结核病微生物标志物在制备诊断结核病的试剂中的应用的制作方法

本发明涉及生物医学领域，具体涉及结核病微生物标志物及其应用，更具体地，本发明涉及结核病微生物标志物在制备用于预测或辅助诊断对象结核病状态的试剂中的应用，利用所述结核病微生物标志物预测结核病患者个体治疗疗效的系统，所述结核病微生物标志物在制备治疗结核病的药物和/或功能性食品中的应用，用于检测结核病生物标志物的试剂盒，用于治疗结核病的药物，生产或筛选所述药物的方法，以及用于治疗结核病的疫苗。

背景技术：

因结核分枝杆菌(mycobacteriumtuberculosis，mtb)感染导致的结核病(tuberculosis，tb)是具有最高感染率、致病率及致死率的烈性传染病之一，是全球及我国面临的最为严峻的公共卫生安全威胁之一。世界卫生组织(who)发布的2015年最新全球结核疫情年报显示：2015年结核新发病例超过900万人，而且结核病的致死人数达到150万人，已经超过hiv/aids感染所致死人数；而且，我国的结核疫情和结核分枝杆菌感染情况都相当严重，是全球22个结核病高负担国家之一，结核病人数位居世界第二。

机体在感染结核分枝杆菌后，少部分发展成活动性结核，产生相应的临床症状，严重者甚至发展成为多重耐药性结核。大部分人在感染后并不出现相应的临床症状，但是机体内有结核分枝杆菌存活，称潜伏性结核。当机体免疫力抵下时，潜伏性结核亦可发展成为活动性结核。

结核病的早期诊断对于有效控制结核病的进展和结核分枝杆菌的传播具有重要意义。目前诊断结核感染的方法有限，主要包括结核分枝杆菌素皮肤实验(tst)、痰涂片、痰细菌培养、放射性x光片、血清学抗体抗原免疫检测以及pcr和核酸杂交法等。然而存在较多缺点和不足，例如，结核分枝杆菌素皮肤实验(tst)所使用的结核分枝杆菌纯蛋白衍生物(ppd)中含有许多分枝杆菌种类(包括致病性分枝杆菌、环境分枝杆菌和bcg)所共有的抗原分子，因此ppd诊断结核病的特异性差，不能准确区分ppd实验结果阳性究竟是因为bcg接种、接触环境中多种非结核分枝杆菌后的致敏还是真正的结核分枝杆菌感染所致。痰涂片方法虽然简单易行，但是很大一部分结核病人痰里面并不一定有结核分枝杆菌(所谓的“痰阴”结核)。所以，痰涂片培养办法具有诊断阳性率低、易漏检、痰细菌培养周期长、培养成功率低(只有80％左右)等缺点。对于其他免疫学诊断技术，例如，已经得到美国fda批准上市的t-spot.tb试剂盒(oxfordimmunoteclimited,aingdon,unitedkingdom)和quantiferon-tbgold试剂盒虽然精确度有所提高，但是成份复杂、价格昂贵、成本极高，严重地制约了其用于数以百万计的活动性结核患者以及数以亿计的结核潜伏感染人群进行大规模结核筛查与诊断。因此，亟待一种可以提前预测或者筛查或者预后结核病的检测方法，能够准确的预测结核病，以提前做出预防和治疗，避免错过最佳治疗时机。

肠道微生物是存在于人体肠道中的微生物群落，是人体的“第二基因组”。人肠道菌群和宿主构成一个相互关联的整体，具有重要作用，包括形成微生物屏障防止病原菌定植、执行免疫调节及代谢功能。肠道微生物数量、结构及稳定性的改变，尤其是菌群的失衡会改变机体的免疫状态。研究表明肠道菌群失衡与某些疾病的发生发展息息相关，包括糖尿病、帕金森症等，然而有时肠道菌群失衡并不直接导致疾病的表达，而作为疾病标记。随着人体基因组测序完成及高通量测序技术的高速发展，基因筛查成为诊断的方向。因此通过对肠道菌群的研究筛选出与结核病相关性高的生物标志物有重要意义。一方面，利用结核病有关的生物标记物可以提供诊断结核病的方法；并且可以用于监测治疗效果。另一方面，通过将获得的生物标志物中的某些保护性微生物进行分离、纯化、培养和加上制成益生菌，可以用于改善并恢复肠道微生物平衡，对于结核病治疗具有重要意义。

