专利名称：：利用25℃常温以改善高分子材料制作过程中所破坏物性、化性及生物相容性的干燥方法
技术领域：
：本发明有关于一种利用25℃常温以改善高分子材料制作过程中所破坏物性、化性及生物相容性的干燥方法，尤指一种25℃常温干燥的方法，以制造出更高品质的生医产品。
背景技术：
：在科技与医药蓬勃发展的年代，老化或意外可导致个别组织器官的机能衰退或损坏，因此组织器官的移植问题日益重要，然而，移植必须克服一些问题，包括组织器官的来源、移植后引发的免疫反应、以及道德问题等，因此人造的组织器官被人们寄以厚望，以弥补日益增加的组织器官修补需求。然而，新型的生医材料除了要改善材料的结构、机械性质、制造方法等，赋予其生物结构和生物功能；此外，也要解决类似组织器官移植后所面临的生物相容性问题，因此，如何提升生医产品的制造品质，以克服上述问题，才能使生医产品的移植更成功，此乃刻不容缓的。本发明人有鉴于此，累积从事此行业多年的经验，乃精心研究并再三测试改良，如今终于发明出一种利用25℃常温以改善高分子材料制作过程中所破坏物性、化性及生物相容性的干燥方法，而具有产业上利用的价值。
发明内容本发明的主要目的在于提供一种利用25℃常温以改善高分子材料制作过程中所破坏物性、化性及生物相容性的干燥方法，于高分子材料制程中，以25℃常温干燥方式，来改善高分子材料制造的品质，以使生医产品的移植更成功。为了便于审查员了解本发明的特性，首先介绍生医高分子材料(biomedicalpolymers)其中生医高分子材料，是指应用在生物医学的材料，包括合成高分子材料(syntheticpolymers)与天然高分子材料(naturalpolymers)；常用的合成生医高分子材料，有硅胶(siliconerubber)、聚乙醇酸(polyglycolicacid)、聚乳酸-甘醇酸(poly(glycolideco-lactide)，PLGA)等；常见的天然生医高分子材料，目前最具发展潜力的有胶原蛋白(collagen)、明胶(gelatin)、几丁质(chitin)、透明质酸(hyaluronicacid)等，现今制作支架(scaffold)的降解性合成高分子材料，仍然不是很理想，可能与其表面化学(surfacechemistry)性质有关，及其潜藏有免疫上的问题，包括降解的毒性反应(toxicreactions)与发炎反应(inflammatoryreactions)，因此，天然的高分子材料，已广泛地在组织工程中使用。其中天然生医高分子材料中的明胶明胶(gelatin)应用热变性或物理、化学降解方式，破坏胶原蛋白的三股螺旋结构，可得到明胶，明胶是一个具有生物可降解的(biodegradable)、生物可相容的(biocompatible)及有免疫耐受性的(nonimmunogenic)材料明胶大约由1000个胺基酸(aminoacids)所组合而成，其主要的胺基酸有甘胺酸(glycine)、脯胺酸(proline)、羧基脯胺酸(hydroxyproline)，明胶水溶液，在温度40℃左右，为溶胶状态(solstate)，冷却后形成物理上热可逆性的(thermoreversible)凝胶状态(solgel)，在溶胶转凝胶(gelling)的过程中，明胶分子链会从一个无序的构形，转变为一个有序的构形，而且倾向重新组合成胶原蛋白样的三股螺旋结构，明胶的抗原性较胶原蛋白低，价格也便宜，且容易取得；尽管如此，因为明胶的机械性质较差，使得它在生医材料上的应用，备受限制；因此，明胶必须藉由交联，来改善其热与机械性质，增强其抵抗酵素降解能力，及降低其抗原性(antigenicity)，若明胶的交联密度(cross-linkdensity)改变，则其溶涨(swelling)、热行为(thermalbehaviours)、及带电基团(chargedgroups)的数目，也会不同，明胶的交联方法有物理交联(Physicalcrosslinking)包括脱水加热(dehydrothermaltreatment)处理、紫外辐射(ultravioletirradiation)、伽码辐射(gammairradiation)等方式；化学交联(chemicalcrosslinking)由于明胶含有大量的侧链官能基(functionalsidegroups)，因此，可以很容易地经由化学方式来进行交联，常见的交联剂包括合成的交联剂(syntheticcrosslinkingreagents)有甲醛(formaldehyde)、戊二醛(glutaraldehyde)、双醛类淀粉(dialdehydestarch)，以及环氧化合物(epoxycompound)等；天然的交联剂(naturallycrosslinkingreagents)有绿栀子素(genipin)。关于明胶经由化学方式进行交联的天然交联剂绿栀子素的介绍绿栀子素栀子(GardeniajasminoidesEllis)，中药名Zhi-Zi，其煎剂(decoction)在中医(TraditionalChineseMedicine)被用来治疗温病(febrilediseases)、黄胆、急性结膜炎、流鼻血、呕血、血尿、化脓性感染及皮肤溃疡等；栀子也可以外用，治疗扭伤(sprains)及血瘀肿痛(painfulswellingsduetobloodstasis)，应用HPLC(high-performanceliquidchromatographic)的技术，从栀子的果实中萃取栀子甙(geniposide)，再以微生物Bacillussubtilisno.24中的β-glucosidase水解，可得到绿栀子素；绿栀子素可以和胺基酸或蛋白质自发性地反应(spontaneousreact)，形成深蓝色的色素(darkbluepigment)，明胶薄膜与高浓度的绿栀子素溶液交联，其最高的交联度(crosslinkingdegree)为85％左右；与最常被使用的交联剂戊二醛比较，当戊二醛浓度从0.1％增加到1％时，其交联度可从60％增加到大约100％，然而，绿栀子素交联的薄膜，在延展性(extensibility)、变性焓(enthalpyofdenaturation)，以及吸水溶涨性质(swellingproperty)等方面，与戊二醛交联的薄膜相近；但前者有较高的变性温度，表示前者有较大的温度稳定性，在细胞毒性(cytotoxicity)方面，绿栀子素远低于戊二醛(glutaraldehyde)；在基因毒性(genotoxicity)方面，戊二醛对细胞株Chinesehamsterovary(CHO-K1)的实验中，发现它可能会引起一个弱的诱发突变反应(clastogenicresponse)，而绿栀子素不会，先前的研究，以绿栀子素交联明胶的神经导管，在截断的大鼠坐骨神经(Sciaticnerve)的影响评估中，虽然神经再生得很成功，然而，再生神经外围紧密的疤痕组织(densescartissue)，很令我们担忧，这些组织，将来会对神经轴索(axon)产生压迫作用，会导致再生神经的坏死，而疤痕组织的形成，是伴随材料降解过程中，在快速发展(rapidprogress)的发炎反应(inflammatoryreaction)下产生的，因此，改善生医材料的制作品质，提高其生物相容性是很重要的。生医产品的制造品质与干燥方式在生医产品的制造程序中，干燥是其中的一个步骤，目的是当水分移除到最终浓度时，能够确保产品的预期品质，确保微生物的安定性(microbialstability)，和保证产品预期的存放期(shelflife)，干燥是一个复杂的过程，同时包含热传(HeatTransfer)、质传(massTransfer)及动量传递(momentumTransfer)等现象，虽然它是一个不起眼的步骤，却能够大大地影响生医产品制造的品质，例如在干燥过程中，材料表面过度地高热(highheat)，与过高的质传速率(masstransferrate)，会导致材料表层过热(overheating)或过干(over-drying)，而产生品质上的问题；Ikoma等以冷冻干燥处理生医材料，制造出一个独特的孔洞结构，以抵抗来自孔洞轴心方向的压力；Suh等以冷冻干燥，来处理胶原蛋白与玻尿酸组成的生医材料，发现干燥温度越低，所产生的孔洞越大，而天然高分子的生医材料，大部分为对热敏感的物质(heat-sensitivematerials)，在干燥过程中常遭受品质上的损失，包括色泽、组织结构等，因此低温干燥机(Lowtemperaturedryingmechanism)，已经被用来使产品品质的恶化达到最小。本发明提供了一种利用25℃常温以改善高分子材料制作过程中所破坏物性、化性及生物相容性的干燥方法，其步骤包括提供一高分子材料；以及利用一25℃常温干燥以改善高分子材料的制作过程。在本发明提供的一种方法中，其中，所述高分子材料为生医高分子材料。在本发明提供的一种方法中，其中，所述生医高分子材料包括合成高分子材料与天然高分子材料。在本发明提供的一种方法中，其中，所述天然生医高分子材料为明胶(gelatin)。在本发明提供的一种方法中，其中，所述明胶经由化学方式进行交联所使用的天然交联剂为绿栀子素(genipin)。在本发明提供的一种方法中，其中，所述明胶薄膜与高浓度的绿栀子素溶液交联，其最高交联度为85％左右。结果本发明使用天然高分子的生医材料明胶，与天然的交联剂绿栀子素交联，尝试以目前实验室最常使用的干燥方式干燥，并探讨其物理性质、化学性质、以及生物相容性等。本发明的结果，可以选择较适当的干燥方式，来制造出更高品质的生医产品。为使本发明的优点及特征更清楚可见，兹将以根据本发明的较佳实施例，并配合相关附件图式，详细说明如下。图1是本发明制备绿栀子素交联明胶的薄膜的实验流程图。图2是本发明茚三酮(Ninhydrin)与自由胺基反应，产生蓝紫色产物的化学分子图。