分子检测小菜蛾对多杀霉素抗性的方法及引物对与流程

本发明属于生物技术领域，涉及分子检测小菜蛾对多杀霉素抗性的方法及引物对。

技术背景

小菜蛾(plutellaxylostella)属于鳞翅目菜蛾科，英文名diamondbackmoth，是世界性十字花科蔬菜和油菜害虫，全球每年造成的损失和防治费用高达四五十亿美元。20世纪80年代中后期以来，小菜蛾在我国持续大面积暴发成灾，尤其以华南和西南省份为害严重。据统计，近年来我国蔬菜种植面积接近3亿亩/年，已是世界第一大蔬菜种植和生产国，因小菜蛾为害造成的蔬菜减产和治理费用极其高昂。目前，农业生产上对小菜蛾的防治仍以化学农药为主，由于杀虫药剂的不合理使用及小菜蛾本身的生物学特性，导致其对几乎所有常用杀虫剂均产生了抗性。我国田间小菜蛾种群的抗药性发展速度极快，并导致蔬菜农药残留超标严重威胁农产品质量安全，小菜蛾抗药性治理形势不容乐观。

多杀霉素类化合物(spinosyns)是美国陶氏益农公司在20世纪90年代初期开发的一类天然杀虫产品，属大环内酯类化合物，由土壤放线菌刺糖多孢菌saccharopolysporaspinosamertz&yao在培养介质中经有氧发酵而得的次级代谢产物，包括20多种活性组分。第一代商业化spinosyns产品多杀霉素(spinosad)首先在美国登记用于作物害虫防治，由spinosynsa(主要成分)和spinosynsd(次要成分)两种化合物混合而成，有很高的生物活性，而且对非靶标生物的毒性很低，对人和其它哺乳动物非常安全。但是，除小菜蛾外，目前已报道包括烟芽夜蛾、家蝇、甜菜夜蛾、果蝇、美洲菊斑潜蝇、棉铃虫和西花蓟马等多个目的田间采集种群和室内选育品系对该药剂产生了较为严重的抗药性。

从现有研究报道来看，只有小部分研究结论表明昆虫对多杀霉素抗性可能与代谢相关，多数研究结果支持靶标抗性机理。perry等(2007)利用基因敲除技术沉默了果蝇的nachrdα6亚基，发现该基因的功能缺失致使果蝇对多杀霉素产生1181倍的抗性，推测在其它物种中nachrα6的基因突变可能会导致对多杀霉素的抗性。baxter等(2010)在对多杀霉素极高抗品系(抗性约18,600倍)的研究中取得进展，发现抗多杀霉素小菜蛾nachrpxα6亚基存在错误剪接，使该基因在翻译过程中发生提前终止，导致第三跨膜区之后的蛋白缺失。家蝇抗多杀霉素的研究也显示是基于靶标的抗性机理，但通过比较家蝇的nachrmdα6亚基抗性和敏感品系该基因选择性剪接、mrna表达水平及rna编辑等转录后调控因子，表明nachrmdα6基因在家蝇对多杀霉素的抗性形成中未起作用(gao等，2007a)。并且mdα5和mdβ3也没有发现与抗性相关的基因突变(gao等，2007b)。

技术实现要素：

本发明的目的是针对现有技术中小菜蛾对杀虫剂多杀霉素抗性检测方法灵敏度低、周期长、材料要求高等问题，根据我们对小菜蛾抗多杀霉素的分子机理的研究结果，提供一种分子检测小菜蛾对多杀霉素抗性的方法及引物对。

本发明的目的可通过以下技术方案实现：

烟碱型乙酰胆碱受体α6亚基tm4缺失突变作为靶标在分子检测小菜蛾对多杀霉素抗性中的应用；所述的烟碱型乙酰胆碱受体α6亚基tm4缺失突变是指烟碱型乙酰胆碱受体α6亚基基因第十二号外显子区域发生9个碱基的缺失突变，导致其编码蛋白的第四跨膜结构域由fclfvftlftiiatvavll组成的19个氨基酸突变为由fclfvftlfttvavll组成的16个氨基酸；小菜蛾多杀霉素敏感品系烟碱型乙酰胆碱受体α6第四跨膜区tm4为fclfvftlftiiatvavll组成的19个氨基酸构成的疏水结构域；多杀霉素抗性品系烟碱型乙酰胆碱受体α6第四跨膜区tm4为fclfvftlfttvavll组成的16个氨基酸。其中涉及的小菜蛾烟碱型乙酰胆碱受体α6亚基基因cdna序列来自genbank(gu207835andgq247883)。

