一种山茶藻斑病病原的分离和培养方法与流程

本发明主要涉及病原的分离和培养领域，具体是一种山茶藻斑病病原的分离和培养方法。

背景技术：

山茶(Camellia japonica)是重要绿化苗木之一。随着山茶花生产基地的不断扩大，园林绿化的普遍应用，国内外品种的频繁交换，苗木大范围的运输流通，再加上全球气候变暖等因素，山茶花的病害发生呈上升趋势，尤以山茶藻斑病的发生最为明显。山茶藻斑病发生于植株叶片及嫩枝上，以叶片为主。发病初期，感病叶片上产生细小圆点，灰绿色或灰白色，上覆疏松污白色丝状物，放射状向四周扩展，以后逐渐扩展，形成圆形或不规则形病斑，病斑中部灰褐色或深褐色，边缘仍为绿色，病斑稍隆起，表面呈毛毡状，直径0.5-1.2cm，病斑背面凹陷。

山茶藻斑病的发生轻则影响植株正常生长，导致植株生长不良、品质下降，从而丧失观赏价值及绿化效果；重则引起整株死亡，造成重大经济损失，给山茶花产业带来较大影响。在生产实践中，人们主要使用化学农药来控制山茶藻斑病的发生，但药剂防治的关键期和施药次数的确定主要是凭经验，缺乏科学依据，以致防治效果不理想，而只有掌握了病原的生理特性和侵染循环，才能科学的制定防治时期和防治对策。但是山茶藻斑病的病原分离困难，一般分离时易受细菌和真菌的污染，因此，急需建立山茶藻斑病病原的分离和培养方法，继而研究病原的生理特性及与病害发生的内在关系，为该病害的有效防控提供理论依据。

技术实现要素：

为解决现有技术的不足，本发明提供了一种山茶藻斑病病原的分离和培养方法，它能快速有效的将山茶藻斑病病原分离和培养，防止受到细菌和真菌的污染。

本发明为实现上述目的，通过以下技术方案实现：

一种山茶藻斑病病原的分离和培养方法，包括病斑采集、消毒处理、分离培养、病原纯化、培养病原藻，具体步骤如下：

步骤一：病斑采集：采集新鲜的病叶标本装入洁净的保鲜袋，带回实验室用自来水冲洗20-30min，备用；

步骤二：消毒处理：选择步骤一中病斑较多的叶片，在超净工作台无菌环境下，用无菌剪刀剪下直径4-6mm的病组织圆片，用体积比75％的酒精处理20-30s，然后用无菌水冲洗4-6次，备用；

步骤三：分离培养：将步骤二中经无菌水冲洗的病组织用无菌滤纸吸取表面水分，然后用镊子将病组织分别放入到Chu10营养基或营养液中，编号、密封后放入到温度22-28℃的光照培养箱内，按照光照12h，黑暗12h进行培养7-10d，观察其变化；

步骤四：病原纯化：待步骤三中培养的病组织周围有疑似藻类产生，分别将藻类似物在装有Chu10营养基的培养皿上斜45度角涂抹4-5次，做好标记，放入到温度22-28℃的光照培养箱内，按照光照12h，黑暗12h进行培养，得到藻类病原；

步骤五：培养病原藻：将步骤四中分离得到的藻类病原，转接到Chu10营养液中，然后在温度22-28℃、光照12h、黑暗12h的条件下以50-100r/min的转速摇床振荡培养7-10d，最终得到纯化的山茶藻斑病病原。

上述山茶藻斑病病原的分离和培养方法，所述Chu10营养液由如下组份的原料制成：3.67g/100mL CaCl₂·2H₂O溶液1份，3.69g/100mL MgSO₄·7H₂O溶液1份，1.26g/100mL NaHCO₃溶液1份，0.87g/100mL K₂HPO₄溶液1份，8.50g/100mL NaNO₃溶液1份，2.84g/100mL Na₂SiO₃·9H₂O溶液1份，3.35g/100mL的柠檬酸和3.35g/100mL的柠檬酸铁混合得到的柠檬酸铁溶液1份，微量营养素溶液1份，蒸馏水1000份。