图3是80℃烘箱的外观图。图4是华葆生技开发股份有限公司的25℃常温干燥机外观图。图5是大成仪器有限公司(HCSFD-5A2P，Taiwan)的冷冻干燥机外观图。图6是拉伸试片图。图7是拉伸试片的夹具图。图8是复水试片图。图9是制作复水试片的夹具图。图10是中断交联实验的标准曲线图。图11是以甘胺酸中断交联实验，薄膜的吸光值与时间关系图。图12是薄膜干燥的重量时间图。图13是烘箱干燥薄膜的横断面图(30倍)。图14是常温干燥薄膜的横断面图(30倍)。图15是冷冻干燥薄膜的横断面图(30倍)。图16是烘箱干燥薄膜的横断面图(1000倍)。图17是常温干燥薄膜的横断面图(1000倍)。图18是冷冻干燥薄膜的横断面图(1000倍)。图19是烘箱干燥薄膜的表面图(1000倍)。图20常温干燥薄膜的表面图(1000倍)。图21是冷冻干燥薄膜的表面图(1000倍)。图22是冷冻干燥薄膜的表面图(100倍)。图23是各成分的示差扫描分析图。图24是三种干燥方式，薄膜的示差扫描分析图。图25是三种干燥方式，薄膜的玻璃转换点温度与熔点图。图26是以烘箱干燥，薄膜的应力-应变图。图27是以常温干燥，薄膜的应力-应变图。图28是以冷冻干燥，薄膜的应力-应变图。图29是三种干燥方式，薄膜的应力一应变图。图30是以烘箱干燥，单一薄膜的应力-应变图。图31是以常温干燥，单一薄膜的应力-应变图。图32是以冷冻干燥，单一薄膜的应力-应变图。图33是薄膜复水的重量时间图。图34是薄膜复水的厚度时间图。图35是干燥后薄膜重量比率间的系图。图36是各成分的傅立叶红外线光谱仪分析图谱。图37是薄膜的傅立叶红外线光谱仪分析图谱。图38是成分的FT-IR分析图谱(指纹区)。图39是薄膜的傅立叶红外线光谱仪分析图(指纹区)。图40是自由胺基测定的标准曲线图。图41是不同干燥方式的薄膜的自由胺基测定图。图42是烘箱干燥薄膜皮下包埋，一周后的组织切片图(25倍)。图43是常温干燥薄膜皮下包埋，一周后的组织切片图(25倍)。图44是冷冻干燥薄膜皮下包埋，一周后的组织切片图(25倍)。图45是烘箱干燥薄膜皮下包埋，二周后的组织切片图(25倍)。图46是常温干燥薄膜皮下包埋，二周后的组织切片图(25倍)。图47是冷冻干燥薄膜皮下包埋，二周后的组织切片图(25倍)。图48是烘箱干燥薄膜皮下包埋，四周后的组织切片图(25倍)。图49是常温干燥薄膜皮下包埋，四周后的组织切片图(25倍)。图50是冷冻干燥薄膜皮下包埋，四周后的组织切片图(25倍)。图51是水的三相图。图52是烘箱及常温干燥的干燥方式图。图53是绿栀子素与明胶分子链交联键结图。图54是明胶分子链间的氢键图。图55是分子链间的交联与氢键形成图。具体实施例方式请参阅图1所示制备绿栀子素交联明胶的薄膜的实验流程图，本实验制备的绿栀子素交联明胶的薄膜10，若薄膜中含有游离态的绿栀子素，则在交联步骤完成后，至干燥步骤开始前的期间，游离态的绿栀子素可能进一步与明胶分子链交联键结，而使薄膜在干燥步骤之前，即因交联程度的变异，而影响实验的品质，因此，本研究以甘胺酸为中断交联剂，用以结合薄膜中的游离态绿栀子素，使游离态的绿栀子素，在交联后、干燥前，不再与明胶继续交联。为了确保甘胺酸有足够的量与时间，与大部分的游离态绿栀子素反应，本实验将交联后的薄膜，以1M的甘胺酸溶液浸泡，让甘胺酸扩散到薄膜中，在不同的时间点，取出部份薄膜，以茚三酮分析法(Ninhydrinassay)测其自由胺基量作图，在曲线趋于缓和的时间，即达饱和的时间，做为之后实验制作薄膜的依据。首先取300bloomnumber的明胶10g加入90ml的去离子水(deionizeddistilledwater)，将溶液加热至50-60℃使完全溶解均匀，再降温至30℃-31℃备用。再取0.5g的绿栀子素，加入99.5ml的去离子水，以超音波振荡助溶。将制备的10％明胶，搅拌加热，温度控制在50-60℃之间，取3ml的明胶水溶液，倒入底盘直径30mm的圆形培养皿(petridish)中，静置6个小时，让明胶薄膜冷却成型，再加入3ml的0.5％绿栀子素溶液进行交联，连续浸泡72小时后，以去离子水冲洗2次，去除绿栀子素溶液，即得绿栀子素交联明胶的薄膜。另取甘胺酸0.7544g加入去离子水至100ml，以磁石搅拌器搅拌至完全溶解均匀。再取1M甘胺酸溶液3ml，倒入30mm的圆形培养皿中，连续浸泡6、12、18、24、48、72、96、120、144、168小时后，依序风干，再以茚三酮分析法(Ninhydrinassay)测其吸光值。参阅图2所示茚三酮(ninhydrin)甘胺酸与自由胺基反应产生蓝紫色的产物的化学分子图，利用茚三酮(ninhydrin)与自由胺基反应，产生蓝紫色的产物Ruhemmann’spurple，在波长570nm，其吸光值与产物浓度成正比的关系，可以求得薄膜中自由胺基的量A液取1.05g柠檬酸(citricacid)、0.4gNaOH、0.04gSnCl2.2H2O置入血清瓶中，再加入去离子水25ml，以磁石搅拌器搅拌均匀。B液取1g茚三酮(ninhydrin)置入血清瓶中，再加入25ml乙二醇单甲醚(ethyleneglycolmonomethylether)，以磁石搅拌器搅拌均匀。将A液倒入B液中，以磁石搅拌器搅拌均匀。再取0.0188g甘胺酸置入试管中，再加入50ml去离子水，以超音波振荡助溶，配成5μmol/ml的甘胺酸溶液，再稀释成0-5μmol/ml的甘胺酸溶液，以供茚三酮分析(ninhydrinassay)中，求取标准曲线值时使用。稀释步骤为取5μmol/ml的甘胺酸溶液，体积分别为0、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100ml，分别置入各自的试管，再依序加入去离子水100、90、80、70、60、50、40、30、20、10、0ml，稀释成0、0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5μmol/ml的甘胺酸溶液。制备50％异丙醇(isopropanol)溶液再取异丙醇(isopropanol)体积50ml，置入血清瓶中，再加入50ml的去离子水，混合均匀，即得50％异丙醇(isopropanol)溶液。制作标准曲线取A、B液的混合液，各加入1ml于己稀释的0-5μmol/ml的甘胺酸试管中，再将试管置于加热器中，避光加热，温度100℃，时间二十分钟，使茚三酮(ninhydrin)与自由胺基充分反应。之后，取出试管，再各加入5ml的50％异丙醇(isopropanol)溶液稀释。最后，吸取试管中的稀释液，每一试管重复取样六次，每次滴150μl的稀释液，在96wellplate上的孔洞中，依序完成取样后，将plate置入MicroplateReader(ModelMRX，DynatechLaboratoriesInc.，Chantilly，Virginia，USA)中，在570nm波长下，测其吸光值，取平均值为y轴，甘胺酸浓度为x轴；再利用Excel求得回归方程式及R2(Rsquare)值。测薄膜的自由胺基量以绿栀子素交联明胶薄膜10，在以甘胺酸中断交联，室温干燥后，每片薄膜取三个样品，每一样品重约3mg，然后加入100μl的去离子水浸泡约1小时，使其充分膨润后，再各加入C液1ml于试管中，将试管置于加热器中，避光加热，使茚三酮(ninhydrin)与自由胺基充分反应。之后再各加入5ml的50％异丙醇(isopropanol)溶液稀释。再从各试管中吸取稀释液150μl的溶液六滴，分别滴入96wellplate的孔洞中，置入MicroplateReader，在波长570nm下，测其吸光值，取平均值为y轴，时间为x轴。以绿栀子素交联明胶薄膜10，再以甘胺酸中断交联20，经烘箱干燥(80℃)30、25度常温干燥(25℃)40及冷冻干燥(-20℃)50等不同干燥方式干燥后，干燥的薄膜，可供本研究做物理性质分析60、化学性质分析70及生物相容性实验80使用。制备绿栀子素交联明胶，甘胺酸中断交联的薄膜取将制备的10％明胶，以磁石搅拌器加热搅拌，温度控制在50-60℃之间，取19ml倒入底盘直径90mm的圆形培养皿中，静置6个小时，让明胶薄膜冷却成型，再加入19ml的0.5％绿栀子素溶液进行交联，连续浸泡72小时后，绿栀子素与明胶充分交联，交联后的明胶颜色由透明变成蓝紫色，以去离子水冲洗2次，再以1M甘胺酸溶液19ml，倒入培养皿中，连续浸泡二天，再以去离子水冲洗2次。薄膜以不同干燥方式干燥薄膜以烘箱干燥机(Oven，80℃)干燥30参阅图3所示，使用烘箱(Dryingoven)，固定风速，于恒温80℃下，来进行干燥，直到重量变化趋于稳定为止。薄膜以25℃常温干燥机(RTD，25℃)干燥40参阅图4所示，使用华葆生技开发股份有限公司，25℃常温干燥机(RTD，Roomtemperaturedryingmachine)，以控制稳定快速流动的出风量及湿度，于常温25℃下进行干燥，直到重量变化趋于稳定为止。薄膜以冷冻干燥机(Lyophilizer，-20℃)干燥50参阅图5所示，冷冻干燥过程，分为冷冻过程及干燥过程。先将薄膜放入-20℃的冰箱中冷冻一天，再置入冷冻干燥机中，进行冷冻干燥处理，直到真空度在200mtorr左右为止。一、物理性质(Physicalcharacteristics)1、干燥度测试(Filmsdehydration)61目的欲观察薄膜在干燥过程中，是否因干燥方式的不同，造成重量的变化有所不同；及其重量变化趋于缓和时，其干燥程度是否也不同。记录薄膜干燥的重量变化绿栀子素交联明胶的薄膜，以甘胺酸中断交联后，随机分配干燥方式。烘箱及常温干燥的薄膜，直接置入干燥机中，每隔一段时间记录重量一次。