿度的培养箱内进行培养，继续观察，直至细胞的融合度为80％时，再将细胞进行消化传代或冻存、培养获得水牛乳腺上皮细胞；

所述A培养液为：含有0.1mg/mL-0.15mg/mL青霉素和0.05mg/mL-0.1mg/mL链霉素的磷酸缓冲盐溶液；

所述B培养液制备方法为：将DMEM/DF12培养基和胚胎牛血清按照体积比为8-9：1混匀，然后加入1mmol/L-1.5mmol/L的L-谷胺酰胺、0.1mmol/L-0.5mmol/L的非必需氨基酸、0.1mmol/L-0.5mmol/L的抗氧化剂、酶活单位最终为100U-150U的青霉素溶液、酶活单位最终为100U-150U的链霉素溶液、终浓度为1μg/mL-1.5μg/mL的氢化可的松、终浓度为1μg/mL-1.5μg/mL孕酮、终浓度为5μg/mL-10μg/mL转铁蛋白、终浓度为5μg/mL-10μg/mL胰岛素和终浓度为10ng/mL-15ng/mL表皮细胞生长因子。

进一步的，所述A培养液为：含有0.1mg/mL青霉素和0.05mg/mL链霉素的磷酸缓冲盐溶液；所述B培养液制备方法为：将DMEM/DF12培养基和胚胎牛血清按照体积比为9：1混匀，然后加入1mmol/L的L-谷胺酰胺、0.1mmol/L的非必需氨基酸、0.1mmol/L的抗氧化剂、酶活单位最终为100U的青霉素溶液、酶活单位最终为100U的链霉素溶液、终浓度为1μg/mL的氢化可的松、终浓度为1μg/mL孕酮、终浓度为5μg/mL转铁蛋白、终浓度为5μg/mL胰岛素和终浓度为10ng/mL表皮细胞生长因子。

进一步的，其特征在于，所述B培养液中非必需氨基酸由以下物质组成：0.1mmol/L-0.3mmol/L的甘氨酸、0.1mmol/L-0.3mmol/L的L-丙氨酸、0.1mmol/L-0.3mmol/L的L-天冬氨酰、0.1mmol/L-0.3mmol/L的L-天冬氨酸、0.1mmol/L-0.3mmol/L的L-谷氨酸、0.1mmol/L-0.3mmol/L的L-脯氨酸和0.1mmol/L-0.3mmol/L的L-丝氨酸。

进一步的，所述B培养液中非必需氨基酸由以下物质组成：0.1mmol/L的甘氨酸、0.1mmol/L的L-丙氨酸、0.1mmol/L的L-天冬氨酰、0.1mmol/L的L-天冬氨酸、0.1mmol/L的L-谷氨酸、0.1mmol/L的L-脯氨酸和0.1mmol/L的L-丝氨酸。

进一步的，所述B培养液中的抗氧化剂为β-巯基乙醇或中药抗氧化剂。

进一步的，所述中药抗氧化剂由同等质量份的王不留行、苜蓿、黄芪、丹参、漏芦、木通、通草、新鲜仙人掌、蒲公英和甲珠组成；所述中药抗氧化剂由以下方法制得：将所述中药材混合后加入与混合物同等质量比的蒸馏水煮沸，然后转文火进行煎煮60min-70min，再进行过滤，取滤液进行浓缩直至生药含量为0.2g/mL-0.4g/mL，再进行离心，取离心之后的上清液调节pH值为7.5，然后再用微孔滤膜进行过滤、除菌、冷却至2℃-4℃制得中药抗氧化剂；所述离心条件为：离心转速为2000r/min-3000r/min，离心温度为室温，离心时间为10min-20min。

进一步的，所述步骤(1)中乳汁保藏方法为在37℃下进行恒温水浴。

进一步的，所述步骤(2)中第一次离心的离心条件为：离心转速为2000r/min，离心温度为室温，离心时间为20min；第二次离心的离心条件为：离心转速为1500r/min，离心温度为室温，离心时间为15min。