上述山茶藻斑病病原的分离和培养方法，所述微量营养素溶液是由1000mL的蒸馏水中加入Na₂EDTA 50.0mg、H₃BO₃618.0mg、CuSO₄·5H₂O 19.6mg、ZnSO₄·7H₂O 44.0mg、CoCl₂·6H₂O 20.0mg、MnCl₂·4H₂O 12.6mg、Na₂MoO₄·2H₂O 12.6mg制备而成。

上述山茶藻斑病病原的分离和培养方法，所述Chu10营养基是由1000mL的Chu10营养液中加入15-20g的琼脂粉，加热溶解而成。

上述山茶藻斑病病原的分离和培养方法，步骤三中所述Chu10营养基装入到培养皿中，每个培养皿放5-8个病组织圆片，并在皿底记上编号，密封后对其进行培养。

上述山茶藻斑病病原的分离和培养方法，步骤四中所述藻类似物用蘸取无菌水的无菌棉签在病斑边缘刮取，然后涂布到Chu10固体培养基上。

上述山茶藻斑病病原的分离和培养方法，步骤三中所述Chu10营养液装入到三角瓶中，每个三角瓶放6-10个病组织圆片，在瓶身标号，密封后对其进行培养。

上述山茶藻斑病病原的分离和培养方法，步骤四中所述藻类似物用三角形玻璃涂布棒涂布到Chu10固体培养基上。

上述山茶藻斑病病原的分离和培养方法，步骤五中所述藻类病原转接到装有Chu10营养液的耐高温带无菌透气膜瓶盖的PC组培瓶中，进行摇床振荡培养。

上述山茶藻斑病病原的分离和培养方法，步骤五中所述藻类病原转接到装有Chu10营养液的试管中，用无菌透气封口膜封住管口，膜用细线绑定，进行摇床振荡培养。

对比现有技术，本发明的有益效果是：

本发明山茶藻斑病病原的分离和培养方法，它能快速有效的将山茶藻斑病病原分离和培养，防止受到细菌和真菌的污染，整个过程污染少，周期短，纯化效果好，具体体现在：

1)本发明采用的新鲜病组织病原活性强，病组织用自来水冲洗后能最大程度减少病部组织表面的其它微生物，免除病组织中其它微生物的干扰；

2)本发明采用75％的酒精对病组织圆片进行处理，消毒迅速，不但可免除病组织其它杂菌的干扰，又能保持病组织病原的活性；

3)本发明采用将无菌水冲洗的病组织用无菌滤纸吸取表面水分，有效降低了分离过程中的污染问题，使得污染率能降低30％以上；

4)本发明采用的Chu10营养液比常用的藻类培养液Basel和BG11更利于山茶藻斑病病原的生长和繁殖，病藻在Chu10营养液中一般培养7-10d后藻类进入对数生长期，而在Basel和BG11营养液中一般需培养15d藻类才进入对数生长期；

5)本发明PC组培瓶培养病原藻大多适用于大量藻液培养，试管培养病原藻大多在室内病藻的生物学特性等测定时采用；

6)本发明采用摇床低转速对山茶藻斑病病原振荡培养，解决了病原培养过程中通气问题，同时能使藻细胞和营养液充分接触，生长迅速。

附图说明

附图1是本发明山茶藻斑病症状；

附图2是本发明实施例1中病组织的分离；

附图3是本发明实施例2中病组织的分离；

附图4是本发明病原藻的PC组培瓶培养；

附图5是本发明病原藻的试管培养。

具体实施方式

结合附图和具体实施例，对本发明作进一步说明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所限定的范围。需要说明的是，下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1：一种山茶藻斑病病原的分离和培养方法，包括病斑采集、消毒处理、分离培养、病原纯化、培养病原藻，具体步骤如下：

步骤一：病斑采集：采集新鲜的病叶标本装入洁净的保鲜袋，带回实验室用自来水冲洗20min，备用；

步骤二：消毒处理：选择步骤一中病斑较多的叶片，在超净工作台无菌环境下，用无菌剪刀剪下直径4mm的病组织圆片，用体积比75％的酒精处理20s，然后用无菌水冲洗4次，备用；