而冷冻干燥的薄膜，先将薄膜放入-20℃的冰箱中冷冻一天后，再置入冷冻干燥机中，每隔一段时间记录重量一次。干燥度的计算本实验的薄膜，在烘箱及常温干燥的干燥，为干燥至每天重量变化小于0.001g以下；而冷冻干燥则干燥至气压在200mtorr以下，纪录其重量，并以2、显微结构分析(MicrostructureAnalysis)---扫描式电子显微镜(scanningelectronmicroscope，SEM)观察62目的明胶薄膜，以绿栀子素溶液交联三天后，再浸泡在甘胺酸溶液二天，以不同干燥方式干燥后，以扫描式电子显微镜(HitachiS-3000NMicroscope)，观察并比较其表面形态，及其结构是否有差异。扫描式电子显微镜的观察经交联、中断交联的明胶薄膜，以不同的干燥方式干燥后，以扫描式电子显微镜，做表面及横断面的显微观察。以扫描式电子显微镜观察前，薄膜样品须以碳胶带，固定于载台上，再经离子覆膜器，在薄膜表面或横断面上，镀一层金膜，再送入扫描式电子显微镜中作观察。3、热分析(Thermalanalysis)----示差扫描分析仪分析63目的欲使用示差扫描分析仪(DifferentialScanningCalorimeter；DSC)分析比较，经不同干燥方式干燥后的薄膜，其热性质是否发生改变。各成分的DSC分析本实验组成薄膜的成分，明胶、绿栀子素及甘胺酸，取定量样品的粉末，置于小铝盘中，以DSC(SeikoSSC5200，Chiba，Japan)作热性质分析。藉由改变温度，当薄膜样品发生熔融、蒸发、结晶相转变等物理现象，或化学变化时，会产生能量变化，图谱中会出现吸热或放热带，进而可推测样品的性质。薄膜的DSC分析明胶薄膜，以绿栀子素交联，甘胺酸中断交联，经不同干燥方式干燥后，干燥的薄膜，取定量样品，置于小铝盘中，以DSC作热性质分析，比较不同干燥方式的薄膜，其玻璃转换点温度(glasstransitiontemperature，Tg)及熔点(melttemperature，Tm)，是否有差异。4、机械性质(Mechanicalproperties)---拉伸实验(Tensiontest)64目的本实验想探讨，明胶薄膜经绿栀子素交联，甘胺酸中断交联，在不同干燥方式干燥后，薄膜抵抗伸长变形的能力，及其断裂的特性，是否有差异。制作哑铃形试片参阅图6所示，以等比例放大1.5倍，绘制出本实验的哑铃形试片。本实验试片的制作，参阅图7所示系采用夹具两片，将薄膜置于夹具中间，将夹具四个角落以螺丝微微锁紧，以电动刻磨机来切割出本实验的哑铃形试片初型之后，再以3000号极细致砂纸修边，制得本实验的哑铃形试片。试片中央部份，其原长度为标距L0(gauge-length)，其原截面积为A0；若试片拉伸时，其长度为L1，其截面积为A1，则试片拉伸的伸长量为δ＝L1-L0。拉伸测试的应力-应变图(Stress-StrainDiagram)将干燥的薄膜，切割成哑铃形试片，使用弘达仪器股份有限公司(HungTaInstrumentCo.，LTD)的万能材料实验机(Micro-ComputerUniversalTestingMachine)来拉伸，荷重元(loadcell)为HT-8503*100kgf(ASTME4-04美国材料测试协会标准)。将试片置于试验机上，夹头位移速率为0.01mm/s，由试验机施予拉力(P)，拉伸至试片断裂为止，记录拉伸过程的电压与时间值，再转换算成力与伸长量，最后计算出应力(σ=PA)]]>与应变值(ϵ=δL0)]]>，由应力-应变关系图，可分析材料的特性。5、复水实验(Rehydrationtest)---复水的扩散系数65目的欲观察薄膜在复水过程中，是否因干燥方式的不同，造成复水后，重量及厚度变化有所不同；并求其扩散系数，探讨其扩散程度是否也不同。制作复水试片本实验试片为一直径三公分的圆形薄膜(如图8)，采用夹具两片(如图9)，将干燥的薄膜置于夹具中间，在夹具两端以螺丝微微锁紧，以电动刻磨机，切割出本实验的直径三公分的圆形薄膜，再以3000号极细致砂纸修边，制得本实验的圆形试片。试片复水将圆形试片，放入装有100ml的37℃生理食盐水的血清瓶中密封，将血清瓶置于恒温37℃的水浴槽中，每隔一段时间，将试片捞起，以拭镜纸拭干，秤其重量及测量厚度，再放回血清瓶中；实验过程中，随时补充血清瓶中的生理食盐水在100ml。薄膜复水的扩散系数使用平板(planesheet)的扩散方程式MtM∞=1-Σn=0∞8(2n+1)2π2exp{-D(n+12)2π2t/l2}]]>，对实验数据的质量与时间的关系做拟和(fitting)，可求出温度37℃时，薄膜的扩散系数。二、化学性质(Chemicalcharacteristics)701、傅立叶红外线光谱仪(FourierTransformInfraredSpectrometer，FT-IR)分析71目的以傅立叶红外线光谱仪(ThermoNicoletIR300Spectrometer，USA)的红外光对薄膜进行扫描时，薄膜中分子链各种不同的官能基，呈现各种不同的吸收，从而得到一张薄膜分子链中，各种不同的官能基的红外光吸收光谱。可用以比较薄膜经不同干燥方式后，薄膜中分子链的官能基的种类及数量是否有差异。各成分的傅立叶红外线光谱仪分析将薄膜的成分明胶、绿栀子、甘胺酸的粉末，各自与KBr放入研钵内研磨成细粉末状，置于锭剂模型中，以油压机压片制成锭片，再使用NicoletAVATAR320型(Madison，Wisconsin，USA)的霍氏转换-红外光谱仪，以减弱式全反射(ATR)方式量测，得各成分的傅立叶红外线光谱分析图。本实验的量测条件扫瞄次数64；解析度2cm-1；扫瞄范围4000～650cm-1。实验中，以KBr当背景的原因，为KBr在400cm-1至4000cm-1的范围内不会吸收，故不会干扰图谱。薄膜的傅立叶红外线光谱仪分析取直径0.5cm大小的薄膜，使用NicoletAVATAR320型(Madison，Wisconsin，USA)的FT-IR，以减弱式全反射(ATR)方式量测，得薄膜的傅立叶红外线光谱分析图。2、能量分散式光谱仪(EnergydispersiveSpectrometer，EDS)分析72目的以扫描式电子显微镜(HitachiS-3000NMicroscope)的能量分散光谱仪进行薄膜的化学成份分析，比较薄膜经不同干燥方式后，其成份是否有差异。以EDS的成份分析经交联、中断交联的明胶薄膜，以不同的干燥方式干燥后，以扫描式电子显微镜的EDS，作横断面的成份分析。以EDS分析前，薄膜样品须以碳胶带，固定于载台上，再经离子覆膜器，在薄膜横断面上，镀一层金膜，再送入扫描式电子显微镜中作分析。3、交联程度与自由胺基的测定73目的欲以茚三酮分析法(NinhydrinAssay)，来测量明胶薄膜以绿栀子素交联，经不同干燥方式干燥后，其交联程度是否有差异；并观察比较，明胶薄膜以绿栀子素交联，以甘胺酸来中断交联，经不同干燥方式干燥后，自由胺基含量是否有差异。做标准曲线取茚三酮分析(NinhydrinAssay)中的C液1ml，加入己稀释的0-5μmol/ml甘胺酸试管中，再将试管避光加热，使茚三酮(ninhydrin)与自由胺基充分反应，之后每只试管加入5ml的50％异丙醇(isopropanol)溶液稀释。每只试管重复试验六次，每只试管取6次150μl的稀释溶液，滴入96wellplate上，再置入MicroplateReader(ModelMRX，DynatechLaboratoriesInc.，Chantilly，Virginia，USA)中，在570nm波长下，测其吸光值。甘胺酸浓度为x轴，OD值取平均值为y轴，绘出茚三酮分析法(NinhydrinAssay)的标准曲线。交联程度的测定明胶薄膜以绿栀子素交联，经不同干燥方式干燥后，以茚三酮分析法(NinhydrinAssay)中的茚三酮(ninhydrin)，与薄膜中未交联的胺基反应，产生蓝紫色Ruhemmann’spurple的产物，在570nm波长，产物的吸光值。从吸光值(OD值)与自由胺基量成正比的关系，由固定指数计算公式Fixation-Index(%)=([NHNreactiveamine]fresh-[NHNreactiveamine]fiixed)[NHNreactiveamine]fresh100]]>可计算出固定指数(fixationindex)，此代表绿栀子素与明胶交联的程度。自由胺基的测定明胶薄膜以绿栀子素交联，以甘胺酸中断交联，经不同干燥方式干燥后，应用茚三酮分析法(NinhydrinAssay)测试，利用茚三酮(ninhydrin)与自由胺基反应，产生蓝紫色的产物Ruhemmann’spurple，在570nm波长的吸光值，与自由胺基量成正比的关系，可用来比较经不同干燥的薄膜间，其自由胺基是否有差异。三、生物相容性实验(Biocompatibility)80目的比较明胶薄膜以绿栀子素交联，以甘胺酸中断交联，经不同干燥方式干燥后，包埋于大鼠皮下，于一定时间，取下薄膜及周围的组织，以光学病理显微镜观察，并比较其生物相容性是否有差异。皮下包埋薄膜的制备明胶薄膜，以绿栀子素交联，甘胺酸中断交联，经不同干燥方式干燥后，取薄膜中央区域，切出0.5cm×0.5cm的正方形薄膜，每一种干燥方式六片。麻醉将大鼠置麻醉箱中，打开气体麻醉机(ForawickVaporizer，MuracoMedicalCo.，Japan)电源，麻醉剂Aerrane(Baxter，USA)的流量为5L/kg，min，待大鼠昏迷后，麻醉剂流量改为1.5-2L/kg，并将大鼠自麻醉箱中取出，大鼠口鼻套入输送麻醉剂的塑胶管中，给予持续的麻醉，使大鼠保持在麻醉状态。1、皮下包埋81大鼠在麻醉的状态下，以电动剃刀将大鼠背部的毛剃掉，于脊椎两旁1.5cm处，标记出要植入薄膜的位置，然后以Betadine(Mundipharma，Germany)进行消毒，以11号手术刀片划开0.5cm宽度的伤口，深度刚好至皮下，再以剪刀在皮下组织做钝性分离。