本发明涉及生物
技术领域：
，涉及基因组序列分析领域,具体涉及一种鉴定胚胎平衡易位断裂点和平衡易位携带状态的方法。
背景技术：
：在生物医学、生殖遗传学的科学研究及临床应用领域，平衡易位是一种非常常见的新生儿染色体结构异常缺陷，大约占新生儿出生的1/500-1/625。平衡易位携带者通常表型正常，也有一部分有微重复、缺失、基因损坏等遗传学变异，从而导致自闭、智障、先天畸形等疾病。平衡易位携带者在生育后代时，更容易产生不平衡的配子，从而导致习惯性流产甚至不孕不育。因此，为平衡易位携带者后代阻断平衡易位，挑选、鉴定出不携带平衡易位的胚胎非常有必要。目前鉴定平衡易位的方法主要有：比较基因组杂交(comparativegenomichybridization,CGH)，荧光原位杂交(fluorescenceinsituhybridization,FISH)，SNP芯片(SNParray)，显微切割结合二代测序(MicroSeq-PGD)等技术。然而，比较基因组杂交技术分辨率比较低，Mb级，通量低，成本高；荧光原位杂交，只针对特定位置，分辨率低，探针杂交效率不稳定，因为平衡易位几乎涉及每条染色体的每条区带，所以每位平衡易位携带者都要单独设计探针，所以会很耗时，成本高，不能作为一个通用检测技术；SNP芯片是针对全基因组设计的，SNP分布不会绝对均一，所以对于平衡易位断裂点周围可用于连锁分析的有效位点不确定，会导致无法区分是否为平衡易位携带的胚胎。除上述技术上的缺陷，以上检测技术都不能精准的确定平衡易位断裂点位置，如果断裂点位置不够精确，超出一定范围，由于重组互换，会导致平衡易位携带/不携带的胚胎判断错误。显微切割结合二代测序(MicroSeq-PGD)的技术虽然可以精准的确定平衡易位断裂点位置，但需经过细胞培养、显微切割等阶段，操作复杂，检测周期非常长，价格昂贵，对于人员、仪器要求高，不能大规模推广。因此，本领域迫切需要开发一种能够更有效综合鉴定胚胎平衡易位的方法，提高判断平衡易位的精准性。技术实现要素：针对现有技术的不足及实际的需求，本发明提供一种鉴定胚胎平衡易位断裂点和平衡易位携带状态的方法，所述方法既可以精准确定平衡易位断裂点位置，又能利用少量SNP位点准确的判断、分型，鉴定出不携带平衡易位的胚胎。为达此目的，本发明采用以下技术方案：第一方面，本发明提供一种确定胚胎平衡易位断裂点的方法，包括如下步骤：(1)获取胚胎待测样本和父母DNA；(2)对待测样本进行扩增，构建文库后测序；(3)将步骤(2)获得的基因组序列与参考基因组进行比对，从而获得基因组序列在参考基因组上的位置信息；(4)将所述的参考基因组分成N个区域片段，其中每个区域片段为一个窗口，计算每个窗口的拷贝数；(5)确定正常拷贝数的阈值范围，逐个计算每个窗口及周围窗口拷贝数的三均值Mi，将Mi不落在阈值范围的窗口记录下来，连续的窗口合并，直到遇到正常窗口；(6)将步骤(5)连续的窗口定义为一级区域，继续计算一级区域每个窗口及周围窗口的三均值Mnps，第一个窗口为第1断点bp1，每遇到正常和异常转换的窗口，为断点bpi；(7)每两个断点之间定义为二级区域，继续计算二级区域每个窗口的三均值Mj，将Mj落在阈值范围之外的窗口即为精确的拷贝数变异区域，所述区域的起始和终止的位置即为拷贝数变异的起始和终止断点；(8)选取多个拷贝数异常的胚胎，用步骤(1)-(7)计算每个胚胎的两条染色体平衡易位的断裂点，分别计算两条染色体平衡易位断裂点的三均值，即为胚胎精确的平衡易位的断裂点；其中，所述i和j独立地为1至N的任意正整数。根据本发明，步骤(1)所述的待测样本为胚胎的活检细胞，所述活检细胞为胚胎发育到卵裂球时期或囊胚时期取下的外胚层细胞，所述外胚层细胞可以是1个也可以是多个滋养外胚层细胞。根据本发明，所述父母DNA为能够提取DNA的任何人源样本都是可行的，在此不做特殊限定，本领域技术人员可以根据实验需要进行提取，本发明的父母DNA选取来自外周血、淋巴液、组织细胞、头发或口腔黏膜细胞中的任意一种或至少两种的组合，优选为外周血。根据本发明，步骤(2)所述的扩增为单细胞扩增，通过单细胞扩增对活检细胞中的微量核酸进行扩增，以获得更多的核酸用于后续分析。根据本发明，所述单细胞扩增为能够进行单细胞扩增的方法都是可行的，在此不做特性限定，本领域技术人员可以根据实验需要进行选择，本发明采用扩增前引物延伸PCR(PrimerextensionpreamplificationPCR,PEP-PCR)、退变寡核苷酸引物PCR(Degenerateoligonucleotideprimer-PCR,DOP-PCR)、多重置换扩增技术(MultipleDisplacementAmplification,MDA)或多次退火环状循环扩增技术(MultipleAnnealingandLoopingBasedAmplificationCycles,MALBAC)中的任意一种或至少两种的组合，优选为多次退火环状循环扩增技术。