目前，尚无研究阐述结核病相关的肠道菌群生物标志物。

技术实现要素：

针对上述现有技术，本发明的第一个目的是提供一种能够准确、有效标记或辅助检测结核病的方法。

本发明的另一个目的是提供一种利用所述结核病微生物标志物预测结核病患者个体治疗疗效的系统。

本发明的又一个目的是提供用于检测所述结核病微生物标志物的试剂盒。

本发明的又一个目的是提供一种用于治疗结核病的药物。

本发明的又一个目的是提供一种生产或筛选上述药物的方法。

本发明的又一个目的是提供一种用于治疗结核病的疫苗。

根据本发明的一个方面，本发明提出了结核病微生物标志物在制备用于预测或辅助诊断对象结核病状态的试剂中的应用，所述结核病微生物标志物为以下种/菌株水平的肠道微生物中的一种或多种，或以下种/菌株水平的灭活、重组、减毒、或经过基因工程、化学或物理方法改造的肠道微生物中的一种或多种：费格森埃希菌(escherichiafergusonii)、布氏弓形菌(arcobacterbutzleri)、肺炎链球菌(streptococcusmitisoralispneumoniae)、格氏链球菌(streptococcusgordonii)、婴儿链球菌(streptococcusinfantis)、前庭链球菌(streptococcusvestibularis)、哈氏梭菌(clostridiumhathewayi)、粪便拟杆菌(bacteroidesstercoris)、迟缓埃格特菌(eggerthellalenta)、圆柱状真杆菌(eubacteriumcylindroides)、大肠埃希氏菌(escherichiacoli)、芦苇链球菌(streptococcusaustralis)、脆弱拟杆菌(bacteroidesfragilis)、阴沟肠杆菌属(enterobactercloacae)、粪拟杆菌(bacteroidescaccae)、小韦荣球菌(veillonellaparvula)、芽胞拟杆菌(bacteroidesmassiliensis)、多型拟杆菌(bacteroidesthetaiotaomicron)、拟杆菌属(bacteroides_finegoldii)、shahii另枝菌属(alistipesshahii)、直肠真杆菌(eubacteriumrectale)、hominis罗氏菌属(roseburiahominis)、卵形拟杆菌(bacteroidesovatus)、布氏瘤胃球菌属(ruminococcusbromii)、普通拟杆菌(bacteroidesvulgatus)、超巨巨单胞菌(megamonashypermegale)、肺炎克雷伯菌(klebsiellapneumoniae)、去磺弧菌(desulfovibriodesulfuricans)、粪球菌属(coprococcuscatus)、肠枝罗氏菌(roseburiaintestinalis)、氨基酸球菌属(acidaminococcusintestini)、挑剔真杆菌(eubacteriumeligens)、殊异韦荣菌(veillonelladispar)、非典型韦荣菌(veillonellaatypica)、inulinivorans罗氏菌属(roseburiainulinivorans)、草酸杆菌(oxalobacterformigenes)、嗜热链球菌(streptococcusthermophilus)、putredinis另枝菌属(alistipesputredinis)、埃氏巨型球菌(megasphaeraelsdenii)、规则粪球菌(coprococcuseutactus)、瘤胃乳酸杆菌(lactobacillus_ruminis)、两岐双岐杆菌(bifidobacteriumbifidum)、青春双歧杆菌(bifidobacterium_adolescentis)、嗜黏蛋白阿克曼氏菌(akkermansia_muciniphila)。