将制备的薄膜，以随机号码方式，依序植入薄膜于大鼠背部，手术完毕后，将大鼠放回笼子中，并给予照光以维持体温。2、组织切片观察82分别在皮下包埋手术后的第一、二、四周，进行皮下包埋薄膜的组织切片采样。首先将大鼠置麻醉箱中，麻醉后，再将大鼠从麻醉箱中取出，置于手术台上，以空针打入2-3ml的空气到大鼠的心脏，待大鼠心脏停止跳动后，才以电动剃刀将大鼠背部的毛剃掉，进行组织切片手术。手术时，沿包埋薄膜周围约0.5公分距离，切下包埋处的皮肤、薄膜及皮下组织，放入装有7ml的10％中性缓冲的福尔马林溶液(neutral-bufferedformalinsolution)的瓶子中，固定三天后，取出组织切片置于石腊盘上，以11号手术刀片，切取中间区域的组织，以固体石蜡(paraffinwax)包埋，再以苏木精和曙红(hematoxylinandeosin)染色。3、光学病理组织的观察以光学显微镜(Olympus1×70，OlympusOpticalCo.Ltd.，Japan)观察组织切片的异物膜(foreignbodycapsule，FBC)、周围组织发炎反应情形及薄膜的降解型态。结果一、制备绿栀子素交联明胶的薄膜10本研究所制作的绿栀子素交联明胶的薄膜，是使用直径3.4cm及9cm规格的培养皿(dish)，制作出厚度3mm的深蓝色薄膜。实验发现，薄膜的颜色，大部分一致，呈现深蓝色、表面洁净的型态；但有少数几片，呈现淡蓝色，或出现菌落，这些薄膜，在本研究中均舍弃不用，以降低实验误差。二、中断交联20实验1、做标准曲线本实验利用茚三酮分析法(NinhydrinAssay)来测试。利用茚三酮(ninhydrin)与具有单胺基的甘胺酸反应，产生蓝紫色Ruhemmann’spurple的产物，在波长570nm，产物的吸光值，与甘胺酸浓度成正比的关系，可以求得标准曲线。本实验甘胺酸的浓度为0、0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5μmol/ml，每一浓度重复试验为六次，去除极大及小值，再求其平均值及变异数，之后再去除变异较大的浓度(表一)。表一标准曲线值，甘胺酸浓度与其相对应的吸光值作图时，甘胺酸浓度为X轴，吸光值的平均值为Y轴(如图10)。并以最小平方法，求取一条最具代表性的直线，称最适合线(best-fitline)或最小平方回归线(least-squaresregressionline)，并算出判定系数R2(CoefficientofDetermination＝1-(SSE/SST))，R2表示所有y值观察变异，可被y及x线性回归关系解释的比例；所以R2值愈近1，表示回归直线愈适合。2、甘胺酸中断交联实验将绿栀子素交联明胶的薄膜，浸泡在1M的甘胺酸溶液中一周，每天取部分的薄膜，以去离子水冲洗，在室温中干燥。在茚三酮分析法(NihydrinAssay)中，每一薄膜取三个样本，每一样本3mg左右，放入试管中，加水100ml膨润1小时，再以茚三酮分析法(NihydrinAssay)测得OD值(表二)。表二中断交联实验中，薄膜吸光值与时间关系在茚三酮分析法(NihydrinAssay)中，茚三酮(ninhydrin)与具有单胺基的甘胺酸反应，产生蓝紫色Ruhemmann’spurple的产物，在波长570nm，测其吸光值。利用线性回归模型，分析其吸光值与甘胺酸浓度成线性相关的程度。此外，在茚三酮分析法(NinhydrinAssay)中，其标准曲线，在甘胺酸浓度为0时，其吸光值应予以扣除校正(表三)。表三修正后的薄膜吸光值与时间的关系3、加测6、12、18小时的甘胺酸中断交联实验先配制茚三酮分析(NihydrinAssay)溶液，求其标准曲线值(表四)。表四加测的标准曲线值，甘胺酸浓度与其相对应的吸光值将绿栀子素交联明胶的薄膜，浸泡在1M的甘胺酸溶液中，分别在6、12、18小时，以去离子水冲洗，在室温中干燥。每一薄膜取三个样本，每一样本3mg左右，放入试管中，加水100ml膨润1小时，再以茚三酮分析法(NihydrinAssay)测OD值(表五)。表五中断交联实验中，加测的薄膜吸光值与时间关系同样的，在茚三酮分析法(NinhydrinAssay)中，其标准曲线，在甘胺酸浓度为0时，其吸光值应予以扣除校正(表六)。表六修正后，加测的薄膜吸光值与时间的关系4、整合后的甘胺酸中断交联实验整合表三与表六，可得到表七，再绘制成图11。表七修正、整合后，甘胺酸浓度与其相对应的吸光值以甘胺酸中断交联实验，薄膜的吸光值与时间关系图由该图中可知，在第二天时，曲线渐趋缓和，即薄膜自由胺基量，在第二天时渐趋缓和。三、薄膜的干燥1、烘箱干燥30烘箱干燥的薄膜，于恒温80℃下来进行干燥。干燥后的薄膜厚度最薄，且呈现平坦平光型态。2、25℃常温干燥40常温干燥的薄膜，于常温25℃来进行干燥。干燥后的薄膜，其厚度略大于烘箱干燥，且呈现平坦光滑型态。3、冷冻干燥50冷冻干燥的薄膜，须先放入-20℃的冰箱中冷冻一天，然后置于冷冻干燥机中，进行冷冻干燥处理。干燥后的薄膜，其厚度最厚，且呈现多孔化型态。四、物理性质分析601、薄膜的干燥薄膜干燥的重量变化绿栀子素溶液交联明胶薄膜三天后，再以甘胺酸溶液中断交联二天，经不同干燥方式干燥，纪录在不同时间点上，薄膜重量的变化(表八)。由薄膜干燥的重量时间图(如图12)，以烘箱干燥的干燥速率最快，常温干燥次之，而冷冻干燥最慢。表八薄膜干燥的重量时间表薄膜的干燥度烘箱及常温干燥，干燥至干燥曲线趋于和缓时，纪录其重量；而冷冻干燥，则干燥至气压在200mtorr以下时，纪录其重量，求其干燥度(表九)。表九薄膜的干燥度由表九中的干燥度，以烘箱干燥的干燥程度最高，常温干燥次之，冷冻干燥最低。2、扫描式电子显微镜(SEM)观察62薄膜截面的SEM观察烘箱干燥薄膜的SEM图(如图13)，横断面呈现起伏不平的波纹。而常温干燥的薄膜，横断面呈现平整的横断面(如图14)。冷冻干燥薄膜的SEM图(如图15)，横断面呈现多孔性。烘箱干燥薄膜的SEM图(如图16)，横断面在高倍数时，呈现熔融状态，高低起伏不平。常温干燥薄膜的SEM图(如图17)，横断面呈现平整。冷冻干燥薄膜的SEM图(如图18)，横断面呈现多孔性。薄膜表面的SEM观察烘箱干燥薄膜的表面SEM图(如图19)，呈现平整。常温干燥薄膜的表面SEM图(如图20)，亦呈现平整。冷冻干燥薄膜表面的SEM图(如图21、图22)，呈现多孔性。3、示差扫描分析仪分析(DSC)63各成分的DSC分析组成薄膜的成分，明胶、绿栀子素及甘胺酸，以DSC测量后，所得的DSC图谱(如图23)薄膜的DSC分析交联、中断交联的明胶薄膜，经不同干燥方式干燥后，以DSC测量后，得薄膜的DSC图谱(图24)。薄膜的玻璃转换点温度(Tg)与熔点(Tm)Tg可由曲线转折处的两条切线相交点决定；或者可由曲线转折所形成的step的上、下两切线，与垂直切线，相交点的中点决定。Tm可由曲线的最低点决定。由薄膜的DSC图谱中(图25)，在玻璃转换点温度方面烘箱干燥(80℃)薄膜的Tg为73.0℃，常温干燥(25℃)薄膜的Tg为43.0℃，冷冻干燥(-20℃)薄膜的Tg为59.0℃。在熔点方面烘箱干燥(80℃)薄膜的Tm为122.8℃，常温干燥(25℃)薄膜的Tm为91.7℃，冷冻干燥(-20℃)薄膜的Tm为99.6℃，且三者的熔融吸热峰，均呈一宽广的范围。4、拉伸实验64拉伸实验的应力-应变拉伸实验，烘箱干燥薄膜的应力-应变图(如图26)，断裂伸长率大，在拉伸过程会发生颈缩。常温干燥薄膜的应力-应变图(如图27)，降伏点不明显，只看到曲线上有较大弯曲部，伸长率很大，断裂强度尚高。冷冻干燥薄膜的应力-应变图(如图28)，其抗拉强度低、没有降伏点，断裂伸长率较其他两种干燥方式为低。将三种干燥方式薄膜的应力-应变图重叠(如图29)，在应力与应变成直线段，斜率的大小为烘箱干燥＞常温干燥＞冷冻干燥；表示外加一单位的应力时，以冷冻干燥的薄膜最易变形。拉伸实验的断裂能量在应力-应变曲线下的面积，为断裂能量(J/m3)。当断裂能量越高时，表示抵抗拉伸断裂的韧性越高。烘箱及常温干燥的单一薄膜应力-应变图(如图30、图31)，在伸长率相近且充分拉伸的条件下，常温干燥的曲线下面积(表4.10)，较烘箱干燥为大。冷冻干燥单一薄膜应力-应变图(如图32)，其曲线下面积(表十)，远低于烘箱干燥与常温干燥。单一薄膜应力-应变图，其曲线下面积(表十)的大小常温干燥＞烘箱干燥＞冷冻干燥；表示在拉伸断裂的韧性方面，常温干燥略大于烘箱干燥，且远大于冷冻干燥。表十单一薄膜的应力-应变图，曲线下的面积5、复水实验试片复水将圆形试片(表十二)，在100ml之37℃生理食盐水的血清瓶中复水，每隔一段时间，纪录其重量，并求其重量的变化量(表十一)；测量其厚度，并求其厚度的变化量(表十三)，然后绘制成图33、图34。表十一复水试片的重量变化量与时间关系表表十二复水前试片的原始重量及厚度表十三复水试片的厚度变化量与时间关系表薄膜复水的扩散系数65薄膜复水后，每隔一段时间，秤重一次，纪录重量与时间(表十四)。本实验质传数据，在短时间内(约四小时)，由复水数据的趋势来看，似乎已达到饱和，但长时间仍有增加，因此，本实验以质传时间四小时的数据点，作为饱和吸收时间点。由薄膜复水的重量时间表，可求得薄膜重量变化量与时间的关系(表十五)。表十四薄膜复水，其重量与时间关系表表十五干燥后，薄膜重量的变化量与时间的关系表<tablesid="table20"num="020"><tablewidth="481">1650.99751.17140.99991800.99551.18321.01781950.99691.19881.02662101.00041.2121.03772250.99931.22221.04922401.00251.22061.0471</table></tables>应用平板的扩散方程式MtM∞=1-Σn=0∞8(2n+1)2π2exp{-D(n+12)2π2t/l2}]]>质传模型以单一扩散系数(D值)做拟和。