一种具有良好热稳定性的葡萄糖氧化酶纳米凝胶的制备方法与流程

本发明涉及一种纳米凝胶的制备方法，尤其涉及一种葡萄糖氧化酶纳米凝胶的制备方法，属于功能高分子材料、纳米材料、酶固定化技术领域。

背景技术：

葡萄糖氧化酶(glucoseoxidase)广泛地分布于生物体内，它能够专一地催化葡萄糖生成葡萄糖酸以及过氧化氢，并在此过程中消耗氧气。因而被应用于食品、饲料、医药等领域中，起到去除葡萄糖、脱氧、杀菌、测定葡萄糖浓度等作用。通常，葡萄糖氧化酶需要保存在低温环境中，以保证其酶活性。但是很多涉及葡萄糖氧化酶的应用难以避免地要在较高温度下储存、运输、实施，因此提高葡萄糖氧化酶的热稳定性是一个亟待解决的技术问题，它具有重要的应用价值和大量的实际需求。

提高葡萄糖氧化酶热稳定性的技术难点在于，它是一种具有四级结构的蛋白质。具体来说就是，葡萄糖氧化酶分子中存在两个亚基，其在高温环境中的变性是由亚基的解离开始的，即两个亚基之间的相互作用力减弱，彼此逐渐分离。亚基解离会进一步引起各种结构变化，令葡萄糖氧化酶失去正确的组装结构，从而失去活性。这造成葡萄糖氧化酶的热失活过程比其它单亚基酶要复杂，那么提高其热稳定性也变得更加困难。目前，提高葡萄糖氧化酶热稳定性的方法包括介质工程、蛋白质工程、物理或化学交联、酶固定化等。但都有一定的缺点，如操作复杂，稳定效果有限等。本发明涉及利用反相微乳液制备纳米凝胶，这种方法制备过程简便、条件温和、被包裹在纳米凝胶中的葡萄糖氧化酶的热稳定性明显提高。

技术实现要素：

本发明针对现有提高葡萄糖氧化酶热稳定性的方法存在的不足，提供一种具有良好热稳定性的葡萄糖氧化酶纳米凝胶的制备方法。

本发明解决上述技术问题的技术方案如下：

一种具有良好热稳定性的葡萄糖氧化酶纳米凝胶的制备方法，包括如下步骤：

1)称取单体、交联剂和葡萄糖氧化酶溶解于mes缓冲溶液中制得混合溶液作为水相，其中，所述单体是指n-异丙基丙烯酰胺、甲基丙烯酸n,n'-二甲氨基乙酯或二者的衍生物中的任意一种；

2)将表面活性剂加入到不溶于水的非极性或弱极性有机溶剂中，溶解后作为油相；

3)在搅拌条件下，将水相逐滴加入到油相中，持续搅拌，得透明稳定的微乳液体系，控制水相与油相的体积比为1：5-1：50，且微乳液中w0值为20；

4)向步骤3)所得的微乳液体系中加入水溶性的引发剂，引发聚合反应并进一步交联，控制反应温度为20-30℃，反应时间为0.5-4h,形成包裹有葡萄糖氧化酶的纳米凝胶，所述引发剂包括还原组份和氧化组份，所述还原组分是指亚硫酸盐和亚铁盐中的任意一种，所述氧化组分是指过硫酸盐、过氧化氢中的一种；

5)聚合反应结束后，向反应体系中加入mes缓冲溶液，打破反应体系中的油水平衡，冷藏静置，待油水界面清晰后去除油相，将水相转移进透析袋中，将透析袋中的产品至于mes缓冲溶液中透析48h以上，以去除表面活性剂和残余单体，即得葡萄糖氧化酶纳米凝胶；

其中，所述mes缓冲溶液是指2-(n-吗啡啉)乙磺酸缓冲溶液。

进一步，步骤1)中控制水相中葡萄糖氧化酶的浓度为0.1-10mg/ml,所述单体与葡萄糖氧化酶的质量之比为(100-500)：1，交联剂的量为单体质量的1-5wt％。

进一步，步骤4)中还原组份的加入量为单体质量的0.5-1wt％,氧化组份的加入量为还原组份质量的1-4倍。

进一步，步骤1)中所述的交联剂是指水溶性的具有双官能团的交联剂，具体可以为n,n'-亚甲基双丙烯酰胺、n,n'-乙烯基双丙烯酰胺、二甲基丙烯酸乙二醇酯、二甲基丙烯酸二甘醇酯中的任意一种。

