本发明涉及一种基于trap1基因多态性位点基因型预测糖皮质激素治疗sle疗效的用途和试剂盒，属于医药卫生技术领域。
背景技术：
系统性红斑狼疮(systemiclupuserythematosus，sle)是一种典型的自身免疫性疾病，临床表现多样化，常累及多系统多器官，给患者本人带来了身体和精神上巨大痛苦，也给其家庭和社会带来了沉重经济负担。sle患病率存在显著性别差异，女性患病率大约是男性的9～13倍，育龄期女性患病率更高，儿童及老年人也可发病。sle发病率缺乏准确评价，多数流行病学调查集中在患病率评价，调查结果显示sle的患病率在不同的人群和地域间存在着明显差异。资料显示我国sle患病率约为31-70/10万人，高于西方国家和亚洲其它国家，妇女的患病率约为113/10万人。到目前为止，sle的发病病因尚未明确，但大量证据显示遗传、内分泌、感染、免疫异常和环境因素都与其发病有关，早年的家系研究及近年的gwas研究证据支持遗传因素是sle的重要发病病因。当前sle患者生存率不断提高，我国sle患者5年生存率约为95％，10年生存率约为90％，患病人口基数越来越大，已成为女性继乳腺癌后的又一重大疾病，严重影响了女性的身心健康，是一个亟需解决的公共卫生问题。
药物基因组学(pharmacogenomics)的出现对于实现患者个体化用药具有重要的意义。它是功能基因组学研究的一个分支，通过研究基因组或基因遗传变异(如单核苷酸多态性，singleneucleotidepolymorphism，snp)对药物在人体内吸收、代谢、疗效及不良反应产生影响的现象及其机制，从而指导合理用药的一门学科。它最终目的是实现依据患者的遗传特征选择治疗方案，最大限度的降低治疗风险，减少治疗费用，达到有效又安全的治疗疾病。近年《science》、《nengljmed》、《jclinoncol》等权威杂志发表的研究证据显示药物基因组学研究成果能够迅速转化应用，在发达国家药物基因组学研究成果已经开始应用于指导临床个体化用药，表现出强大的生命力。
糖皮质激素(glucocorticoid，gc)是治疗sle的基础药物，如何有效、安全和规范的使用gc是目前sle治疗中急需解决的问题。gc在sle的应用可追溯到半个世纪之前，因其强大的抗炎和免疫抑制作用而被广泛应用于sle的治疗。sle患者必须长期应用gc，但临床实践显示gc治疗sle是一把“双刃剑”，gc在缓解病情的同时会带来严重的不良反应。同时sle患者对gc治疗反应敏感性存在较大个体差异，有的患者很快获得疗效，有的患者需要较长时间才能缓解病情，有的患者始终不能获得较好疗效，有的患者会出现严重不良反应。因此sle治疗必须遵循个体化用药原则。目前，临床上能够真正指导sle患者个体化治疗的方法还未出现，sle患者的治疗方案往往凭借医生的个人经验来选择。借助药物基因组学研究技术，基于遗传因素预测gc治疗sle的疗效和不良反应，给每个患者提供最佳的治疗方案，是实现sle真正个体化治疗的一个新的突破口。
gc主要作用机制是通过基因调控途径完成，它与细胞浆内的糖皮质激素受体(glucocorticoidreceptor，gr)相结合起作用。gc被动弥散进入细胞内，与gr结合形成gc-gr复合物，迅速进入细胞核后，通过直接和间接基因调控机制发挥作用。热休克蛋白90(heatshockprotein90，hsp90)是热休克蛋白家族中的重要成员，是gc-gr效应通路中的重要伴侣蛋白。它具有高度保守性，存在于从细菌到高等真核生物中，生物学功能广泛，对维持生命具有重要意义。hsp90的结构和功能的任何变化都会影响gc发挥其生物学效应。肿瘤坏死因子受体相关蛋白1(tumornecrosisfactorreceptor-associatedprotein1，trap1)是hsp90家族的主要成员之一，能够抵御氧化应激所诱导的凋亡，维持线粒体完整性及细胞内稳态。证据表明trap1表达异常在sle的发生发展及治疗疗效反应中具有重要作用。
目前，中国人群中多个trap1基因多态性位点已被发现，这些遗传变异可能是导致gc治疗sle疗效和不良反应存在个体化差异的重要原因之一，当前本领域缺乏通过trap1基因多态性位点基因型来预测gc治疗sle疗效的方法和试剂盒。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种基于trap1基因多态性位点基因型预测糖皮质激素治疗sle疗效的用途和试剂盒，为实现sle患者的个体化治疗提供新的思路和方法。