上述本发明一方面提供的结核病微生物标志物是发明人通过对大量结核病个体和大量健康对照个体的粪便样本中的微生物的丰度的差异比较分析、以及验证，而确定下来的，明确了肠道微生物中结核病相关的微生物标志物。利用所称的结核病标志物，能够确定个体处于患有结核病状态的概率或者处于健康状态的概率，能够用于非侵入性的早期发现或辅助检测结核病。

作为一种优选的实施方式，对所述对象的粪便样本、肠道排出物或肠道提取物进行检测，以确定是否存在所述肠道微生物中的一种或多种或所述肠道微生物的核酸、蛋白、菌体成分、代谢产物等所述肠道微生物特异性标志物中的一种或多种。

作为一种优选的实施方式，确定是否存在所述肠道微生物中的一种或多种进一步包括：

将所述测序结果与所述微生物进行比对；以及

基于比对结果，确定是否存在所述肠道微生物中的一种或多种。

作为一种优选的实施方式，进一步包括步骤：

确定所述肠道微生物的相对丰度；以及

将所述相对丰度与预定的临界值进行比较。

根据本发明的又一方面，本发明提出了一种用于检测结核病生物标志物确定对象异常状态的试剂盒，该试剂盒含有对上述微生物进行检测的试剂。具体地，所述试剂盒中含有对所述微生物标志物进行检测的试剂，所述试剂盒包括提取所述微生物标志物基因的dna等核酸物质的试剂和检测所提取的dna等核酸的基因芯片或其他核酸检测技术或方法。

根据本发明的又一方面，本发明提出了一种检测结核病生物标志物的试剂盒，所述试剂盒中含有对权利要求1所述的微生物标志物进行检测的试剂，所述试剂盒包括提取所述微生物标志物的蛋白、菌体成分、代谢产物的试剂和检测这些蛋白、菌体成分、代谢产物的抗原、抗体、化学标记、显色或发光试剂、生物标记、显色或发光材料或其他检测方法或技术。

利用上述试剂盒，可以确定这些微生物在肠道菌群中的相对丰度，因此.可以通过所得到的相对丰度值与预定的临界值进行比较.从而提高确定对象个体为结核病个体或者为健康个体的概率，以及用于监控结核病患者的治疗效果的效率。

依据本发明的又一方面，本发明还提供上述结核病微生物标志物在制备预防或治疗结核病的药物和/或在制备功能性食品中的用途，本发明还提供了一种用于治疗结核病的药物或功能性食品，所述药物或功能性食品促使所述结核病微生物标志物中的拟杆菌属(bacteroides_finegoldii)、shahii另枝菌属(alistipesshahii)、直肠真杆菌(eubacteriumrectale)、hominis罗氏菌属(roseburiahominis)、卵形拟杆菌(bacteroidesovatus)、布氏瘤胃球菌属(ruminococcusbromii)、普通拟杆菌(bacteroidesvulgatus)、超巨巨单胞菌(megamonashypermegale)、肺炎克雷伯菌(klebsiellapneumoniae)、去磺弧菌(desulfovibriodesulfuricans)、粪球菌属(coprococcuscatus)、肠枝罗氏菌(roseburiaintestinalis)、氨基酸球菌属(acidaminococcusintestini)、挑剔真杆菌(eubacteriumeligens)、殊异韦荣菌(veillonelladispar)、非典型韦荣菌(veillonellaatypica)、inulinivorans罗氏菌属(roseburiainulinivorans)、草酸杆菌(oxalobacterformigenes)、嗜热链球菌(streptococcusthermophilus)、putredinis另枝菌属(alistipesputredinis)、埃氏巨型球菌(megasphaeraelsdenii)、规则粪球菌(coprococcuseutactus)、瘤胃乳酸杆菌(lactobacillus_ruminis)、两岐双岐杆菌(bifidobacteriumbifidum)、青春双歧杆菌(bifidobacterium_adolescentis)、嗜黏蛋白阿克曼氏菌(akkermansia_muciniphila)的相对丰度或绝对丰度增加：以及促使费格森埃希菌(escherichiafergusonii)、布氏弓形菌(arcobacterbutzleri)、肺炎链球菌(streptococcusmitisoralispneumoniae)、格氏链球菌(streptococcusgordonii)、婴儿链球菌(streptococcusinfantis)、前庭链球菌(streptococcusvestibularis)、哈氏梭菌(clostridiumhathewayi)、粪便拟杆菌(bacteroidesstercoris)、迟缓埃格特菌(eggerthellalenta)、圆柱状真杆菌(eubacteriumcylindroides)、大肠埃希氏菌(escherichiacoli)、芦苇链球菌(streptococcusaustralis)、脆弱拟杆菌(bacteroidesfragilis)、阴沟肠杆菌属(enterobactercloacae)、粪拟杆菌(bacteroidescaccae)、小韦荣球菌(veillonellaparvula)、芽胞拟杆菌(bacteroidesmassiliensis)、多型拟杆菌(bacteroidesthetaiotaomicron)的相对丰度或绝对丰度降低。

