本发明涉及一种采用离体叶片鉴定甘蔗梢腐病抗性的方法。
背景技术：
甘蔗梢腐病是甘蔗生产上的一种重要叶部病害，甘蔗梢腐病(Pokkah Boeng)是由多种镰刀菌引起的一种甘蔗叶部病害，病原菌为藤仓赤霉病菌复合种(Gibberella fujikuroi complex)，无性态至少包括Fuarium sacchri、F.proliferatum、F.verticillioides、F.subglutinan和F.andiyazi等5种镰刀菌。病原菌主要通过气流传播到甘蔗心叶侵染为害，造成叶片死亡，植株生长受阻，严重可造成植株死亡，导致甘蔗减产5％-20％，甘蔗糖分降低达3％，对感病甘蔗品种造成待影响更加显著。该病在几乎所有甘蔗生产国家和地区均普遍发生，虽然通过化学药剂进行防控可降低该病的发生。但应用抗病品种可有效减少甘蔗梢腐病的发生，并降低化学农药对环境的污染。
近年来，甘蔗梢腐病在我国蔗区的发生呈逐渐加重的趋势，对我国的甘蔗生产和糖业可持续发展构成严重威胁。因此，建立一套快速、精准的甘蔗梢腐病抗性鉴定方法，有利于对现有的甘蔗种质资源和品种进行科学评价，为甘蔗梢腐病的抗病育种以及品种的和合理布局提供科学依据。
现有技术中已有甘蔗苗期人工针刺接种对梢腐病的抗性评价，但是整个过程需要经历甘蔗种消毒、播种，待蔗苗长至3～4片完全叶后才能接种，接种后需要10～15天才能观察和判断甘蔗品种的抗病性。整个周期较长，甘蔗从播种到可以接种的适当苗龄至少需要1.5～2个月的时间，且大棚不易控制温湿度，不同的季节播种，甘蔗的抗性不同，容易造成重复性试验结果的不一致。另外，不及时进行接种时，随着苗龄的增加，品种本身的抗性会不断提高，接种难以致使甘蔗叶片发病，导致抗性水平的判别误差。
公开于该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不应当被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种采用离体叶片鉴定甘蔗梢腐病抗性的方法，该方法能缩短鉴定评价的周期，简易、精准、有效、重复性好，样本的采集不易受栽培季节以及苗龄的影响。
为实现上述目的，本发明提供了一种采用离体叶片鉴定甘蔗梢腐病抗性的方法，包括以下步骤：
(1)将甘蔗梢腐病菌接种在PDA培养基平板上，25-28℃培养3-5天；
(2)采集新鲜甘蔗叶片，清洗叶片，将叶片剪成片段，在叶片中间叶脉两侧刺伤，取甘蔗梢腐病菌的菌块接种在刺伤部位，以长有菌丝的一面贴在伤口处；
(3)将接菌的甘蔗叶片置于培养皿中，喷洒无菌水，于室温条件下放置3-5天；
(4)病情调查，观察和测量病斑的长度，沿着叶脉方向测量黄色晕圈的长度，根据病斑长度对甘蔗品种梢腐病抗性进行评价，去除一个最高值和一个最低值，以剩余数值的平均值代表该甘蔗品种的抗性；甘蔗梢腐病的发病等级划分标准如下：
0级：无发病症状；
1级：针刺伤口处黑褐色，黄色晕圈沿叶脉方向长度≤1.0cm；
2级：针刺伤口处黑褐色，黄色晕圈沿叶脉方向长度1.1-2.0cm；
3级：针刺伤口处黑褐色，黄色晕圈沿叶脉方向长度2.1-3.0cm；
4级：针刺伤口处黑褐色，黄色晕圈沿叶脉方向长度3.1-4.0cm；
5级：针刺伤口处黑褐色，黄色晕圈沿叶脉方向长度>4.0cm。
优选地，上述技术方案中，根据甘蔗梢腐病的发病等级划分标准对甘蔗抗性等级进行划分，甘蔗抗性等级划分标准如下：
高抗：发病等级为0；
抗病：发病等级为1；
中抗：发病等级为2；
中感：发病等级为3；
感病：发病等级为4
高感：发病等级为5。
优选地，上述技术方案中，所述步骤(2)中采集新鲜甘蔗叶片为，从心叶往下数第2至第4张完全展开叶片。
优选地，上述技术方案中，所述步骤(2)中叶片剪成的片段长度为10-14cm。
优选地，上述技术方案中，所述步骤(2)中取菌块为，用灭菌的移液器枪头挖取菌块，菌块直径为5-6mm。
优选地，上述技术方案中，所述步骤(3)中喷洒无菌水的量为3-5ml。
