一种携带白介素6基因的重组狂犬病病毒及其应用的制作方法

本发明属于分子生物免疫学
技术领域：
。更具体地，涉及一种携带免疫增强因子白介素6基因的重组狂犬病病毒及其应用。
背景技术：
：由狂犬病病毒(rabiesvirus，rv)引起的狂犬病(rabies)是以侵染中枢神经系统为特点的烈性人兽共患传染病，一旦发病致死率几乎高达100％。亚非地区属于狂犬病的高发地，猫、狗等家养动物是携带rv的主要宿主，约99％的患者是被这些动物咬伤或抓伤后而患病，狂犬病仍是严重威胁这些地区人们生命安全的重要传染病。我国是狂犬病的高发区，发病人数仅次于印度，高居世界第二位。随着家养宠物的增加，我国狂犬病的控制和防治依然任重道远。目前对于狂犬病，主要以有效的疫苗防治为主，人或者动物一旦发病，无特效药可治，所以，安全有效的疫苗是消除我国人间狂犬病的重要手段。在我国，犬只成为狂犬病的主要带毒宿主和传播源，要想在我国消灭人狂犬病，就必须减少流浪狗的数量，普及家养犬只的免疫，使其免疫率达到70％以上，先在动物中消灭狂犬病。我国目前虽然刚批准几款具自主知识产权的兽用灭活狂犬疫苗，但因生产规模的限制、生产成本的偏高和长期使用进口灭活疫苗的惯性，国产兽用灭活疫苗尚未在国内大量施用。绝大部分经济发达的城市仍然首选进口灭活疫苗，这些灭活疫苗对于农村和经济落后地区来说价格太高，难以大规模推广使用，国产的灭活疫苗虽然价格便宜，但其免疫效果不佳。因此，有必要进一步降低研发成本，开发出价格低廉、安全、有效的人用及兽用狂犬病疫苗。免疫增强因子白介素6(il6)已经被广泛用于疫苗的佐剂。il6作为分子佐剂，具有多种生物学功能。首先il6可以激活b细胞和诱导t细胞的成熟，增强机体产生特异性抗体的能力；其次，il6可以提高免疫球蛋白igg的亲和性，使有效抗体的比例更高，更加有效的中和抗原或者清除病原；同时，il6还可以促进细胞毒性t细胞的产生，增强细胞免疫，及时清除病原；另外，il6也是一种较强的炎症因子，可以诱导局部炎症反应，适度的炎症反应有利于机体清除病原及产生更强的免疫应答。所以，将il6作为分子佐剂，可以有效的提高疫苗免疫效果，增强机体的特异性免疫应答。但是，il6作为一种炎症因子，过量表达或使用会会引起过度的炎症反应而损害机体。技术实现要素：本发明要解决的技术问题是克服上述现有技术的缺陷和不足，利用分子生物学手段，以狂犬病疫苗候选株hep-flury为骨架，将免疫增强因子il6基因插入hep-flury；通过拯救获得携带犬il6的重组狂犬病毒株，能够免疫诱导产生更高的抗狂犬病病毒中和抗体水平，降低了犬用疫苗的成本。而且，本发明将il6基因重组至狂犬病毒中，既能稳定表达il6蛋白，又能避免其过度表达，克服了过量il6引起病理损伤的缺陷。本发明的目的是提供一种携带白介素6基因的重组狂犬病病毒rhep-cail6。本发明另一目的是所述携带白介素6基因的重组狂犬病病毒rhep-cail6在作为或制备狂犬病疫苗方面的应用。本发明上述目的通过以下技术方案实现：一种携带犬il6基因的重组狂犬病病毒rhep-cail6，是以狂犬病病毒hep-flury株为骨架，将seqidno.1所示的犬il6基因插入hep-flury，得到携带犬il6基因的重组质粒phep-cail6，最后拯救筛选获得重组狂犬病病毒株rhep-cail6。其中，seqidno.1所示的犬il6基因是利用通过生物信息学，从我国大量饲养的中华田园犬中扩增得到，其表达的il6蛋白对几乎所有的犬只产生作用。具体地：所述重组狂犬病病毒rhep-cail6是将犬il6基因克隆到狂犬病病毒hep-flury株全长cdna克隆中，构建了表达犬il6蛋白的重组cdna克隆phep-cail6；然后将cdna克隆phep-cail6和表达狂犬病病毒n、p、g和l蛋白的辅助质粒共转染bhk-21细胞，拯救获得了携带犬il6基因的一株嵌合狂犬病病毒rhep-cail6。更具体地，所述重组狂犬病病毒rhep-cail6中，犬il6基因被克隆至狂犬病病毒株hep-flury假基因区，即g基因和l基因中间，构建策略如附图1所示。该重组狂犬病病毒rhep-cail6携带免疫增强因子il6蛋白，能够免疫诱导产生更高的抗狂犬病病毒中和抗体，且产生更好的保护效果，降低了犬用疫苗的成本。