上述结核病标志物是发明人通过差异比较分析各种肠道微生物在结核病疾病组和健康组的粪便样本中的丰度，以及经过大量已知状态下的验证，而确定下来的。所称结核病标志物在结核病组和健康组具有显著差异，所称显著差异是指在结核病组中和健康组的丰度比较中，上述结核病标志物所包含的各种微生物在在两组中的丰度均具有统计意义的显著性差异。本发明提供的结核病标志物能够用于制备治疗人结核病的药物和/或用于制备益于平衡肠道菌群的功能性食品、保健药等。

根据本发明的另一方面，本发明还提供生产或筛选上述药物的方法，包括筛选促使结核病微生物标志物中的拟杆菌属(bacteroides_finegoldii)、shahii另枝菌属(alistipesshahii)、直肠真杆菌(eubacteriumrectale)、hominis罗氏菌属(roseburiahominis)、卵形拟杆菌(bacteroidesovatus)、布氏瘤胃球菌属(ruminococcusbromii)、普通拟杆菌(bacteroidesvulgatus)、超巨巨单胞菌(megamonashypermegale)、肺炎克雷伯菌(klebsiellapneumoniae)、去磺弧菌(desulfovibriodesulfuricans)、粪球菌属(coprococcuscatus)、肠枝罗氏菌(roseburiaintestinalis)、氨基酸球菌属(acidaminococcusintestini)、挑剔真杆菌(eubacteriumeligens)、殊异韦荣菌(veillonelladispar)、非典型韦荣菌(veillonellaatypica)、inulinivorans罗氏菌属(roseburiainulinivorans)、草酸杆菌(oxalobacterformigenes)、嗜热链球菌(streptococcusthermophilus)、putredinis另枝菌属(alistipesputredinis)、埃氏巨型球菌(megasphaeraelsdenii)、规则粪球菌(coprococcuseutactus)、瘤胃乳酸杆菌(lactobacillus_ruminis)、两岐双岐杆菌(bifidobacteriumbifidum)、青春双歧杆菌(bifidobacterium_adolescentis)、嗜黏蛋白阿克曼氏菌(akkermansia_muciniphila)的相对丰度或绝对丰度增加的物质作为所述药物的步骤；以及促使费格森埃希菌(escherichiafergusonii)、布氏弓形菌(arcobacterbutzleri)、肺炎链球菌(streptococcusmitisoralispneumoniae)、格氏链球菌(streptococcusgordonii)、婴儿链球菌(streptococcusinfantis)、前庭链球菌(streptococcusvestibularis)、哈氏梭菌(clostridiumhathewayi)、粪便拟杆菌(bacteroidesstercoris)、迟缓埃格特菌(eggerthellalenta)、圆柱状真杆菌(eubacteriumcylindroides)、大肠埃希氏菌(escherichiacoli)、芦苇链球菌(streptococcusaustralis)、脆弱拟杆菌(bacteroidesfragilis)、阴沟肠杆菌属(enterobactercloacae)、粪拟杆菌(bacteroidescaccae)、小韦荣球菌(veillonellaparvula)、芽胞拟杆菌(bacteroidesmassiliensis)、多型拟杆菌(bacteroidesthetaiotaomicron)的相对丰度或绝对丰度降低的物质作为所述药物的步骤。