根据本发明，步骤(2)所述的测序将扩增后的样本进行文库构建后，采用高通量测序平台进行测序，所述高通量测序平台为第二代测序平台，本领域的第二代测序平台都是可行的，在此不做特殊限定，本领域技术人员可以根据需要进行选择，本发明可采用Illumina公司的GA、GAII、GAIIx、HiSeq1000/2000/2500/3000/4000、XTen、XFive、NextSeq500/550、MiSeq、MiSeqDx、MiSeqFGx、MiniSeq、NovaSeq5000/6000；AppliedBiosystems的SOLiD，Roche的454FLX，ThermoFisherScientific(LifeTechnologies)的IonTorrent、IonPGM、IonProtonI/II，华大基因的BGISEQ1000、BGISEQ500、BGISEQ100、BGISEQ50，博奥生物集团的BioelectronSeq4000，中山大学达安基因股份有限公司的DA8600，贝瑞和康的NextSeqCN500，紫鑫药业旗下子公司中科紫鑫的BIGIS，华因康基因HYK-PSTAR-IIA中的任意一种，本发明优选采用Illumina公司的HiSeq2500高通量测序平台。优选地，所述测序类型为单端测序和/或双端测序，优选为单端测序。根据本发明，所述测序的长度为不小于30bp，例如可以是是30bp、40bp、50bp、80bp、100bp、150bp、300bp、500bp，优选为50bp，以及上述数值之间的具体点值，限于篇幅及出于简明的考虑，本发明不再穷尽列举所述范围包括的具体点值。根据本发明，所述测序的深度为不小于基因组的0.1倍，例如可以是是0.1倍、0.5倍、1倍、2倍、5倍、10倍、30倍、50倍、100倍，优选为基因组的0.1倍，以及上述数值之间的具体点值，限于篇幅及出于简明的考虑，本发明不再穷尽列举所述范围包括的具体点值。优选地，本发明中测序采用MALBAC单细胞扩增方法，Illumina公司的HiSeq2500高通量测序平台，测序类型为单端测序，测序长度50bp，测序深度为基因组的0.1倍。根据本发明，所述参考基因组包括全基因组，所述参考基因组的覆盖率达到全基因组的50％以上，例如可以是50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％，优选为60％以上，进一步优选为70％以上，再优选为80％以上，最优选为95％以上，以及上述数值之间的具体点值，限于篇幅及出于简明的考虑，本发明不再穷尽列举所述范围包括的具体点值。所述参考基因组为全基因组。参考基因组通常选择已被公认确定的序列，如人的基因组可为NCBI或UCSC的hg18(GRCh18)、hg19(GRCh19)或hg38(GRCh38)。根据本发明，所述将基因组序列与参考基因组进行比对，所述比对采用本领域的可进行比对的软件都是可行的，可用任何一种免费或商业软件，在此不做特殊限定，本领域技术人员可根据需要进行选择，例如可以是BWA(Burrows-WheelerAlignmenttool)、SOAPaligner/soap2(ShortOligonucleotideAnalysisPackage)、Bowtie/Bowtie2中的任意一种。根据本发明，步骤(4)所述的窗口的长度为1×102-1×106，例如可以是1×102、2×102、5×102、8×102、1×103、5×103、8×103、1×104、5×104、1×105、5×105、8×105、1×106，以及上述数值之间的具体点值，限于篇幅及出于简明的考虑，本发明不再穷尽列举所述范围包括的具体点值。根据本发明，所述步骤(4)还包括校正每个窗口的拷贝数，计算每个窗口校正后的拷贝数的步骤，所述校正每个窗口拷贝数的方法为本领域可进行校正窗口拷贝数的方法都是可行的，在此不做特殊限定，本领域技术人员可以根据需要进行选择，本发明采用Loess校正。根据本发明，根据测得的序列在基因组上的位置，统计落到每个窗口的序列数目、碱基分布、参考基因组的碱基分布，根据每个窗口的序列及碱基GC含量，校正每个窗口的拷贝数，计算每个窗口校正后的拷贝数。