一种抗磷酸酶2Cm单克隆抗体及其应用的制作方法

本发明涉及生物检测领域，具体涉及一种抗磷酸酶2cm单克隆抗体单克隆抗体，其可用于检测磷酸酶2cm。

背景技术：

磷酸酶2cm(pp2cm)在支链氨基酸(bcaa)的分解代谢中起关键的调节作用，有研究发现，pp2cm对细胞存活及正常发育至关重要，压力条件下能下调其活性。应用蛋白组学的方法研究线粒体磷酸酶，发现pp2cm能够特异性结合α-支链酮酸脱氢酶复合体(bckdh)并在底物存在的情况下催化诱导ser293位点去磷酸化。pp2cm的缺失使体内及体外底物诱导α-支链酮酸脱羧酶(e1α)去磷酸化的能力消失，而且pp2cm缺陷鼠表现出的bcaa代谢缺乏症与人类由于bckdh缺陷导致遗传异常的枫糖尿病的中间症状相似，因此其缺失可能导致枫糖尿病。近期的研究发现，脑、心脏、肝脏及隔膜等组织pp2cm依赖性bcaa分解代谢水平相对较高，pp2cm具有与α-支链酮酸脱氢酶激酶(bckdk)竞争性结合bckdh的能力，其二者根据pp2cm的水平相互协调以保证最佳的bckdh调节。

尽管长期的研究中发现pp2cm在bcaa的分解代谢中起到关键的调节作用，但是过去20多年研究中，关于bckdh和pp2cm在bcaa代谢中相互之间的分子作用机理研究还不够完善，而且没有特异性检测的单克隆抗体。本单克隆抗体制备方法和应用的公开能够提供一种可被广泛应用、可检测bcaa代谢过程限速酶的抗pp2cm蛋白单克隆抗体，并有助于bcaa代谢的进一步研究。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种抗磷酸酶2cm的单克隆抗体。

本发明的另一个目的是提供上述单克隆抗体的应用。

为了达到上述目的，本发明首先提供一株稳定分泌磷酸酶2cm单克隆抗体杂交瘤细胞株，其保藏编号为cgmccno.13818。该杂交瘤细胞株7p3已于2017年3月30日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，简称cgmcc，邮编100101)保藏，分类命名为小鼠杂交瘤细胞系，其保藏编号为cgmccno.13818。

本发明提供了由上述杂交瘤细胞株产生的单克隆抗体。

本发明提供了保藏编号为cgmccno.13818的杂交瘤细胞株在制备磷酸酶2cm含量检测试剂盒中的应用。

本发明提供了保藏编号为cgmccno.13818的杂交瘤细胞株在制备诊断与α-支链酮酸脱氢酶复合体(bckdh)缺乏导致的相关疾病的试剂盒中的应用。

所述的疾病为枫糖尿病。

本发明提供了保藏编号为cgmccno.13818的杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体在制备磷酸酶2cm含量检测试剂盒中的应用。

本发明提供了保藏编号为cgmccno.13818的杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体在制备诊断与α-支链酮酸脱氢酶复合体缺乏导致的相关疾病的试剂盒中的应用。

所述的疾病为枫糖尿病。

本发明提供了一种用于检测磷酸酶2cm含量的试剂盒，含有保藏编号为cgmccno.13818的杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体。

本发明提供了含有保藏编号为cgmccno.13818的杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体的诊断试剂。

本发明通过克隆大鼠磷酸酶2cm的基因；将克隆的基因插入表达载体，构建重组表达载体；用重组表达载体转化感受态大肠杆菌，诱导表达，通过分子筛层析和离子交换层析纯化得了高纯度的磷酸酶2cm重组蛋白；用该重组蛋白接种小鼠，取其脾淋巴细胞与小鼠sp2/0骨髓瘤细胞融合，建立杂交瘤细胞系，从中筛选出分泌磷酸酶2cm抗体最稳定、抗体活性最高的杂交瘤细胞株，它们所产生的抗体即为所需的单克隆抗体。该单克隆抗体具有高度特异性和强亲和力，制备方法简单高效；可直接通过western-blot直接用于血清中磷酸酶2cm含量的检测，也可用于制备elisa检测试剂盒等。

