一种利用定点突变和分子修饰技术改造的珍珠贝肉抗氧化肽及其构建和制备方法与流程

本发明涉及抗氧化肽，具体涉及一种利用定点突变和分子修饰技术改造的珍珠贝肉抗氧化肽，本发明还涉及该抗氧化肽构建方法以及制备方法。
背景技术：
：海洋物种丰富，海洋生物体内具有许多天然的蛋白质类抗氧化活性物质，从海洋天然产物中获得高效、专一的大分子或小分子抗氧化活性物质，来改善人民膳食营养结构、提高人民的健康生活水平具有重要的意义。海水珍珠贝肉是一种优质蛋白，含有许多功能活性物质，中国水产科学研究院南海水产研究所近10年来一直致力于合浦珠母贝肉的高值化开发利用，积累了一系列的成果。其中从合浦珠母贝肉中通过酶解技术制备得到的珍珠贝肉抗氧化肽，其结构序列为gly-ala-gly-leu-pro-gly-lys-arg-glu-arg，但在实现大规模制备生产该抗氧化肽时，我们发现需要大量的贝肉原料，制备速度慢，成本较高，而且该多肽的抗氧化活性的dpph清除能力的ic50仅有0.132mg/ml,仅为化妆品中常用抗氧化剂bht(dpph清除能力的ic50仅有0.025mg/ml)的dpph清除能力的六分之一。技术实现要素：本发明目的之一是提供一种利用定点突变和分子修饰技术改造的珍珠贝肉抗氧化肽。本发明目的之二是提供上述珍珠贝肉抗氧化肽的构建方法。本发明目的之三是提供上述珍珠贝肉抗氧化肽的制备方法，该方法满足抗氧化肽在工业上的应用，缩短制备时间，降低成本，提高抗氧化肽的活性。本发明所述的利用定点突变和分子修饰技术改造的珍珠贝肉抗氧化肽，其氨基酸序列如下：gly-ala-gly-ile-pro-gly-lys-arg-glu-arg-asn-gly-gly-ala-gly-ile-pro-gly-lys-arg-glu-arg-glu-arg-asn-gly-gly-ala-gly-ile-pro-gly-lys-arg-glu-arg-asn-gly-gly-ala-gly-ile-pro-gly-lys-arg-glu-arg-glu-arg-asn-gly-gly-ala-gly-ile-pro-gly-lys-arg-glu-arg。该抗氧化肽在本发明命名为mp。本发明所述的利用定点突变和分子修饰技术改造的珍珠贝肉抗氧化肽的构建方法，将从海水珍珠贝肉中酶法制备的抗氧化肽gly-ala-gly-leu-pro-gly-lys-arg-glu-arg的4号位位置的leu经定点突变为ile，突变后多肽氨基酸序列转变为：gly-ala-gly-ile-pro-gly-lys-arg-glu-arg，然后进行分子修饰，对其序列作进一步改造，使之序列串联延长从而具有卷曲结构。由于获得的珍珠贝肉抗氧化肽序列较长并具有一些简单的卷曲结构，导致其抗氧化活性由于空间结构的改变而活性提高，经验证构建所得的抗氧化肽的活性高，是现有的同类肽的4倍。本发明所述的利用定点突变和分子修饰技术改造的珍珠贝肉抗氧化肽的制备方法，该方法是在上述构建方法基础上，进一步作密码子优化、重组工程菌株构建和纯化获得目的蛋白抗氧化肽。具体地，该制备方法包括以下步骤：(1)对上述构建的抗氧化肽进行密码子优化得到利于在宿主菌de3表达的基因密码子序列，该mp目的基因序列如下：5’-aatggtggtgcgggtatcccgggcaaacgcgaacgtaacggtggtgcgggtatcccgggcaaacgcgaacgtaacggtggtgcgggtatcccgggcaaacgcgaacgtaacggtggtgcgggtatcccgggcaaacgcgaacgtaacggtggtgcgggtatcccgggcaaacgcgaacgttaactcgag-3’；(2)所述mp目的基因与载体pgex-his构建重组载体pgex-his-mp，而后将该重组载体转化原核表达宿主菌大肠杆菌菌株de3，培养转化体，获得重组工程菌株de3-pgex-his-mp；(3)对重组工程菌株de3-pgex-his-mp进行诱导表达，然后收集经原核表达系统表达出的含有目的蛋白的沉淀；(4)所述的含有目的蛋白的沉淀经纯化，获得含有目的蛋白mp。本发明具有以下技术效果：（1）抗氧化肽活性高：本发明提供的抗氧化肽是在海水珍珠贝抗氧化肽的基础上进行定点突变后进行分子修饰使其序列串联延长而得，由于序列较长并具有简单的卷曲结构，使得其抗氧化活性由于空间结构的改变而提高抗氧化活性，而且该抗氧化肽的抗氧化活性与改造之前的海水珍珠贝抗氧化肽相比，提高了4倍，这为后期珍珠贝抗氧化肽在化妆品、保健食品领域中的应用打下良好基础。