进一步，步骤5)中加入mes缓冲溶液的体积为水相体积的3-8倍。

进一步，步骤2)中所述的表面活性剂为二(2-乙基己基)琥珀酸酯磺酸钠、聚乙二醇对异辛基苯基醚,十六烷基三甲基溴化铵中的任意一种。

进一步，步骤2)中所述的有机溶剂为正己烷，环己烷，异辛烷，甲苯，石油醚中的任意一种。

本发明提高葡萄糖氧化酶热稳定性的机理如下：

1)本发明的方法中单体在微乳液的水相液滴中进行原位的聚合和交联，并将葡萄糖氧化酶包裹在其中形成纳米凝胶，聚合物凝胶的三维网状结构可以对葡萄糖氧化酶实现多点、多面的固定化。即使高温时葡萄糖氧化酶的两个亚基间的相互作用力减弱，也不会分离。因此可以有效防止由亚基解离引起的不可逆的酶结构变化。

2)单体聚合形成的温敏性聚合物也有助于提高葡萄糖氧化酶的热稳定性。高温时温敏性聚合物变得疏水，可以与葡萄糖氧化酶上的疏水位点发生相互作用，从而有效防止酶分子之间发生不可逆的聚集导致失活。而且，在高温撤离后温敏性聚合物变得亲水，这种相互作用会自动消失，帮助葡萄糖氧化酶恢复天然结构。

本发明方法的有益效果是：

采用本发明的方法得到的葡萄糖氧化酶纳米凝胶能够大幅提高葡萄糖氧化酶的热稳定性，经高温加热后，仍能保持较高的相对酶活性，大大拓展了葡萄糖氧化酶的使用范围和使用环境。

附图说明

图1为实施例1、实施例2所得产品与自由葡萄糖氧化酶在不同温度下失活复性后的相对酶活性数据；

图2为实施例3、实施例4所得产品与自由葡萄糖氧化酶在60℃下加热不同时间失活复性后的相对酶活性数据；

图1、2中，b是指与测试产品相同浓度的自由葡萄糖氧化酶经相同条件失活复性后所得的相对酶活性。

具体实施方式

以下结合实例对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。

实施例1：

一种具有良好热稳定性的葡萄糖氧化酶纳米凝胶的制备方法，包括如下步骤：

1)称取0.02g的葡萄糖氧化酶溶解于10ml的mes缓冲溶液中制得2mg/ml的葡萄糖氧化酶溶液，量取1ml的上述溶液，向其中加入200mg的单体n-异丙基丙烯酰胺和2mg的交联剂n，n'-亚甲基双丙烯酰胺溶解制得混合溶液作为水相；

2)将表面活性剂二(2-乙基己基)琥珀酸酯磺酸钠1.235g加入到50ml的异辛烷中，溶解后作为油相；

3)在不断搅拌条件下，将步骤1)所得水相加入到步骤2)所得油相中，继续搅拌得透明稳定的微乳液体系，最终所得微乳液的w0值为20；

4)向步骤3)所得微乳液体系中加入1.5mg的亚硫酸氢钠和1.5mg的过硫酸铵作为引发剂，控制反应温度为20℃，反应2h,形成包裹有葡萄糖氧化酶的纳米凝胶；

5)聚合反应结束后，向反应体系中加入8ml的mes缓冲溶液，打破反应体系中的油水平衡，后冷藏静置，待油水界面清晰后去除油相，将水相转移进透析袋中，将透析袋中的产品置于mes缓冲溶液中透析48h以上，以去除表面活性剂和残余单体，即得葡萄糖氧化酶纳米凝胶e1。

实施例2：

一种具有良好热稳定性的葡萄糖氧化酶纳米凝胶的制备方法，包括如下步骤：

1)称取0.001g的葡萄糖氧化酶溶解于10ml的mes缓冲溶液中制得0.1mg/ml的葡萄糖氧化酶溶液，量取2ml的上述溶液，向其中加入50mg的单体甲基丙烯酸n,n'-二甲氨基乙酯和1mg的交联剂二甲基丙烯酸乙二醇酯溶解制得混合溶液作为水相；

2)将表面活性剂聚乙二醇对异辛基苯基醚3.594g加入到20ml的正己烷中，溶解后作为油相；

3)在不断搅拌条件下，将步骤1)所得水相加入到步骤2)所得油相中，继续搅拌得透明稳定的微乳液体系，最终所得微乳液的w0值为20；

4)向步骤3)所得微乳液体系中加入0.25mg的硫酸亚铁和0.5mg的过氧化氢作为引发剂，控制反应温度为25℃，反应1h,形成包裹有葡萄糖氧化酶的纳米凝胶；

5)聚合反应结束后，向反应体系中加入10ml的mes缓冲溶液，打破反应体系中的油水平衡，后冷藏静置，待油水界面清晰后去除油相，将水相转移进透析袋中，将透析袋中的产品置于mes缓冲溶液中透析48h以上，以去除表面活性剂和残余单体，即得葡萄糖氧化酶纳米凝胶e2。