根据本发明，步骤(5)所述的阈值范围为N–σ到N+σ之间，其中，所述N为待测样本的倍体，所述σ为设定的拷贝数正常波动范围的预定值，所述预定值σ为0.05-0.2，例如可以是0.05、0.06、0.08、0.1、0.12、0.15、0.18、0.2，以及上述数值之间的具体点值，限于篇幅及出于简明的考虑，本发明不再穷尽列举所述范围包括的具体点值。以人为例，人是二倍体，则N＝2，设定正常波动范围的预定值(σ)为0.05，正常拷贝数的阈值范围为(2–0.05，2+0.05)。优选地，步骤(5)所述的阈值范围为N-m×SD到N+m×SD之间，其中，所述N为待测样本的倍体，所述m为1-3中的任意整数，所述SD为待测样本所有窗口拷贝数的标准差。本发明中，计算拷贝数时，基因组分成很多窗口，每个窗口都有一个拷贝数，大部分窗口拷贝数是正常的，其数值在2上下波动，符合正态分布，m是标准差的倍数，理论上，m＝1时，68.3％的数落在[N-SD,N+SD]；m＝2时，95.5％的数落在[N-2×SD,N+2×SD]；m＝3时，99.7％的数落在[N-3×SD,N+3×SD]；m是一个统计学概念，本领域技术人员可以根据实际情况进行选择。以人为例，正常拷贝数的阈值范围可以为(2–2×SD，2+2×SD)。本发明中，两种阈值都可以用于后续的实验，“N–σ到N+σ”这种阈值范围的σ一般根据大量样本拷贝数分布特点经验得来，适用于大部分情况；“N-m×SD到N+m×SD”这种阈值范围的SD是根据待测样本本身拷贝数的分布特点算出来的，适用范围更广，适用于全部情况。根据本发明，步骤(5)所述的周围窗口的数量为10-100，例如可以是10、12、15、20、30、40、50、60、70、80、90、100，优选为10-60，进一步优选为10，以及上述数值之间的具体点值，限于篇幅及出于简明的考虑，本发明不再穷尽列举所述范围包括的具体点值。优选地，所述三均值的计算公式为：M＝Q1/4+M/2+Q3/4，其中，Q1为下四分位数，M为中位数，Q3为上四分位数。优选地，步骤(6)所述的周围窗口的数量为3-10，例如可以是3、4、5、6、7、8、9、10，优选为3-8，进一步优选为3-5，以及上述数值之间的具体点值，限于篇幅及出于简明的考虑，本发明不再穷尽列举所述范围包括的具体点值。步骤(6)所述的每遇到正常和异常转换的窗口具体为第一个窗口为第1断点bp1，逐一计算每个窗口，当出现至少连续2个Mnps落在异常范围时，记录该窗口为第2断点bp2，继续扫描，直到出现至少连续2个Mnps回到正常范围时，记录该窗口为第3断点bp3，这样每遇到正常和异常转换的窗口，记录一个断点bpi，直到一级区域的最后一个窗口，其中，所述i为1至M的任意正整数。根据本发明，对于非平衡易位的配子导致的胚胎拷贝数变异，检测到的断点即为平衡易位断裂点。优选地，步骤(8)所述的多个胚胎的数量为大于5的正整数。步骤(8)所述的胚胎平衡易位的断裂点具体为通过IVF会得到n个胚胎，其中拷贝数异常(包括活检不合格的废胚)的胚胎n’个，用上述同样的方法检测，其中选取n”(n”为小于等于n’的正整数，优选n”＝n’)个拷贝数异常胚胎，确定两条相互易位的染色体断裂点，定义两条相互易位的染色体分别为chrM和chrN，n”个拷贝数异常的胚胎，在chrM上会得到nM”个的断裂点位置，在chrN上会得到nN”个的断裂点位置，分别计算两条染色体断裂点位置的三均值，得到bpchrM和bpchrN即为两条相互易位的染色体的精确断裂点的位置。第二方面，本发明提供一种鉴定胚胎平衡易位携带状态的方法，包括如下步骤：(1’)采用如第一方面所述的方法确定胚胎平衡易位断裂点；(2’)检测断裂点周围的SNP；(3’)胚胎单倍型分析：挑选有效的SNP，根据其中一方的SNP基因型进行分型，通过拷贝数正常的胚胎构建另外一方的单倍型，将拷贝数异常的胚胎进行单倍型分型后进行比较，确定单倍型的分型结果；(4’)确定胚胎携带状态：将拷贝数正常的胚胎进行单倍型分型，再将分型结果分类，分成易位携带和不携带两类，确定单倍型的分型结果；(5’)确定胚胎携带状态：将拷贝数正常的胚胎进行单倍型分型，再与步骤(4’)所述单倍型的分型结果进行比对，确定胚胎易位携带状态。根据本发明，步骤(2’)所述的断裂点周围的长度为2×105-5×106，例如可以是2×105、3×105、4×105、5×105、6×105、7×105、8×105、9×105、1×106、2×106、3×106、4×106、5×106，优选为2×105-1×106，以及上述数值之间的具体点值，限于篇幅及出于简明的考虑，本发明不再穷尽列举所述范围包括的具体点值。