一种诊断骨性关节炎的miRNA分子标志物及一种骨性关节炎检测试剂盒的制作方法

文档序号:11722591阅读:321来源:国知局
一种诊断骨性关节炎的miRNA分子标志物及一种骨性关节炎检测试剂盒的制作方法与工艺
本发明涉及生物技术诊断领域,特别是涉及一种诊断骨性关节炎的mirna分子标志物及一种骨性关节炎检测试剂盒。
背景技术
:骨关节炎(osteoarthritis,oa)是一种慢性退行性关节病变,本病发病率随年龄的增长而增加,是一种中老年人常见的关节疾病。oa的发病因素众多,发病机制十分复杂,其中oa特征性的表现是软骨细胞基质合成不足、关节软骨退变、骨赘形成和滑膜病变。虽然目前有很多学说通过解释oa的形成机理,建立了一些诊断和治疗oa的方法,但这些诊断oa的手段主要还是以影像学检查为基础。目前在临床影像学辅助检查(x线、mri及超声等)确诊oa时,关节软骨已经出现了不可逆性损伤,这就使得临床在对oa进行早期干预或治疗时没有一种良好的改变或延缓病情的治疗措施。如何早期诊断oa成为延缓及控制骨关节炎进展的关键。mirna是广泛存在于真核生物中的单链小分子rna,其不编码蛋白质,但可在转录后调控基因表达,影响蛋白质的翻译,参与机体各种重要的生理和病理过程。随着科学界对mirna在调控细胞功能方面的研究日渐加深以及新的mirna作用靶标的发现,越来越多的研究证实,mirna可在多方面调控oa软骨相关基因的表达。其中,mir-140是在正常软骨中特异性表达的少数几个mirna之一,敲除小鼠体内的mir-140基因后,小鼠表现出与oa类似的病理过程,表现出软骨蛋白多糖的减少和关节软骨的纤维化。关节软骨的营养来源于滑液的渗透,关节软骨与关节滑液之间存在一定的物质交换;与血液和尿液相比,关节液成分及量的变化更能反映关节内组织病变的发生和发展。因此,找寻一种mirna分子标志物,通过检测关节液中的该分子标志物的表达量来诊断oa的严重程度,可为骨关节炎的早期诊断和治疗提供重要依据。技术实现要素:鉴于此,本发明提供了一种诊断骨性关节炎的mirna分子标志物,通过检测该分子标志物在关节液中的表达量,可获知骨关节炎病程的进展,从而为骨关节炎的早期诊断和治疗提供依据。具体地,第一方面,本发明提供了一种诊断骨性关节炎的mirna分子标志物,所述mirna分子标志物包括mirna140-3p。所述mirna140-3p的序列为:uaccacaggguagaaccacgg。本发明第一方面提供的mirna分子标志物为骨关节炎的诊断提供了新的生物标志物,通过检测关节液中mirna140-3p的表达量,可初步判断骨关节液的严重程度,灵敏度和特异性高。通过采用本发明的mirna分子标志物进行骨性关节炎的诊断,具体具有如下优势:(一)无创:对病人的损伤较小,能够克服创伤性检测带来的风险;(二)稳定:在临床血清、血浆、关节液样本中,microrna以抵抗rna酶的形式稳定存在;(三)早期:microrna在疾病早期阶段就已经表现出异常,因此可以用于高危人群的预警或者早期检测;(四)简便:采用qpcr进行检测,操作简单、灵敏度高、样本需求量少,检测周期短,仅需数小时便可获取结果,价格低廉。相应地,本发明第二方面提供了一种骨性关节炎检测试剂盒,包括:(1)mirna分子标志物,所述mirna分子标志物包括mirna140-3p;(2)提取rna试剂:trizol裂解液、氯仿、sio2吸附液、乙醇、depch2o;(3)逆转录试剂:5×buffer、10mmol/l脱氧核糖核苷三磷酸(dntp)、m-mlv逆转录酶、rnaseinhibitor(rnase抑制剂)、microrna140-3p逆转录引物、内参u6逆转录引物、depch2o;(4)荧光定量pcr试剂:sybrgreenqpcrsupermix、microrna140-3p特异性前向引物、microrna140-3p特异性后向通用引物、内参u6扩增引物、depch2o。其中,所述microrna140-3p特异性前向引物(forwardprimer)的基因序列为5’-acactccagctgggaggcggggcgccgcggga-3’。