步骤三：分离培养：将步骤二中经无菌水冲洗的病组织用无菌滤纸吸取表面水分，然后用镊子将病组织分别放入装有Chu10营养基的培养皿中，每个放5个病组织圆片，并在皿底记上编号，密封后放入到温度22℃的光照培养箱内，按照光照12h，黑暗12h进行培养10d，观察其变化；

步骤四：病原纯化：待步骤三中培养的病组织周围有疑似藻类产生，用蘸取无菌水的无菌棉签在病斑边缘刮取藻类似物，分别将刮取的藻类似物在装有Chu10营养基的培养皿上斜45度角涂抹4次，做好标记，放入到温度22℃的光照培养箱内，按照光照12h，黑暗12h进行培养，得到藻类病原；

步骤五：培养病原藻：将步骤四中分离得到的藻类病原，转接到装有Chu10营养液的耐高温带无菌透气膜瓶盖的PC组培瓶中，然后在温度22℃、光照12h、黑暗12h的条件下以50r/min的转速摇床振荡培养10d，最终得到纯化的山茶藻斑病病原。

实施例2：一种山茶藻斑病病原的分离和培养方法，包括病斑采集、消毒处理、分离培养、病原纯化、培养病原藻，具体步骤如下：

步骤一：病斑采集：采集新鲜的病叶标本装入洁净的保鲜袋，带回实验室用自来水冲洗30min，备用；

步骤二：消毒处理：选择步骤一中病斑较多的叶片，在超净工作台无菌环境下，用无菌剪刀剪下直径6mm的病组织圆片，用体积比75％的酒精处理30s，然后用无菌水冲洗6次，备用；

步骤三：分离培养：将步骤二中经无菌水冲洗的病组织用无菌滤纸吸取表面水分，然后用镊子将病组织将病组织分别放入装有Chu10营养液的三角瓶中，每个放10个病组织圆片，在瓶身标号，密封后放入到温度28℃的光照培养箱内，按照光照12h，黑暗12h进行培养9d，每天对瓶子进行轻微地摇晃，观察其变化；

步骤四：病原纯化：待步骤三中培养的病组织周围有疑似藻类产生，分别用三角形玻璃涂布棒将藻类似物在装有Chu10营养基的培养皿上斜45度角涂抹5次，做好标记，放入到温度28℃的光照培养箱内，按照光照12h，黑暗12h进行培养，得到藻类病原；

步骤五：培养病原藻：将步骤四中分离得到的藻类病原，转接到Chu10营养液中，然后在温度28℃、光照12h、黑暗12h的条件下以100r/min的转速摇床振荡培养9d，最终得到纯化的山茶藻斑病病原。

实施例3：一种山茶藻斑病病原的分离和培养方法，包括病斑采集、消毒处理、分离培养、病原纯化、培养病原藻，具体步骤如下：

步骤一：病斑采集：采集新鲜的病叶标本装入洁净的保鲜袋，带回实验室用自来水冲洗25min，备用；

步骤二：消毒处理：选择步骤一中病斑较多的叶片，在超净工作台无菌环境下，用无菌剪刀剪下直径5mm的病组织圆片，用体积比75％的酒精处理25s，然后用无菌水冲洗5次，备用；

步骤三：分离培养：将步骤二中经无菌水冲洗的病组织用无菌滤纸吸取表面水分，然后用镊子将病组织分别放入装有Chu10营养基的培养皿中，每个放7个病组织圆片，并在皿底记上编号，密封后放入到温度25℃的光照培养箱内，按照光照12h，黑暗12h进行培养8d，观察其变化；

步骤四：病原纯化：待步骤三中培养的病组织周围有疑似藻类产生，用蘸取无菌水的无菌棉签在病斑边缘刮取藻类似物，分别将刮取的藻类似物在装有Chu10营养基的培养皿上斜45度角涂抹5次，做好标记，放入到温度25℃的光照培养箱内，按照光照12h，黑暗12h进行培养，得到藻类病原；