优选地，步骤(2’)所述的SNP的数量一般检测30个以上，每个胚胎上的可用位点约占1/3,10个以上可用位点就可以确定单倍型连锁关系，本发明中所述SNP的数量为10-500，例如可以是10、20、30、40、50、60、80、100、120、130、150、200、250、300、350、400、450、500，优选为30-100，以及上述数值之间的具体点值，限于篇幅及出于简明的考虑，本发明不再穷尽列举所述范围包括的具体点值。根据本发明，所述检测断裂点周围的SNP的方法为本领域公知的方法，在此不做特殊限定，本领域技术人员可以根据需要进行选择，本发明采用设计探针芯片捕获测序、设计引物对扩增子进行一代测序或设计引物对扩增子进行二代测序中的任意一种或至少两种的组合。本发明中，所述确定基因型的方法为一代测序根据测序结果的峰图确定；二代测序，经过上述步骤(测序、将基因组序列与参考基因组进行比对)后，用分析软件分析，分析软件为SAMtools、GATK、Varscan等软件中的任意一种或至少两种的组合。根据本发明，所述有效的SNP为父方母方中有一方为纯合子有一方为杂合子，所述有效SNP的数量为10-500。本发明中，所述挑选有效SNP的具体过程为：被检测物种为人，人是二倍体，胚胎的父母中有一方为易位携带者，一方为正常(不携带者)。易位携带者M和N号染色体部分发生相互易位，同时含有一条正常的染色体，所以会有正常染色体chrM、易位衍生染色体der(chrM)、正常染色体chrN、易位衍生染色体der(chrN)；正常一方有正常染色体chrM’、chrM”、chrN’、chrN”。根据孟德尔遗传规律和连锁交换规律，在断裂点上游和下游选取可以有效区分正常染色体和易位衍生染色体单倍型的SNP。本发明中，所述胚胎携带状态的确定的具体结果为：根据两条染色体单倍型分型的结果，检验每个拷贝数正常的胚胎。判断遗传自(父母中)易位携带方的染色体，如果这条染色体与易位染色体相同，则胚胎携带状态为易位携带；如果这条染色体与正常染色体相同，则胚胎携带状态为不携带(正常)；从而确定为平衡易位携带胚胎。根据本发明，所述鉴定胚胎平衡易位携带状态的方法，包括如下步骤：(1)获取胚胎待测样本和父母DNA；(2)对待测样本进行扩增，构建文库后测序；(3)将步骤(2)获得的基因组序列与参考基因组进行比对，从而获得基因组序列在参考基因组上的位置信息；(4)将所述的参考基因组分成N个区域片段，其中每个区域片段为一个窗口，计算每个窗口的拷贝数；(5)确定正常拷贝数的阈值范围，逐个计算每个窗口及周围窗口拷贝数的三均值Mi，将Mi不落在阈值范围的窗口记录下来，连续的窗口合并，直到遇到正常窗口；(6)将步骤(5)连续的窗口定义为一级区域，继续计算一级区域每个窗口及周围窗口的三均值Mnps，第一个窗口为第1断点bp1，每遇到正常和异常转换的窗口，为断点bpi；(7)每两个断点之间定义为二级区域，继续计算二级区域每个窗口的三均值Mj，将Mj落在阈值范围之外的窗口即为精确的拷贝数变异区域，所述区域的起始和终止的位置即为拷贝数变异的起始和终止断点；(8)选取多个拷贝数异常的胚胎，用步骤(1)-(7)计算每个胚胎的两条染色体平衡易位的断裂点，分别计算两条染色体平衡易位断裂点的三均值，即为胚胎精确的平衡易位的断裂点；(9)检测断裂点周围的SNP；(10)胚胎单倍型分析：挑选有效的SNP，根据其中一方的SNP基因型进行分型，通过拷贝数正常的胚胎构建另外一方的单倍型，将拷贝数异常的胚胎进行单倍型分型后进行比较，确定单倍型的分型结果；(11)确定胚胎携带状态：将拷贝数正常的胚胎进行单倍型分型，再与步骤(10)所述单倍型的分型结果进行比对，确定胚胎易位携带状态；其中，所述i和j独立地为1至N的任意正整数。与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：(1)本发明方法提供了一个精准确定平衡易位断裂点位置的方法，使断裂点判定分辨率大大提高，从而在更精准有效的区域内检测SNP，避免重组交换的发生；(2)本发明利用胚胎互推的方法，实现了利用少量的胚胎、SNP位点就能准确的进行单倍型分型，鉴定鉴定胚胎平衡易位携带状态，大大的节约成本，提高准确度；(3)本发明检测方法适用人群更广泛，检测流程上操作更加简单，检测周期更短。附图说明图1是本发明鉴定胚胎平衡易位携带状态的方法的流程图。具体实施方式为更进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合附图并通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案，但本发明并非局限在实施例范围内。本发明已经应用到30个例子，经临床验证，检测结果和实际临床结果符合率为100％。为了使本发明的用法和效果更加易于理解和掌握，下面将举一个实例进行进一步的阐述。