所述microrna140-3p特异性后向引物(reverseprimer)的基因序列为5’-ctcaactggtgtcgtgga-3’。所述内参u6逆转录引物包括上游引物和下游引物,所述上游引物的基因序列为:5’-ctcgcttcggcagcaca-3’,所述下游引物的基因序列为:5’-aacgcttcacgaatttgcgt-3’。本发明通过在mirna的3’端加上一特异性的茎环引物,通过逆转录和荧光定量pcr的方法检测被检膝骨关节液样本中microrna-3p的表达量,并与正常人microrna-3p的水平相比较来诊断oa,其灵敏度和特异性高。本发明第二方面提供的骨性关节炎检测试剂盒,用于诊断骨关节炎的特异性和灵敏度高,可从分子标志物mirna140-3p的表达量初步判断骨关节炎的严重程度。本发明的优点将会在下面的说明书中部分阐明,一部分根据说明书是显而易见的,或者可以通过本发明实施例的实施而获知。附图说明图1为本发明实施例中mir-140-3p扩增曲线图;图2为本发明实施例中mir-140-3p在各试验组膝关节液中的相对表达量;图3为本发明实施例中各研究对象年龄与其mir-140-3p相对表达量散点图。具体实施方式下面结合附图对本发明上述技术方案的实施例进行具体说明。本发明实施例提供一种骨性关节炎检测试剂盒,包括:(1)mirna分子标志物,所述mirna分子标志物包括mirna140-3p;(2)提取rna试剂:trizol裂解液、氯仿、sio2吸附液、体积分数75%的乙醇、depch2o;depc水是指经depc(焦碳酸二乙酯)处理过并经高温高压消毒的纯水;(3)逆转录试剂:5×buffer、10mmol/l脱氧核糖核苷三磷酸(dntp)、m-mlv逆转录酶、rnaseinhibitor、microrna140-3p逆转录引物、内参u6逆转录引物、depch2o;(4)荧光定量pcr试剂:sybrgreenqpcrsupermix、microrna140-3p特异性前向引物、microrna140-3p特异性后向引物、内参u6扩增引物、depch2o。本发明实施例收集到10例健康志愿者、10例痛风性关节炎患者、10例类风湿关节炎患者、45例膝骨关节炎患者关节液作为研究对象进行检测,其中骨关节炎早期、中期、晚期各15例。经患者或健康志愿者知情同意后,经关节腔穿刺抽取关节液置于无菌、无酶的冻存管,保存于液氮中。采用本发明实施例的检测试剂盒对上述受试者进行骨性关节炎诊断的具体操作为:(1)总rna抽提:本发明实施例采用trizol一步法提取总rna,具体方法如下:取300μl关节液,加入4倍体积trizol溶液,再加入200μl氯仿,强烈振荡20s后静置3min;使用珠海黑马tgl-16r高速冷冻离心机10000×g离心15min;小心将上层水层移至另一个新的无rnase的ep管(离心管)中;加入10μlsio2吸附液,混匀,8000×g离心1min;吸弃上清,加入体积分数为75%的乙醇400μl,8000×g离心1min;吸弃上清,风干15min,加入30μldepc水溶解rna。(2)逆转录合成cdna采用茎环法进行逆转录,具体步骤为:取10μl总rna置于无rnase的pcr管中混匀,85℃孵育5min,以打开rna二级结构。随后立即置于冰上,以防止rna复性再次恢复二级结构;在另一去rnase的pcr管中配置含10mmol/ldntp2.0μl,rnaseinhibitor0.5μl,mir-140-3p逆转录引物0.5μl,u6逆转录引物0.5μl,5×buffer4.0μl,m-mlv0.5μl,depc水1.5μl的溶液,将配置好的溶液加入至上述含10μl总rna的pcr管中,混匀后42℃温度条件下孵育60min;然后85m孵育10min灭活逆转录酶,获得cdna。(3)定量pcr检测序列片段大小:内参片段u6为94bp,目的片段hsa-mir-140-3p为71bp(mimat0004597),见表1。