本发明技术方案是通过以下实现的：
一种基于trap1基因多态性位点基因型预测糖皮质激素治疗系统性红斑狼疮疗效的用途，所述的trap1基因多态性位点为rs4786428和/或rs3751842和/或rs3794701和/或rs12597773和/或rs6500550和/或rs17183750和/或rs6500552。
优选地，所述的糖皮质激素包括泼尼松、泼尼松龙、甲泼尼龙、强的松、强的松龙、氢化可的松、可的松、曲安西龙、地塞米松、倍他米松、甲强龙、甲基泼尼松中的至少一种。
一种基于trap1基因多态性位点基因型预测糖皮质激素治疗系统性红斑狼疮疗效的试剂盒，包含有下述试剂成分：
(1)检测trap1基因多态性位点基因型的引物；
(2)pcr扩增酶及相应缓冲液；
(3)pcr产物纯化酶；
(4)dntp；
(5)单碱基延伸反应酶及相应缓冲液；
(6)单碱基延伸产物纯化酶。
优选地，所述的检测trap1基因多态性位点基因型的引物包括扩增多态性位点的引物和单碱基延伸多态性位点的引物，
所述的扩增rs4786428多态性位点的引物：
5’-tgacaaccacaagctgggatga-3’
5’-tctgggaagctcacggatgaag-3’。
优选地，所述的扩增rs3751842多态性位点的引物：
5’-acggggcaggtcaccacttatt-3’
5’-gtgcttcctaagcccccagagc-3’。
优选地，所述的扩增rs3794701多态性位点的引物：
5’-ccttctccctggctgtggttct-3’
5’-cactggcactcagagcagagca-3’。
优选地，所述的扩增rs12597773多态性位点的引物：
5’-gagggtgtggtgagctgaggtt-3’
5’-tgtagcatgtgcctggcttcag-3’。
优选地，所述的扩增rs6500550多态性位点的引物：
5’-gcgatgaccccccacttagg-3’
5’-ctgacacaccccgtcctttctc-3’。
优选地，所述的扩增rs17183750多态性位点的引物：
5’-atgactgggagccatgcagaaa-3’
5’-tcccgactccagttgtcctctg-3’。
优选地，所述的扩增rs6500552多态性位点的引物：
5’-caagaaacatcaatggctttacgtcct-3’
5’-cagacggcattgccaacagttt-3’。
优选地，所述的单碱基延伸rs4786428多态性位点的引物：
5’-tttttggcccactggtagtgccc-3’。
优选地，所述的单碱基延伸rs3751842多态性位点的引物：
5’-ttttttttttttggtagtggactcgggggttgtc-3’。
优选地，所述的单碱基延伸rs3794701多态性位点的引物：
5’-ttcccgcaggagaggcgtc-3’。
优选地，所述的单碱基延伸rs12597773多态性位点的引物：
5’-tttttttttctttcagacctcactgacccctga-3’。
优选地，所述的单碱基延伸rs6500550多态性位点的引物：
5’-ttttttttttttttcctaggctcctctgtgtgctcc-3’。
优选地，所述的单碱基延伸rs17183750多态性位点的引物：
5’-ttttttttttttttttttttttttttttttttttttttaagtaaagaatgattgacatatttgacgtca-3’。
优选地，所述的单碱基延伸rs6500552多态性位点的引物：
5’-tttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttaaaacgagatagcattttcactaccaga-3’。
本发明还提供了一种基于trap1基因多态性位点基因型预测糖皮质激素治疗sle疗效的方法，具体步骤包括：
第一步、dna提取；
第二步、pcr扩增反应；
第三步、pcr产物纯化；
第四步、单碱基延伸反应；
第五步、延伸产物纯化；
第六步、对trap1基因多态性位点进行分型；
第七步、预测糖皮质激素治疗sle疗效。
所述pcr扩增反应包含rs4786428和/或rs3751842和/或rs3794701和/或rs12597773和/或rs6500550和/或rs17183750和/或rs6500552扩增多态性位点的引物。