优选地，上述技术方案中，所述步骤(3)中培养皿选用直径为15cm。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：本发明一种采用离体叶片鉴定甘蔗梢腐病抗性的方法，采用离体接种测定甘蔗品种对梢腐病抗性水平，甘蔗叶片样本的采集不受甘蔗苗龄，种植时期的影响，测定条件易控制。甘蔗离体叶片在保温保湿条件下可在一定时间内不干枯，保证了病原菌的侵染。接种体的制备省工省事，直接接种在PDA培养基平板室温培养即可，无需额外制作液体培养液以及分生孢子液。无需按照季节进行甘蔗种苗的种植，也不受甘蔗苗龄和场地的限制，在室内操作简便，重复性好，尤其对于大量样本的筛选具有较好的省工、省时的特点。
具体实施方式
下面结合具体实施例，对本发明的具体实施方式进行详细描述，但应当理解本发明的保护范围并不受具体实施方式的限制。
实施例
一种采用离体叶片鉴定甘蔗梢腐病抗性的方法，包括以下步骤：
1、接种体的制备
采用致病力较强的两个甘蔗梢腐病镰刀菌菌株进行分别培养。具体为：分别将甘蔗梢腐病病原菌接种在PDA培养基平板上活化3天，挑取边缘菌丝接种新的PDA培养基平板上，25-28℃培养3-5天，用灭菌的1mL移液器枪头(宽口的一端)挖取菌丝块(直径约5-6mm)，待用。
2、接种材料的处理
选择生产上表现为甘蔗梢腐病感病品种GT37和LC05-136，抗病品种ROC22以及5个区试品系(G505-3217、GR2、GT08-6、GT09-1743和GT08-120)，采集新鲜甘蔗叶片(从心叶往下数第2至第4张完全展开叶片)，用自来水冲洗干净表面的尘土，晾干，剪成约12cm的片段。
3、接种
用大头针在叶片中间叶脉两侧刺伤，按照约3×3mm的方式共刺4针。取甘蔗梢腐病菌菌块，接种在刺伤部位，以长有菌丝的一面贴在伤口处，菌碟完全覆盖刺伤口。每个菌株分别在10张叶片叶脉的一侧接种，另一侧以接纯PDA培养基为对照。将接菌的甘蔗叶片至于直径15cm的玻璃培养皿中，喷洒适量的无菌水(约3-5mL)。于室温条件(25-28℃)下放置3-5天。
4、病情调查
观察和测量病斑的长度，沿着叶脉方向测量黄色晕圈的长度，根据病斑长度对甘蔗品种梢腐病抗性进行评价，去除一个最高值和一个最低值，以剩余数值的平均值代表该甘蔗品种的抗性；对针刺接种法，甘蔗梢腐病的发病等级划分标准如下：
0级：无发病症状；
1级：针刺伤口处黑褐色，黄色晕圈沿叶脉方向长度≤1.0cm；
2级：针刺伤口处黑褐色，黄色晕圈沿叶脉方向长度1.1-2.0cm；
3级：针刺伤口处黑褐色，黄色晕圈沿叶脉方向长度2.1-3.0cm；
4级：针刺伤口处黑褐色，黄色晕圈沿叶脉方向长度3.1-4.0cm；
5级：针刺伤口处黑褐色，黄色晕圈沿叶脉方向长度>4.0cm。
根据甘蔗梢腐病的发病等级划分标准对甘蔗抗性等级进行划分，甘蔗抗性等级划分标准如下：
高抗：发病等级为0；
抗病：发病等级为1；
中抗：发病等级为2；
中感：发病等级为3；
感病：发病等级为4
高感：发病等级为5。
5、抗性结果鉴定
不同甘蔗品种接种梢腐病菌抗性水平鉴定结果见表1。不同甘蔗品种对对不同梢腐病菌株的感病情况不一样，采用两个前期筛选为致病力较强的菌株分别对8个甘蔗品种(材料)进行接种，除了在个别材料上表现抗性有些差异，但总体水平较为一致。例如，抗性最差的两个甘蔗品种LC05-136和GT37分别接种2个病原菌株时，均表现为抗性最差；而抗性较强的甘蔗材料GT08-120分别接种2个病原菌株时，也均表现为较好的抗性。室内离体抗性鉴定结果与生产上的表现基本一致。说明该方法能较好地适用于甘蔗梢腐病抗性材料的筛选。
表1不同甘蔗品种接种梢腐病菌抗性水平鉴定结果
前述对本发明的具体示例性实施方案的描述是为了说明和例证的目的。这些描述并非想将本发明限定为所公开的精确形式，并且很显然，根据上述教导，可以进行很多改变和变化。对示例性实施例进行选择和描述的目的在于解释本发明的特定原理及其实际应用，从而使得本领域的技术人员能够实现并利用本发明的各种不同的示例性实施方案以及各种不同的选择和改变。本发明的范围意在由权利要求书及其等同形式所限定。