实施的简要流程图如图1所示，详细实施过程如下：本实施例中，对某平衡易位携带者胚胎及家系样本进行检测，鉴定结果与临床核型检测的金标准(羊水穿刺验证)结果比较。该家系夫妇父方核型正常，母方为chr7与chr16平衡易位携带者，核型为46,XX,t(7；16)(p12.3；q22.1)。具体实施过程如下：实施例1平衡易位断裂点的确定(1)获取胚胎待测样本和父母DNA经过IVF此家系获得8个胚胎，胚胎发育到囊胚时期，每个胚胎活检取下的3-5个滋养外胚层细胞。(2)对样本进行扩增、测序单细胞扩增采用上海亿康医学检验所有限公司的多次退火环状循环扩增技术单细胞全基因组扩增试剂盒YK001A，按照上海亿康医学检验所有限公司提供的说明书操作，对胚胎活检细胞进行全基因组扩增。测序采用Illumina公司的HiSeq2500高通量测序平台，按照Illumina公司提供的说明书操作。测序类型为单端(SingleEnd)测序，测序长度50bp，测序深度为基因组的0.1倍。(3)序列比对，进行拷贝数分析将测序结果去掉接头及低质量数据，比对到参考基因组。参考基因组hg19(GRCh19)。比对软件为BWA(Burrows-WheelerAlignmenttool)，采用默认参数，将序列比对到参考基因组，得到序列在基因组上的位置，选择在基因组上唯一比对的序列。将基因组分成长度为5×107bp的窗口。根据序列在基因组上的位置，统计落到每个窗口的序列数目、碱基分布、参考基因组的碱基分布。根据每个窗口的序列及碱基GC含量，校正每个窗口的拷贝数，校正方法为Loess，计算每个窗口校正后的拷贝数。拷贝数结果如表1所示，由于人的基因组非常大，有3×109bp，表1只展示chr7部分区域拷贝数情况：表1各胚胎chr7部分区域拷贝数(4)精确确定断裂点的位置经以上步骤，得到各窗口的拷贝数。设定正常拷贝数的范围：根据样本拷贝数分布特征，计算样本所有窗口拷贝数的标准差(StandardDeviation,SD),本实施例SD＝0.11，确定正常拷贝数的阈值范围为正常值±2倍标准偏差，范围为(1.78,2.22)。逐个计算每个窗口及周围10个窗口拷贝数的三均值Mi。三均值Mi落在正常拷贝数范围以外的窗口记录下来，连续的窗口合并，直到遇到正常窗口。经以上计算得到拷贝数异常的连续窗口，这些连续窗口定义为一级区域，定义一级区域的第一个窗口为第1断点bp1，然后计算一级区域每个窗口及周围3个窗口的平均值Mnps。逐一计算每个窗口，当出现至少连续2个Mnps落在异常范围时，记录该窗口为第2断点bp2，继续扫描，直到出现至少连续2个Mnps回到正常范围时，记录该窗口为第3断点bp3，这样每遇到正常和异常转换的窗口，记录一个断点bpi，直到一级区域的最后一个窗口，记录为bpf。断点bp1到断点bpf将一级区域分成(f–1)个次级片段，定义为二级区域，计算每个二级区域窗口拷贝数的三均值Mj，和拷贝数正常范围比较，Mj落在异常范围的二级区域即为精确的拷贝数变异区域，其中Mj为该区域的拷贝数，该区域起始和终止的位置即为拷贝数变异的起始和终止断点。对于非平衡的配子导致的胚胎拷贝数变异，检测到的断点即为平衡易位断裂点。本实施例得到8个胚胎，其中拷贝数异常4个，分别为E1、E3、E7、E8，用上述同样的方法检测，全部选取4个拷贝数异常胚胎，确定两条相互易位的染色体断裂点。4个拷贝数异常的胚胎，在chr7上得到4个的断裂点位置，在chr16上同样得到4个的断裂点位置，分别计算两条染色体断裂点位置的三均值，得到两条相互易位的染色体的精确断裂点的位置为：chr7:45,900,001±50,000；chr16:43,100,001±50,000。检测结果如表2所示。表2根据4个拷贝数异常的断裂点确定精确断裂点实施例2胚胎平衡易位携带状态的确定(1’)从实施例1得到的确定的平衡胚胎平衡易位断裂点；(2’)检测断裂点周围SNP在距离chr7断裂点1×106bp的范围内分别检测胚胎父母、胚胎的61个SNP位点；在距离chr16断裂点1×106bp的范围内分别检测胚胎父母、胚胎的63个SNP位点。SNP位点的检测方法为，设计引物对扩增子进行二代测序。确定基因型的方法为二代测序，使用分析软件为SAMtools确定SNP基因型。该家系chr7及chr16断裂点上下游的SNP结果如表3和表4所示。