本发明具有如下有益效果：

1、本发明采用从水牛乳汁中分离水牛乳腺上皮细胞的方法，材料为水牛乳汁，采集方式为人工挤奶，取材方便，经济便捷，本发明选择乳汁中细胞数量在2万/mL-20万/mL的奶水牛，确保了乳汁中细胞的数量，同时减少细胞污染的可能性，其次，本发明采用乳汁和含有0.1mg/mL青霉素和0.05mg/mL链霉素的磷酸缓冲盐溶液按1-2：1的比例混匀离心后，减低乳汁中各成分的浓度，使乳脂、乳蛋白更容易被去除，保证将乳脂去除干净，促进细胞贴壁，而且在收集乳腺上皮细胞的过程中，对离心的乳汁的收集包括了沉淀部分和中层白色浑浊液的少部分最大程度上的收集了细胞，解决了水牛乳汁中，乳腺上皮细胞含量少不易收集的问题；同时，为了减少对水牛乳腺上皮细胞的损害，增加水牛上皮细胞的体外增殖，经发明人研究发现，添加非必需氨基酸可以增强水牛乳腺上皮细胞的体外增殖，加快水牛乳腺上皮细胞的生长、富集；同时，为了提高乳腺上皮细胞抗氧化酶活性，增强细胞的抗氧化能力，在乳腺上皮细胞培养基中，发明人还添加了抗氧化剂来保证细胞的生长，达到平衡氧化系统和抗氧化系统有效的避免细胞氧化损伤，提高细胞活力。

2、本发明的非必需氨基酸主要是甘氨酸、L-丙氨酸、L-天冬氨酰、L-天冬氨酸、L-谷氨酸、L-脯氨酸和L-丝氨酸；其中，甘氨酸、L-丙氨酸、L-天冬氨酰、L-天冬氨酸、L-谷氨酸、L-脯氨酸和L-丝氨酸能够调节奶牛乳腺上皮细胞的增殖和凋亡，低浓度的甘氨酸对细胞增殖具有促进作用，高浓度的甘氨酸对细胞增殖具有抑制作用能促进细胞的凋亡，发明人研究发现甘氨酸、L-丙氨酸、L-天冬氨酰、L-天冬氨酸、L-谷氨酸、L-脯氨酸和L-丝氨酸的含量分别为0.1mmol/L-0.3mmol/L时能有效促进乳腺上皮细胞向S期转化，促进细胞分裂。

3、本发明的抗氧化剂主要是β-巯基乙醇和中药物质；其中，β-巯基乙醇能有效去除氧化代谢中的活性氧，起到抗氧化作用有效提高细胞活性；本发明的中药物质主要由王不留行、苜蓿、黄芪、丹参、漏芦、木通、通草、新鲜仙人掌、蒲公英和甲珠制得，这几种中药混合熬煮后含有丰富的黄酮槲皮素等活性成分能够促进奶牛乳腺上皮细胞增殖，提高细胞抗氧化水平，上调奶牛乳腺上皮细胞存活率，提高抗氧化和抗凋亡的能力。