从薄膜重量变化量与时间的关系，可求得重量比率与时间的关系(表十六、图35)，藉由调整D值，使Mt与时间做图的曲线，与与时间做图的曲线拟和，可求得扩散系数(表十七)。表十六干燥后，薄膜重量比率与时间的关系表<tablesid="table21"num="021"><tablewidth="526">时间(分)烘箱干燥常温干燥冷冻干燥0000150.46330.40380.3594300.65260.54790.4948450.77240.65880.6144600.83580.72730.6912750.89210.79060.7665900.93130.84380.8174</table></tables>表十七由扩散方程式求得扩散系数五、化学性质分析701、傅立叶红外线光谱仪(FT-IR)分析71各成分的FT-IR分析薄膜的成分明胶、绿栀子及甘胺酸等，使用的FT-IR量测，得各成分的FT-IR图谱(图36)。薄膜的FT-IR分析干燥后的薄膜，以FT-IR量测，得薄膜之的FT-IR图谱(如图37)。在3000-3500cm-1处有强的吸收峰，是有机官能基O-H伸展振动的基频率。吸收峰越高，表示该有机官能基的吸收强度越强。由图37中，有机官能基O-H的吸收强度为冷冻干燥＞烘箱干燥＞常温干燥。由图36和图37比较，在2250-2350cm-1处有强的吸收峰，这段范围的光谱是受大气中二氧化碳与水气吸收的影响。薄膜的FT-IR分析图谱--指纹区各成分及薄膜的FT-IR分析图谱，在900-1800cm-1指纹区处(finger-printregion)(图38、图39)，予以放大比较，薄膜的FT-IR在指纹区的曲线，较近似各成分的FT-IR中明胶在指纹区的曲线。由图39的薄膜FT-IR在900-1800cm-1处的指纹区来看。在1690-1760cm-1处有强的吸收峰，是有机官能基C＝O伸展振动的基频率；1500-1600cm-1处有强的吸收峰，是有机官能基C＝C伸展振动的基频率；1690-1760cm-1处有强的吸收峰，是有机官能基C＝O伸展振动的基频率；1340-1470cm-1处有强的吸收峰，是有机官能基C-H伸展振动的基频率；1180-1360cm-1处有强的吸收峰，是有机官能基C-N伸展振动的基频率；1050-1300cm-1处有强的吸收峰，是有机官能基C-O伸展振动的基频率。由图39的薄膜FT-IR，吸收峰出现的位置呈现一致性。另外，吸收峰越高，表示该有机官能基的吸收强度越强。由图39来看，薄膜分子链的官能基的吸收强度为冷冻干燥＞烘箱干燥＞常温干燥。2、能量分散式光谱仪分析(EDS)72薄膜的横断面的EDS分析由表十八薄膜的横断面的能量分散式光谱仪分析表，元素碳(C)、氮(N)、氧(O)的比率，在烘箱干燥、常温干燥及冷冻干燥中，氧(O)的比率相近；但是在碳(C)、氮(N)的比率，有明显的不同。表十八薄膜的横断面的能量分散式光谱仪分析3、交联程度与自由胺基的测定73做标准曲线本实验利用茚三酮分析法(NinhydrinAssay)与具有单胺基的甘胺酸反应，产生蓝紫色Ruhemmann’spurple的产物，在570nm波长，产物的吸光值，与甘胺酸浓度成正比的关系，可以求得标准曲线。本实验甘胺酸浓度0、0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5μmol/ml，每一浓度重复实验六次，去除极大及小值，再求其平均值及变异数，去除变异较大的浓度(表十九)。表十九自由胺基测定的标准曲线中，甘胺酸浓度与其吸光值的关系作图时，甘胺酸浓度为X轴，吸光值的平均值为Y轴(图40)。并以最小平方法，求取一条最具代表性的直线，称最适合线或最小平方回归线，算出判定系数R2，R2表示所有y值观察变异，可被y及x线性回归关系解释的比例；所以R2值愈近1，表示回归直线愈适合。交联程度与自由胺基的测定本实验所测试薄膜的自由胺基量，分未交联、交联及中断交联三种。未交联部份，为未交联的明胶薄膜在室温干燥后，以锉刀研磨成粉，以茚三酮分析法(NihydrinAssay)所测得的OD值。交联部份，为绿栀子素交联明胶的薄膜，干燥后研磨成粉，所测得的OD值。中断交联部份，为绿栀子素交联明胶的薄膜，浸泡在1M的甘胺酸溶液中二天，干燥后研磨成粉，所测得的OD值(表二十)。表二十薄膜未交联、交联及中断交联的吸光值此外，在茚三酮分析法(NinhydrinAssay)中，其标准曲线，在甘胺酸浓度为0时，其吸光值应予以扣除校正(表二十一)，再由表二十一绘制成长条图(图41)。表二十一修正后的薄膜未交联、交联及中断交联的吸光值明胶薄膜以绿栀子素交联，经不同干燥方式干燥后，利用茚三酮分析法(NihydrinAssay)测得产物的吸光值(OD值)，经扣除修正后(表二十一)。利用吸光值(OD值)与自由胺基量成正比的关系，以下列方程式来计算固定指数(表二十二)。Fixationindex(%)=([NHNreactiveamine]fresh-[NHNreactiveamine]fiixed)[NHNreactiveamine]fresh100]]>由表二十二，固定指数以烘箱干燥最高(52.4％)，其次冷冻干燥(48.3％)，最后为常温干燥(44.4％)。六、生物相容性实验801、皮下包埋一周的组织切片明胶薄膜以绿栀子素交联三天后，以去离子水冲洗两次，再浸泡在1M的甘胺酸溶液中二天，经不同干燥方式干燥后的薄膜，随机包埋在Sprague-Dawley(SD)大白鼠皮下。一周后，取下包埋于皮下的薄膜及其周围组织，以甲醛(福马林)固定，石腊包埋后做成组织切片(图42、图46、图47)。从烘箱干燥、常温干燥及冷冻干燥组织切片比较，在异物膜厚度方面，冷冻干燥＞烘箱干燥＞常温干燥。2、皮下包埋二周的组织切片二周后，取下包埋于皮下的薄膜及其周围组织，制成组织切片(图45、图46、图47)。从烘箱干燥、常温干燥及冷冻干燥的组织切片作比较，在薄膜降解程度方面，三种干燥方式的薄膜降解程度相近。3、皮下包埋四周的组织切片四周后，取下包埋于皮下的薄膜及其周围组织，制成组织切片(图48、图49、图50)。比较三种干燥方式从烘箱干燥、常温干燥及冷冻干燥的薄膜降解形态。烘箱干燥的薄膜降解(图48)，薄膜横切面原本是长方形，降解后，横切面变为椭圆形；常温干燥的薄膜降解(图49)，薄膜横切面从原本是长方形，降解成横切面变为纺锤形；冷冻干燥的薄膜降解(图50)，薄膜横切面原本是长方形，降解后，横切面形状介于椭圆形跟纺锤形之间。讨论一、制备绿栀子素交联明胶的薄膜本实验的绿栀子素交联明胶薄膜的制作，是将加热搅拌的10％明胶水溶液，倒入直径3.4cm或9cm规格的培养皿(dish)中，室温静置成胶后，加入等体积的绿栀子素溶液进行交联。为了防止水分于交联过程中散失，将培养皿(dish)密封。实验发现，尽管水分没有散失，但因水分因蒸发，凝结附着于培养皿上盖内缘，使得同时间内，薄膜的交联程度略有变异，因而有少数几片薄膜，因交联程度较低，而呈现淡蓝色。本实验的薄膜，主成分为明胶。明胶为动物性蛋白质经分解后取得，为很好的细菌培养基，易受细菌作用而变质，因此，制备绿栀子素交联明胶的薄膜时，须在无菌操作台(Laminarflow)中操作，以降低薄膜被细菌污染，因而影响实验结果。二、中断交联实验1、做标准曲线本实验应用茚三酮分析法(NinhydrinAssay)来测试。因茚三酮(ninhydrin)与甘胺酸上的单胺基性毒气，实验操作时，须在抽气柜(fumehood)中执行，才不致于吸入过多有机溶剂。2、甘胺酸中断交联实验在茚三酮分析法(NinhydrinAssay)中，其标准曲线，在甘胺酸浓度为0时，其吸光值应予以扣除校正。因本实验配制B液时，部份茚三酮(ninhydrin)与乙二醇单甲醚(ethyleneglycolmonomethylether)作用，会形成淡蓝色的产物。在甘胺酸中断交联实验图，在第二天时，曲线渐趋缓和，表示薄膜中自由胺基增加速度，在第二天后渐趋缓和；长期观察，曲线仍然缓慢上升。又绿栀子素交联明胶的薄膜，在水中会水解，因此，薄膜以1M的甘胺酸溶液浸泡二天是合适的。三、薄膜的干燥1、烘箱干燥烘箱干燥的薄膜，厚度最薄，且呈现平坦平光型态，因烘箱干燥，其干燥程度最高，且在干燥过程中，其干燥温度大于其玻璃转换点温度，薄膜中长链分子的原子和分子链片段，处于不断的振动和滑动中，有助于增加高分子链间的相互作用，增加分子链间新氢键和凡得瓦引力(vanderWaalsforces)的形成；或提高绿栀子素与明胶分子链的交联程度，使侧枝键结增加，使三维网状结构增加。因此，烘箱干燥的薄膜，成为既干燥又紧密的薄膜；因几何结构改变，故表面色泽呈现平光型态。2、常温干燥常温干燥的薄膜，其厚度略大于烘箱干燥，且呈现平坦光滑型态，因常温干燥，是在25℃、一大气压下进行干燥，其干燥度仅次于烘箱干燥，又常温干燥的干燥温度，与交联、中断交联实验中的室温温度相近，且在玻璃转换点温度之内，分子链处于安定状态，因此，在干燥过程中，分子链间发生重新排组合的机率较少，所增加的侧枝键结也较少，故其三维的网状结构增加得也较少，薄膜的紧密程度，较烘箱干燥为低，几何结构改变较少。因此，薄膜干燥后，其厚度略大于烘箱干燥，其表面色泽较烘箱干燥为平坦光滑。3、冷冻干燥冷冻干燥的薄膜，厚度最厚，且呈现多孔化型态，因冷冻干燥过程，可分为冷冻过程及干燥过程，在冷冻过程中，因浓缩作用及压挤作用，造成薄膜的型态及物理性质发生改变。在浓缩作用方面在冷冻过程中，部分的水分，会渗出到薄膜表面上；部分的水留在薄膜中，结晶析出，因而造成溶质浓度提高，明胶的分子链距离缩短。