（2）抗氧化肽纯度高：采用该方法制备的抗氧化肽mp(相对于传统的酶解方法得到的纯度高，经分离纯化后，蛋白纯度高达95%以上，且操作简单。而传统方法获取的酶解液的酶解程度控制在不同批次会受到原料、操作人员、环境的影响而导致酶解程度的不一样，从而使得海水珍珠贝贝肉酶解的小分子抗氧化肽纯度低。（3）制备抗氧化肽的速度快：由于本发明所用重组工程菌的宿主菌为大肠杆菌，平均繁殖一代的周期为20min，因此诱导培养时间短，大大节约时间。然而传统酶解方法由于受到原料成本、加工处理方式等条件的限制，在实际生产过程中，相对于大肠杆菌系统来讲有着工艺单位时间产量上等诸多限制。（4）制备成本低：本发明采用大肠杆菌为宿主菌，由于大肠杆菌生长用培养基原料价格低廉，其培养基组成的95%以上均为水，易于大规模生产获得大量的抗氧化活性肽物质，在成本上相对于传统的酶解方法有着经济节约。（5）本发明提供构建方法和制备方法自动化程度高，可以实现全程自动化无人管理，大大节约了人力成本。附图说明图1是ni-nta亲和层析纯化sds-page分析图；m：proteinmarker；1：上样；2：流出；3：bindingbuffer冲洗组分；4：洗脱。图2是本发明提供的抗氧化肽mp的质谱分析图谱。具体实施方式下面结合具体实施例和附图对本发明作进一步详细说明。本实施案例在以本发明技术为前提下进行实施，现给出详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于以下的实施例。1.利用定点突变技术，将从海水珍珠贝肉中酶法制备的抗氧化肽：gly-ala-gly-leu-pro-gly-lys-arg-glu-arg的4号位位置的leu突变为ile，突变后多肽氨基酸序列转变为：gly-ala-gly-ile-pro-gly-lys-arg-glu-arg，然后通过分子修饰技术，对其序列进行进一步的设计，使得改造过的多肽由于序列的串联延长而具有一些简单的卷曲结构，并导致其抗氧化活性由于空间结构的改变而改变。至此，经定点突变和分子修饰两步改造所形成的新的抗氧化活性多肽构建完成，命名为mp，对应的氨基酸序列为：gly-ala-gly-ile-pro-gly-lys-arg-glu-arg-asn-gly-gly-ala-gly-ile-pro-gly-lys-arg-glu-arg-glu-arg-asn-gly-gly-ala-gly-ile-pro-gly-lys-arg-glu-arg-asn-gly-gly-ala-gly-ile-pro-gly-lys-arg-glu-arg-glu-arg-asn-gly-gly-ala-gly-ile-pro-gly-lys-arg-glu-arg。定点突变和分子修饰是一起做的。定点突变依据：由酶解分离纯化出的抗氧化多肽（序列为gly-ala-gly-leu-pro-gly-lys-arg-glu-arg）直接做定点突变和分子修饰做不了，因此在基因水平对其进行改造修饰，即利用生物信息学分析软件将多肽对应dna序列翻译出，然后将dna序列中对应的4号位亮氨酸的三个碱基突变为异亮氨酸对应的三个碱基。具体步骤为突变前由酶解分离纯化出的抗氧化多肽（序列为gly-ala-gly-leu-pro-gly-lys-arg-glu-arg）对应的dna序列为5’-ggtgcgggtctgccgggcaaacgcgaacgt-3’，其中，序列中ctg密码子对应的就是亮氨酸，因此在基因序列上将ctg密码子替换为异亮氨酸对应的密码子atc，就达到了定点突变改造肽链的结果，且突变后肽链序列转变为gly-ala-gly-ile-pro-gly-lys-arg-glu-arg，对应的dna序列为5’-ggtgcgggtatcccgggcaaacgcgaacgt-3’。分子修饰技术改造方法：依据，由本实验室首次提出并验证关于肽链高级结构对其抗氧化功能活性的影响理论。