本发明不仅利用大肠杆菌表达系统成功表达了大鼠磷酸酶2cm基因的主要抗原表位区，并且得到了高纯度的表达蛋白，进而用于单克隆抗体的制备，并得到了一组特异性更强、亲和力更高的单克隆抗体。该抗体可直接用于血清中磷酸酶2cm的检测。该单克隆抗体的制备能够监测机体中磷酸酶2cm的含量，用于辅助诊断与bckdh缺乏导致的相关疾病，还可用于动物选种育种中的早期筛选。

附图说明

图1为pet-28a-pp2cm诱导表达后菌液裂解上清/沉淀的sds-page电泳图。marker为分子量标记，a1为未经诱导的菌液裂解上清，a2为经iptg诱导的菌液裂解上清，b1为未经诱导的菌液裂解沉淀，b2为经iptg诱导的菌液裂解沉淀。结果显示，目的蛋白的表达在包涵体沉淀内。

图2为pet-28a-pp2cm重组蛋白经纯化后的sds-page电泳图。由图中所示，重组pp2cm蛋白分子量约为38kda，蛋白纯度在90％以上，浓度约为1-1.5mg/ml。可以满足免疫动物和抗体筛选与鉴定的要求。

图3为5只小鼠第三次免疫后血清效价检测。

图4为单克隆抗体纯化的sds-page电泳图。marker为分子量标记，a为纯化前抗体，b为流穿液，c为纯化抗体。结果表明，在还原剂的作用下，抗体分解为两个片段，分别为约55kd的重链和约25kd的轻链。

图5为免疫印迹实验结果，a为iptg诱导表达的pp2cm蛋白，b为鼠肝脏细胞制备物。结果显示，单克隆抗体7p3能与原核表达的pp2cm反应，也可特异性识别鼠肝脏细胞中分子量约为37kda的条带，具有很高的特异性。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

实施例1重组大鼠pp2cm蛋白的制备与纯化

1、基因克隆

利用现有的模板质粒pp2cm，源基因在t载体上，质粒信息来源于文献：anovelmitochondrialmatrixserine/threonineproteinphosphataseregulatesthemitochondriapermeabilitytransitionporeandisessentialforcellularsurvivalanddevelopment.genesdev2007；21:784–96.[pmcfreearticle][pubmed](由中国农业大学董冰提供)，选取基因部分片段377-1405bp进行克隆重组。在基因5’端和3’端分别加入ncol和utr限制性酶切位点，3’xhol通过酶切位5’ncol和3’xhol将基因克隆至载体pet28a(kan)，并交由苏州金唯智生物科技有限公司合成，引物序列如下：

上游引物(5’-3’)：taatacgactcactatagg；

下游引物(5’-3’)：tgctagttattgctcagcgg。

对pcr扩增反应产物进行琼脂糖凝胶电泳，使用北京全式金生物技术有限公司生产的琼脂糖凝胶回收试剂盒(货号h41118)，根据制造商使用说明书实施操作，对pcr扩增产物进行回收。连接产物转化大肠杆菌感受态细胞bl21，挑取平板上的克隆接种，提取质粒dna，进行pcr鉴定。pcr显示重组蛋白基因阳性的克隆进行测序分析，序列完全正确的克隆即采用。

2、蛋白表达和纯化

按1:100的比例将单菌落培养的过夜菌转接至200mllb培养基，加入终浓度为50μg/ml的卡那霉素，37℃震荡培养至od600为0.6-0.8；加入0.1mol/l的iptg，25℃震荡过夜，收菌后超声破碎，大部分蛋白以包涵体形式呈不可溶性表达，收集包涵体。该重组蛋白为pp2cm蛋白带有6个组氨酸标签，便于使用镍柱进行蛋白质的亲和纯化。包涵体经过6m盐酸胍变性，用不同浓度的咪唑溶液进行洗脱后，用透析的方法进行蛋白复性，将各组分和流穿分别上样进行sds-page分离检测。pet-28a-pp2cm诱导表达后菌液裂解上清/沉淀的sds-page电泳图见图2，pet-28a-pp2cm重组蛋白经纯化后的sds-page电泳图见图3。

