一种与肺腺癌转移及预后相关的分子标记物及其应用的制作方法

本发明涉及一种具有潜力的肺腺癌诊断的分子标记物，属于肿瘤生物诊断及治疗技术领域。

背景技术：

肺癌是当今世界致死率最高的恶性肿瘤之一，每年全世界范围内的新生病例超过100万，其中以肺腺癌为最主要的组织类型。肺腺癌极易发生肝、骨和脑转移，甚至有些患者在致病初期即可发生远端转移，因而导致肺腺癌的治愈率极低，且由于复发和转移，患者术后五年生存率尚不足15％。由此可见，转移是目前肺腺癌患者致死的主要原因。尽管近年来肺腺癌的诊断和治疗已经取得了显著进展，但关于肺腺癌转移的确切分子机制尚未明确，且尚无有效的相关分子标记物。

染色体凝集调节因子2(regulatorofchromosomecondensation2，rcc2)为染色体乘客复合体(cpc)的主要组成蛋白，参与有丝分裂和胞质分裂进程中纺锤体的装配进而调节有丝分裂进程，近期报道其亦可参与调节粘附分子及细胞迁移运动进而在细胞间期活动中发挥重要作用。

本发明在前期研究基础上认为rcc2基因扩增和表达水平的升高与肺腺癌转移发生及不良预后密切相关，可作为肿瘤标记物应用于肺腺癌转移发生的检测诊断中。

技术实现要素：

本发明针对目前临床肺腺癌及其转移缺乏有效诊断标记物的情况，提供了一种具有潜力的肺腺癌诊断的分子标记物——染色体凝集调节因子2(regulatorofchromosomecondensation2，rcc2)，通过检测rcc2基因扩增水平及表达水平从而达到对肺腺癌转移进行早期诊断及预后评估的目的。

为了达到上述目的，本发明采用了以下技术手段：

本发明通过tcga数据库分析临床肺腺癌样本中rcc2基因扩增以及mrna表达水平。结果发现，在临床肺腺癌样本中rcc2基因扩增水平与rcc2基因表达水平呈显著正相关，并且临床肺腺癌样本中rcc2的mrna表达水平显著高于癌旁组织。为了进一步确定rcc2的表达水平与腺癌恶性程度、转移发生及预后评估的关系，本发明通过westernblot法以及免疫组化方法检测了6对临床配对的肺腺癌(t)与癌旁(n)组织以及肺腺癌组织芯片中rcc2的蛋白表达水平，结果发现在配对肺腺癌样本中rcc2蛋白表达水平显著高于癌旁组织，且与肺腺癌浸润深度,淋巴结转移及临床分期显著相关。更进一步的，本发明通过kaplan-meier法(log-rank检验)分析了rcc2表达水平与肺腺癌患者的生存期的关系，结果显示rcc2表达高的患者预后较差，且经过cox回归分析可知，rcc2可作为判断肺腺癌患者预后的独立影响因子。

因此，在上述研究的基础上，本发明提出了染色体凝集调节因子2(regulatorofchromosomecondensation2，rcc2)作为分子标记物在制备用于肺腺癌转移的早期诊断以及预后评估的试剂或试剂盒中的用途。

进一步的，本发明还提出了用于检测rcc2基因扩增水平和表达水平的试剂在制备用于肺腺癌转移的早期诊断以及预后评估的试剂或试剂盒中的用途。

优选的，所述的用于检测rcc2基因扩增水平和表达水平的试剂包括从dna水平、rna水平以及蛋白水平检测的试剂。

其中，优选的，所述的从rna水平检测的试剂包括用于rcc2pcr检测所需的引物，所述引物由上游引物和下游引物组成，在本发明的一个具体实施例中，所述的上游引物的核苷酸序列如seqidno.1所示，下游引物的核苷酸序列如seqidno.2所示。

