一种黑鲷DNA条形码标准检测序列及其应用的制作方法

本发明涉及物种鉴定技术领域，涉及一种黑鲷dna条形码标准检测序列及其在物种鉴定中的应用。

背景技术：

黑鲷(学名：acanthopagrusschlegelii)，又名黑棘鲷，俗称黑加吉、乌翅等，为辐鳍鱼纲鲈形目鲷科棘鲷属的鱼类，是我国沿海最受欢迎的经济鱼类之一,也是重要的海水养殖品种。主要分布于西太平洋区，包括中国东海、香港、日本等海域。黑鲷为广温、广盐性鱼类，最大个体长可达45厘米，一般4龄之前的生长速度较快。目前，对黑鲷的物种识别仅局限于形态学鉴定，而且专业鉴定人员很少。此外，对黑鲷地方特有种进行有效鉴定对培育优良杂交鲷品种具有很重要的意义。

dna条形码技术(dnabarcoding)是指用基因组内一段标准的、短的dna片段来鉴定物种的一项分子鉴定新技术，可以快速、准确的进行物种鉴定。目前在动物中最常见的分子标记是线粒体细胞色素c氧化酶亚基i(cytochromecoxidasei,coi)基因的部分序列。dna条形码具有广泛的应用前景，在物种鉴定、分子进化、种群遗传、濒危物种保护等研究领域具有一定的发展潜力。dna条形码不同于以往的传统鉴别方法，对研究人员的专业技能并无较高要求，上至生物学家，下至普通生物爱好者，都可在短时间内掌握该技术。dna条形码技术摆脱了传统形态鉴定方法依赖长期经验的障碍，可实现快速准确的鉴定，是分子鉴定方法学上的创新，操作简单、效率高、应用广等特点无疑将改变整个物种鉴定领域的发展方向。运用dna条形码技术，可以很好的对黑鲷进行快速、有效的鉴定。

物种鉴定一直是分类学乃至几乎所有生物领域上的研究至关重要的基础步骤。因此，准确的对物种鉴定，特别是对那些稀有物种和具有保护意义的种类，分类鉴定工作就显得尤其重要。自从2003年，加拿大科学家hebert提出以coi基因做为dna条形码以来，越来越多的研究表明dna条形码在物种分类上具有高效可行性。大量的研究结果显示以coi基因为标记的dna条形码能够准确的对各类动物进行物种鉴定，可以选用coi基因作为各种动物条形码数据库的标准条形码。

该方法与传统的分类学方法互为佐证，不仅可以解决鉴定中标本残缺不全无法准确鉴定等问题，而且有利于快速鉴定。目前已有专门的鱼类数据库，其中包括1.5万多种鱼类的条形码数据。但是我国许多鱼类由于其特有性，没有足够的相关数据。也没有黑鲷的相关基因序列。

技术实现要素：

本发明的目的在于提出一种黑鲷dna条形码标准检测序列。

本发明的另一目的在于提供上述黑鲷dna条形码标准检测序列在物种鉴定中的应用。本发明所提供的黑鲷dna条形码标准检测序列有利于实现黑鲷的分子鉴定，能有效缩短鉴定时间。

为达此目的，本发明采用以下技术方案：

一种黑鲷dna条形码标准检测序列，该条形码标准检测序列为coi基因，其序列如seqidno:1所示(658bp)：

gaccctttatctcgtatttggtgcttgagctggaatagtaggaaccgccttaagtctgctcattcgagccgaattaagccaacctggcgctctcctaggagatgatcaaatttataatgtaattgttacagcacatgcgtttgtaataattttctttatagtaataccaattatgattgggggctttggaaattgattagtaccacttatgattggtgcccctgacatagcattcccccgtataaacaacataagcttctgacttcttcctccatcattcctcctgctgctagcttcttctggtgtcgaagctggggccggtaccgggtggacagtttaccccccactggcaggaaacctcgcccacgcaggtgcatcagttgacttaaccatcttttctcttcacctagccggaatttcatctattcttggggccatcaattttattaccactattatcaatatgaaaccgccagctatctcacaatatcaaacacccctatttgtgtgggccgttttaattactgctgtcctactcctcttgtccctcccagttcttgctgccggaattacaatactccttacagaccgaaatctaaataccaccttctttgacccagctggaggaggagaccctattctctatcaacacctattc。