分子检测小菜蛾对多杀霉素抗性的方法，通过检测烟碱型乙酰胆碱受体α6亚基基因第十二号外显子区域是否发生9个碱基的缺失突变从而判定待测小菜蛾对多杀霉素的抗性，发生了所述的9个碱基的缺失突变的小菜蛾具有对多杀霉素抗性，未发生所述的9个碱基的缺失突变的小菜蛾不具备对多杀霉素抗性；烟碱型乙酰胆碱受体α6亚基基因第十二号外显子区域发生9个碱基的缺失突变导致其编码蛋白的第四跨膜结构域由fclfvftlftiiatvavll组成的19个氨基酸突变为由fclfvftlfttvavll组成的16个氨基酸。

本发明所述的方法，优选包括用seqidno.1所示的特异性正向引物f和seqidno.2所示的特异性反向引物r(5’端由fam进行荧光标记)对烟碱型乙酰胆碱受体α6亚基基因进行pcr扩增，通过对pcr产物进行毛细管电泳，根据毛细管电泳图谱直接鉴定小菜蛾个体α6亚基tm4跨膜区的编码基因是否存在由9bp的碱基缺失导致的iia氨基酸的缺失突变及其具体类型，一次性区分该个体为对多杀霉素的敏感纯合子、抗性杂合子和抗性纯合子。

所述的根据pcr产物的毛细管电泳图谱快速鉴定烟碱型乙酰胆碱受体α6亚基是否发生tm4缺失突变及其具体类型，一次性区分出两个位点敏感纯合子、抗性杂合子和抗性纯合子的方法为：利用上述专用引物对扩增小菜蛾烟碱型乙酰胆碱受体α6亚基，若pcr产物经毛细管电泳后显示为1个112bp的单峰，则检测的小菜蛾个体为多杀霉素敏感型纯合子(图2a)；若pcr产物经毛细管电泳后显示为1个112bp和1个103bp的双峰，则检测的小菜蛾个体为多杀霉素抗性杂合子(图2b)；若pcr产物经毛细管电泳后显示为1个103bp的单峰，则检测的小菜蛾个体为多杀霉素抗性型纯合子(图2c)。

所述的分子检测方法，优选包含以下步骤：

(1)提取单头小菜蛾幼虫或成虫的基因组dna；

(2)利用seqidno.1所示的特异性正向引物f和seqidno.2所示的特异性反向引物r，对上一步提取的小菜蛾基因组dna进行pcr扩增；

(3)将上一步获得的pcr产物进行毛细管电泳，通过毛细管电泳图谱检测烟碱型乙酰胆碱受体α6亚基tm4跨膜区碱基缺失情况，一次性区分检测小菜蛾个体是否为烟碱型乙酰胆碱受体α6亚基第四跨膜结构域缺失3个氨基酸的多杀霉素抗性个体。

其中pcr反应体系25ul：12.5ul2xgcbufferi，1.25ulataqdna聚合酶,1ul单头小菜蛾样本的基因组dna，1ul10mmdntps，10mm的引物各1ul，加双蒸水至反应总体积为25ul；pcr反应程序：94℃预变性3min，然后循环数为35：94℃变性30s，50℃退火30s，72℃延伸30s。

用于分子检测小菜蛾对多杀霉素抗性的引物对，由seqidno.1所示的特异性正向引物f和seqidno.2所示的特异性反向引物r组成。

一种用于快速鉴定小菜蛾对多杀霉素抗性的试剂盒，包含本发明所述的引物对。

本发明所述的引物对在制备分子检测小菜蛾对多杀霉素抗性中的应用。

本发明所述的引物对在分子检测小菜蛾对多杀霉素抗性中的应用。

本发明所述的试剂盒在分子检测小菜蛾对多杀霉素抗性中的应用。

有益效果

发明人研究发现小菜蛾烟碱型乙酰胆碱受体α6亚基tm4跨膜结构域缺失iia氨基酸与多杀霉素抗性相关，且经过外源表达实验进行功能验证分析，明确了表达缺失突变的细胞对[³h]-α-bungarotoxin的亲和性降低。本发明基于上述发现建立了小菜蛾对多杀霉素抗性靶标的分子检测方法。