本发明拯救的hep-flury假基因区有多个酶切位点，易于克隆和表达多个外源基因，易于将il6基因克隆至狂犬病病毒株hep-flury。根据本发明将il6基因克隆至狂犬病病毒假基因区进行独立表达的策略，犬il6蛋白被单独表达，而非融合表达。作为一种优选的可实施方案，本发明所述重组狂犬病病毒rhep-cail6的构建方法包括如下步骤：s1.构建重组质粒phep-cail6：将seqidno.1所示犬il6基因克隆至狂犬病病毒hep-flury株全长cdna中；s2.利用重组质粒进行拯救获得重组病毒rhep-cail6。优选地，步骤s1构建重组质粒的具体方法如下：s11.利用引物il6-f/il6-r扩增犬il6基因，并引入bsiwi和psti酶切位点；所述引物il6-f/il6-r的序列分别如seqidno.2和3所示；s12.利用核酸限制性内切酶bsiwi和psti，分别对il6基因和phep-3.0质粒对进行酶切处理，两者的酶切产物连接获得重组质粒phep-cail6。优选地，步骤s12所述phep-3.0质粒是携带hep-flury毒株全长cdna的重组质粒。优选地，步骤s11所述扩增的pcr体系为：模板(含il6基因质粒)0.5μl、5×hfphusionbuffer10μl、dntp(2.5mm)4μl、上游引物(10μm)2μl、下游引物(10μm)2μl、phusion高保真酶0.5μl、ddh2o31μl。优选地，步骤s11所述扩增的pcr反应条件为：98℃2min；98℃10s，62℃20s，72℃1min，运行30个循环；最后于72℃延伸10min。优选地，步骤s12所述酶切处理的酶切体系为：il6/phep-3.04μl、10×fdbuffer2μl、bsiwi1μl、psti1μl、ddh2o13μl。优选地，步骤s12所述连接的反应体系为：il6基因酶切产物7μl、phep-3.0酶切产物1μl、10×t4连接酶buffer1μl、t4dna连接酶1μl。优选地，步骤s2的具体方法为：s21.转染：s211.细胞培养板中培养bhk-21细胞；s212.按照1：0.25：0.125：0.05：0.075的质量比，将重组质粒phep-cail6，和辅助质粒ph-n、ph-p、ph-l、ph-g混匀，添加灭菌去离子水，添加转染试剂，漩涡震荡器上震荡，室温静置后，添加含10％胎牛血清与100iu/ml双抗的dmem，混匀得溶解液；s213.溶解液加入细胞37℃培养2.5～3h，靠板壁轻轻吸去dmem，用1×pbs洗涤细胞一次，重新添加含10％胎牛血清与双抗的dmem；在37℃5％co2培养箱中培养48h，细胞95％长满后转入34℃培养96h；s22.病毒筛选。其中，优选地，步骤s212中灭菌去离子水和重组质粒phep-cail6的体积质量比为75μl/μg；灭菌去离子水和转染试剂的体积比为10：1。优选地，步骤s212中含10％胎牛血清与100iu/ml双抗的dmem和重组质粒phep-cail6体积质量比为400μl/μg。优选地，步骤s212中震荡10s，室温静置20min；优选地，步骤s211具体是：将细胞培养板中培养至细胞密度为1×105个/孔，培养液中含10％胎牛血清；37℃培养12～16h，至细胞60％～80％汇合；转染时用1×pbs洗涤细胞一次。优选地，步骤s22所述病毒筛选的具体方法如下：s221.用锡箔纸包住上述细胞板，-70℃反复冻融细胞3次，冷冻时间1h，室温溶解；取上清液和新鲜的bhk-21细胞混合于96孔板，其后在37℃培养48h，34℃培养96h；s222.倾去细胞培养液，每孔加满80％预冷的丙酮，快速倾去丙酮，再次加满丙酮，锡箔纸包住培养板，置-20℃30min；弃去丙酮，空干，每孔添加30μl抗狂犬病病毒n蛋白荧光抗体，37℃孵育1h，弃去溶解液，用1×pbs洗涤细胞两次，每次5min，再用去离子水快速洗涤细胞一次，自然干燥。荧光显微镜下观察，见到大量绿色荧光斑点的为阳性，即拯救成功。拯救获得的病毒命名为rhep-cail6。其中，优选地，步骤s221中上清液和新鲜的bhk-21细胞的体积比为2：5；所述新鲜的bhk-21细胞的细胞密度为4×105个/ml。另外，上述重组狂犬病病毒rhep-cail6在作为或制备狂犬病疫苗方面的应用，也在本发明的保护范围之内。