所述单碱基延伸反应包含rs4786428和/或rs3751842和/或rs3794701和/或rs12597773和/或rs6500550和/或rs17183750和/或rs6500552单碱基延伸多态性位点的引物。
所述的trap1基因多态性位点分型包含rs4786428和/或rs3751842和/或rs3794701和/或rs12597773和/或rs6500550和/或rs17183750和/或rs6500552多态性位点基因型。
所述的糖皮质激素包括(但不限于)泼尼松、泼尼松龙、甲泼尼龙、强的松、强的松龙、氢化可的松、可的松、曲安西龙、地塞米松、倍他米松、甲强龙、甲基泼尼松等。
所述的预测为trap1基因rs4786428多态性位点基因型为cc，预测糖皮质激素治疗系统性红斑狼疮的疗效好；rs3751842多态性位点基因型为ct和/或tt时，预测糖皮质激素治疗系统性红斑狼疮的疗效好；rs3794701多态性位点基因型为gg和/或ga时，预测糖皮质激素治疗系统性红斑狼疮的疗效好；rs12597773多态性位点基因型为gg时，预测糖皮质激素治疗系统性红斑狼疮的疗效好；rs6500550多态性位点基因型为cc和/或ct时，预测糖皮质激素治疗系统性红斑狼疮的疗效好；rs17183750多态性位点基因型为gg和/或ga时，预测糖皮质激素治疗系统性红斑狼疮的疗效好；rs6500552多态性位点基因型为tc和/或cc时，预测糖皮质激素治疗系统性红斑狼疮的疗效好。
所述的疗效为经过糖皮质激素治疗后sle患者临床症状是否得到缓解，临床症状得到缓解则疗效好，没有得到缓解则疗效差。
本发明的有益效果在于：
本发明试剂盒预测糖皮质激素治疗sle疗效的方法快速、简便、有效、准确度高，为指导系统性红斑狼疮患者的合理用药及个体化治疗提供了新的思路和方法。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进一步说明。应该理解为，这些实施例仅用于说明本发明，而非限制本发明的范围。
实施例1：一种基于trap1基因多态性位点基因型预测糖皮质激素治疗sle疗效的试剂盒和方法
(一)试剂盒的组成成分
(1)检测trap1基因多态性位点基因型的引物；
扩增多态性位点的引物：
延伸多态性位点的引物：
(2)pcr扩增酶及相应缓冲液；
(3)pcr产物纯化酶；
(4)dntp；
(5)单碱基延伸反应酶及相应缓冲液；
(6)单碱基延伸产物纯化酶。
(二)标本收集准备和基因型检测
1采集血样
由经过培训的医护人员从sle患者前臂采取静脉血5ml，放置于0.5medta抗凝管中。
2提取dna
dna的提取采用基因组dna抽提试剂盒提取，提取方法如下：
(1)向1.5ml离心管中加入20μlqiagen蛋白酶，再向其中加入200μl血样，充分混匀。
(2)向离心管中加入200μlbufferal，涡旋振荡15s，使得其充分混匀，56℃下孵育10min，再快速离心，并确保离心管盖子中无液滴残留。
(3)向离心管中加入200μl的96-100％乙醇，涡旋振荡15s，充分混匀，再快速离心，确保离心管盖子中无液滴残留。
(4)将样品移至qiaampmini离心柱中，6000g(8000rpm)离心1min，再将离心柱移至一个新的2ml收集管中。
(5)向离心柱中加入500μlbufferaw1，6000g(8000rpm)离心1min，将离心柱放入一个新的2ml收集管中。
(6)向离心柱中加入500μlbufferaw2，20000g(14000rpm)离心3min，再将离心柱放入一个新的2ml收集管，20000g(14000rpm)离心1min。
(7)将离心柱转移到一个1.5ml收集管中，在离心柱中加200μlbufferae，室温孵育1min，再6000g(8000rpm)离心1min，洗提dna。
3检测基因型
(1)dna浓度和质量评估：先取1μldna样本，1％agarose电泳对其进行浓度估计和质量评估，然后根据估计的浓度将dna样本稀释到5-10ng/μl的工作浓度。
(2)进行pcr扩增反应
a)扩增多态性位点引物：
扩增rs4786428多态性位点的引物：
5’-tgacaaccacaagctgggatga-3’
5’-tctgggaagctcacggatgaag-3’
扩增rs3751842多态性位点的引物：