当然，依据人类rcc2基因序列所设计的所有引物均应在本发明的保护范围之内。

其中，优选的，所述的从蛋白水平检测的试剂包括抗rcc2的抗体。

本发明针对rcc2在临床肺腺癌患者中存在拷贝数变异及表达差异，并与转移发生和不良预后存在相关性的情况，通过对rcc2基因扩增水平与mrna、蛋白表达水平的检测，从而起到提示肺腺癌恶性程度、转移发生及预后评估的作用。将rcc2序列及其相关抗体应用于临床肺腺癌转移诊断及预后评估中，能够为肺腺癌及其转移发生提供新的早期诊断及预后评估方案，对于肺腺癌的临床诊疗具有重要意义。

附图说明

图1为通过tcga数据库分析临床肺腺癌样本中rcc2基因扩增水平；

结果显示在临床肺腺癌样本中rcc2基因扩增水平与rcc2基因表达水平呈显著正相关；

图2为通过tcga数据库分析临床肺腺癌样本中rcc2的mrna表达水平；

结果显示在临床肺腺癌样本中rcc2mrna表达水平显著高于癌旁组织；

图3为westernblot检测6对临床配对的肺腺癌(t)与癌旁(n)组织中rcc2蛋白表达水平；

结果显示在配对肺腺癌样本中rcc2的蛋白表达水平显著高于癌旁组织；

图4为免疫组化方法检测临床肺腺癌组织样本病理切片中rcc2的表达；

经秩和检验分析发现rcc2蛋白在肺腺癌组织中表达明显高于癌旁组织，且与肺腺癌浸润深度，淋巴结转移及临床分期显著相关；

图5为kaplan-meier法(log-rank检验)分析肺腺癌患者的生存期。

结果显示rcc2表达高的患者预后较差(左：组织芯片数据；中：tcga数据；右：geo数据)，且经过cox回归分析可知，rcc2可作为判断肺腺癌患者预后的独立影响因子。

具体实施方式

以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。

实施例1通过tcga数据库分析临床肺腺癌样本中rcc2基因扩增水平

通过tcga数据库分析临床肺腺癌样本中rcc2基因扩增以及mrna表达水平。结果如图1和图2所示，从图1和图2结果可以看出，在临床肺腺癌样本中rcc2基因扩增水平与rcc2基因表达水平呈显著正相关，并且临床肺腺癌样本中rcc2的mrna表达水平显著高于癌旁组织。