如此，可能使游离态的绿栀子素，有机会进一步与明胶分子链交联键结，增加明胶分子链的侧枝键结；或有利于新氢键与凡得瓦引力的形成。在压挤作用方面冷冻过程中，水分结晶，体积膨胀，出现压挤作用，使薄膜的分子链间的距离，更加缩短，压密(compation)有利于分子链间新氢键与凡得瓦引力的形成。另外，在干燥过程中，抽真空造成干燥腔的减压作用，有助于薄膜在干燥过程中体积的维持，也使水分结晶能够快速升华，而形成多孔化结构。因此，冷冻干燥的薄膜，其厚度最厚，且呈现多孔化型态。四、物理性质分析1、干燥度测试薄膜的重量变化薄膜的重量变化，以烘箱的干燥速率最快，常温干燥的干燥速率次之，而冷冻干燥最慢。由水的三相图(图51)，烘箱及常温干燥，主要是藉由蒸发作用，来移走水分子；而冷冻干燥，主要是藉由升华作用，来移走水分子。干燥时，烘箱及常温干燥的薄膜，其内部的水分子，藉由扩散作用到达薄膜表面，再经表面蒸发作用，将水分子移走(图52)。而影响薄膜内部扩散作用的因子，包括薄膜的密度，薄膜的组织架构、聚合度，及内部水分移动的方向性；而影响薄膜表面蒸发作用的因子，包括温度、湿度、风向，及薄膜的形状和干燥机的干燥效率。烘箱干燥，干燥的温度控制在80℃，透过热空气回流，使薄膜的水分子吸收热量，汽化蒸发。而常温干燥，干燥的温度控制在25℃，通过控制风速及气流方向，使产生类似自然风的效果，有利于水分子汽化蒸发。烘箱及常温干燥机内，均有气流，水分子容易被干燥的气流带走，薄膜表面上的空气，很难达到饱和点，水分子可以不断地蒸发出去。当干燥的温度越高，速度大的水分子就越多，水分子的平均动能提升，有利于水分子从薄膜中逸出。另外，当干燥温度升高时，水分子和聚合物的分子链间的引力，会因而逐渐降低，也有利于水分子从薄膜中逸出。因此，烘箱干燥的干燥速率，会较常温干燥为快。冷冻干燥，是靠冰的升华，其内部并无扩散作用。干燥时，先由薄膜表面的冰开始升华，再循序渐进地，升华至薄膜内部的冰，直到干燥完成为止。故其干燥速率最慢。干燥度薄膜的干燥度，以烘箱干燥的干燥程度最高，常温干燥次之，冷冻干燥最低。薄膜中的水分，可分为游离水(freewater)及结合水(boundwater)。游离水是附着于薄膜表面或裂隙中的水；结合水是在薄膜中以氢键结合的水，而干燥主要是移走游离水。随着干燥过程的进行，薄膜内部的水分，移动到薄膜表面的速度，小于薄膜表面水分汽化的速率，造成薄膜表面出现干燥区，最后薄膜表面全部干燥，形成干燥层，汽化面逐渐向薄膜内部移动，汽化所需的热量，必须通过干燥层，才能传递到内部的汽化面；而从薄膜中汽化的水分，也必须通过干燥层，才能传递到薄膜表面。干燥过程继续进行，热量及水分传递的途径不断地加长，薄膜中的游离水已被排尽，接下去所汽化的是各种形式的结合水，此时，平衡蒸汽压逐渐下降，干燥速率也随之降低，最后干燥速率降为零。由基本的能量平衡方程式能量输入＝能量输出+累积的能量来看，对薄膜输入能量的大小，依序为烘箱干燥(80℃)＞常温干燥(25℃)＞冷冻干燥(-20℃)。故烘箱干燥，较常温干燥及冷冻干燥，能够克服干燥层，及热量及水分传递途径的加长，使薄膜中的游离水蒸发完全，甚至能够汽化部分结合水，故其干燥程度较常温及冷冻干燥为高。2、扫描式电子显微镜(SEM)观察薄膜截面SEM观察制作横断面的薄膜样品时，若在室温中，直接将干燥的薄膜折断，易因材料干燥度低或人为因素，造成横断面塑性变形，而无法观察到薄膜真正的显微结构，因此，本实验应用液态氮处理薄膜，使薄膜变得又硬又脆，再以镊子挟住两端，将其折断，再以电子显微镜观察。烘箱干燥薄膜的SEM图，横断面呈现起伏不平的波纹。在高倍数时，呈现熔融状态，高低起伏不平；不像常温干燥薄膜，横断面平整。显示烘箱干燥的薄膜，可能因其干燥温度高于玻璃转换点温度，干燥过程中，历经变性(denaturation)与复性(renaturation)，使分子链间侧枝键结增加，形成三维的网状结构，聚合度增高，故较能克服空间障碍，故能呈现出起伏不平的结构。常温干燥，水分在薄膜中，由中间往两边扩散，呈现梯度分布，中间保有较多水分，两侧较少。当以液态氮处理后，薄膜中间水分结晶，体积膨胀，使得结构变得较松散，以镊子挟住两端折断时，薄膜易中裂。冷冻干燥薄膜的SEM图，由横断面的结构来看，微细冰粒升华后，所遗留的孔洞形状，近似圆锥状，靠近薄膜中间端，孔洞较宽平；靠近薄膜两侧边缘，孔洞较尖小，表示靠近薄膜中间的水分较多，结晶较大，产生的挤压作用较强；薄膜两侧边缘有孔洞与外界相通，表示微细冰粒是由中间往两边升华。薄膜表面SEM观察烘箱干燥薄膜及常温干燥薄膜的表面SEM图，在高倍数时，均呈现平整；冷冻干燥薄膜的表面SEM图，在高倍数时，则呈现多孔性的横断面。冷冻干燥的薄膜，表面的SEM图与横断面的SEM图比较，发现，表面SEM图较横断面SEM图平整且孔洞较小，可能因为冷冻过程，微细冰粒的形成方向，为从薄膜表面开始，往薄膜中心进行；中心的水分析出，无法外渗至薄膜表面，故越往薄膜中间，形成的微细冰粒也就越大。而常温干燥的薄膜，其表面与横断面的SEM图，均呈现平整型态，可能与其干燥的温度，与交联、中断交联实验的室温温度相近，且其温度小于其玻璃转换点温度，分子链间处于安定状态，发生重新排列组合的机率较少，故干燥后，薄膜内外的结构变化较小，表面与横断面均呈现平整的结构。3、示差扫描分析仪(DSC)分析各成分与薄膜的DSC图分析比较由各成分与薄膜的DSC图分析比较，薄膜的DSC曲线，较近似各成分中明胶的DSC曲线，显示明胶对薄膜的DSC图贡献较大。薄膜的DSC分析由薄膜的DSC图中，不同干燥方式的薄膜，其玻璃转换点温度(Tg)及熔点(Tm)的大小为烘箱干燥((Tg；Tm)＝(73.0℃；122.8℃))＞冷冻干燥(59.0℃；99.6℃)＞常温干燥(43.0℃；91.7℃)。本研究的主成分明胶，是胶原蛋白经过热变性(thermaldenaturation)或化学变性(chemicaldenaturation)后，将胶原蛋白中的三股结构破坏，形成所谓的明胶。在高温时(＞40℃)，10％明胶溶液为水溶液状态，此时，明胶分子链的动能非常高，如果将其快速冷却下来，明胶分子链会联结成三股结构，形成胶原蛋白；但当温度降至玻璃转换点温度时，明胶分子链的联结会停止；因此，在室温中冷却下，仍有部分的明胶仍维持单股型态。因此，未交联的明胶是很好的结晶性材料，熔融时粘滞性低，容易流动，因不具有大的侧基、侧枝或交联的聚合物。但若以绿栀子素与明胶进行交联，则侧枝的键结形成，当温度升高至玻璃转换点温度时，侧枝的键结，将会阻止分子链间的滑动，结果，交联的分子链就变成不熔化、不溶解的不定形结构。因此，本实验的薄膜为具有部分结晶(semi-crystalline)、部分玻璃态不定型(glassyamorphousphase)的高分子，故在熔点方面，没有真正的熔点，熔融的吸热峰，会呈现一宽广的范围。而玻璃转换点温度，为高分子聚合物在升温时，从玻璃态固体转变为橡胶态的相变时的温度。而熔点，为在特定温度下，物质的固、液相平衡的温度。在玻璃转换点温度或熔点，分子链间要产生滑动、移动，必须克服分子链间的作用力，包括氢键和凡得瓦引力。其中凡得瓦引力的大小，与分子链的大小有关。本实验中，烘箱干燥(80℃)的薄膜，其玻璃转换点温度及熔点最高。从微观来看，烘箱干燥(80℃)，其干燥温度，略高于玻璃转换点温度(73.0℃)，明胶分子链中的原子和明胶分子链片段，不断的振动和滑动，经变性后，使分子链间的作用力增加，新氢键与凡得瓦引力形成；或增加交联键结，扩展其侧枝键结，形成更庞大的三维网状结构。如此，分子链长度、氢键数目、交联程度等的增加，能够进一步提高分子链间的作用力，故其玻璃转换点温度及熔点，为三种干燥方式中最高。常温干燥(25℃)与冷冻干燥(-20℃)的薄膜，其干燥温度均小于其玻璃转换点温度，分子链处于安定状态，因此，发生分子链重新排列组合的机率较小。但冷冻干燥(-20℃)，在冷冻过程中，因浓缩作用及压挤作用，使分子链间的距离缩短。在浓缩作用方面冷冻过程中，胶质状的薄膜，水分会由薄膜表面渗出，造成溶质浓度提高；同时在薄膜中，也会因水分结晶析出，而造成溶质浓度的提高，使得分子链间的距离缩短。在压挤作用方面水分结晶，体积膨胀，产生压挤作用，使分子链间的距离更加缩短。如此，分子链间距离大幅缩短，有利于新氢键与凡得瓦引力的形成，有利于交联程度的提升，因而使分子链间的作用力增加，故其玻璃转换点温度及熔点，略高于常温干燥(25℃)。常温干燥(25℃)的薄膜，其干燥温度小于玻璃转换点温度，分子链处于安定状态，分子链间的发生重新排列组合的机会较少。因此，干燥过程对分子链间作用力的改变较小，故其玻璃转换点温度及熔点，为三种干燥方式中最低。4、拉伸实验制作哑铃形试片制作哑铃形试片时，将薄膜置于夹具中间，以电动刻磨机切割，以3000号极细致砂纸修边，修边方向须与试片平行，若修边方向与试片垂直，易使平行边缘出现细微裂缝或呈现锯齿状，而影响拉伸的品质。拉伸实验的应力-应变图与曲线下的面积从烘箱干燥薄膜的应力-应变图，其最大抗拉强度最高，断裂伸长率较大，在拉伸过程中会发生颈缩。常温干燥薄膜的应力-应变图，其最大抗拉强度次高，降伏点不明显，断裂伸长率较大。冷冻干燥薄膜的应力-应变图，其最大抗拉强度最小，没有降伏点，断裂伸长率较小。由表二十三应力-应变曲线的五种类型，烘箱干燥薄膜的应力-应变图，较类似“强而韧”型，可能因其干燥程度、聚合度、交联度较其他两种干燥方式为高，侧枝键结较多，形成的三维的网状结构较强，在弹性范围内，当外加一单位的应力时，其变形程度最低，抗拉强度最强。当薄膜缓慢地被拉伸时，分子链渐渐地被拉直，当拉伸超过最大抗拉强度之后，因为较强抗拉强度的侧枝键结结构，被破坏较多，分子链间的作用力，不足以抵抗拉伸所造成的变形，因而截面积缩小，局部变形，产生颈缩现象。