本发明与常规的生物测定技术相比，其优点和积极效果表现在：(1)快速：常规生测技术(包括抗性水平测定、诊断剂量分析等)需要采集试虫并繁殖到一定规模才可以进行检测，至少需要2周时间，本发明可直接检测田间小菜蛾个体，从取得样本到获得检测结果在12个小时以内(若送公司进行毛细管电泳也仅需24小时)。(2)准确：生物测定技术要求试虫标准化，一般要求待测试虫为小菜蛾3龄中期幼虫，取样误差和虫体之间的差异对结果影响很大，造成结果的不稳定性。本技术由于采取了核苷酸扩增策略，通过直接判读毛细管电泳图谱在可快速操作的基础上实现了准确性的最强化。(3)材料要求少：生物测定技术中测定一个标准曲线至少需要200-300头标准试虫，这些试虫的饲养需要花费一定的人力、物力。而本发明对一个种群的检测只需要50头左右，即可判定种群中突变个体的基因型，计算出与抗性有关的等位基因突变频率。(4)灵敏度高：传统生物测定检测技术是一种相对粗略检测抗性水平的方法，不能检测早期多杀霉素抗性或低频率抗性个体，本发明基于小菜蛾对多杀霉素抗性相关的缺失突变，设计特异性引物扩增目的片段，根据毛细管电泳图谱可以直接判断待测个体的基因型。通过一定数量的个体的测定，可以确定某个种群中敏感纯合子、抗性杂合子和抗性纯合子的频率，为高水平多杀霉素的抗药性预警和小菜蛾化学治理提供了重要依据。

附图说明

图1小菜蛾烟碱型乙酰胆碱受体α6亚基基因氨基酸序列比对图

图示小菜蛾烟碱型乙酰胆碱受体α6亚基cdna序列，其中sz-ps序列来自小菜蛾敏感品系，该基因第四跨膜区tm4为fclfvftlftiiatvavll组成的19个氨基酸；spin-del序列来自小菜蛾多杀霉素抗性品系，该基因第四跨膜区tm4为fclfvftlfttvavll组成的16个氨基酸，即缺失iia氨基酸。

图2小菜蛾烟碱型乙酰胆碱受体α6亚基基因突变区域pcr产物毛细管电泳图谱

图示为利用seqidno.1所示的特异性正向引物f和seqidno.2所示的特异性反向引物r(5’端由fam进行荧光标记)对小菜蛾基因组dna模板进行pcr扩增，产物经毛细管电泳后获得的图谱。若pcr产物经毛细管电泳后显示为1个112bp的单峰，则检测的小菜蛾个体为多杀霉素敏感型纯合子(图2a)；若pcr产物经毛细管电泳后显示为1个112bp和1个103bp的双峰，则检测的小菜蛾个体为多杀霉素抗性杂合子(图2b)；若pcr产物经毛细管电泳后显示为1个103bp的单峰，则检测的小菜蛾个体为多杀霉素抗性型纯合子(图2c)

具体实施方式

实施例1

本实施例选取了室内敏感品系sz-ps、经多杀菌素多代选育获得的抗性品系spin-del和田间采集的合肥(hf)、济南(jn)、南京(nj)、昆山(ks)种群进行了生物测定，并运用本发明优选的技术检测了各种群携带的等位基因频率。其中hf、jn、nj和ks种群分别于2015年5-6月份间采集自安徽省合肥市小白菜寄主、山东市济南市甘蓝寄主、江苏省南京市甘蓝寄主和江苏省昆山市小白菜寄主。上述各种群对多杀霉素的生物测定数据见表1：

表1

注：sz-ps品系为室内饲养多年的敏感材料，其对多杀霉素的致死中浓度(lc50值)在本实验中作为对照基线，以此测定其他5个种群的抗性水平。

根据本发明优选的分子检测技术，其具体实施步骤包括：

1.单头小菜蛾幼虫基因组dna的提取：分别随机挑取上述种群的25-30头四龄幼虫，使用axyprep^tmmultisourcegenomicdnaminiprepkit基因组试剂盒提取全基因组dna。

2.以各种群小菜蛾的基因dna模板进行烟碱型乙酰胆碱受体α6亚基基因突变区域的pcr扩增。

(1)设计小菜蛾钠离子通道基因的特异性引物，上游引物f序列为:5’-ttgatgacagtgattgtgtgtgtt-3’(seqidno.1)、下游引物r序列为:5’-tcactgcacgatgatgtgcgg-3’(seqidno.2)，引物合成由上海invitrogen公司完成。