一组用于扩增上述黑鲷dna条形码标准检测序列的通用引物，它包括两对通用引物，其中，一对通用引物的正向引物序列和反向引物序列分别如seqidno:2和seqidno:3所示；另一对通用引物的正向引物序列和反向引物序列分别如seqidno:4和seqidno:5所示，其中，r处的碱基为a或g，y处的碱基为c或t。

上述的黑鲷dna条形码标准检测序列、上述的通用引物在制备用于鉴定黑鲷的试剂盒中的应用。

一种用于鉴定黑鲷的试剂盒，它包括上述的通用引物。

上述的试剂盒，还包括pcr技术常用试剂。

一种重组载体，它包含上述的黑鲷dna条形码标准检测序列。

上述的黑鲷dna条形码标准检测序列、上述的通用引物、上述的试剂盒在鉴定黑鲷中的应用。

一种黑鲷的分子鉴定方法，它包括以下步骤：

(1)从待鉴定组织样本中分离提取基因组dna；

(2)以步骤(1)所提取的基因组dna为模板，采用两对通用引物，通过聚合酶链式反应进行扩增；

其中，一对通用引物的正向引物序列和反向引物序列分别如seqidno:2和seqidno:3所示；另一对通用引物的正向引物序列和反向引物序列分别如seqidno:4和seqidno:5所示；

seqidno:2如下：

5’-tgtaaaacgacggccagtcgactaatcataaagatatcggcac-3’；

seqidno:3如下：

5’-caggaaacagctatgacacttcagggtgaccgaagaatcagaa-3’；

seqidno:4如下：

5’-tgtaaaacgacggccagtcaaccaaccacaaagacattggcac-3’；

seqidno:5如下：

5’-caggaaacagctatgacacctcagggtgtccgaaraaycaraa-3’；其中，r处的碱基为a或g，y处的碱基为c或t，r或y的设立是用来扩增未知碱基的；

(3)将步骤(2)的聚合酶链式反应扩增产物用琼脂糖凝胶电泳进行分离，根据扩增产物的大小判定结果，如果能特异性扩增出710±10bp的条带，则将其进行测序分析；

(4)根据测序结果，如果与如seqidno:1所示的核苷酸序列的同源性在98％以上，即可判断该待鉴定组织为黑鲷。

上述的黑鲷分子鉴定方法，作为一种优选技术方案，步骤(2)中所述聚合酶链式反应的条件为：95℃变性2min；94℃、30s，55℃、30s，72℃、1min，35个循环；72℃延伸10min。

步骤(2)中所述聚合酶链式反应的反应体系(25μl)为：10×pcrbuffer2.5μl，dntpmixture(2.5mmeach)2.0μl，takarataq(5u/μl)0.3μl，fishf2_t1引物(10μm)0.5μl，fishr2_t1引物(10μm)0.5μl，vf2_t1引物(10μm)0.5μl，fr1d_t1引物(10μm)0.5μl，dna模板(约10ng/μl)1μl，ddh2o17.2μl。

上述黑鲷的分子鉴定方法流程图如图1所示。

相对于现有技术，本发明具有如下有益效果：

(1)本发明提供了一种用于鉴定黑鲷的dna条形码标准检测序列及该dna条形码标准检测序列的应用，实现了对标本中残缺不全无法准确鉴定的个体以及完整的个体采用可靠的dna分子鉴定技术，快速、准确的鉴定黑鲷；克服了现有技术中的如下不足：对残缺不全的个体基本上不能鉴定；对完整的个体鉴定需要对黑鲷形态非常熟悉的专业人员；与传统的形态学鉴定方法相比，有效的缩短了鉴定时间。

(2)本发明提供的分子鉴定方法中的pcr反应体系和反应条件，重复性高，经多次试验稳定性好。

附图说明

图1是本发明提供的黑鲷的分子鉴定方法的流程示意图。

图2是实施例1中的黑鲷肌肉组织的coi基因pcr扩增结果电泳鉴定图。

其中，泳道m为dna标准分子量标，泳道1、2为黑鲷肌肉组织的coi基因，检出大小为700bp左右的条带。

具体实施方式

下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。

实施例1：

1、待测样本的采集、保存与处理

从浸泡标本中剪取黑鲷的部分肌肉组织，保存在95％酒精中于-20℃冰箱中存放。

2、dna提取

酚-氯仿方法提取样品中的dna，于-20℃保存备用。

3、pcr引物合成

本方法选取2对通用引物：

fishf2_t1:

5’-tgtaaaacgacggccagtcgactaatcataaagatatcggcac-3’(seqidno:2)；

fishr2_t1:

5’-caggaaacagctatgacacttcagggtgaccgaagaatcagaa-3’(seqidno:3)；

vf2_t1:

5’-tgtaaaacgacggccagtcaaccaaccacaaagacattggcac-3’(seqidno:4)；

fr1d_t1:

5’-caggaaacagctatgacacctcagggtgtccgaaraaycaraa-3’(seqidno:5)。其中，r处的碱基为a或g，y处的碱基为c或t，r或y的设立是用来扩增未知碱基的。

4、pcr反应体系(25μl)

5、pcr反应程序

反应结束后，打开pcr仪，取出完成扩增的样品，于4℃保存

6、pcr产物检测

取2μlpcr产物，用1.5％琼脂糖凝胶电泳(120v，200ma，25min)，溴化乙锭染色。凝胶成像系统检测，电泳图谱如图2所示，检出大小约为710±10bp的条带，可初步判定待测样本可能是黑鲷。

7、基因序列测定

选取效果较好的pcr产物送至生物公司纯化后测序，测序结果显示其序列如seqidno:6所示，seqidno:6序列如下：

aaagaattggacctttatcttgtatttggtgcctgagccggaatagtgggaaccgctctaagccttctcattcgagccgaactaagccaacctggatcacttctgggcgatgatcaaatttataatgttattgtcactgcccatgccttcgtaataattttctttatagtaataccaattttaatcggaggatttggaaattgactcgtgccattaataatcggagcgcctgatatggcattcccacgaataaataacatgagtttctgacttctacctccctctttccttctactactagcctcctctggtgtcgaagccggggctggaacagggtggacagtatacccgccactcgcaggcaatcttgcccacgcaggagcatccgtagacctaacaattttctcactccacctagcaggtgtatcatcaattttaggtgcaattaacttcatcaccacaactattaatatgaaaccaccagccatctctcaataccaaacacctctgtttgtttgagctgtacttgtaacagctgtacttcttctcttatccctaccagttctagccgccggaattactatgcttcttacagatcgaaatctaaataccacattctttgatccagcaggaggaggggacccaattctatatcaacatctattctgattcttcggacaccctgaagtgtcatacttgtttccttgg。

经同源性比对发现，seqidno:6所示核苷酸序列与如seqidno.1所示核苷酸序列的同源性为99％，因而可判定该待测样本即为黑鲷的组织样本。

实施例2：

从鱼类组织样本(残缺不全，无法进行生物学鉴定)中选取2组肌肉组织样，保存在95％酒精中。选取的肌肉组织分属两组不同品种的鱼类，其中一组为黑鲷(5个样品)，另一组为其他品种(5个样品)，取样人根据具体信息做好品种记录并编号，实验操作人员在不清楚2组样本品种归属的情况下进行实验。采用与实施例1相同的实验方法进行实验，pcr产物测序结果显示其中一组的5个样品为黑鲷的组织样本，另一组的5个样品为非黑鲷的组织样本，实验结果同取样人记录信息完全一致。

上述实施例为本发明的较佳实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其它的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

sequencelisting

<110>镇江华大检测有限公司

<120>一种黑鲷dna条形码标准检测序列及其应用

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aattgttacagcacatgcgtttgtaataattttctttatagtaataccaattatgattgg180

gggctttggaaattgattagtaccacttatgattggtgcccctgacatagcattcccccg240

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taccaccttctttgacccagctggaggaggagaccctattctctatcaacacctattc658

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<213>人工序列

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tgtaaaacgacggccagtcaaccaaccacaaagacattggcac43

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<212>dna

<213>未知

<221>样品pcr扩增产物序列

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ctattctgattcttcggacaccctgaagtgtcatacttgtttccttgg708