本发明首先以狂犬病病毒疫苗株hep-flury为骨架，以我国目前大量饲养的中华田园犬的il6基因作为免疫增强因子，通过酶切连接，构建含有犬il6基因(见seqidno.1)的重组狂犬病病毒rhep-cail6，构建策略如附图1所示。然后对成功拯救的重组狂犬病病毒进行pcr、测序、免疫荧光鉴定正确。本发明还对重组病毒进行生长曲线、致病性、免疫原性和攻毒保护力等生物学特性研究，以评估其作为基因工程疫苗的效果。结果显示，重组狂犬病病毒rhep-cail6作为重组基因工程疫苗致病性较低，不会对成鼠致死，在na细胞上的滴度比亲本株hep-flury高，重组病毒具有良好的免疫原性，能诱导机体产生具有保护效力的狂犬病中和抗体，能够更好的保护机体抵抗致死性狂犬病毒的攻击。具体研究方法方面，本发明利用分子生物学手段构建携带犬il6基因的具有感染性的全长狂犬病毒cdna，通过细胞生物技术拯救出表达犬il6蛋白的重组狂犬病毒，利用免疫学相关技术，研究重组基因工程疫苗的免疫原性。在体外培养细胞以及小鼠体内进行了重组狂犬病毒株作为基因工程疫苗的效果评估。本发明对携带犬il6的重组狂犬病病毒进行鉴定和在bhk-21细胞上面传代及rt-pcr鉴定。经免疫荧光试验证实，重组病毒n蛋白在嵌合病毒感染细胞中均成功表达。通过western-blot鉴定重组病毒的g蛋白和犬il6蛋白均得到表达。将rhep-cail6在bhk-21细胞中传代，通过序列测定，没有发现il6丢失及任何突变。本发明对rhep-cail6重组病毒在na细胞上的体外生长曲线进行了研究。病毒的生长曲线表明rhep-cail6与亲本株hep-flury相比较生长特性基本一致，并且rhep-cail6在第2天的滴度达到最高且高于亲本株。本发明对rhep-cail6重组病毒在小鼠上的致病性进行了研究。将rhep-cail6和亲本株hep-flury分别颅内接种小鼠，每天监测小鼠体重。结果表明，重组病毒rhep-cail6和亲本株hep-flury影响小鼠体重基本一致，且重组病毒组的小鼠更加快速恢复体重，表明其安全性更高。本发明对rhep-cail6重组病毒免疫原性和攻毒保护进行了研究。将rhep-cail6与亲本株hep-flury分别制备成不同浓度的弱毒疫苗，肌肉注射免疫小鼠，7、14、21天后采血分离血清，检测抗狂犬病病毒中和抗体。结果表明，重组狂犬病病毒rhep-cail6免疫小鼠后均能诱导产生相对于亲本株更高的抗狂犬病病毒中和抗体水平，且较低剂量的重组病毒rhep-cail6可产生超过0.5iu的中和抗体水平，22天后用狂犬病标准攻毒毒株cvs-11进行攻毒保护试验，rhep-cail6免疫组小鼠可获得比亲本株更高的存活率。本发明具有以下有益效果：本发明科学构建了表达犬il6免疫增强因子的重组狂犬病病毒rhep-cail6。重组狂犬病病毒相比亲本株hep-flury具有较高的病毒滴度，可以降低犬用疫苗的成本。本发明同时验证出重组病毒能在小鼠体内产生比亲本株更高的狂犬病病毒中和抗体，较低剂量的重组狂犬病毒能产生大于0.5iu的中和抗体水平，即降低了免疫剂量，可以降低犬用疫苗的成本，可以作为新型狂犬病基因工程疫苗候选株。本发明的疫苗效果研究显示，重组狂犬病毒作为弱毒疫苗能产生比亲本株更好的保护力。而且，本发明将il6基因重组至狂犬病毒中，既能稳定表达il6蛋白，又能避免其过度表达，克服了过量il6引起病理损伤的缺陷。本发明通过对重组病毒构建体系条件的优化，包括拯救条件等，确证了重组狂犬病病毒rhep-cail6构建的最佳体系，能显著提高成功率，可以作为狂犬病毒的参考构建体系，尤其是对于公认的重难点——病毒拯救体系。附图说明图1为构建重组狂犬病病毒rhep-cail6的基因重组策略。图2为phep-cail6重组质粒pcr鉴定电泳图；m：dnamarker2000，1～2：il6的pcr扩增产物，3：阴性对照。图3为拯救的rhep-cail6重组病毒rt-pcr鉴定电泳图；m：dnamarker2000，1～2：il6的pcr扩增产物，3：阴性对照。图4为拯救的rhep-cail6重组病毒直接免疫荧光鉴定。图5为拯救的rhep-cail6重组病毒在na细胞上的g蛋白及犬il6蛋白表达的westernblot鉴定。