又应力-应变曲线下的面积，反映出材料拉伸断裂韧性的大小，本实验中，烘箱干燥应力-应变曲线下的面积，略低于常温干燥的薄膜，因其交联度较高，侧枝键结较多，形成的三维的网状结构较强，使其韧性相对的减小。常温干燥薄膜的应力-应变图，较类似“软而韧”型，可能因其干燥程度略低烘箱干燥，氢键键结的水分子彼此互斥，加大分子链间的距离，为分子链提供了运动空间；又其干燥温度小于玻璃转换点温度，分子链重新排列组合的机率较少，因此，干燥过程对聚合度及交联程度的提升有限，分子链间的侧枝键结，增加得也比较少，分子链间的滑动的阻力较少。故在弹性范围内，当外加一单位的应力时，其变形程度较烘箱干燥大，抗拉强度较烘箱干燥小。当薄膜渐渐被拉伸时，分子链逐渐地被拉直，分子链间交联的侧枝键结，也逐渐地被破坏，分子链进行重排，分子链间的作用力变得显著起来，有助于抵抗进一步的变形，故其韧性较烘箱干燥高，且在被充分拉伸时，能呈现出较高的抗拉强度。冷冻干燥薄膜的应力-应变图，较类似“硬而脆”型。因冷冻干燥历经冷冻过程及干燥过程。在冷冻过程中，压挤作用，来自水分结晶，体积增加，造成薄膜内部的压挤，形成多孔化型态；加上在干燥过程中，抽真空，造成干燥腔的减压作用，使薄膜多孔性结构得以维持，如此，使薄膜结构严重地被破坏，特别是不同胶原蛋白样的三股螺旋(collagen-liketriplehelix)间的交联被破坏，使抗拉强度大大地减少。另外，冷冻过程中的浓缩作用，水分的析出，使溶质浓度增加，分子链间的距离缩短，有助于新氢键与凡得瓦引力的发生，使抗拉强度提升，尽管如此，仍无法弥补因结构破坏，所造成的抗拉强度减损，与抵抗拉伸断裂时的低韧性。另外，冷冻干燥的干燥度最低，氢键键结的水分子彼此互斥，加大分子链间的距离，为分子链提供了运动空间，因此，在弹性范围内，当外加一单位的应力时，其变形程度最大，抗拉强度最弱。表二十三聚合物材料应力-应变曲线的五种类型5、复水实验制作复水试片制作圆形复水试片时，将干燥的薄膜置于夹具中间，以电动刻磨机切割出圆形，以3000号极细致砂纸修边，修边方向须沿试片圆周的切线方向，若修边方向与切线方向垂直，则易使平行边缘出现细微裂缝，或呈现锯齿状，而影响复水试片的品质。试片复水在薄膜复水实验中，从重量与厚度的时间图上，当曲线趋于缓和时，其重量与厚度的增加量，大小依序为常温干燥＞冷冻干燥＞烘箱干燥。在复水的重量时间图上，烘箱干燥的曲线，较其他两种干燥方式的曲线，先趋于缓和，表示烘箱干燥的薄膜，最先达到饱和。当水分子进入薄膜后，水分子与分子链中的NH、CO及OH等官能基，形成新的烘箱干燥的薄膜，因其聚合程度大，交联程度大，结构紧密，水分子间的互斥力，较分子链间的键结强度小，无法使分子链间的距离增加太多，故复水后，其重量及厚度的增加较少，达到饱和的时间较短，故其扩散系数也较常温干燥为大。常温干燥(25℃)的薄膜，其干燥温度小于玻璃转换点温度，分子链处于安定状态，分子链间的发生重新排列组合的机会较少，故其侧枝键结增加得较少，形成的三维的网状结构较少，因此，当水分子进入薄膜后，氢键键结的水分子，所产生的互斥力，较能克服分子链间的作用力，使其距离加大，因此，薄膜结构较能回复，且较慢达到饱和，故其扩散系数较烘箱干燥略小，但其复水后的重量及厚度相对地增加较多。冷冻干燥的薄膜，冷冻过程中的浓缩与压挤作用，使分子链间的距离缩短，有助于新氢键与凡得瓦引力的形成、交联键结反应的增加，使其侧枝键结增加，形成较多之三维的网状结构，限制其结构恢复的能力。因此，当水分子进入薄膜后，其结构的回复，较常温干燥(25℃)的薄膜困难，故其重量及厚度的增加量只能居中。又冷冻过程中的压挤作用，及干燥过程中的减压作用，使干燥后的薄膜，表面及横断面均呈多孔性结构，故水分进入薄膜后，易留在孔洞中，而孔洞内的水，并非完全经由扩散吸收，且无法经由薄膜表面的擦拭去除，故其扩散系数高出其他干燥方式一个数量级。五、化学性质分析1、傅立叶红外线光谱仪(FT-IR)各成分与薄膜的FT-IR图谱比较由各成分及薄膜的FT-IR图谱比较，薄膜的FT-IR图谱上的曲线，较近似各成分中明胶的FT-IR图谱上的曲线，表示明胶对薄膜的FT-IR图谱贡献较大。由能量与频率的方程式E＝hv(E为能量，h为浦郎克常数，v为频率)，可利用FT-IR测出化合物的振动频率。又O-H键的频率和质量的关系(方程式5.2)如下v=12πc(κMoMHMOMH)12]]>(v＝O-H键的振动频率(单位为cm-1)，c＝光速(cm/sec)，κ＝O-H键的力常数(dyne/cm)，MO，MH分别为O及之质量(g))O-H键在没有氢键形成的情况下，其v值大约为3600cm-1。当氢键形成时，O-H键上的H，与另外的原子(N或O)键结形成氢键，减弱原来的O-H键，使其力常数κ减弱，由方程式5.2可知，v值也会随之降低，且其减弱的程度，随其键结形成氢键的原子而有所不同，通常在3200cm-1附近，故由O-H键振动频率的降低，可预测氢键的存在。本实验中，薄膜的FT-IR图谱，在3300cm-1处有强的吸收峰，表示O-H键有氢键形成。薄膜的FT-IR图谱中，在3300cm-1处，冷冻干燥的吸收强度最高。可能因冷冻过程中，水分结晶，形成多孔性结构，加上干燥过程中的减压作用，使薄膜多孔性结构得以维持。如此，几何结构的改变，使其总表面积，较其他两种干燥方式高出许多，故在单位面积范围内，所呈现的薄膜表面积较大，暴露的O-H键较多；另外，因其干燥度较低，水分较多，故其O-H键较多，形成的氢键也较多，故在3300cm-1处，其吸收强度较其它两种干燥方式为强。虽然烘箱干燥的干燥程度，较常温干燥略高，薄膜中的水分较少，O-H键的红外线吸收强度，理当较小；但从薄膜的FT-IR图谱中，在3300cm-1处的红外线吸收强度，烘箱干燥略高于常温干燥。可能因烘箱干燥的薄膜，于干燥过程中，其分子链片段，发生重新排列组合，分子链间的氢键键结形成增加，因而使其吸收强度略高于常温干燥的薄膜。薄膜的FT-IR图谱一指纹区各成分及薄膜的FT-IR图谱，在900-1800cm-1的指纹区处作比较，薄膜的FT-IR图谱在指纹区的曲线，较近似各成分的FT-IR图谱中明胶的曲线，表示在指纹区中，明胶对薄膜的FT-IR图谱贡献较大。指纹区的吸收峰对于鉴别官能团的意义不大，但对整个分子的特征却是有帮助的。因此，指纹区可显示分子结构的微细差异，即表示不同的材料，在此区域会有其独特的吸收带出现，有如指纹的独特不可重复性。由指纹区薄膜的FT-IR图谱，比较三种干燥方式的薄膜FT-IR图谱，其吸收峰出现的位置呈现一致性，显示三者组成薄膜的分子官能基一致。由图谱中，红外线吸收强度的高低，冷冻干燥与烘箱干燥相近，且远高于常温干燥。若FT-IR的图谱，Y轴往上，表示薄膜吸收红外线的程度；则Y轴往下，表示红外线穿透薄膜的程度。冷冻干燥可能因其干燥度较低，水分较多，故吸收较多的红外线，使红外线穿透度下降；而烘箱干燥薄膜，因其聚合程度与交联程度较高，红外线穿透不易，故其穿透度较常温干燥薄膜为低。2、能量分散式光谱仪(EDS)分析薄膜的横断面的EDS分析由薄膜的EDS分析，主要元素碳(C)、氮(N)、氧(O)的比率，在烘箱干燥、常温干燥及冷冻干燥中，氧(O)的比率相近；但是在碳(C)、氮(N)的比率，有明显的不同。从的比率，烘箱干燥、常温干燥及冷冻干燥分别为及的比率以冷冻干燥最少，烘箱干燥次之，常温干燥最高，其原因讨论如下。薄膜中分子链间的交联键结与氢键键结明胶与绿栀子素的交联键结，其分子结构像梯子(如图53)。梯子侧边的扶手，由明胶的N-C-C组成骨架；梯子的踏板，由两个绿栀子素串联组成，连结于两侧骨架上的氮(N)元素。明胶分子链间的氢键键结，其分子结构也像梯子(如图54)。梯子两侧的扶手，由分子链N-C-C所组成；梯子中间一条条的踏板，由C＝O键结上的氧(O)与N-H键结上的氢(H)相互配对而成。交联的分子链间新增氢键键结烘箱干燥(80℃)干燥的薄膜，其干燥温度大于其玻璃转换点温度，薄膜中的长链分子的原子和分子链片段，处于不断的振动和滑动中，分子链处于不安定状态，使胶原蛋白样的三股螺旋，历经变性与复性。从微观来看，若有两股分子链为部分交联键结(如图55)，当坎入小片段的分子链片段，分子链间以氢键键结时，其的比率将会降低。举例说明图55的绿色框中，为绿栀子素与明胶分子链的交联键结，其骨架的的比率为；若在未交联部位，坎入一段未交联分子链片段，则骨架的的比率，将从原来的降为冷冻干燥薄膜，在冷冻过程中，浓缩作用，水分子渗出薄膜表面结晶，或在薄膜内部结晶，均会增加溶质的浓度，有机会使明胶分子链交错重叠，彼此互相靠近。在冷冻过程中，压挤作用，水分结晶体积增加，对薄膜内部产生压挤，使交错重叠的明胶小片段更加紧密；而多孔化型态，总表面积大幅增加，使暴露出来的交错重叠的明胶小片段增加。因此，明胶分子链交错重叠，犹如烘箱干燥薄膜的部分交联的两股分子链，滑入一小片段的分子链一样，使的比率降低，故冷冻干燥(-20℃)薄膜的比率之下降，会较常温干燥及烘箱干燥薄膜更大。3、交联程度与自由胺基的测定交联程度的测定从吸光值(OD值)与自由胺基量成正比的关系，计算干燥后绿栀子素交联明胶的固定指数。烘箱干燥最高(52.4％)，其次冷冻干燥(48.3％)，最后为常温干燥(44.4％)。烘箱干燥薄膜在80℃的温度下干燥，其温度较交联实验的室温(15-24℃)高出很多，故反应物间的运动速率较大，在单位时间内碰撞次数较多，碰撞时所具有的能量较大，使原来的交联反应更趋完全，故其交联的固定指数较高。冷冻干燥的薄膜，历经冷冻过程及干燥过程。在冷冻过程中，压挤作用，来自水分结晶，体积增加，对薄膜内部产生压挤，使分子链间的距离缩短；又水分结晶升华后，在干燥过程的减压作用下，使多孔化型态能够维持。冷冻过程中，浓缩作用，来自冷冻过程中，水分结晶或水分渗到薄膜表面，使溶质浓度增加，分子链间的距离缩短，分子链间的交互作用增加，有机会使交联程度提升，故其固定指数较次高。