【附图说明】

图1是本发明实施例中水牛乳腺上皮细胞分离纯化培养的形态验证过程，接种12h后在放大倍数为10×倒置显微镜下培养皿内液体沉淀的形态图；

图2是本发明实施例中水牛乳腺上皮细胞分离纯化培养的形态验证过程，接种12h后在放大倍数为10×倒置显微镜下培养皿内上清液的形态图；

图3是本发明实施例中水牛乳腺上皮细胞分离纯化培养的形态验证过程，接种12h培养6d后在放大倍数为10×倒置显微镜下培养皿内乳腺上皮的形态图；

图4是本发明实施例中水牛乳腺上皮细胞分离纯化培养的形态验证过程，经过消化、传代后在低密度培养条件下，在放大倍数为10×倒置显微镜下呈铺路石样的形态图；

图5是本发明实施例中水牛乳腺上皮细胞分离纯化培养的形态验证过程，经过消化、传代后在低密度培养条件下，在放大倍数为10×倒置显微镜下呈短梭形或多角形的形态图；

图6是本发明实施例中乳腺上皮细胞经吉姆萨染色后，处于分裂期的形态图；

图7是本发明实施例中水牛乳腺上皮细胞分离纯化培养的形态验证过程，经过消化、传代后，高密度培养10d后，在放大倍数为10×倒置显微镜下呈圆顶乳头状结构的形态图；

图8是本发明实施例中水牛乳腺上皮细胞分离纯化培养的形态验证过程，经过消化、传代后，在大倍数为10×倒置显微镜下呈圆乳滴状结构的形态图；

图9是本发明实施例中水牛乳腺上皮细胞分离纯化培养的形态验证过程，细胞生长紧密时，在大倍数为10×倒置显微镜下呈分层生长的形态图；

图10是本发明实施例中水牛乳腺上皮细胞免疫荧光鉴定图。

图11是本发明实施例水牛乳腺上皮细胞的生长曲线图。

附图说明：图10中，A是本发明实施例中水牛乳腺上皮细胞角蛋白18的荧光表达图；B是本发明实施例中水牛乳腺上皮Hoechest 33342染核的荧光表达图。

【具体实施方式】

为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合附图对本发明的具体实施方式做详细的说明。在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明。但是本发明能够以很多不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似改进，因此本发明不受下面公开的具体实施的限制。

实施例1：

1、实施例的A、B培养液配方：

本实施例所使用的A培养液配方为：含有0.1mg/mL青霉素和0.05mg/mL链霉素的磷酸缓冲盐溶液；

所使用的B培养液配方和制备方法为：将DMEM/DF12培养基和胚胎牛血清按照体积比为9：1混匀，然后加入1mmol/L的L-谷胺酰胺、0.1mmol/L的非必需氨基酸、0.1mmol/L的抗氧化剂、酶活单位最终为100U的青霉素溶液、酶活单位最终为100U的链霉素溶液、终浓度为1μg/mL的氢化可的松、终浓度为1μg/mL孕酮、终浓度为5μg/mL转铁蛋白、终浓度为5μg/mL胰岛素和终浓度为10ng/mL表皮细胞生长因子；其中，上述的非必需氨基酸组成配方为：0.1mmol/L的甘氨酸、0.1mmol/L的L-丙氨酸、0.1mmol/L的L-天冬氨酰、0.1mmol/L的L-天冬氨酸、0.1mmol/L的L-谷氨酸、0.1mmol/L的L-脯氨酸和0.1mmol/L的L-丝氨酸；其中，上述的抗氧化剂为β-巯基乙醇。

2、本实施例使用上述A、B培养液从水牛乳汁中分离培养水牛乳腺上皮细胞的方法包括以下步骤：

(1)收集水牛乳汁：选取乳汁体细胞数为2万/mL的高产泌乳期的水牛，用体积百分数为75％(v/v)的酒精浸泡纱布，用完全浸湿后的纱布对水牛的乳房进行消毒，消毒时纱布从乳头向乳房基部擦拭3次，弃去前2把乳汁，然后将乳汁直接挤入500mL的无菌玻璃瓶内，拧紧瓶盖，将乳汁在37℃下进行恒温水浴保藏后立刻带回实验室，得到新鲜水牛乳汁；