实施例3：

一种具有良好热稳定性的葡萄糖氧化酶纳米凝胶的制备方法，包括如下步骤：

1)称取0.01g的葡萄糖氧化酶溶解于10ml的mes缓冲溶液中制得1mg/ml的葡萄糖氧化酶溶液，量取5ml的上述溶液，向其中加入1g的单体甲基丙烯酸n,n'-二乙氨基乙酯和30mg的交联剂n,n'-乙烯基双丙烯酰胺溶解制得混合溶液作为水相；

2)将表面活性剂十六烷基三甲基溴化铵5.062g加入到100ml的环己烷中，溶解后作为油相；

3)在不断搅拌条件下，将步骤1)所得水相加入到步骤2)所得油相中，继续搅拌得透明稳定的微乳液体系，最终所得微乳液的w0值为20；

4)向步骤3)所得微乳液体系中加入5mg的亚硫酸氢铵和20mg的过硫酸钾作为引发剂，控制反应温度为30℃，反应0.5h,形成包裹有葡萄糖氧化酶的纳米凝胶；

5)聚合反应结束后，向反应体系中加入40ml的mes缓冲溶液，打破反应体系中的油水平衡，后冷藏静置，待油水界面清晰后去除油相，将水相转移进透析袋中，将透析袋中的产品置于mes缓冲溶液中透析48h以上，以去除表面活性剂和残余单体，即得葡萄糖氧化酶纳米凝胶e3。

实施例4：

一种具有良好热稳定性的葡萄糖氧化酶纳米凝胶的制备方法，包括如下步骤：

1)称取0.10g的葡萄糖氧化酶溶解于10ml的mes缓冲溶液中制得10mg/ml的葡萄糖氧化酶溶液，量取5ml的上述溶液，向其中加入5000mg的单体n-异丙基-2-羧基丙烯酰胺和150mg的交联剂二甲基丙烯酸二甘醇酯溶解制得混合溶液作为水相；

2)将表面活性剂二(2-乙基己基)琥珀酸酯磺酸钠6.174g加入到200ml的石油醚中，溶解后作为油相；

3)在不断搅拌条件下，将步骤1)所得水相加入到步骤2)所得油相中，继续搅拌得透明稳定的微乳液体系，控制微乳液中w0值为20；

4)向步骤3)所得微乳液体系中加入30mg的亚硫酸氢钠和90mg的过硫酸钠作为引发剂，控制反应温度为20℃，反应4h,形成包裹有葡萄糖氧化酶的纳米凝胶；

5)聚合反应结束后，向反应体系中加入20ml的mes缓冲溶液，打破反应体系中的油水平衡，后冷藏静置，待油水界面清晰后去除油相，将水相转移进透析袋中，将透析袋中的产品置于mes缓冲溶液中透析48h以上，以去除表面活性剂和残余单体，即得葡萄糖氧化酶纳米凝胶e4。

为了验证本发明的葡萄糖氧化酶纳米凝胶的热稳定性，我们进行了如下测试：

一、将实施例1、实施例2所得的纳米凝胶e1、e2进行了热稳定性测试，具体测试方法如下：

1)将纳米凝胶样品e1、e2和自由葡萄糖氧化酶样品b分别置于60℃、65℃和70℃的恒温水浴中加热30min，使其失活，后冷藏保存24h，使其复性；

2)室温下将复性后的样品470μl、葡萄糖溶液(浓度400mm，溶于mes中)10μl、辣根过氧化物酶溶液(浓度1mg/ml，溶于mes中)10μl和焦棓酸的丙酮溶液(浓度40mm)10μl加入到比色皿中混合均匀，然后立即监测反应体系在波长420nm处吸光度随时间的变化。将该数据与未经加热的相同样品在同样的反应条件下经同样的测试所得的数据进行比较，得到相对酶活性，结果如图1所示。

二、将实施例3、实施例4所得的纳米凝胶e3、e4进行热稳定性测试，具体测试方法如下：

1)将纳米凝胶样品e3、e4和自由葡萄糖氧化酶样品b分别置于60℃的恒温水浴中加热10-60min，使其失活，后冷藏保存24h,使其复性；

2)室温下将复性后的样品470μl、葡萄糖溶液(浓度400mm，溶于mes中)10μl、辣根过氧化物酶溶液(浓度1mg/ml，溶于mes中)10μl和焦棓酸的丙酮溶液(浓度40mm)10μl加入到比色皿中混合均匀，然后立即监测反应体系在波长420nm处吸光度随时间的变化。将该数据与未经加热的相同样品在同样的反应条件下经同样的测试所得的数据进行比较，得到相对酶活性，结果如图2所示。

由图1、2中的数据可知，本发明所得的葡萄糖氧化酶纳米凝胶经不同温度以及不同时间的加热复性后，与自由葡萄糖氧化酶的活性相比较，能够保持相对较高的酶活性，大大扩展了葡萄糖氧化酶的应用范围和使用环境。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。