实施例2临床样本的检测

1、样本

6对临床配对的肺腺癌(t)与癌旁(n)组织样本以及临床肺腺癌组织样本病理切片。

2、方法

2.1.检测肺腺癌组织中rcc2基因扩增水平。

2.1.1肺腺癌组织中dna的提取。

(1)取冰冻组织，在液氮冷冻下迅速研磨成粉末。

(2)将粉末放入到1.5ml离心管中，然后加入缓冲液750ul,充分混匀。

(3)将离心管置于65℃水浴中1-2小时，水浴过程中温和混匀几次。

(4)取出离心管,每管加入等体积的酚-氯仿(v/v＝1:1)溶液600-700ul，混匀后离心，10000g,10min。

(5)上清液移入另一离心管中，加入等体积的氯仿，混匀后，10000g,6min。

(6)将上清液移入另一离心管中，加入0.6倍体积的异丙醇，轻轻混匀，静置一段时间，然后用枪头勾出dna,并用70％乙醇冲洗2次。

(7)勾出的dna，真空干燥后将其溶于500ul1×te中。

(8)加入3ulrna酶溶液，37℃保温1小时。

(9)加入等体积的酚-氯仿溶液,轻轻混匀后,10000g，离心6min。

(10)取上清液，加入等体积的氯仿，轻轻混匀后，10000g离心6min。

(11)取上清液，入1/10体积3m醋酸钠，混匀后，加入2倍体积冷的无水乙醇。

(12)轻轻混匀静置一会儿后，用枪头勾出dna,用70％乙醇冲洗2次后，真空干燥。

(13)加入20-50ul的1×te溶解dna。

(14)测定dna的浓度，样品在4℃下保存备用。

2.1.2基因测序，检测rcc2基因扩增水平。

2.2.检测肺腺癌组织中rcc2的mrna水平。

2.2.1肺腺癌组织中总rna提取。

(1)取2mleppendorf管，加入100mg冰冻组织，100μl0.5mm硅酸锆珠子，1mltrizol。

(2)置于组织破碎仪中，最大速度破碎5min。

(3)加入0.2ml氯仿，剧烈振荡30s，冰上静置3～5min。

(4)离心，4℃，12000g，15min。

(5)将上层水相移至新的eppendorf管中，加入与上清等体积异丙醇，轻轻混匀，室温放置10min。

(6)离心，4℃，12000g，15min。

(7)弃上清，75％乙醇洗涤rna沉淀。离心，4℃，7500g，10min。

(8)室温干燥rna沉淀，5～10min后溶于适量depc水(30μl)。

2.2.2rt-qpcr检测rcc2的表达。

2.2.2.1逆转录

依测定浓度调整各组样品总rna量，采用roche公司的transcriptorfirststandcdnasystemkit逆转录试剂盒，按照说明书提供的方法逆转录合成cdna第一链。

(1)cdna反应体系

(2)反应条件

50℃60min；85℃5min；16℃+∞。所得cdna第一链测浓度稀释到50ng/μl，直接使用或-20℃保存备用。

2.2.2.2实时定量pcr

用扩增目的基因的引物以转染后细胞的cdna为模版进行扩增，rcc2引物序列如下：

上游引物：5′-ttcctttgggtgccctgaa-3′(seqidno.1)

下游引物：5′-ggcagaatctgtccatctttcg-3′(seqidno.2)

(1)反应体系

(2)反应条件：

95℃6min；95℃20s，tm20s，72℃20s，进行45个循环的反应。

2.3检测肺腺癌组织中rcc2蛋白表达情况。

2.3.1免疫组化方法检测肺腺癌癌组织中rcc2的表达情况。

(1)组织切片制备：每个病例按3-5μm切片，以预涂apes粘附性载玻片捞片，70℃烘烤2h。

(2)脱蜡、水化：38℃烘烤过夜，石腊切片常规二甲苯脱蜡，逐级梯度(100％-80％)酒精水化。

(3)阻断内源性过氧化物酶：0.3％h202溶液室温孵育30min。

(4)抗原修复：柠檬酸修复液高压修复10min。

(5)室温静置冷却，待温度与室温相同(约45min)，pbs洗3次，每次5min。

(6)加一抗：1％牛血清抗体稀释液稀释一抗，均匀滴加在石蜡切片的组织上，4℃冰箱过夜。

(7)室温静置20min，pbs洗3次，每次5min。

(8)加二步法检测试剂，室温孵育1h。

(9)pbs洗3次，每次5min。

(10)dab显色，30s左右(视染色情况)；苏木素复染20s。

(11)酒精梯度浓度脱水、二甲苯透明，中性树胶封片。

(12)结果染色阳性判断：

阳性着色程度(抗原含量)：阴性染色记为0，弱阳性记为1，阳性记为2，强阳性记为3。

2.3.2westernblot方法检测肺腺癌组织中rcc2的表达情况。

2.3.2.1冰冻组织蛋白提取。

(1)取2mleppendorf管，加入300mg冰冻组织，300μl0.5mm硅酸锆珠子，600μl裂解液。

(2)置于组织破碎仪中，最大速度破碎10min。

(3)离心，4℃，13000r/min，30min。

(4)收集上清至新1.5mleppendorf管中，测定蛋白质浓度，并以50μl每管分装，保存于-80℃冰箱中备用。

2.3.2.2westernblot

(1)制备10％的sds-page分离胶

按照快速配胶试剂盒说明书制备分离胶。取分离胶缓冲液和分离胶溶液各4ml混匀，加入80μl的改良型过硫酸铵溶液，混匀。将混合液注入制胶玻璃板中，加入适量无水乙醇覆盖于分离胶之上。分离胶凝固后倒去上层无水乙醇，取浓缩胶缓冲液和浓缩胶溶液各1.5ml混匀，加入30μl的改良型过硫酸铵溶液混匀。凝固后即用或置于潮湿4℃中备用。