(2)分离水牛乳汁：水牛乳汁经过第一次、第二次离心分离获得水牛乳腺上皮细胞；其中，第一次离心分离方法为：将步骤(1)的新鲜水牛乳汁与A培养液按体积比为2:1混合均匀后在离心转速为2000r/min，离心温度为室温，离心时间为20min的条件下进行第一次离心，离心后除去上层半凝固状的脂肪层和中层乳白色浑浊液体，直至中层白色浑浊液体剩余5mL停止，完成第一次离心分离，得到第一次离心剩余混合物；其中，第二次离心分离方法为：将第一次离心剩余混合物与A培养液按体积比为2:1的比例重悬后在离心转速为1500r/min，离心温度为室温，离心时间为15min的条件下进行第二次离心，离心后除去上层环状的脂肪层和中层乳白色浑浊液体，直至中层白色浑浊液体剩余1mL停止，完成第二次离心分离，得到第二次离心分离剩余混合物；

(3)水牛乳腺上皮细胞培养和纯化：将步骤(2)第二次离心分离剩余混合物接种于含有5mlB培养液的培养皿中，接种后将培养皿放在温度为37℃，5％CO₂饱和湿度的培养箱内进行培养，12h后，观察培养皿内的液体，取液体外观呈粉红浑浊状且无蜡样物质的培养皿，将磷酸缓冲盐溶液加入培养皿中对培养皿内的液体进行清洗直至液体由粉红浑浊状转为澄清透明；然后再加入4mL的B培养液，然后每两天更换一次B培养液，培养至第6d时，将培养皿放在显微镜下观察、并刮除培养皿内的非乳腺上皮细胞并去除培养皿内的B培养液，再用磷酸缓冲盐溶液对去B培养液后的液体进行清洗3次，清洗后将培养皿放在温度为37℃，5％CO₂饱和湿度的培养箱内进行培养，继续观察，直至细胞的融合度为80％时，再将细胞进行消化传代或冻存,培养获得水牛乳腺上皮细胞。

实施例2：

1、实施例的A、B培养液配方：

本实施例所使用的A培养液配方为：含有0.15mg/mL青霉素和0.1mg/mL链霉素的磷酸缓冲盐溶液；

所使用的B培养液配方和制备方法为：将DMEM/DF12培养基和胚胎牛血清按照体积比为8：2混匀，然后加入1.5mmol/L的L-谷胺酰胺、0.5mmol/L的非必需氨基酸、0.5mmol/L的抗氧化剂、酶活单位最终为150U的青霉素溶液、酶活单位最终为150U的链霉素溶液、终浓度为1.5μg/mL的氢化可的松、终浓度为1.5μg/mL孕酮、终浓度为10μg/mL转铁蛋白、终浓度为10μg/mL胰岛素和终浓度为15ng/mL表皮细胞生长因子；其中，上述的非必需氨基酸组成配方为：0.3mmol/L的甘氨酸、0.3mmol/L的L-丙氨酸、0.3mmol/L的L-天冬氨酰、0.3mmol/L的L-天冬氨酸、0.3mmol/L的L-谷氨酸、0.3mmol/L的L-脯氨酸和0.3mmol/L的L-丝氨酸；其中，上述的抗氧化剂为β-巯基乙醇。

2、本实施例使用上述A、B培养液从水牛乳汁中分离培养水牛乳腺上皮细胞的方法包括以下步骤：

(1)收集水牛乳汁：选取乳汁体细胞数为20万/mL的高产泌乳期的水牛，用体积百分数为90％(v/v)的酒精浸泡纱布，用完全浸湿后的纱布对水牛的乳房进行消毒，消毒时纱布从乳头向乳房基部擦拭5次，弃去前3把乳汁，然后将乳汁直接挤入400mL的无菌玻璃瓶内，拧紧瓶盖，将乳汁在37℃下进行恒温水浴保藏后立刻带回实验室，得到新鲜水牛乳汁；