分子修饰方法步骤，首先通过生物信息学软件设计出具有高级结构的抗氧化肽，即将突变后的合浦珠母贝抗氧化肽（序列为gly-ala-gly-ile-pro-gly-lys-arg-glu-arg）设计出具有一定高级结构的多肽，序列为gly-ala-gly-ile-pro-gly-lys-arg-glu-arg-asn-gly-gly-ala-gly-ile-pro-gly-lys-arg-glu-arg-glu-arg-asn-gly-gly-ala-gly-ile-pro-gly-lys-arg-glu-arg-asn-gly-gly-ala-gly-ile-pro-gly-lys-arg-glu-arg-glu-arg-asn-gly-gly-ala-gly-ile-pro-gly-lys-arg-glu-arg；然后通过免费在线蛋白质一级结构和二级结构分析工具数据库http://web.expasy.org/protscale/和http://web.expasy.org/protparam/和http://bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred/中分析得到抗氧化肽一级结构和二级结构特征，并进一步利用swiss-modelworkspace数据库对肽链序列进行同源建模分析得到其三级结构特征。至此，分子修饰后多肽构建完成，命名为mp。2.密码子优化：根据抗氧化肽（mp）的氨基酸序列gagipgkrernggagipgkrernggagipgkrernggagipgkrernggagipgkrer，按照构建重组工程菌的原核表达宿主菌——大肠杆菌菌株de3的密码子的偏好性，利用免费在线密码子优化工具http://www.jcat.de优化设计得到利于在宿主菌表达的基因密码子序列，即mp对应dna碱基序列：5’-ggtgcgggtatcccgggcaaacgcgaacgtaacggtggtgcgggtatcccgggcaaacgcgaacgtaacggtggtgcgggtatcccgggcaaacgcgaacgtaacggtggtgcgggtatcccgggcaaacgcgaacgtaacggtggtgcgggtatcccgggcaaacgcgaacgt-3’，其中at含量为0.4，gc含量为0.6，另外，为了后期将该基因序列导入到表达载体中和最终诱导表达能及时终止翻译保留肽链完整的c端活性，在该抗氧化肽（mp）两端设计并加入的酶切位点分别为限制性内切酶bamhi和xhoi，且在3’端插入xhoi酶切位点之前设计加入taa终止翻译密码子；设计完成后的基因全长序列如下：5’-aatggtggtgcgggtatcccgggcaaacgcgaacgtaacggtggtgcgggtatcccgggcaaacgcgaacgtaacggtggtgcgggtatcccgggcaaacgcgaacgtaacggtggtgcgggtatcccgggcaaacgcgaacgtaacggtggtgcgggtatcccgggcaaacgcgaacgttaactcgag-3’。3.构建重组工程菌株：（1）酶切：将上一步mp目的基因亚克隆入改造载体pgex-his，利用限制性内切酶bamhi和xhoi双酶切目的基因mp、改造载体pgex-his：将mp目的基因用限制性内切酶bamhi和xhoi按照20μl的酶切体系于37℃水浴酶切5h，酶切完成后取5μl酶切反应液加入0.5μl的10×loadingbuffer在2.5%琼脂糖胶浓度下验证是否酶切完全，若酶切完全，则按照invitrogene胶回收试剂盒回收双酶切后的mp基因片段和改造载体pgex-his片段。（2）连接：然后将双酶切后的pgex-his和mp按照20μl的连接体系于金属浴中16℃连接16h，得连接液。（3）转化：将连接液转入大肠杆菌菌株de3感受态细胞中：取100μl大肠杆菌de3感受态细胞，冰浴解冻后轻轻震荡，使细胞悬浮均匀。将10μl连接液加入感受态细胞中，轻轻混匀，冰浴30min。42℃热激90秒，然后迅速转移至冰浴中，静置2分钟。加入900μllb液体培养基，37℃、150rpm震荡孵育1h，3000rpm离心1min，弃上清。取少量培养物均匀涂布于la-c（50µg/ml氨苄青霉素和34µg/ml氯霉素）固体培养基平板上。将平板倒置放入37℃恒温培养箱，培养10-16h，观察单菌落生长情况。（4）鉴定：挑取培养后长出的单菌落至装有la-c液体培养基的2ml的ep管中，37℃、180rpm培养10h，做菌落pcr验证、双酶切验证或测序验证，其中以测序验证为准，验证结果表明本发明成功构建了重组载体pgex-his-mp和重组工程菌株de3-pgex-his-mp。