步骤五：培养病原藻：将步骤四中分离得到的藻类病原，转接到Chu10营养液中，然后在温度25℃、光照12h、黑暗12h的条件下以90r/min的转速摇床振荡培养8d，最终得到纯化的山茶藻斑病病原。

实施例4：一种山茶藻斑病病原的分离和培养方法，包括病斑采集、消毒处理、分离培养、病原纯化、培养病原藻，具体步骤如下：

步骤一：病斑采集：采集新鲜的病叶标本装入洁净的保鲜袋，带回实验室用自来水冲洗25min，备用；

步骤二：消毒处理：选择步骤一中病斑较多的叶片，在超净工作台无菌环境下，用无菌剪刀剪下直径5mm的病组织圆片，用体积比75％的酒精处理25s，然后用无菌水冲洗5次，备用；

步骤三：分离培养：将步骤二中经无菌水冲洗的病组织用无菌滤纸吸取表面水分，然后用镊子将病组织将病组织分别放入装有Chu10营养液的三角瓶中，每个放8个病组织圆片，在瓶身标号，密封后放入到温度26℃的光照培养箱内，按照光照12h，黑暗12h进行培养7d，每天对瓶子进行轻微地摇晃，观察其变化；

步骤四：病原纯化：待步骤三中培养的病组织周围有疑似藻类产生，分别用三角形玻璃涂布棒将藻类似物在装有Chu10营养基的培养皿上斜45度角涂抹5次，做好标记，放入到温度26℃的光照培养箱内，按照光照12h，黑暗12h进行培养，得到藻类病原；

步骤五：培养病原藻：将步骤四中分离得到的藻类病原，转接到装有Chu10营养液的耐高温带无菌透气膜瓶盖的PC组培瓶中，然后在温度26℃、光照12h、黑暗12h的条件下以80r/min的转速摇床振荡培养7d，最终得到纯化的山茶藻斑病病原。

实施例5：Chu10营养液的制备：在1000mL蒸馏水中，加入经高压蒸汽处理无菌的3.67g/100mL CaCl₂·2H₂O溶液1mL，3.69g/100mL MgSO₄·7H₂O溶液1mL，1.26g/100mL NaHCO₃溶液1mL，0.87g/100mL K₂HPO₄溶液1mL，8.50g/100mL NaNO₃溶液1mL，2.84g/100mL Na₂SiO₃·9H₂O溶液1mL，3.35g/100mL的柠檬酸和3.35g/100mL的柠檬酸铁混合得到的柠檬酸铁溶液1mL，微量营养素溶液1mL混合而成。

所述微量营养素溶液是由1000mL的蒸馏水中加入Na₂EDTA 50.0mg、H₃BO₃618.0mg、CuSO₄·5H₂O 19.6mg、ZnSO₄·7H₂O 44.0mg、CoCl₂·6H₂O 20.0mg、MnCl₂·4H₂O 12.6mg、Na₂MoO₄·2H₂O 12.6mg制备而成。

所述Chu10营养基是由1000mL的Chu10营养液中加入20g的琼脂粉，加热溶解而成。

实验例

为了验证Chu10营养液对山茶藻斑病病原生长的影响，本发明选用Chu10营养液、Basel营养液、BG11营养液对分离的山茶藻斑病病原进行培养，培养3d后每隔48h取样测OD₆₈₀值，观察不同营养液对病原生长的影响，其结果如下：

表1不同营养液对山茶藻斑病病原生长的影响

备注：A₀表示初始OD₆₈₀值，A_n表示培养n天的OD₆₈₀值，n表示培养天数。

实验结果表明：山茶藻斑病病原在Chu10营养液中进入对数生长期比Basel营养液和BG11营养液更早，且培养相同天数的情况下，山茶藻斑病病原在Chu10营养液中OD₆₈₀更高，实验证明Chu10营养液比Basel营养液和BG11营养液更利于山茶藻斑病病原的生长和繁殖。