(2)分离水牛乳汁：水牛乳汁经过第一次、第二次离心分离获得水牛乳腺上皮细胞；其中，第一次离心分离方法为：将步骤(1)的新鲜水牛乳汁与A培养液按体积比为1:1混合均匀后在离心转速为2000r/min，离心温度为室温，离心时间为20min的条件下进行第一次离心，离心后除去上层半凝固状的脂肪层和中层乳白色浑浊液体，直至中层白色浑浊液体剩余4ml停止，完成第一次离心分离，得到第一次离心剩余混合物；其中，第二次离心分离方法为：将第一次离心剩余混合物与A培养液按体积比为1:1的比例重悬后在离心转速为1500r/min，离心温度为室温，离心时间为15min的条件下进行第二次离心，离心后除去上层环状的脂肪层和中层乳白色浑浊液体，直至中层白色浑浊液体剩余0.5mL停止，完成第二次离心分离，得到第二次离心分离剩余混合物；

(3)水牛乳腺上皮细胞培养和纯化：将步骤(2)第二次离心分离剩余混合物接种于含有8mLB培养液的培养皿中，接种后将培养皿放在温度为35℃，5％CO₂饱和湿度的培养箱内进行培养，13h后，观察培养皿内的液体，取液体外观呈粉红浑浊状且无蜡样物质的培养皿，将磷酸缓冲盐溶液加入培养皿中对培养皿内的液体进行清洗直至液体由粉红浑浊状转为澄清透明；然后再加入4mL的B培养液，然后每两天更换一次B培养液，培养至第6d时，将培养皿放在显微镜下观察、并刮除培养皿内的非乳腺上皮细胞并去除培养皿内的B培养液，再用磷酸缓冲盐溶液对去B培养液后的液体进行清洗5次，清洗后将培养皿放在温度为35℃，5％CO₂饱和湿度的培养箱内进行培养，继续观察，直至细胞的融合度为80％时，再将细胞进行消化传代或冻存、培养获得水牛乳腺上皮细胞。

实施例3：

1、实施例的A、B培养液配方：

本实施例所使用的A培养液配方为：含有0.12mg/mL青霉素和0.08mg/mL链霉素的磷酸缓冲盐溶液；

所使用的B培养液配方和制备方法为：将DMEM/DF12培养基和胚胎牛血清按照体积比为8.5：1.5混匀，然后加入1.2mmol/L的L-谷胺酰胺、0.3mmol/L的非必需氨基酸、0.3mmol/L的抗氧化剂、酶活单位最终为120U的青霉素溶液、酶活单位最终为120U的链霉素溶液、终浓度为1.3μg/mL的氢化可的松、终浓度为1.3μg/mL孕酮、终浓度为8μg/mL转铁蛋白、终浓度为8μg/mL胰岛素和终浓度为12ng/mL表皮细胞生长因子；其中，上述的非必需氨基酸组成配方为：0.2mmol/L的甘氨酸、0.2mmol/L的L-丙氨酸、0.2mmol/L的L-天冬氨酰、0.2mmol/L的L-天冬氨酸、0.2mmol/L的L-谷氨酸、0.2mmol/L的L-脯氨酸和0.2mmol/L的L-丝氨酸；其中，上述的抗氧化剂为β-巯基乙醇。

2、本实施例使用上述A、B培养液从水牛乳汁中分离培养水牛乳腺上皮细胞的方法包括以下步骤：

(1)收集水牛乳汁：选取乳汁体细胞数为15万/mL的高产泌乳期的水牛，用体积百分数为80％(v/v)的酒精浸泡纱布，用完全浸湿后的纱布对水牛的乳房进行消毒，消毒时纱布从乳头向乳房基部擦拭3-5次，弃去前3把乳汁，然后将乳汁直接挤入800mL的无菌玻璃瓶内，拧紧瓶盖，将乳汁在37℃下进行恒温水浴保藏后立刻带回实验室，得到新鲜水牛乳汁；