常温干燥薄膜，在25℃的温度下干燥，其温度小于玻璃转换点温度，故其分子链处于安定状态，较少重新排列组合。故常温干燥的干燥过程，对交联程度的提升较少，故其固定指数较烘箱干燥及冷冻干燥干燥的薄膜为低。测薄膜交联、中断交联后的自由胺基量本实验的薄膜，为绿栀子素交联明胶的薄膜，浸泡在1M的甘胺酸溶液中，再经不同干燥方式干燥。实验中的甘胺酸，主要用来与薄膜中自由态的绿栀子素反应，中断薄膜中自由态的绿栀子素，于干燥过程中，进一步与明胶分子链交联键结。本实验中以1M的甘胺酸溶液浸泡二天，使甘胺酸充分扩散入薄膜中。利用吸光值(OD值)与自由胺基量成正比的关系，测其吸光值，用以比较不同干燥方式的自由胺基量。测量结果，吸光值大小为常温干燥(3.243)＞烘箱干燥(2.393)＞冷冻干燥(2.364)。本实验的自由胺基量，主要来自甘胺酸的贡献。烘箱干燥的薄膜，其聚合度及交联程度较高，不同胶原蛋白样的三股螺旋间侧枝键结较多，形成较紧密的三维网状结构，故甘胺酸在茚三酮分析法(NinhydrinAssay)中，由薄膜中扩散出来不易，故所测得的自由胺基量较少。冷冻干燥薄膜，在冷冻过程中，浓缩作用，造成溶质浓度提高，使分子链彼此靠近。压挤作用，迫使分子链间的距离缩短。因此，分子链间的距离变短，有利于新氢键与凡得瓦引力的形成，及交联键结的增加，因而甘胺酸在茚三酮分析法(NinhydrinAssay)中，由薄膜中扩散出来的较不容易，故测得的自由胺基量亦较少。常温干燥(25℃)的薄膜，其干燥温度小于其玻璃转换点温度，分子链处于安定状态，故在干燥过程中，分子链发生重新排列组合的机率较小，侧枝键结的增加也较少，故其溶涨能力较其它两者为强，因而在茚三酮分析法(NinhydrinAssay)中，甘胺酸较易由薄膜中扩散出，故测得的自由胺基量较多。六、生物相容性实验1、皮下包埋一周的组织切片皮下包埋一周后，烘箱干燥、常温干燥及冷冻干燥组织切片比较，在异物膜厚度方面，冷冻干燥＞烘箱干燥＞常温干燥。表示在皮下包埋一周后，冷冻干燥薄膜引起的免疫反应较其他两种干燥方式激烈，烘箱干燥薄膜引起的免疫反应居中，常温干燥薄膜引起的免疫反应相对较低。本研究的主成分明胶，在高温时(＞40℃)，10％明胶溶液为水溶液状态，明胶分子链的动能非常高，如果将其快速冷却下来，明胶分子链会联结成三股结构，形成胶原蛋白；但当温度降至玻璃转换点温度时，明胶分子链的联结会停止，仍保有部分的明胶仍维持单股型态。而胶原蛋白免疫反应最强烈的部分，在三股螺旋两端非螺旋的结构，即N端及C端。因为在冷冻过程中，水分结晶体积增加，对薄膜内部产生压挤作用，使薄膜的几何结构严重破坏，形成多孔化型态；在干燥过程中，抽真空造成干燥腔的减压作用，使薄膜的多孔化型态能够维持，厚度保持一定。因此，冷冻干燥的薄膜，外观较厚、表面呈现粗糙，增加薄膜与周边组织的作用；又总表面积大幅增加，较多的明胶小片段的N端及C端暴露出来，故能引起较激烈的免疫反应。烘箱干燥薄膜，其干燥温度，大于其玻璃转换点温度，分子链片段易于滑动重组，因而使其聚合程度及交联程度，较其他两种干燥方式为高，胶原蛋白样的三股螺旋间的侧枝键结较多，形成较强的三维的网状结构，使横断面较具立体的几何结构，而增加薄膜中，小片段的明胶分子链与周边组织的作用，故能引起较常温干燥薄膜更大的免疫反应。常温干燥的薄膜，其干燥温度小于玻璃转换点温度，分子链处于安定状态，发生重新排列组合的机率较小，故其侧枝键结增加得较少，形成的三维的网状结构也较少，因而降低薄膜中的片段胺基酸序列，与周边组织的作用，故引起的免疫反应较小。2、皮下包埋二周的组织切片皮下包埋二周后，烘箱干燥、常温干燥及冷冻干燥薄膜部份降解，将其组织切片作比较，在薄膜降解程度方面，三种干燥方式的薄膜降解厚度相近。但其降解型态略有不同，烘箱干燥薄膜的降解，其边缘较平整；常温干燥及冷冻干燥的薄膜，其边缘均呈现锯齿状，以常温干燥薄膜的锯齿状较为明显。因此，常温干燥薄膜的降解难易程度，较冷冻干燥薄膜为低，而烘箱干燥薄膜的降解难易程度则最高。烘箱干燥薄膜，其聚合度、交联度较其他两种干燥方式为高，侧枝键结较多，形成的胶原蛋白样的三股螺旋间的作用力增加，形成的三维的网状结构较强，降解难度较高，故降解时，其边缘较平整。冷冻干燥薄膜，在冷冻过程中，压挤作用，形成多孔化型态；浓缩作用，增加分子链新氢键与凡得瓦引力的形成。在干燥过程中，抽真空造成干燥腔的减压作用，使薄膜多孔化型态得以维持。故降解时，因薄膜多孔型态及紧密靠近的分子链，薄膜边缘降解难度居中，故呈现不明显的锯齿状。常温干燥的薄膜，干燥过程中，分子链处于较安定状态，分子链间重新排列组合的机会较小，故其侧枝键结增加得较少，形成的三维的网状结构较少，其降解难度较低，故降解时，其边缘呈现锯齿状较为明显。3、皮下包埋四周的组织切片皮下包埋四周后，烘箱干燥、常温干燥及冷冻干燥薄膜几乎完全降解，将组织切片作比较，三种干燥方式的薄膜，所残留的型态略有不同。烘箱干燥薄膜残留的型态近椭圆形，常温干燥薄膜残留的型态近纺锤形，冷冻干燥薄膜残留的型态介于椭圆形跟纺锤形的中间型。而包埋的薄膜横切面，原为长方形，由三种干燥方式薄膜所残留的型态，显示薄膜的降解在两端较为快速，在中间部位较为缓慢。烘箱干燥薄膜残留的型态近椭圆形，表示薄膜较难降解；常温干燥薄膜残留的型态近纺锤形，表示薄膜较易降解；冷冻干燥薄膜残留的型态介于椭圆形跟纺锤形之间，表示其降解难易程度居中。烘箱干燥薄膜，其聚合度、交联度均较高，侧枝键结较多，形成的三维的网状结构较强，较不易被吞噬细胞(phagocyte)所吞噬，故薄膜两端降解后的残留较多，使其型态近椭圆形。冷冻干燥薄膜，虽其薄膜多孔型态，但因内部压密的分子链，较常温干燥有较多的新氢键与凡得瓦引力的形成，故降解后的残留型态，介于其他两种干燥方式之间。常温干燥的薄膜，干燥过程中，分子链间重新排列组合较少，侧枝键结增加较少，形成的三维的网状结构较少，故其降解难度较低，降解时，薄膜两端的降解明显，呈现纺锤形。结论干燥方式对生医高分子材料的影响真的很大。本研究使用了三种干燥机，包括烘箱干燥机(80℃)、常温干燥机(RTD)(25℃)，及冷冻干燥机(-20℃)等来研究。研究的生医材料为绿栀子素交联明胶，经甘胺酸溶液处理后的干燥薄膜。经物理、化学，以及生物相容性等的实验后，发现除了化学性质外，其他方面的差异相当大。实验发现烘箱干燥的薄膜，有较薄的干燥厚度、在SEM下呈现熔融状态、有较低的溶涨能力、较低的生物相容性与生物降解性；及较快的干燥速率、较高的干燥程度、较高的玻璃转换点与熔点、较高的交联程度、较强的抗拉能力与韧性及较高的延展性(tensileductility)。由烘箱干燥，其干燥温度高于玻璃转换点温度，在干燥过程中，历经变性(denaturation)与复性(renaturation)的过程，因而影响胶原蛋白样的三股螺旋中、及部分单股型态的明胶分子片段间，交联程度及氢键(hydrogenbond)的稳定度，及酵素可辨识的切点位置。进而使其结构缩收(shrinkage)，机械性质改变、抵抗酵素分解的能力增强。另外，实验发现冷冻干燥的薄膜，有较慢的干燥速率、较低的干燥程度、在SEM下呈现多孔性型态、较低的抗拉能力与韧性；及有居中的交联程度、居中的玻璃转换点与熔点、居中的生物相容性；及较厚的干燥厚度、较高的溶涨能力、较高的脆性(brittleness)等。由冷冻干燥的冷冻过程中，微细冰晶(Icecrystallites)形成，造成溶质浓度(concentration)及粘滞性(viscosity)增加。微细冰晶经升华过程(Sublimation)后，薄膜结构完全被破坏，溶质间的连接更加紧密。使具有明显影响机械性质，之不同胶原蛋白样三股螺旋间的交联被破坏；然而，压挤作用增加新氢键与凡得瓦引力的形成，及交联键结的增加，使胶原蛋白样的三股螺旋中，螺旋内(intrahelical)与螺旋间(interhelical)的交联程度。因多孔性结构，使得材料与组织的接触面积增加，而增加其抗原性(antigenity)。相对的，常温干燥的薄膜，在SEM下呈现平坦的型态、较低的玻璃转换点与熔点、有居中的干燥厚度、有较高的溶涨能力、较高的生物相容性与生物降解性；居中的交联程度、及居中的干燥速率、居中的干燥程度、较强的抗拉能力与韧性、较高的延展性(tensileductility)。因常温干燥，模拟材料在室温的干燥空气中干燥，因此，在干燥过程中，材料在结构上，较能保持较良好，因而降低干燥对材料的影响。本发明以较佳实施例揭露如上，然其并非用以限定本发明，任何熟习此技艺者，在不脱离本发明的精神和范围内，所作的各种更动与润饰均落在本发明的范围内，因此本发明的专利保护范围当视后附的权利要求所界定者为准。权利要求1.一种利用25℃常温以改善高分子材料制作过程中所破坏物性、化性及生物相容性的干燥方法，其步骤包括提供一高分子材料；以及利用一25℃常温干燥以改善高分子材料的制作过程。2.如权利要求1所述的方法，其中，所述高分子材料为生医高分子材料。3.如权利要求2所述的方法，其中，所述生医高分子材料包括合成高分子材料与天然高分子材料。4.如权利要求3所述的方法，其中，所述天然生医高分子材料为明胶(gelatin)。5.如权利要求4所述的方法，其中，所述明胶经由化学方式进行交联所使用的天然交联剂为绿栀子素(genipin)。6.如权利要求5所述的方法，其中，所述明胶薄膜与高浓度的绿栀子素溶液交联，其最高交联度为85％左右。全文摘要本发明提供一种利用25℃常温以改善高分子材料制作过程中所破坏物性、化性及生物相容性的干燥方法，乃利用25℃常温干燥方法改善生医高分子材料制作过程中，对物理性质、化学性质及生物相容性的破坏，以制造出更高品质的生医产品。文档编号F26B7/00GK101093136SQ20061008684公开日2007年12月26日申请日期2006年6月21日优先权日2006年6月21日发明者陈丽文申请人:陈丽文