实施例2杂交瘤细胞系的建立

1、免疫

将实施例1中纯化的蛋白用弗氏完全佐剂(sigma公司)乳化，免疫4-6周龄雌性balb/c小鼠(购自北京维通利华试验动物技术有限公司)腹腔注射每只小鼠50μg蛋白，每14天加强免疫一次，第二次免疫抗原使用弗氏非完全佐剂(sigma公司)乳化，以后均用抗原直接免疫，剂量为50μg/只。第3次加强免疫后3天以间接elisa(波长450nm)检测小鼠血清中抗免疫原的多抗效价，效价最高的小鼠以尾静脉注射冲击免疫，抗原用生理盐水混匀，剂量50μg/只。5只小鼠第三次免疫后血清效价检测见图3。免疫小鼠用的抗原为重组pp2cm抗原蛋白，上述重组pp2cm抗原蛋白由序列表1中的核苷酸序列编码经大肠杆菌重组表达获得。

2、细胞融合

无菌制备免疫达标的小鼠脾细胞悬液，与小鼠骨髓瘤细胞sp2/0以2:1比例混合，离心1500rpm，5min；弃上清后离心管放入37℃水浴中，在1分钟内缓慢加入1ml的peg1500(sigma公司)，并搅动细胞；在温水中静止1min后，加入10ml无血清的培养液，混匀，离心1000rpm，5min；弃上清后，用20％(v/v)fbs与1×hat培养基添加剂hybri-max(sigma公司)选择培养液重悬，将细胞悬液铺至96孔细胞培养板内，每孔加200μl。将培养板置37℃、5％co2培养箱中培养。

3、挑克隆

融合后7天克隆细胞团大小密度适中，在解剖镜下吸取圆、实、大的克隆团打入事先准备好培养基的96孔培养板中，放入37℃，5％co2培养箱中培养。

4、elisa筛选阳性杂交瘤细胞

3天后，细胞量大约占底面积2/3，取100μl上清用免疫原和重组蛋白分别进行elisa筛选；阳性克隆完全换液，加入200μl含饲养细胞和1％ht(sigma公司)的完全培养基；两天后进行第二次elisa筛选，阳性克隆转入事先准备好培养基(含饲养细胞和ht)的24孔板培养；五天后取100μl上清进行第三次elisa筛选，阳性克隆逐次转入6孔板和细胞培养瓶扩大培养并冻存。

实施例3细胞株建立与腹水诱生法制备单克隆抗体

1、细胞株建立

经常规elisa检测，得到5个阳性反应的细胞株，分别经过5次亚克隆发现其中1株反应值较高，命名为7p3，并扩大培养，分别用于液氮冻存和单抗腹水的制备。7p3号杂交瘤细胞株于2017年3月30日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，简称cgmcc，邮编100101)保藏，分类命名为小鼠杂交瘤细胞系，其保藏编号为cgmccno.13818。

2、腹水制备

对数生长期细胞用无血清培养基洗涤并悬起，计数5×10⁵/ml,悬浮的细胞腹腔注射事先用石蜡油致敏小鼠；7天后开始收集腹水，取出的腹水于4℃离心4000rpm，10min；小心吸出中间的腹水收集与离心管中，4℃或-20℃保存。

3、单克隆抗体的纯化

用hitraprproteinaff(ge公司)亲和层析法按说明书从腹水中纯化抗体。sds-page胶鉴定纯度，纯化的抗体加50％甘油保存于-20℃。单克隆抗体纯化的sds-page电泳图见图5。

4、elisa测定抗体效价

纯化的pp2cm蛋白以2μg/ml的浓度100μl/孔包被elisa板，37℃孵育1h，pbst洗3次，3min/次，拍干后用5％脱脂奶粉pbs封闭，37℃孵育1h，pbst洗3次，3min/次，拍干后加入2000×、4000×、8000×、16000×、32000×、64000×、128000×、256000×稀释的本研究制备的抗体，37℃作用1h，pbst洗3次，3min/次，以tmb显色，设正常balb/c小鼠的血清为阴性对照。