根据本发明的又一方面.本发明提出了一种确定对象中异常状态的方法。根据本发明的实施例，该方法包括步骤：(l)确定所述个体的粪便样本中的所述结核病标志物中的各种微生物的丰度；(2)分别将步骤(l)中确定的结核病标志物中的各种微生物的丰度与其在对照组中的丰度进行比较，依据获得的比较结果确定所述个体的状态，所述对照组由一组或多组相同状态的个体的粪便样本组成，所述状态包括患有结核病状态和健康状态。所称结核病标志物是发明人通过差异比较分析各种肠道微生物在结核病疾病组和健康组的粪便样本中的丰度，以及经过大量已知状态的粪便样本的验证，而确定下来的。

上述本发明这一方面的方法基于检测个体的粪便样本中的结核病标志物中的各种微生物的丰度，分别将检测确定的各种微生物的丰度与其在对照组中丰度进行比较，依据获得的比较结果能够确定个体为结核病个体或者为健康个体的概率。为早期发现结核病提供一种非侵入性的辅助检测方法。

根据本发明的又一方面，本发明提出了一种利用所述的结核病微生物标志物预测结核病患者个体治疗疗效的系统。根据本发明的实施例，该检测对象中异常状态的系统包括：核酸样本分离单元，所述核酸样本分离单元适于从检测对象中分离肠道菌群核酸样本：测序单元，所述测序单元与所述核酸样本分离单元相连，并且适于对所分离的肠道菌群核酸样本进行测序，以获得测序结果：以及比对装置，所述比对装置与所述测序单元相连，并且适于以这样的方式将所述测序结果与参照基因组进行比对.以便确定所述测序结果中是否存在上述结核病标志物。所述比对装置包括数据处理单元和结果判定单元。其中，数据处理单元用于根据测序结果，对肠道菌群中的所述结核病微生物标志物的相对丰度进行检测，将所得到的相对丰度值进行分析，得出上述微生物标志物的临界值；结果判定单元用于将数据处理单元得到的微生物标志物的临界值与设定诊断值进行比较。

利用该方法，可以确定上述微生物在肠道菌群中的相对丰度.因此.可以通过所得到的相对丰度值与预定的临界值进行比较.从而提高确定对象个体为结核病个体或者为健康个体的概率，以及用于监控结核病患者的治疗效果的效率。

根据本发明的又一方面，本发明提供了所述结核病微生物标志物在制备治疗结核病的药物和/或功能性食品中的应用。

根据本发明的又一方面，本发明提供了一种用于预防或治疗结核病的疫苗，所述疫苗采用所述的结核病微生物标志物中的一种或多种制备或由所述微生物标志物的蛋白、菌体成分、代谢产物的一种或多种制备，或采用现有疫苗与所述微生物标志物中的一种或多种联合制备或与所述微生物标志物的蛋白、菌体成分、代谢产物的一种或多种联合制备。

本发明能够准确、有效地检测与结核病相关的微生物(肠道菌群)，可以有效地预测结核病以及监控结核病患者的治疗效果，具有较好的临床应用前景。合理有效地应用本发明，能够更精准地为病人提供个体化治疗方案。

附图说明

本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：

图1示出了采用根据本发明的试剂盒检测确定结核病微生物标志物的流程示意图。

图2示出了根据本发明的检测系统的信息处理流程示意图。

具体实施方式

下面将结合附图和实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将理解，下列附图和实施例仅用于说明本发明，而不是对本发明的范围的限定。在本发明中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。并且，本文中所使用的各种实验室操作步骤均为相应领域内广泛使用的常规步骤。