图6为rhep-cail6重组病毒及亲本株hep-flury在na上的生长曲线(**p<0.01)。图7为rhep-cail6重组病毒对balb/c小鼠体重影响，同时设立亲本株hep-flury及mock对照组。图8为携带犬il6基因的重组病毒rhep-cail6在km小鼠体内的狂犬病中中和抗体水平，同时设立亲本株hep-flury及mock对照组(*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001；****p<0.0001)。图9为携带犬il6基因的重组病毒rhep-cail6作为弱毒疫苗免疫小鼠21天后狂犬病毒攻毒保护率。具体实施方式以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本
技术领域：
常规试剂、方法和设备。除非特别说明，本发明所用试剂和材料均为市购。实施例1犬il6基因的扩增1、从发病死亡的中华田园犬采集腹股沟淋巴结和脾脏样品，对样品进行处理和核酸提取，进行rt-pcr扩增。(1)引物序列见表1犬的il6扩增引物设计，设计引物il6-f/il6-r(含bsiwi和psti限制性内切酶位点和保护碱基)。表1(2)利用随机引物和oligo(dt)，按表2所示体系进行cdna合成：表2(3)以上述反转录合成的cdna为模板，利用引物il6-f/il6-r进行pcr扩增，体系如表3所示。表3(4)参照magen公司的凝胶回收试剂盒(hipuregelpurednamicrokit)使用说明书对pcr产物进行切胶回收、纯化，与载体pmd18t进行连接。连接反应体系如表4所示：表4(5)连接产物转化dh5α感受态细胞，抽提重组质粒，酶切鉴定正确。将质粒送测序，结果得到il6序列如seqidno.1。从genbank下载其他犬il6基因的序列，使用clustalx软件和mega6.0软件对序列进行比对分析，结果获得的基因序列为犬的il6基因。实施例2犬il6基因克隆至hep-flury1、构建重组质粒phep-cail6(1)利用引物il6-f/il6-r(见表1)扩增实施例1中获得的犬il6基因(序列如seqidno.1所示)，il6-f/il6-r引物预计扩增长度为642bp(扩增反应体系如表5所示)，分别引入bsiwi和psti酶切位点。表5在pcr管中依次加入上述试剂。pcr反应条件为：98℃2min；98℃10s，62℃20s，72℃1min，运行30个循环；最后于72℃延伸10min。(3)将pcr扩增的il6基因进行切胶回收、纯化，将纯化的il6基因和phep-3.0质粒(携带hep-flury毒株全长cdna的重组质粒)用bsiwi和psti核酸限制性内切酶进行处理，酶切体系如表6所示：表6上述体系混匀后，先37℃孵育3h，用凝胶回收试剂盒进行回收。将回收产物连接，连接体系如表7所示：表7上述体系混匀后，至于连接仪中，16℃连接24h，连接产物转化xl10-gold感受态细胞，筛选阳性克隆，抽提重组质粒，用引物il6-f/il6-r进行pcr初步鉴定，检测结果正确，见图2。将pcr鉴定正确的质粒送生工生物(上海)股份有限公司进行序列测定，正确，质粒命名为phep-cail6。将测序正确的克隆参照qiagen公司质粒中量提取试剂盒说明书进行去内毒素中提phep-cail6重组质粒，4℃保存待拯救用。实施例3利用重组质粒phep-cail6进行重组病毒rhep-cail6的拯救及筛选1、转染和病毒筛选方法参照inoue(2003)和郭霄峰等(2006)的方法进行。转染：(1)准备bhk-21细胞：12孔细胞培养板细胞密度为1×105个/孔，培养液中含10％胎牛血清；37℃培养12～16h，至细胞60％-80％汇合。转染时用800μl1×pbs洗涤细胞一次。