(2)煮样

取不同样本总蛋白各50ng，加入四分之一体积的5×上样缓冲液，加热煮沸5min，立即放在冰上，完全冷却后瞬时离心，上样。

(3)sds-page电泳

80v恒压电泳通过积层胶，待蛋白样品进入分离胶后，改用120v恒压电泳2h，分离蛋白。

(4)转膜

将凝胶于转移缓冲液中浸泡30min。剪切1张与凝胶大小一致的pvdf膜，首先以甲醇浸泡30s，再以去离子水浸泡3至5min以去除甲醇，最后浸于转移缓冲液中浸泡20min。同时，将转移所用滤纸、泡沫垫及转子于转移缓冲液中完全浸透。按一定顺序组装电泳转移装置：阳极→泡沫垫→3张whatman3mm滤纸→pvdf膜→凝胶→3张whatman3mm滤纸→泡沫垫→阴极，排除气泡后封闭转移装置，300ma，室温转移60-120min。

(5)封闭

转膜结束后，将做好标记的pvdf膜置于杂交盒中，加入适量封闭液(快速封闭液1：100稀释)，室温摇床封闭2～4h。

(6)杂交

tbs-t洗膜3次，每次10min，加入1:200稀释的一抗，4℃杂交过夜。tbs-t洗膜3次，每次10min，然后加入1:5000稀释二抗，室温杂交1h。tbs-t洗膜3次，每次10min后扫描成像。

3、结果

3.1检测肺腺癌组织中rcc2基因扩增水平

通过对6对临床配对的肺腺癌(t)与癌旁(n)组织的dna进行测序，结果发现肺腺癌(t)组织中的rcc2基因扩增水平显著高于癌旁(n)组织。

3.2检测肺腺癌组织中rcc2的mrna水平

通过对6对临床配对的肺腺癌(t)与癌旁(n)组织的mrna表达水平进行rt-qpcr检测，结果发现肺腺癌(t)组织中的rcc2基因的mrna表达水平显著高于癌旁(n)组织。

3.3westernblot方法检测肺腺癌组织中rcc2的蛋白表达情况

图3为westernblot检测6对临床配对的肺腺癌(t)与癌旁(n)组织中rcc2蛋白表达水平的结果。从该结果可以看出，在配对肺腺癌样本中rcc2蛋白表达水平显著高于癌旁组织。

3.4免疫组化方法检测肺腺癌癌组织中rcc2的蛋白表达情况

图4为免疫组化方法检测临床肺腺癌样本病理切片中rcc2的表达结果，经秩和检验分析发现rcc2蛋白在肺腺癌组织中表达明显高于癌旁组织，且与肺腺癌浸润深度，淋巴结转移及临床分期显著相关。

3.5rcc2的表达情况与腺癌患者的生存期的关系

图5为kaplan-meier法(log-rank检验)分析肺腺癌患者的生存期结果，结果显示rcc2表达高的患者预后较差(左：组织芯片数据；中：tcga数据；右：geo数据)，且经过cox回归分析可知，rcc2可作为判断肺腺癌患者预后的独立影响因子。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110>哈尔滨医科大学

<120>一种与肺腺癌转移及预后相关的分子标记物及其应用

<130>klpi170138

<160>2

<170>patentin3.5

<210>1

<211>19

<212>dna

<213>人工序列

<400>1

ttcctttgggtgccctgaa19

<210>2

<211>22

<212>dna

<213>人工序列

<400>2

ggcagaatctgtccatctttcg22