生物标志物

根据本发明的第一方面，本发明提出结核病的生物标志物。

在本文中.术语“生物标志物”应做广义理解.其包括任何能够反映异常状态的任何可检测生物指标，可以包含基因标志物、物种标志物(种标志物属标志物)以及功能标志物(k0标志物)。其中，基因标志物的含义并不局限于现有可以表达为且有生物活性的蛋白质的基因，还包括任何核酸片段，可以为dna.也可以为rna，可以是经修饰的dna或者rna，也可以为未经修饰的dna从或者rna.在本文中基因标志物有时也可以称为特征片段。特别地，本发明的生物标志物为微生物标志物。

根据本发明的实施例，运用高通量测序，分析健康人群和结核病患者的粪便样本。基于高通量测序数据，对健康人群与结核病患者群进行统计检验，从而确定与结核病患者相关的特异性核酸序列。简言之，其步骤如下：

(1)样品的收集与处理：收集健康人群与结核病患者群的粪便样本，使用试剂盒

进行dna提取，得到核酸样本；

(2)文库构建和测序：利用高通量测序进行dna文库构建和测序，以便得到粪便样品中所包含肠道微生物的核酸序列；

(3)通过生物信息学的分析方法.确定结核病患者相关的特异性肠道微生物核酸序列。首先，将测序序列读段(reads)与参照基因集(可以为新构建的基因集或任何已知序列的数据库)进行比对，接下来，基于比对结果，分别确定来自健康人群和结核病患者群的粪便样品的核酸样本中各基因的相对丰度，通过将测序序列与参照基因集进行比对，可以将测序序列与参照基因集中的基因建立对应关系，从而针对核酸样本中的特定基因，与其相对应的测序序列的数目可以有效地反映该基因的相对丰度。由此，可以通过比对结果，按照常规的统计分析，确定在核酸样本中基因的相对丰度。最后，在确定核酸样本中各基因的相对丰度后.对来自健康人群和结核病患者粪便的核酸样本中各基因的相对丰度进行统计检验，由此.可以判断在健康人群和结核病人群中是否存在相对丰度有显著差异的基因，如果存在基因是显著差异的，则该基因被当作是异常状态的生物标志物，即基因标志物。

另外，对于已知或新构建的的参照基因集，其通常包含基因物种信息和功能注释，由此，在确定基因相对丰度的基础上，可以进一步通过将基因的物种信息和功能注释进行分类，从而确定肠道菌群中各微生物的物种相对丰度和功能相对丰度，也就可以进一步确定异常状态的物种标志物和功能标志物。简言之，确定物种标志物和功能标志物的方法进一步包括：将健康人群和的结核病患者群的测序序列与参照基因集进行比对；基于比对结果，分别确定健康人群和的结核病患者群的核酸样本中各基因的物种相对丰度和功能相对丰度；对来自健康人群和的结核病人群的核酸样本中各基因的物种相对丰度和功能相对丰度进行统计学检验；以及分别确定在健康人群和的结核病患者群的核酸样本之间相对丰度存在显著差异的物种标志物和功能标志物。根据本发明的实施例，可以采用对来自相同物种的基因的基因相对丰度和具有相同功能注释的基因的基因相对丰度进行统计检验，例如加和、取平均值、中位数值等，来确定功能相对丰度和物种相对丰度。