表3家系样本chr7断裂点上下游SNP基因型SNP编号父方母方E1E2E3E4E5E6E7E81C/CT/TT/CT/CC/CT/CT/CT/CT/CT/C2A/AC/CA/CA/CA/AA/CA/CA/CA/CA/C3G/GT/TT/GT/G--T/GT/GG/GT/G4C/CT/TT/CT/CC/CT/CT/CT/CT/CT/C5G/GA/AA/GA/GG/GA/GA/GA/GA/GA/G6T/TG/GG/TG/TT/TT/TG/TG/TG/TG/T7A/AG/AG/AG/AA/AG/AG/AA/AG/AG/A8G/GG/GG/GG/GG/G-G/GG/GG/GG/G9G/AG/GG/AG/GA/AG/GG/AG/GG/GG/A10A/AC/AC/AA/AA/AA/AA/AC/AA/AC/A11T/GT/GT/GG/GT/T-T/GT/GG/GT/G12G/TG/GG/TG/GT/TG/GG/TG/GG/GG/T13G/GG/GG/GG/GG/GG/GG/GG/GG/GG/G14C/TT/TC/TT/TC/CT/TC/TT/TT/TC/T15G/GG/GG/GG/GG/GG/GG/GG/GG/GG/G16A/AG/AG/AG/AA/AG/AG/AA/AG/AG/A17A/GA/GA/GA/GA/AA/GA/AG/GA/GA/G18T/CT/TT/CT/TC/C-T/CT/TT/TT/C19G/TG/GG/TG/GT/TG/GG/TG/GG/GG/T20G/TG/GG/TG/GT/TG/GG/TG/GG/GG/T21T/GT/TT/GT/TG/GT/TT/GT/TT/TT/G22G/AA/AG/AA/AG/GA/AG/AA/AA/AG/A23T/TC/TC/TT/TT/TT/TT/TC/TT/TC/T24T/TC/TC/TC/TT/TC/TC/TT/TC/TC/T25C/TC/TC/TC/TT/TG/AT/TC/CC/TC/T26T/CT/CT/CT/CC/C-C/C-T/CT/C27G/CG/CG/C---C/CG/GG/CG/C28C/CT/CT/CC/CC/CC/CC/CT/CC/CT/C29T/CT/CT/CT/C-T/CC/CT/TT/CT/C30G/AA/AA/AG/GA/AG/AA/AG/AG/AA/A31G/CG/GG/CG/GG/CG/GG/CG/GG/GG/C32T/CT/CT/CC/CT/TC/CT/CT/CT/CT/C33A/GA/GA/GG/GA/AG/GA/GA/GA/GA/G34C/TC/TC/TC/CT/T-C/TC/TC/TC/T35G/AA/AA/AG/AA/AG/GA/AG/AG/AA/A36G/AA/AA/AG/AA/AG/AA/AG/AG/AA/A37T/TT/AT/AT/AT/T-T/AT/TT/TT/A38C/CT/TT/CT/CT/CT/TT/CT/CT/CT/C39A/AG/GA/GA/GA/GA/GA/GA/GA/GA/G40G/CG/CG/GC/CC/CG/GG/GC/CG/CG/G41G/GG/GG/GG/GG/GG/GG/GG/GG/GG/G42G/AG/AG/GG/AG/AA/AG/GA/AG/AG/G43A/AG/AG/AG/AA/AG/AG/AA/AG/AG/A44T/CT/TT/TT/CT/TT/CT/TT/CT/CT/T45T/GT/TT/TT/GT/T-T/TT/GT/GT/T46A/GG/G--G/G-G/GA/AA/GG/G47T/TT/TT/TT/TT/TT/TT/TT/TT/TT/T48C/CC/CC/CC/CC/CC/CC/CC/CC/CC/C49G/GG/GG/GG/GG/G-G/GG/GG/GG/G50A/GA/GA/AA/GA/G-A/AG/GA/GA/A51A/AA/GA/AA/AA/GA/AA/AA/GA/GA/A52G/GA/AG/AG/AG/G-G/AG/AG/AG/A53G/GG/GG/GG/GG/GG/GG/GG/GG/GG/G54A/AA/GA/GA/GA/AA/GA/GA/AA/GA/G55G/AG/GG/AG/GG/A-G/AG/GG/GG/A56C/CC/TT/TC/TC/C-C/TC/CC/TC/T57G/AG/GG/AG/GG/AG/GG/AG/GG/GG/A58G/TG/GG/TG/GG/TG/GG/TG/GG/GG/T59G/AA/AG/AA/AG/A-G/AA/AA/AG/A60G/AG/AA/AG/AG/A-A/AG/GG/AA/A61C/TC/TC/TC/CT/TC/CC/TC/TC/TC/T“-”：表示该位点未检测到，后续表格采用相同的表示方法。