（5）诱导表达挑单菌落于100/500ml含有la-c液体培养基的锥形三角瓶中，于37℃、220rpm条件下培养至od600约0.8时，添加iptg诱导，使其终浓度为0.5mmol/l，继续培养诱导4h，此过程设置未添加iptg诱导剂作为阴性对照；4000rpm离心10min收集菌体，弃上清；菌体用500µlpbs（ph7.4）缓冲液悬浮，超声破碎6min，超0.5s停1.5s，分别离心收集上清和沉淀，沉淀用500µl包涵体溶解液（8murea，50mmtris-hcl，150mmnacl，ph8.0）溶解，分别取40µl样品和10µl5×proteinloadingbuffer混匀，沸水浴10min。sds-page检测：准备12%的sds-page，tris-gly电泳缓冲液（tris30g，甘氨酸144.0g，sds10g，定容至1l），上样量10µl，浓缩胶80v20min，分离胶120v60min，凝胶电泳结束考染20min，脱色，拍照记录，结果参见图1，泳道4的蛋白条带即为抗氧化肽mp理论分子量附近的目的蛋白条带。对4号泳道中在抗氧化肽mp理论分子量附近的目的蛋白条带，切胶消化并利用maldi-tof-ms对其进行质谱分析，结果如下图2所示。由质谱结果其氨基酸序列与理论序列结果相符。收集经验证正确的经原核表达系统表达出的含有目的蛋白的沉淀，于4℃保存。4.纯化利用ni-nta亲和层析，对制备的mp进一步分离纯化，获得纯品，进行目的蛋白的验证，ni-nta亲和层析纯化步骤：(1)取25mlni-nta柱料，用10倍柱床体积的bindingbuffer清洗平衡柱子，流速5ml/min。(2)上柱，流速为2ml/min，收集穿透液。(3)10倍柱床体积的bindingbuffer清洗柱子，流速5ml/min。(4)elutionbuffer洗脱，流速2ml/min，收集洗脱液。其中，bindingbuffer（20mmtris-hcl,8murea,500mmnacl,5mmimidazole,ph8.0；elutionbuffer（20mmtris-hcl,8murea,500mmnacl,500mmimidazole,ph8.0。将收集到的组分进行sds-page检测，将验证正确的含有目的蛋白mp的样品冻干保存。抗氧化能力分析抗氧化能力测定包括：dpph清除能力、超氧离子清除能力和羟自由基清除能力的ic50值见表１。清除能力的测定：将纯化出的抗氧化肽纯品溶液取0.5ml于干净ep管中，依次加入0.5ml去离子水和1.0mldpph溶液（2×10-4mol/l，dpph溶于无水乙醇），涡旋振荡2~4s混匀后在室温下避光放置反应30min，然后利用酶标仪测定取出适量混合液在517nm处的吸光值，即为样品组吸光值ai；在其它条件不变的情况下，与样品组相比，将0.5ml去离子水代替0.5ml抗氧化肽纯品溶液测得的吸光值即为对照组吸光值a0；同样，在其它条件不变的情况下，与对照组相比，将1.0ml95%乙醇代替dpph溶液的1.0ml测得的吸光值即为空白组吸光值aj；与此同时，每个处理步骤设置三个平行，最后dpph清除率(%)的公式计算结果表示为：抗氧化肽·dpph清除率（%）＝[1－(ai－aj)/a0]×100式中：a0-对照组吸光值；ai-样品组吸光值；aj-空白组吸光值。抗氧化肽dpph清除能力的ic50的确定：将上述抗氧化肽样品用去离子水稀释6个浓度梯度，并分别测其dpph清除率且每个梯度设置三个平行，然后以抗氧化肽浓度为横坐标dpph清除率为纵坐标做趋势线，最后利用趋势线的方程计算得出清除能力为50%的抗氧化肽纯度，即为抗氧化肽dpph清除能力的ic50。超氧阴离子清除能力的测定：将纯化出的抗氧化肽纯品溶液取0.2ml于干净ep管中，加入5.0mltris-hcl溶液（ph8.2），涡旋振荡2~4s混匀后在25℃水浴中保温放置10min，然后取出反应液并向其中加入0.2ml邻苯三酚溶液（3×10-3mol/l），最后利用酶标仪测定取出适量混合液在325nm处的吸光值（每30s读数一次，5min后结束），即为样品组吸光值ai，利用得到的数据作图计算出样品组邻苯三酚自氧化速率(δa/min)为v样品；在其它条件不变的情况下，与样品组相比，将0.2ml去离子水代替0.2ml抗氧化肽纯品溶液测得的吸光值即为对照组吸光值a0，同样计算可得对照组邻苯三酚自氧化速率(δa/min)为v对照；与此同时，每个处理步骤设置三个平行，最后样品对超氧阴离子抑制率(%)的公式计算结果可以表示为：抗氧化肽超氧阴离子抑制率（%）＝[1－v样品/v对照]×100%式中：v对照-对照组邻苯三酚自氧化速率(δa/min)；v样品-样品组邻苯三酚自氧化速率(δa/min)。