番茄颈腐根腐病菌PCR检测专用引物及其检测试剂盒的制作方法

本发明涉及分子生物学技术领域，特别涉及一种番茄颈腐根腐病菌PCR检测专用引物及其检测试剂盒。

背景技术：

番茄(Solanum esculentum L.)是我国重要的蔬菜作物之一，营养丰富，可以周年种植，并且产量越来越高，品种花色越来越多，用途广泛，深受种植者和消费者喜爱。据2014年联合国粮食及农业组织(FAO)统计，我国番茄种植面积和产量均居世界首位，种植面积约1500多万亩，产量约5260万吨。但是在番茄长期、大面积的生产过程中，其病害也随之发展，危害加重，尤其是近年来番茄颈腐根腐病(Fusarium crown and root rot,FCRR)的大面积暴发，并有进一步发展的趋势。番茄颈腐根腐病是由尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum f.sp.radicis-lycopersici，FORL)引起的最具破坏性的番茄土传病害之一(Roberts et al.,2000)。该病害在世界各地普遍发生，首先于1974年在日本发现，之后在美国、加拿大、墨西哥、以色列、韩国、中国等许多国家陆续被发现(Scott and Jones,2000；Scott,2005)，该病对多数国家的番茄生产造成极大威胁。近些年，番茄颈腐根腐病在我国山东、东北、河北、北京、江苏、浙江等番茄主产区大范围发生，误诊或防治不及时，番茄发病率达80％以上，致死率达30％以上，造成严重减产，给种植户造成严重的经济损失(程琳等，2016)，因此，加强番茄颈腐根腐病菌的防治对于保证番茄稳产、高产有着重要的作用。目前生产上没有较理想的防治方法，因此，生产上急需对其开展监测预警研究，全面深入地了解番茄颈腐根腐病菌致病性情况，建立高效、快速、准确的病菌检测技术，这些可对制定正确的抗病育种策略和合理布局品种都具有极其重要的参考价值。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种番茄颈腐根腐病菌PCR检测专用引物，特异性强，检测准确性高。

本发明还提供了包含上述引物的试剂盒，适用于植物组织和土壤样品中番茄颈腐根腐病菌的快速、准确鉴定，对于农业生产中番茄颈腐根腐病菌引起的病害防治具有重要的实用价值。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：

一种番茄颈腐根腐病菌PCR检测专用引物，包括上游引物和下游引物，上游引物和下游引物的序列如下：

上游引物：5’-CCTTACTCGACATTTTTCAGA-3’(SEQ ID NO:1所示)；

下游引物：5’-TGCCTGATGTCATTAGTA-3’(SEQ ID NO:2所示)。

一种番茄颈腐根腐病菌PCR检测试剂盒，该试剂盒包括盒体和7支PCR管，在5支PCR管中分别装有dNTP，MgCl₂，PCR缓冲液，Taq DNA聚合酶和ddH₂O；在另外2支PCR管中分别装有检测番茄颈腐根腐病菌的上游引物、检测番茄颈腐根腐病菌的下游引物。

本发明提供了用于对番茄颈腐根腐病菌的检测引物和试剂盒，通过提取待测样品的DNA，并结合PCR检测技术，可达到鉴定待测样品中番茄颈腐根腐病菌的目的。

作为优选，检测番茄颈腐根腐病菌的上游引物序列为：5’-CCTTACTCGACATTTTTCAGA-3’。

作为优选，检测番茄颈腐根腐病菌的下游引物序列为：5’-TGCCTGATGTCATTAGTA-3’。

作为优选，采用所述试剂盒配置10μL PCR扩增体系的组成如下：

DNA模板20ng，检测番茄颈腐根腐病菌的上游引物0.2μM，检测番茄颈腐根腐病菌的下游引物0.2μM，dNTP 0.25mM，MgCl₂ 2.0mM，1×PCR缓冲液，Taq DNA聚合酶1U，加ddH₂O补足至10μL。

本发明的有益效果是：本发明能够快速、准确地鉴定番茄颈腐根腐病菌，对于农业生产中番茄颈腐根腐病菌引起的病害防治具有重要的实用价值。

附图说明

图1为本发明引物特异性检测样品DNA扩增后的凝胶电泳图。

图2为本发明田间病株上分离菌株DNA扩增后的凝胶电泳图。

具体实施方式

下面通过具体实施例，对本发明的技术方案作进一步的具体说明。

本发明中，若非特指，所采用的原料和设备等均可从市场购得或是本领域常用的。下述实施例中的方法，如无特别说明，均为本领域的常规方法。

本发明所用引物由大连宝生物技术公司合成，所有序列测定工作均由上海生物技术有限公司完成。

实施例

1、用于对番茄颈腐根腐病菌检测的引物的设计

根据GenBank中多聚半乳糖醛酸外切酶(pgx4)的保守序列(GenBank编号AB256798.1、AB256796.1、AB256797.1、AB256795.1、GU169176.1、AB256825.1)。