表4家系样本chr16断裂点上下游SNP基因型SNP编号父方母方E1E2E3E4E5E6E7E81C/CC/TC/CC/TC/TC/TC/TC/CC/CC/C2T/TT/CT/CT/TT/TT/TT/TT/CT/TT/C3T/TC/T--T/T-T/TC/T-C/T4A/AC/C-C/C-C/AC/AC/A-C/A5A/CC/CA/CA/CA/CC/CC/CC/CA/AC/C6A/AG/GA/GA/GA/GA/GA/GA/GA/AA/G7G/GA/GA/GG/GG/GG/GG/GA/GG/GA/G8A/AC/AC/AA/AA/AA/AA/AC/AA/AC/A9T/TA/AT/AT/AT/AT/AT/AT/AT/TT/A10G/GG/GG/GG/GG/G-G/GG/GG/GG/G11C/AC/AC/CC/AC/AA/AA/AC/AC/CC/A12T/GT/GT/GT/TT/TT/GT/GG/GT/TG/G13A/AG/GG/AG/AG/A-G/AG/AA/AG/A14G/TT/TG/TG/TG/TT/TT/TT/TG/GT/T15C/CC/TC/TC/CC/CC/CC/CC/T-C/T16A/GA/GA/GG/GG/GG/GA/GA/AG/GA/A17T/CT/CT/CC/CC/CT/CT/CT/TC/CT/T18C/CC/CC/CC/CC/CC/CC/CC/CC/CC/C19T/TC/TT/TC/TC/TC/TC/TT/TT/TT/T20C/TT/TC/TC/TC/T-T/TT/TC/CT/T21T/TT/AT/TT/AT/A-T/AT/TT/TT/T22T/TC/TT/TC/TC/TC/TC/TT/T-T/T23C/CT/CC/CT/CT/CT/CT/CC/CC/CC/C24A/AC/AA/AC/AC/A-C/AA/AA/AA/A25C/AA/AC/AC/AC/AA/AA/AA/AC/CA/A26C/TT/TC/TC/TC/TT/TT/TT/TC/CT/T27T/GG/GT/GT/GT/GG/GG/GG/GT/TG/G28A/GG/GA/GA/GA/GG/GG/GG/GA/AG/G29C/AC/CC/CC/CC/CC/AC/AC/AC/CC/A30G/TG/GG/GG/GG/G-G/TG/TG/GG/T31G/AA/AA/AA/AA/A-G/AG/AA/AG/A32T/AT/TT/TT/TT/TT/AT/AT/AT/TT/A33A/GA/GG/GG/GA/G-A/G--A/A34C/CC/AC/CC/AC/AC/AC/AC/CC/CC/C35C/TT/TT/TT/TT/TC/CC/TC/TT/TC/C36C/CC/TC/CC/TC/CT/TC/TC/CC/CC/C37C/GC/CG/GC/GC/GC/CC/CC/CC/GC/C38G/AG/GA/AG/AG/AG/GG/GG/GG/AG/G39C/TC/CT/TC/TC/TC/CC/CC/CC/TC/C40G/GG/GG/GG/GG/GG/GG/GG/GG/GG/G41C/CC/CC/CC/CC/C-C/CC/CC/CC/C42A/AG/GA/AA/GG/GG/GG/GG/GA/G-43A/AG/GA/AG/AG/AG/AG/AG/AG/AA/A44C/CC/CC/CC/CC/C-C/CC/CC/CC/C45T/GG/GG/GG/GG/GT/GT/GT/GG/GT/T46T/CC/C-T/TC/C-C/C-T/CC/C47C/TT/TC/CC/TC/TT/TT/TT/TC/TT/T48A/AA/AA/AA/AA/AA/AA/AA/AA/AA/A49T/TT/TT/TT/TT/TT/TT/TT/TT/TT/T50A/AA/AA/AA/AA/A-A/AA/AA/AA/A51A/AA/AA/AA/AA/AA/AA/AA/AA/AA/A52T/TT/TT/TT/TT/TT/TT/TT/TT/TT/T53A/GA/GG/GG/GA/GA/GA/GA/AA/GA/A54G/GG/CG/GG/GG/CG/GG/GG/CG/CG/G55A/GA/G-A/GA/GA/AA/A-G/GA/A56G/CG/GC/CG/CG/CG/GG/GG/GG/CG/G57C/CT/TC/CC/TC/TC/TC/TC/TC/TC/C58A/GA/AA/AA/AA/AA/GA/G-A/AG/G59G/AG/A-G/GG/AG/AG/AA/AG/AA/A60T/TT/TT/TT/TT/TT/TT/TT/TT/TT/T61T/TT/CT/TT/CT/CT/CT/CT/TT/TT/T62T/GT/TG/GT/GT/GT/TT/TT/TT/GT/T63C/CC/TC/CC/TC/TC/TC/TC/CC/CC/C(3’)胚胎单倍型分析根据孟德尔遗传规律和连锁交换规律，从表3-4中的SNP中挑选出有效的信息SNP，结果如表5所示。