5’-acggggcaggtcaccacttatt-3’
5’-gtgcttcctaagcccccagagc-3’
扩增rs3794701多态性位点的引物：
5’-ccttctccctggctgtggttct-3’
5’-cactggcactcagagcagagca-3’
扩增rs12597773多态性位点的引物：
5’-gagggtgtggtgagctgaggtt-3’
5’-tgtagcatgtgcctggcttcag-3’
扩增rs6500550多态性位点的引物：
5’-gcgatgaccccccacttagg-3’
5’-ctgacacaccccgtcctttctc-3’
扩增rs17183750多态性位点的引物：
5’-atgactgggagccatgcagaaa-3’
5’-tcccgactccagttgtcctctg-3’
扩增rs6500552多态性位点的引物：
5’-caagaaacatcaatggctttacgtcct-3’
5’-cagacggcattgccaacagttt-3’。
b)pcr反应体系：
反应体系(10μl)有1μl样本dna，1xhotstartaqbuffer，3.0mmmg2+，0.3mmdntp，1uhotstartaqpolymerase(qiageninc.)，和1μl多重pcr引物。
c)pcr循环程序：
(3)纯化pcr产物
在10μl的pcr产物中加入2uexonucleasei酶以及5usap酶，然后37℃温浴60min，75℃条件下灭活15min。
(4)单碱基延伸反应
a)延伸引物：
单碱基延伸rs4786428多态性位点的引物：
5’-tttttggcccactggtagtgccc-3’
单碱基延伸rs3751842多态性位点的引物：
5’-ttttttttttttggtagtggactcgggggttgtc-3’
单碱基延伸rs3794701多态性位点的引物：
5’-ttcccgcaggagaggcgtc-3’
单碱基延伸rs12597773多态性位点的引物：
5’-tttttttttctttcagacctcactgacccctga-3’
单碱基延伸rs6500550多态性位点的引物：
5’-ttttttttttttttcctaggctcctctgtgtgctcc-3’
单碱基延伸rs17183750多态性位点的引物：
5’-ttttttttttttttttttttttttttttttttttttttaagtaaagaatgattgacatatttgacgtca-3’
单碱基延伸rs6500552多态性位点的引物：
5’-tttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttaaaacgagatagcattttcactaccaga-3’。
b)延伸反应条件：
延伸反应体系10μl，包括5μlsnapshotmultiplexkit(abi)，1μl延伸引物混合物，2μl纯化后多重pcr产物和2μl超纯水。
c)延伸反应程序：
(5)纯化延伸产物
添加1usap酶至10μl延伸产物中，再37℃温浴1小时，接着75℃条件下灭活15分钟。
(6)延伸产物上abi3730xl测序仪
将0.5μl纯化后的延伸产物、9μlhi-di和0.5μlliz120sizestandard混匀成10μl的反应体系，在95℃下变性5min后，使用abi3730xl测序仪收集数据。
(7)基因分型
用genemapper4.1(appliedbiosystemsco.,ltd.,usa)分析abi3730xl测序仪上收集数据，从而确定trap1基因rs4786428，rs3751842，rs3794701，rs12597773，rs6500550，rs17183750和rs6500552多态性位点基因型。
(三)预测疗效
1判定疗效标准
收集处于活动期sle患者414例，采用糖皮质激素治疗三个月，糖皮质激素治疗sle疗效采用系统性红斑狼疮活动指数(sledai)评分来判定。sle患者治疗三个月后sledai评分在0～4分间或者治疗前后患者sledai评分下降≥5分判定为病情缓解，疗效好；sle患者治疗三个月后sledai评分仍大于4分而且治疗前后患者sledai评分下降值<5分判定为病情没有缓解，疗效差。
2预测糖皮质激素疗效