设计简并引物FL-F(5’-GATGGTGGAACGGTATGACYC-3’，SEQ ID NO:3所示)与FL-R(5’-GATATCCTTRACACCATCACA-3’，SEQ ID NO:4所示)，扩增长度为960bp，对其片段进行克隆、测序和分析，并在960bp序列内部设计特异性的引物。番茄颈腐根腐病菌特异性的引物序列如下：

上游引物：5’-CCTTACTCGACATTTTTCAGA-3’(SEQ ID NO：1)；

下游引物：5’-TGCCTGATGTCATTAGTA-3’(SEQ ID NO：2)；

EQ ID NO：1由21个碱基组成，SEQ ID NO：2由18个碱基组成，扩增片段长度为486bp。

2、用本发明的引物对番茄颈腐根腐病菌进行常规PCR检测

本例所述菌株：

浙江省农科院植微所提供的番茄颈腐根腐病菌；

检测方法按以下步骤进行：

(1)菌丝DNA的提取：用灭菌牙签从平板上刮取菌丝约0.1克，置于2.0mL离心管中，按常规CTAB法提取DNA后，分别保存，备用；

(2)PCR扩增：在各PCR管中分别加入步骤(1)提取的各样品DNA 20ng后，再依次加入检测番茄颈腐根腐病菌的上下游引物各0.2μM，dNTP 0.25mM，MgCl₂ 2.0mM，1×PCR缓冲液(大连宝生物技术公司)，Taq DNA聚合酶1单位，加ddH₂O至10μL后，按PCR反应程序：94℃预变性3min，94℃50seconds，55℃退火50seconds，72℃60seconds，35个循环进行扩增，72℃延伸10min，产物4℃保存；所述检测番茄颈腐根腐病菌的上游引物序列为SEQ ID NO：1，下游引物序列为SEQ ID NO：2。

(3)PCR扩增产物的凝胶电泳分析：各样品分别取扩增产物10μL和由0.25％溴酚兰加40％蔗糖配制而成的上样缓冲液2μL，混匀，将混合物在1.2％琼脂糖凝胶上进行电泳分离，至溴酚兰到达凝胶的2/3位置处停止电泳，凝胶经EB染色后用凝胶成像系统进行观察、照相；

(4)番茄颈腐根腐病菌的检测：根据凝胶电泳结果，分析判断被检测样品(见图1)：番茄颈腐根腐病菌扩增出486bp条带，与预期结果相符，表明本发明的引物可用于番茄颈腐根腐病菌的常规PCR检测。

3、用本发明的引物对从番茄颈腐根腐病病株上分离的菌株进行常规PCR检测

本例所述菌株：

浙江番茄主栽区番茄颈腐根腐病病株上分离获得的菌株。

检测方法按以下步骤进行：

(1)菌丝DNA的提取：用灭菌牙签从平板上刮取菌丝约0.1克，置于2.0mL离心管中，按常规CTAB法提取DNA后，分别保存，备用；

(2)PCR扩增：在各PCR管中分别加入步骤(1)提取的各样品DNA 20ng后，再依次加入检测番茄颈腐根腐病菌的上下游引物各0.2μM，dNTP 0.25mM，MgCl₂ 2.0mM，1×PCR缓冲液，Taq DNA聚合酶1单位，加ddH₂O至10μL后，按PCR反应程序：94℃预变性3min，94℃50seconds，55℃退火50seconds，72℃60seconds，35个循环进行扩增，72℃延伸10min，产物4℃保存；所述检测番茄颈腐根腐病菌的上游引物序列为SEQ ID NO：1，下游引物序列为SEQ ID NO：2；

(3)PCR扩增产物的凝胶电泳分析：各样品分别取扩增产物10μL和由0.25％溴酚兰加40％蔗糖配制而成的上样缓冲液2μL，混匀，将混合物在1.2％琼脂糖凝胶上进行电泳分离，至溴酚兰到达凝胶的2/3位置处停止电泳，凝胶经EB染色后用凝胶成像系统进行观察、照相；

(4)番茄颈腐根腐病菌的检测：根据凝胶电泳结果，分析判断被检测样品(见图2)：番茄颈腐根腐病菌扩增出486bp条带，表明本发明的引物可用于番茄颈腐根腐病菌的常规PCR检测。

一种番茄颈腐根腐病菌PCR检测试剂盒，该试剂盒包括盒体和7支PCR管，在5支PCR管中分别装有dNTP，MgCl₂，PCR缓冲液，Taq DNA聚合酶和ddH₂O；在另外2支PCR管中分别装有检测番茄颈腐根腐病菌的上游引物(SEQ ID NO：1)、检测番茄颈腐根腐病菌的下游引物(SEQ ID NO：2)。

以上所述的实施例只是本发明的一种较佳的方案，并非对本发明作任何形式上的限制，在不超出权利要求所记载的技术方案的前提下还有其它的变体及改型。

SEQUENCE LISTING

<110> 浙江省农业科学院

<120> 番茄颈腐根腐病菌PCR检测专用引物及其检测试剂盒

<130> 2017.02

<160> 4

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

ccttactcga catttttcag a 21

<210> 2

<211> 18

<212> DNA

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<400> 2

tgcctgatgt cattagta 18

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<211> 21

<212> DNA

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<212> DNA

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gatatccttr acaccatcac a 21