表5家系样本断裂点上下游有效SNP基因型染色体SNP编号父方母方E1E2E3E4E5E6E7E8chr77A/AG/AG/AG/AA/AG/AG/AA/AG/AG/Achr710A/AC/AC/AA/AA/AA/AA/AC/AA/AC/Achr716A/AG/AG/AG/AA/AG/AG/AA/AG/AG/Achr723T/TC/TC/TT/TT/TT/TT/TC/TT/TC/Tchr724T/TC/TC/TC/TT/TC/TC/TT/TC/TC/Tchr728C/CT/CT/CC/CC/CC/CC/CT/CC/CT/Cchr737T/TT/AT/AT/AT/T-T/AT/TT/TT/Achr743A/AG/AG/AG/AA/AA/GG/AA/AG/AG/Achr751A/AA/GA/AA/AA/GA/AA/AA/GA/GA/Achr754A/AA/GA/GA/GA/AA/GA/GA/AA/GA/Gchr756C/CC/TT/TC/TC/C-C/TC/CC/TC/Tchr161C/CC/TC/CC/TC/TC/TC/TC/CC/CC/Cchr162T/TT/CT/CT/TT/TT/TT/TT/CT/TT/Cchr163T/TC/T--T/T-T/TC/T-C/Tchr167G/GA/GA/GG/GG/GG/GG/GA/GG/GA/Gchr168A/AC/AC/AA/AA/AA/AA/AC/AA/AC/Achr1615C/CC/TC/TC/CC/CC/CC/CC/T-C/Tchr1619T/TC/TT/TC/TC/TC/TC/TT/TT/TT/Tchr1621T/TT/AT/TT/AT/A-T/AT/TT/TT/Tchr1622T/TC/TT/TC/TC/TC/TC/TT/T-T/Tchr1623C/CT/CC/CT/CT/CT/CT/CC/CC/CC/Cchr1624A/AC/AA/AA/CC/A-C/AA/AA/AA/Achr1634C/CC/AC/CC/AC/AC/AC/AC/CC/CC/Cchr1636C/CC/TC/CC/TC/CT/TC/TC/CC/CC/Cchr1654G/GG/CG/GG/GG/CG/GG/GG/CG/CG/Gchr1661T/TT/CT/TT/CT/CT/CT/CT/TT/TT/Tchr1663C/CC/TC/CC/TC/TC/TC/TC/CC/CC/Cchr7断裂点上下游有11个有效SNP，chr16断裂点上下游有16个有效SNP。对父方的chr7和chr16的SNP基因型进行分型。再根据拷贝数正常的胚胎(E2、E4、E5和E6)，构建母方单倍型。其中，构建母方单倍型是通过将拷贝数正常的胚胎(E2、E4、E5和E6)减去父方的纯合子单倍型得到，每个胚胎在chr7上用于单倍型分型的是SNP数目为9-11，在chr16上用于单倍型分型的是SNP数目为13-16，合并这些母方单倍型，构建母方在chr7单倍型HAchr7和HBchr7，构建母方在chr16单倍型HAchr16和HBchr16，详细结果见表6-7所示。表6家系拷贝数正常胚胎chr7断裂点上下游单倍型表7家系拷贝数正常胚胎chr16断裂点上下游单倍型同上方法，对CNV异常的胚胎(E1、E3、E7和E8)进行单倍型分型，每个胚胎都可以确定chr7/chr16上的单倍型是正常还是易位携带，4个胚胎的结果相互验证，得到综合判定结果，结果如表8-9所示。表8家系拷贝数异常胚胎chr7断裂点上下游单倍型判定结果“N/A”：表示该位点不可用于连锁分析，后续表格采用相同的表示方法。表9家系拷贝数异常胚胎chr16断裂点上下游单倍型判定结果综合判定结果和HAchr7、HBchr7、HAchr16、HBchr16的单倍型分型结果比较，判定哪个单倍型代表“正常”，哪个单倍型代表“易位携带”。如表10所示，4个异常胚胎一致判定HAchr7为正常单倍型，HBchr7为易位携带单倍型；同样，判定HAchr16为正常单倍型，HBchr16为易位携带单倍型。表10家系单倍型分型结果(4’)确定胚胎携带状态根据上述步骤的单倍型的分型结果，判定拷贝数正常的胚胎E2、E4、E5和E6的携带状态。判定结果如表11所示，结果显示胚胎E2、E4、E5均为正常(不携带易位)胚胎。用本发明方法挑选出1个正常(不携带易位)的胚胎，鉴定过程结束。胚胎植入后，孕妇正常受孕，经羊水穿刺检测确认该胎儿核型正常。表11家系胚胎携带状态确定结果染色体胚胎chr7chr16E2正常正常E4正常正常E5正常正常E6携带携带申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属
技术领域：
的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。当前第1页1 2 3