从报道的中国人群trap1基因上的多个snp中的28个标签多态性位点进行筛选，最终发现rs4786428，rs3751842，rs3794701，rs12597773，rs6500550，rs17183750和rs6500552多态性位点能够预测糖皮质激素治疗系统性红斑狼疮的疗效。414例sle患者三个月糖皮质激素治疗结束后，174例患者疗效差，240例患者疗效好。7个多态性位点基因型分布均符合hardy-weinburg平衡(见表1)。采用显性模型和隐性模型分析发现rs4786428，rs3751842，rs3794701，rs12597773，rs6500550，rs17183750和rs6500552七个多态性位点和糖皮质激素治疗sle的疗效之间存在关联(因变量：0＝疗效好；1＝疗效差)。trap1基因rs4786428多态性位点基因型为cc，预测糖皮质激素治疗系统性红斑狼疮的疗效好；rs3751842多态性位点基因型为ct和/或tt时，预测糖皮质激素治疗系统性红斑狼疮的疗效好；rs3794701多态性位点基因型为gg和/或ga时，预测糖皮质激素治疗系统性红斑狼疮的疗效好；rs12597773多态性位点基因型为gg时，预测糖皮质激素治疗系统性红斑狼疮的疗效好；rs6500550多态性位点基因型为cc和/或ct时，预测糖皮质激素治疗系统性红斑狼疮的疗效好；rs17183750多态性位点基因型为gg和/或ga时，预测糖皮质激素治疗系统性红斑狼疮的疗效好；rs6500552多态性位点基因型为tc和/或cc时，预测糖皮质激素治疗系统性红斑狼疮的疗效好(见表2)。
表1trap1基因多态性位点基因型频率分布及hardy-weinburg平衡结果
表2trap1基因多态性位点与糖皮质激素治疗sle疗效的关联
(四)得出结论
基于上述数据得出：trap1基因rs4786428，rs3751842，rs3794701，rs12597773，rs6500550，rs17183750和rs6500552多态性位点能够预测糖皮质激素治疗系统性红斑狼疮的疗效。rs4786428多态性位点基因型为cc，预测糖皮质激素治疗系统性红斑狼疮的疗效好；rs3751842多态性位点基因型为ct和/或tt时，预测糖皮质激素治疗系统性红斑狼疮的疗效好；rs3794701多态性位点基因型为gg和/或ga时，预测糖皮质激素治疗系统性红斑狼疮的疗效好；rs12597773多态性位点基因型为gg时，预测糖皮质激素治疗系统性红斑狼疮的疗效好；rs6500550多态性位点基因型为cc和/或ct时，预测糖皮质激素治疗系统性红斑狼疮的疗效好；rs17183750多态性位点基因型为gg和/或ga时，预测糖皮质激素治疗系统性红斑狼疮的疗效好；rs6500552多态性位点基因型为tc和/或cc时，预测糖皮质激素治疗系统性红斑狼疮的疗效好。
以上所述实施方式仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案作出的各种变形和改进，均应落入本发明的权利要求书确定的保护范围内。
<110>安徽医科大学
<120>一种基于trap1基因多态性位点基因型预测糖皮质激素治疗sle疗效的用途和试剂盒
<160>28
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ttctcagactgacaacgcaacctttgacaaccacaagctgggatgaggacccctgctctg120
cagctttgggcactaccagtgggccagcatgcctgccacagccaggaatgcagctccctt180
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tcccctcacagg252
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cccatggcctcctggcactccaggctggccctgacccgagggacggtagtggactcgggg120
gttgtctgagagcaggccttgctctgcccatcaggccccttttgggagctctgggggctt180
aggaagcacctcctgccccaggtggcccaggggctctccagggagctacgcgcaccacgc240
cctgggagggga252
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