抗氧化肽超氧阴离子抑制能力的ic50的确定：将上述抗氧化肽样品用去离子水稀释6个浓度梯度，并分别测其超氧阴离子抑制率且每个梯度设置三个平行，然后以抗氧化肽浓度为横坐标超氧阴离子抑制率为纵坐标做趋势线，最后利用趋势线的方程计算得出抑制能力为50%的抗氧化肽纯度，即为抗氧化肽超氧阴离子抑制能力的ic50值。3.还原力和·oh清除率的测定：将纯化出的抗氧化肽纯品溶液取1.5ml于干净ep管中，依次加入0.5mlfeso4溶液、0.5ml水杨酸-乙醇（3×10-3mol/l，水杨酸溶于无水乙醇）和0.5mlh2o2溶液（3×10-3mol/l），涡旋振荡2~4s混匀后在室温下放置反应30min，然后利用酶标仪测定取出适量混合液在510nm处的吸光值，即为样品组吸光值ai；在其它条件不变的情况下，与样品组相比，将1.5ml去离子水代替1.5ml抗氧化肽纯品溶液测得的吸光值即为对照组吸光值a0；同样，在其它条件不变的情况下，与样品组相比，将0.5ml去离子水代替水杨酸-乙醇的0.5ml测得的吸光值即为空白组吸光值aj；与此同时，每个处理步骤设置三个平行，最后·oh清除率(%)的公式计算结果表示为：抗氧化肽·oh清除率（%）＝[1－(ai－aj)/a0]×100式中：a0-对照组吸光值；ai-样品组吸光值；aj-空白组吸光值。抗氧化肽·oh清除能力的ic50的确定：将上述抗氧化肽样品用去离子水稀释6个浓度梯度，并分别测其·oh清除率且每个梯度设置三个平行，然后以抗氧化肽浓度为横坐标dpph清除率为纵坐标做趋势线，最后利用趋势线的方程计算得出清除能力为50%的抗氧化肽纯度，即为抗氧化肽·oh清除能力的ic50值。表1珍珠贝肉抗氧化肽（序列为gly-ala-gly-leu-pro-gly-lys-arg-glu-arg）和本发明的抗氧化肽（mp）的抗氧化活性测定结果antioxidantdpph清除活性(ic50,mg/ml)超氧自由基清除活性(ic50,mg/ml)羟自由基清除活性(ic50,mg/ml)mp0.056±0.0050.310±0.0080.126±0.006珍珠贝肉抗氧化肽0.132±0.0051.046±0.030.268±0.045本发明可用其他的不违背本发明的精神或主要特征的具体形式来概述。凡是依据本发明的实质技术对以上实施例所作的任何细微修改、等同变化与修饰，均属于本发明技术方案的范围内。序列表<110>中国水产科学研究院南海水产研究所<120>一种利用定点突变和分子修饰技术改造的珍珠贝肉抗氧化肽及其构建和制备方法<160>3<210>1<211>62<212>prt<213>珍珠贝肉抗氧化肽<400>1glyalaglyileproglylysarggluargasnglyglyalagly151015ileproglylysarggluarggluargasnglyglyalaglyile202530proglylysarggluargasnglyglyalaglyileproglylys354045arggluarggluargasnglyglyalaglyileproglylysarg505560gluarg62<210>2<211>174<212>dna<213>珍珠贝肉抗氧化肽<400>2ggtgcgggtatcccgggcaaacgcgaacgtaacggtggtgcgggtatcccgggcaaacgc60gaacgtaacggtggtgcgggtatcccgggcaaacgcgaacgtaacggtggtgcgggtatc120ccgggcaaacgcgaacgtaacggtggtgcgggtatcccgggcaaacgcgaacgt174<210>3<211>189<212>dna<213>密码子优化珍珠贝肉抗氧化肽基因<400>3aatggtggtgcgggtatcccgggcaaacgcgaacgtaacggtggtgcgggtatcccgggc60aaacgcgaacgtaacggtggtgcgggtatcccgggcaaacgcgaacgtaacggtggtgcg120ggtatcccgggcaaacgcgaacgtaacggtggtgcgggtatcccgggcaaacgcgaacgt180taactcgag189当前第1页12