(2)在0.2ml的pcr管中完成总反应体积为25μl的目的片段扩增：

(3)pcr反应程序为：首先94℃预变性3min，进行循环数为35：94℃变性30s，50℃退火30s，72℃延伸30s，最后72℃延伸10min。

3.对6个种群各个样本获得的pcr产物进行毛细管电泳，根据电泳图谱结果快速鉴定烟碱型乙酰胆碱受体α6亚基是否发生tm4缺失突变及其具体类型。

4.计算小菜蛾各种群携带抗性等位基因的突变频率。

小菜蛾烟碱型乙酰胆碱受体α6亚基介导的多杀霉素抗性等位基因频率的计算方法如下：

抗性等位基因频率＝(抗性纯合子个体数×2+抗性杂合子个体数)/(总检测个体数×2)

根据上述计算方法，测得本例涉及的6个种群检测个体的基因型和抗性等位基因突变频率如下：

表2

注：ss表示敏感纯合子、rs表示抗性杂合子、rr表示抗性纯合子

通过本实施案例，本发明优选的分子检测技术可以快速测定不同种群碱型乙酰胆碱受体α6亚基是否发生tm4缺失突变及其具体类型，并可简便地计算该种群对多杀霉素靶标性抗性突变的等位基因频率。说明书中所述的烟碱型乙酰胆碱受体α6亚基tm4缺失突变是指该基因第四跨膜结构域由fclfvftlftiiatvavll组成的19个氨基酸突变为由fclfvftlfttvavll组成的16个氨基酸。

实施例2

本例使用的科研材料为小菜蛾敏感品系sz-ps与多杀霉素抗性品系spin-del杂交f1代进行自交获得的f2代个体。本发明优选的技术方案在本实例中用于计算小菜蛾个体携带抗性突变的情况，并根据孟德尔遗传规律和抗性原理确定本发明发现的iia突变与多杀霉素抗性的遗传连锁关系。

1.随机选取小菜蛾敏感品系sz-ps与多杀霉素抗性品系spin-del各60头进行室内交配，成虫以10％的蜂蜜水辅助营养，产卵于萝卜苗温室养殖。待幼虫羽化后群体交配产卵获得f2代研究材料。

2.随机选取f2代个体经区分剂量(10ppm)处理，随机挑取13头存活和47头死亡个体提取基因组。所有个体基因组dna的提取采用axyprep^tmmultisourcegenomicdnaminiprepkit基因组试剂盒。

3.利用第一步中提取的基因dna模板进行烟碱型乙酰胆碱受体α6亚基基因目的片段的pcr扩增：

(1)设计小菜蛾钠离子通道基因的特异性引物，上游引物f序列为:5’-ttgatgacagtgattgtgtgtgtt-3’(seqidno.1)、下游引物r序列为:5’-tcactgcacgatgatgtgcgg-3’(seqidno.2)，引物合成由上海invitrogen公司完成。

(2)在0.2ml的pcr管中完成总反应体积为25μl的目的片段扩增：

(3)pcr反应程序为：首先94℃预变性3min，进行循环数为35：94℃变性30s，50℃退火30s，72℃延伸30s，最后72℃延伸10min。

4.对各样本获得的pcr产物进行毛细管电泳，根据电泳图谱结果快速鉴定烟碱型乙酰胆碱受体α6亚基是否发生tm4缺失突变及其具体类型。

根据所述的检测方法，检测各个体的基因型信息如下：

①：经区分剂量处理存活个体共检测13头，其基因型全部为rr型，即13头个体的pcr产物毛细管电泳图谱均为1个103bp的单峰。

②：经区分剂量处理死亡个体共检测47头，经pcr扩增后的毛细管电泳图谱显示，其中32头个体为rs型基因型，即为1个103bp的峰和112bp的峰；另外15头个体为112bp的单峰。

表3

根据孟德尔遗传分离规律和相关的抗性基本原理，结合实施例1的检测数据，发现敏感品系个体全部为敏感型α6亚基ss，抗性品系全部为突变型α6亚基rr，f2代经区分剂量处理存活后个体均为突变型α6亚基rr，处理死亡组的47头个体中32头为杂合性突变体rs，15头个体为敏感型α6亚基ss(即rs：ss＝2:1，符合孟德尔遗传分离规律)。本例根据电泳图谱结果快速鉴定烟碱型乙酰胆碱受体α6亚基是否发生tm4缺失突变及其具体类型，并根据实验结果从遗传上证实本研究发现的小菜蛾nachrα6亚基iia缺失突变与多杀霉素抗性连锁。