(2)辅助质粒的比例摸索重组质粒phep-cail6和辅助质粒ph-n、ph-p、ph-l和ph-g的摸索比例如表8所示：表8phep-cail6ph-nph-pph-lph-g11.00μg0.30μg0.175μg0.05μg0.075μg21.00μg0.30μg0.155μg0.07μg0.075μg31.00μg0.25μg0.155μg0.02μg0.075μg41.00μg0.25μg0.125μg0.07μg0.055μg51.00μg0.25μg0.125μg0.05μg0.075μg按表8不同比例取重组质粒phep-cail6，和辅助质粒ph-n，ph-p，ph-l和ph-g混匀在1.5ml离心管中，添加灭菌去离子水至75μl，瞬时离心，使得管顶部的液滴进入溶液中。(3)添加7.5μl转染试剂，漩涡震荡器上震荡10s。(4)室温静置20min，添加400μl含10％胎牛血清和双抗(100iu/ml)的dmem于离心管中，上下颠倒管几次，混匀。(5)混匀的溶解液加入细胞(12孔培养板中的一孔)，37℃培养2.5～3h，靠板壁轻轻吸去dmem，用1×pbs洗涤细胞一次，重新添加dmem(含10％胎牛血清和双抗)。在37℃5％co2培养箱中培养48h，细胞95％长满后转入34℃培养96h。2、拯救重组病毒质粒用量比例筛选和病毒筛选：(1)用锡箔纸包住上述细胞板，-70℃反复冻融细胞3次，冷冻时间1h，室温溶解。取40μl上清液和100μl新鲜的bhk-21细胞(细胞密度为4×105个/ml)混合于96孔板，其后在37℃培养48h，34℃培养96h。(2)倾去细胞培养液，每孔加满80％预冷的丙酮，快速倾去丙酮，再次加满丙酮，锡箔纸包住培养板，置-20℃30min。弃去丙酮，轻微空干，每孔添加30μl抗狂犬病病毒n蛋白荧光抗体，37℃孵育1h，弃去溶解液，用1×pbs洗涤细胞两次，每次5min，再用去离子水快速洗涤细胞一次。自然干燥，荧光显微镜下观察，结果显示，当质粒用量的比例为1.00μgphep-cail6，0.25μgph-n，0.125μgph-p，0.05μgph-l和0.075μgph-g时可以见到大量绿色荧光斑点，即为拯救成功。拯救获得的病毒命名为rhep-cail6。实施例4重组病毒rhep-cail6的传代和鉴定1、将重组病毒rhep-cail6在bhk-21细胞上面进行传代和培养。将培养的rhep-cail6进行rt-pcr鉴定、免疫荧光鉴定、和g蛋白、il6蛋白表达检测。rt-pcr检测利用引物il6-f/il6-r，引物见表1。免疫荧光在bhk-21细胞进行，利用fitc标记的抗狂犬病毒n蛋白抗体鉴定。g蛋白和il6蛋白表达检测在bhk-21细胞进行，通过参照luo等(2016)的方法进行westernblot检测。2、rt-pcr检测结果正确，如图3所示；表明本发明的重组病毒rhep-cail6成功插入犬il6基因。免疫荧光检测结果阳性，如图4所示，表明培养病毒为重组狂犬病毒。westernblot检测结果正确，如图5所示，表明重组病毒表达g蛋白和犬il6蛋白。实施例5重组病毒rhep-cail6在na细胞上的体外生长曲线研究1、将传代培养的重组病毒rhep-cail6利用na细胞进行体外生长曲线研究。用细胞营养液调整na细胞密度为2×105/ml，将重组狂犬病毒rhep-cail6和亲本株hep-flury病毒感染浓度调整为moi(multiplicityofinfection)0.01，37℃感染1h后，弃去上清液，加入新鲜的完全培养液(10％血清)于5％co237℃培养箱中培养，当细胞完全汇合时转移至34℃，共培养120h；每隔24h收集100μl上清培养液并进行直接免疫荧光抗体检测，测定不同时间的病毒滴度，绘制成生长曲线。2、结果显示，重组病毒rhep-cail6在48h滴度达到最高，且滴度比亲本株hep-flury滴度高，见图6。实施例6重组病毒rhep-cail6对小鼠体重影响的研究1、分别将rhep-cail6和亲本株hep-flury病毒滴度稀释为1×106ffu/ml，6～8周龄的spf级balb/c系雌性小鼠分为3组，即rhep-cail6组、hep-flury组和mock组，每组8只。实验组每只小鼠颅内注射30μl病毒液(约3.3×104ffu/只)，mock组颅内注射30μldmem。于免疫后每天检测每只小鼠的体重，直至所有小鼠体重稳定(约31天)。将所有小鼠的体重比上各自注射前的体重，研究体重比例变化情况。2、结果显示，携带免疫增强因子il6的基因工程重组病毒rhep-cail6与亲本hep-flury的体重变化趋势基本一致，且rhep-cail6组比hep-flury组更早的开始恢复体重，如图7。