(2)分离水牛乳汁：水牛乳汁经过第一次、第二次离心分离获得水牛乳腺上皮细胞；其中，第一次离心分离方法为：将步骤(1)的新鲜水牛乳汁与A培养液按体积比为1.5:1混合均匀后在离心转速为2000r/min，离心温度为室温，离心时间为20min的条件下进行第一次离心，离心后除去上层半凝固状的脂肪层和中层乳白色浑浊液体，直至中层白色浑浊液体剩余4.5mL停止，完成第一次离心分离，得到第一次离心剩余混合物；其中，第二次离心分离方法为：将第一次离心剩余混合物与A培养液按体积比为1.5:1的比例重悬后在离心转速为1500r/min，离心温度为室温，离心时间为15min的条件下进行第二次离心，离心后除去上层环状的脂肪层和中层乳白色浑浊液体，直至中层白色浑浊液体剩余1.3mL停止，完成第二次离心分离，得到第二次离心分离剩余混合物；(3)水牛乳腺上皮细胞培养和纯化：将步骤(2)第二次离心分离剩余混合物接种于含有6mL的B培养液的培养皿中，接种后将培养皿放在温度为36℃，5％CO₂饱和湿度的培养箱内进行培养，11h后，观察培养皿内的液体，取液体外观呈粉红浑浊状且无蜡样物质的培养皿，将磷酸缓冲盐溶液加入培养皿中对培养皿内的液体进行清洗直至液体由粉红浑浊状转为澄清透明；然后再加入4mL的B培养液，然后每两天更换一次B培养液，培养至第6d时，将培养皿放在显微镜下观察、并刮除培养皿内的非乳腺上皮细胞并去除培养皿内的B培养液，再用磷酸缓冲盐溶液对去B培养液后的液体进行清洗4次，清洗后将培养皿放在温度为36℃，5％CO₂饱和湿度的培养箱内进行培养，继续观察，直至细胞的融合度为80％时，再将细胞进行消化传代或冻存、培养获得水牛乳腺上皮细胞。

实施例4：

1、实施例的A、B培养液配方：

本实施例所使用的A培养液配方为：含有0.1mg/mL青霉素和0.05mg/mL链霉素的磷酸缓冲盐溶液；

所使用的B培养液配方和制备方法为：将DMEM/DF12培养基和胚胎牛血清按照体积比为9：1混匀，然后加入1mmol/L的L-谷胺酰胺、0.1mmol/L的非必需氨基酸、0.1mmol/L的抗氧化剂、酶活单位最终为100U的青霉素溶液、酶活单位最终为100U的链霉素溶液、终浓度为1μg/mL的氢化可的松、终浓度为1μg/mL孕酮、终浓度为5μg/mL转铁蛋白、终浓度为5μg/mL胰岛素和终浓度为10ng/mL表皮细胞生长因子；其中，上述的非必需氨基酸组成配方为：0.1mmol/L的甘氨酸、0.1mmol/L的L-丙氨酸、0.1mmol/L的L-天冬氨酰、0.1mmol/L的L-天冬氨酸、0.1mmol/L的L-谷氨酸、0.1mmol/L的L-脯氨酸和0.1mmol/L的L-丝氨酸；其中，上述的抗氧化剂为中药抗氧化剂；

其中，中药抗氧化剂由同等质量份的王不留行、苜蓿、黄芪、丹参、漏芦、木通、通草、新鲜仙人掌、蒲公英和甲珠制得；

制作方法为：将所述中药材混合后加入与混合物同等质量比的蒸馏水煮沸，然后转文火进行煎煮60min，再进行过滤，取滤液进行浓缩直至生药含量为0.2g/mL，然后在离心转速为2000r/min，离心温度为室温，离心时间为10min的条件下进行离心，取离心之后的上清液调节pH值为7.5，然后再用微孔滤膜进行过滤、除菌、冷却至2℃制得。