表1间接elisa结果

表1为纯化后单克隆抗体的效价。结果显示，本研究制备的单抗腹水与纯化pp2cm的反应为阳性，与正常balb/c小鼠的阴性血清的反应为阴性。

实施例4单克隆抗体的鉴定

1、单克隆抗体亚类鉴定

用100mmpbs(ph7.4)稀释包被羊抗鼠igg(北京中衫金桥生物技术有限公司)至0.5μg/ml，每孔加100μl，4℃，过夜。清空液体，用pbst清洗3次，每孔加入200μl封闭液(含2％bsa和3％蔗糖的pbs)，37℃孵育1h；清空液体用pbst清洗3次。每孔加入0.1ml杂交瘤上清，37℃孵育1h；清空液体用pbst洗3次。用封闭液1:2000稀释hrp标记的羊抗鼠(igm，igg1，igg2a，igg2b，igg3，iga)抗体(southernbiotech公司)0.1ml每孔分别加入适当地孔中，37℃孵育1h，清空液体用pbst洗3次。然后每孔加入50μg含0.15％abts(southernbiotech公司)和0.03％h2o2的柠檬酸缓冲液(ph4.0)进行显色反应，10-20min内测定405nm波长下的od值。结果显示，本发明单克隆抗体为igg2a型鼠源单克隆抗体。

2、免疫印迹检测单克隆抗体的特异性

分别以iptg诱导表达的pp2cm蛋白和鼠肝脏细胞制备物为电泳样品，蛋白上样约5-10ng，进行12％聚丙烯酰胺凝胶电泳，按常规方法在bio-rad电转移系统中将凝胶蛋白带转移到pvdf膜上(millipore公司)。将膜置于含5％脱脂奶粉的tbst封闭液中4℃过夜。加入单克隆抗体(1:1000稀释)4℃过夜。用tbst洗膜后，加入1:5000稀释的羊抗鼠二抗(北京中衫金桥生物技术有限公司)室温孵育1h。再次tbst洗膜，加入ecl超敏显色液(北京普利莱基因技术有限公司)，以chemidocmp多色荧光成像系统(bio-rad)进行化学发光图像数据的采集。

其免疫印迹实验结果如图5所示，a为iptg诱导表达的pp2cm蛋白，b为鼠肝脏细胞制备物。结果显示，单克隆抗体7p3能与原核表达的pp2cm反应，也可特异性识别鼠肝脏细胞中分子量约为37kda的条带，具有很高的特异性。

3、亲和常数测定

包被重组pp2cm蛋白，包被浓度为2μg/ml，100μg/孔，4℃包被过夜，pbs-t洗3次。每孔加200μl封闭液37℃封闭2h，pbs-t洗3次。纯化的单克隆抗体，从1:200开始2倍梯度稀释，最后1孔留空白对照，37℃孵育1h，pbs-t洗3次。每孔加入100μl含0.1％tmb(sigma公司)和0.03％h2o2的柠檬酸-磷酸缓冲液显色10min，加50μl0.5m硫酸溶液终止反应。

用酶标仪测定波长450nm的吸光值，画出od值对应抗体稀释倍数的曲线，找出≥1/2“平台od值”对应的稀释倍数a，然后利用下列公式计算出亲和常数为1.97×10⁹。亲和常数≈150000×a/抗体原始浓度

4、单抗抗体滴度

用常规间接elisa方法检测单抗腹水效价，结果表明7p3单抗腹水效价达到10^-7。

虽然，上文中已经用一般性说明、具体实施方式及试验，对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

sequencelisting

<110>中国农业大学

<120>一种抗磷酸酶2cm单克隆抗体及其应用

<130>khp171110811.1

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<213>pp2cm

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cgcattgatgagccaattctgttgccacctagcatcaagtatggcaagccaattcccaaa180

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