表明rhep-cail6具有更低的致病性和更高的安全性。实施例7重组病毒rhep-cail6在km小鼠体内的免疫原性及攻毒保护研究1、重组狂犬病病毒rhep-cail6免疫原性研究：分别将rhep-cail6和亲本株hep-flury病毒滴度稀释为1×104ffu/ml、1×105ffu/ml、1×106ffu/ml，6～8周龄的spf级昆明系雌性小鼠分为7组，即rhep-cail6组(1×104ffu/ml、1×105ffu/ml、1×106ffu/ml)、hep-flury组(1×104ffu/ml、1×105ffu/ml、1×106ffu/ml)和mock组，每组10只。免疫组每只小鼠肌注100μl弱毒疫苗(注射剂量约为1×103ffu/只、1×104ffu/只、1×105ffu/只)，mock组肌注100μldmem。于免疫后第7、14、21天尾静脉采血制备血清，采用cliquet等(1998)的方法进行狂犬病病毒中和抗体检测。结果显示，重组病毒均能产生高于亲本株的狂犬病中和抗体，均大于0.5iu/ml，被认为是具有抗狂犬病病毒保护力的，且使用较低剂量的重组病毒rhep-cail6就能产生大于0.5iu/ml的中和抗体，见图8。2、为了验证小鼠获得高水平免疫力后是否具有对强毒攻击的保护，在免疫后第22d对小鼠颅内接种50ld50的cvs-1130μl，连续16d观察小鼠的发病及死亡情况。结果显示，低剂量组rhep-cail6和hep-flury保护率均在80％以下，均达不到保护要求，中剂量组，rhep-cail6达到了80％的保护率，而免疫hep-flury得保护率为40％，高剂量组rhep-cail6达到了90％的保护率，而免疫hep-flury得保护率为60％。上述结果表明，相对于亲本株hep-flury，携带免疫增强因子il6的基因工程重组病毒rhep-cail6在较低剂量就能产生较高的免疫应答且提供符合国际要求的免疫犬攻毒保护率80％以上的标准，见图9。sequencelisting<110>华南农业大学<120>一种携带白介素6基因的重组狂犬病病毒及其应用<130><160>3<170>patentinversion3.3<210>1<211>624<212>dna<213>犬il6基因<400>1atgaactccctctccacaagcgccttctccctggggctgctcctggtgatggctactgct60ttccctaccccgggacccctggcaggagattccaaggatgatgccacttcaaatagtcta120ccactcacctctgcaaacaaagtggaagaactgattaagtacatcctcggcaaaatctct180gcactgagaaaggagatgtgtgacaagtttaacaagtgtgaagacagcaaagaggcactg240gcagaaaataacctacatcttcccaaactggagggaaaagatggatgcttccaatctggg300ttcaatcaggagacctgcttgacaagaatcactaccggtcttgtggagtttcagctacac360ctgaatatcctccagaacaactatgaaggtgataaggaaaatgtcaagtctgtgcacatg420agtaccaagatcctggtccagatgctaaagagcaaggtaaagaatcaggatgaagtgacc480actcctgacccaaccacagacgccagcctgcaggctatcttgcagtcacaggatgagtgg540ctgaagcacacaacaattcacctcatcctgcggagtctggaggatttcctgcagttcagt600ctgagggctgttcggataatgtag624<210>2<211>30<212>dna<213>引物il6-f<400>2attcgtacgatgaactccctctccacaagc30<210>3<211>27<212>dna<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