2、本实施例使用上述A、B培养液从水牛乳汁中分离培养水牛乳腺上皮细胞的方法与实施例1完全相同。

实施例5：

1、实施例的A、B培养液配方：

本实施例所使用的A培养液配方为：含有0.1mg/mL青霉素和0.05mg/mL链霉素的磷酸缓冲盐溶液；

所使用的B培养液配方和制备方法为：将DMEM/DF12培养基和胚胎牛血清按照体积比为9：1混匀，然后加入1mmol/L的L-谷胺酰胺、0.1mmol/L的非必需氨基酸、0.1mmol/L的抗氧化剂、酶活单位最终为100U的青霉素溶液、酶活单位最终为100U的链霉素溶液、终浓度为1μg/mL的氢化可的松、终浓度为1μg/mL孕酮、终浓度为5μg/mL转铁蛋白、终浓度为5μg/mL胰岛素和终浓度为10ng/mL表皮细胞生长因子；其中，上述的非必需氨基酸组成配方为：0.1mmol/L的甘氨酸、0.1mmol/L的L-丙氨酸、0.1mmol/L的L-天冬氨酰、0.1mmol/L的L-天冬氨酸、0.1mmol/L的L-谷氨酸、0.1mmol/L的L-脯氨酸和0.1mmol/L的L-丝氨酸；其中，上述的抗氧化剂为中药抗氧化剂；

其中，中药抗氧化剂由同等质量份的王不留行、苜蓿、黄芪、丹参、漏芦、木通、通草、新鲜仙人掌、蒲公英和甲珠制得；

制作方法为：将所述中药材混合后加入与混合物同等质量比的蒸馏水煮沸，然后转文火进行煎煮70min，再进行过滤，取滤液进行浓缩直至生药含量为0.4g/mL，然后在离心转速为3000r/min，离心温度为室温，离心时间为10min-20min的条件下进行离心，取离心之后的上清液调节pH值为7.5，然后再用微孔滤膜进行过滤、除菌、冷却至4℃制得。

2、本实施例使用上述A、B培养液从水牛乳汁中分离培养水牛乳腺上皮细胞的方法与实施例1完全相同。

实施例6：

1、实施例的A、B培养液配方：

本实施例所使用的A培养液配方为：含有0.1mg/mL青霉素和0.05mg/mL链霉素的磷酸缓冲盐溶液；

所使用的B培养液配方和制备方法为：将DMEM/DF12培养基和胚胎牛血清按照体积比为9：1混匀，然后加入1mmol/L的L-谷胺酰胺、0.1mmol/L的非必需氨基酸、0.1mmol/L的抗氧化剂、酶活单位最终为100U的青霉素溶液、酶活单位最终为100U的链霉素溶液、终浓度为1μg/mL的氢化可的松、终浓度为1μg/mL孕酮、终浓度为5μg/mL转铁蛋白、终浓度为5μg/mL胰岛素和终浓度为10ng/mL表皮细胞生长因子；其中，上述的非必需氨基酸组成配方为：0.1mmol/L的甘氨酸、0.1mmol/L的L-丙氨酸、0.1mmol/L的L-天冬氨酰、0.1mmol/L的L-天冬氨酸、0.1mmol/L的L-谷氨酸、0.1mmol/L的L-脯氨酸和0.1mmol/L的L-丝氨酸；其中，上述的抗氧化剂为中药抗氧化剂；

其中，中药抗氧化剂由同等质量份的王不留行、苜蓿、黄芪、丹参、漏芦、木通、通草、新鲜仙人掌、蒲公英和甲珠制得；

制作方法为：将所述中药材混合后加入与混合物同等质量比的蒸馏水煮沸，然后转文火进行煎煮65min，再进行过滤，取滤液进行浓缩直至生药含量为0.3g/mL，然后在离心转速为2500r/min，离心温度为室温，离心时间为12min的条件下进行离心，取离心之后的上清液调节pH值为7.5，然后再用微孔滤膜进行过滤、除菌、冷却至3℃制得。