pcr反应总体积为20μl,其中cdna(1︰20)5.0μl,hsa-microrna140-3p特异性前向引物(hsa-mir-140-3pf)0.5μl,hsa-microrna140-3p特异性后向引物(hsa-mir-140-3pr)0.5μl,2×sybrgreenqpcrsupermix10μl,dh2o(超纯水)4.0μl。反应条件为50℃2min;95℃2min;95℃15s,60℃32s读板,40个循环,熔解曲线分析:温度60-95℃,每个样重复3次。表1hsa-mir-140-3pf:5’acactccagctgggaggcggggcgccgcgggahsa-mir-140-3pr:5’ctcaactggtgtcgtggau6-f(u6上游引物):5’ctcgcttcggcagcacau6-r(u6下游引物):5’aacgcttcacgaatttgcgt本发明实施例采用检测试剂盒对各研究对象进行检测的各组实验的结果如下:1、mir-140-3p在各组膝关节液中相对表达量的分析(1)在健康对照组,类风湿关节炎组,痛风性关节炎组及骨关节炎早、中、晚期组患者膝关节液中均能检测到mir-140-3p的表达,扩增曲线如图1所示,经正态分布检验(k-s检验)表明:mir-140-3p在各组膝关节液中的相对表达量2-δδct均服从正态分布。(2)对健康对照组,类风湿关节炎组,痛风性关节炎组及骨关节炎早、中、晚期组患者膝关节液中mir-140-3p的相对表达量进行levene法方差齐性检验,结果如表2所示,结果显示各组方差不齐(levenestatistic=13.4,p<0.05)。表2表注:δct=(目的基因ct-内参ct);δδct=(待测样品中目的基因δct-参照样品中目的基因δct),选择正常对照组δct的均数作为参照进行计算;相对表达量=2-δδct。(3)进一步对mir-140-3p在各组关节液中的相对表达量进行tamhane’st2检验,结果如表3所示,表3结果显示:mir-140-3p表达量在健康对照组、痛风性关节炎组与类风湿关节炎组间差异无显著性意义(p>0.05);非骨关节炎组与骨关节炎组间相对表达量差异有显著性意义(p<0.05),且mir-140-3p在非骨关节炎组中的表达量是骨关节炎组的9.6倍,健康对照组的表达量是骨关节炎组的11.4倍。mir-140-3p在骨关节炎早期、中期、晚期组间相对表达量差异均有显著性意义,且随骨关节炎严重程度的增加mir-140-3p表达量呈相对减少的趋势(如图2所示)。表3表注:表中数值为mir-140-3p在各组关节液中相对表达量差异比较的p值,因相对表达量δδct在各组间方差不齐,故使用tamhane’st2检验,检验水准α=0.05。(4)将mir-140-3p在健康对照组,骨关节炎早、中、晚期组间的相对表达量进一步进行spearman等级相关分析,结果显示spearman等级相关系数r=-0.87,p=0.00。按α=0.05水准,可以认为mir-140-3p的表达量与骨关节炎的严重程度间存在负相关关系。2、mir-140-3p相对表达量与受试者年龄的相关性分析绘制mir-140-3p在健康对照组、膝骨关节炎早、中、晚期组中的相对表达量与年龄的散点图(图3)。由散点图可见,mir-140-3p在膝关节液中的相对表达量与年龄间并无明显的直线相关关系;将mir-140-3p在健康对照组、膝骨关节炎早、中、晚期组中相对表达量与年龄的相关性进一步行pearson相关分析,结果显示:mir-140-3p与年龄的pearson相关系数r=-0.144,p=0.293,按α=0.05检验水准,可以认为mir-140-3p在各膝关节液中的相对表达量与年龄之间无直线相关关系。需要说明的是,根据上述说明书的揭示和和阐述,本发明所属领域的技术人员还可以对上述实施方式进行变更和修改。因此,本发明并不局限于上面揭示和描述的具体实施方式,对本发明的一些等同修改和变更也应当在本发明的权利要求的保护范围之内。此外,尽管本说明书中使用了一些特定的术语,但这些术语只是为了方便说明,并不对本发明构成任何限制。当前第1页12
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