2、本实施例使用上述A、B培养液从水牛乳汁中分离培养水牛乳腺上皮细胞的方法与实施例1完全相同。

验证试验：

以实施例1做为一个例子，利用显微镜对分离纯化过程中的上皮细胞进行细胞形态观察、利用免疫细胞化学鉴定对水牛的上皮细胞进行验证检验并绘制细胞的生长曲线：

1、分离纯化过程中的上皮细胞进行细胞形态观察：

将实施例1第二次离心分离后的细胞在直径为60mm细胞培养皿内接种培养12h后，选取培养皿内培养液为粉红浑浊液体，无蜡样物质漂浮的培养皿液体，用2mL磷酸缓冲盐溶液清洗细胞直至液体澄清透明，加入4mL的B培养液，此时乳汁沉淀皿内有较多贴壁的细胞，但杂质较多(如图1所示)；而乳汁上清皿内贴壁较少，杂质也较少(如图2所示)。此后每两天更换一次培养液。培养至6d时，在10×倒置显微镜下观察，乳汁上清皿内出现有单个细胞增殖而形成的单克隆(如图3所示)，乳汁沉淀皿内出现多个克隆集落，而极少会出现非乳腺上皮细胞，出现时用记号笔圈出。在体式解剖显微镜下，用10μL枪头将圈出的细胞刮除，于10×倒置显微镜下观察确认刮除干净；弃去培养液，用磷酸缓冲盐溶液洗3次，确认无非乳腺上皮细胞悬浮细胞，添加4mL B培养液，置于37℃、5％CO₂饱和湿度培养箱中继续培养。待细胞长至80％融合时，弃去培养液后加入1mL TrypLE胰蛋白酶混匀，37℃消化10min，吸去培养皿内的TrypLE胰蛋白酶，再加入1mL TrypLE胰蛋白酶混匀，37℃消化约20min。细胞传代后，低密度培养时细胞呈铺路石样(如图4所示)、短梭形或多角形(如图5所示)，高密度培养10d以后出现圆顶乳头状结构(如图7所示)、有丰富乳滴(如图8所示)。乳腺上皮细胞经吉姆萨染色后，可观察到多处于分裂期，且细胞为含有3-6个核仁(如图6所示)。当水牛乳腺上皮细胞生长紧密时，出现分层生长(如图9所示)。

2、水牛乳腺上皮细胞性质的免疫细胞化学鉴定：

水牛乳腺上皮细胞经体积百分数为4％多聚甲醛中固定20min后，溶于含质量百分数为2％牛血清白蛋白磷酸缓冲盐溶液中，在室温下培养30min，然后再加入细胞角蛋白18抗体，其中细胞角蛋白18抗体与上述的磷酸缓冲盐溶液体积比为1:200，混合均匀后在4℃过夜培养，再加入青霉素/链霉素双抗溶液，双抗溶液与混合液体积比为1:800，混合均匀后在室温条件下避光孵育60min，然后取出培养液，并用磷酸缓冲盐溶液洗涤，再用Hoechest 33342对水牛乳腺上皮细胞染核，洗涤后于倒置荧光显微镜下观察拍照，经免疫细胞化学鉴定表明，所获得的水牛乳腺上皮细胞表达细胞角蛋白18(图10)，进而证实该细胞为水牛乳腺上皮细胞。

3、绘制水牛乳腺上皮细胞的生长曲线：将分离纯化的水牛乳腺上皮细胞按1×10³接种于24孔板，置于37℃，5％CO₂培养箱培养。用细胞计数仪连续计数12天，并以时间为横坐标，细胞个数为纵坐标，绘制细胞生长曲线。细胞在前7d内生长缓慢；8d至11d细胞较快增殖；11d后细胞数量变化很小。细胞生长曲线呈“S”形,较符合细胞生长的一般生物学规律(图11)。

综上所述，使用本发明的方法能安全、高效的从水牛乳汁中分离水牛乳腺上皮细胞，而且水牛乳腺上皮细胞在体外进行培养时还不会造成细胞损伤。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明的保护范围应以所附权利要求为准。