最后，确定了在健康人群和结核病患者群的粪便样品之间相对丰度存在显著差异的微生物，即来自肠道微生物中的费格森埃希菌(escherichiafergusonii)、布氏弓形菌(arcobacterbutzleri)、肺炎链球菌(streptococcusmitisoralispneumoniae)、格氏链球菌(streptococcusgordonii)、婴儿链球菌(streptococcusinfantis)、前庭链球菌(streptococcusvestibularis)、哈氏梭菌(clostridiumhathewayi)、粪便拟杆菌(bacteroidesstercoris)、迟缓埃格特菌(eggerthellalenta)、圆柱状真杆菌(eubacteriumcylindroides)、大肠埃希氏菌(escherichiacoli)、芦苇链球菌(streptococcusaustralis)、脆弱拟杆菌(bacteroidesfragilis)、阴沟肠杆菌属(enterobactercloacae)、粪拟杆菌(bacteroidescaccae)、小韦荣球菌(veillonellaparvula)、芽胞拟杆菌(bacteroidesmassiliensis)、多型拟杆菌(bacteroidesthetaiotaomicron)、拟杆菌属(bacteroides_finegoldii)、shahii另枝菌属(alistipesshahii)、直肠真杆菌(eubacteriumrectale)、hominis罗氏菌属(roseburiahominis)、卵形拟杆菌(bacteroidesovatus)、布氏瘤胃球菌属(ruminococcusbromii)、普通拟杆菌(bacteroidesvulgatus)、超巨巨单胞菌(megamonashypermegale)、肺炎克雷伯菌(klebsiellapneumoniae)、去磺弧菌(desulfovibriodesulfuricans)、粪球菌属(coprococcuscatus)、肠枝罗氏菌(roseburiaintestinalis)、氨基酸球菌属(acidaminococcusintestini)、挑剔真杆菌(eubacteriumeligens)、殊异韦荣菌(veillonelladispar)、非典型韦荣菌(veillonellaatypica)、inulinivorans罗氏菌属(roseburiainulinivorans)、草酸杆菌(oxalobacterformigenes)、嗜热链球菌(streptococcusthermophilus)、putredinis另枝菌属(alistipesputredinis)、埃氏巨型球菌(megasphaeraelsdenii)、规则粪球菌(coprococcuseutactus)、瘤胃乳酸杆菌(lactobacillus_ruminis)、两岐双岐杆菌(bifidobacteriumbifidum)、青春双歧杆菌(bifidobacterium_adolescentis)、嗜黏蛋白阿克曼氏菌(akkermansia_muciniphila)。

由此，通过检测上述微生物中的至少一种是否存在并富集于结核病组或者健康组，来有效地确定对象为结核病患者或者健康个人的概率，并且可以用于监控结核病患者的治疗效果。在本文中所使用的术语“存在”应做广义理解，既可以指的是定性分析样本中是否含有相应的目标物，也可以指对样本中的目标物进行定量分析，并且还可以进一步将所得到的定量分析结果与参照(例如通过对具有已知状态的样本进行平行试验所得到的定量分析结果)进行统计学分析或者任何已知数学运算所得到的结果。本领域技术人员可以根据需要和试验条件进行容易的选择。根据本发明的实施例，还可以通过确定这些微生物在肠道菌群中的相对丰度，从而可以通过所得到的相对丰度值与预定的临界值进行比较，从而提高确定对象为结核病患者或者健康个人的概率，以及用于监控结核病患者的治疗效果的效率。

根据本发明的实施例，费格森埃希菌(escherichiafergusonii)、布氏弓形菌(arcobacterbutzleri)、肺炎链球菌(streptococcusmitisoralispneumoniae)、格氏链球菌(streptococcusgordonii)、婴儿链球菌(streptococcusinfantis)、前庭链球菌(streptococcusvestibularis)、哈氏梭菌(clostridiumhathewayi)、粪便拟杆菌(bacteroidesstercoris)、迟缓埃格特菌(eggerthellalenta)、圆柱状真杆菌(eubacteriumcylindroides)、大肠埃希氏菌(escherichiacoli)、芦苇链球菌(streptococcusaustralis)、脆弱拟杆菌(bacteroidesfragilis)、阴沟肠杆菌属(enterobactercloacae)、粪拟杆菌(bacteroidescaccae)、小韦荣球菌(veillonellaparvula)、芽胞拟杆菌(bacteroidesmassiliensis)、多型拟杆菌(bacteroidesthetaiotaomicron)在结核病中被富集，因此在本文中可以统称为“有害生物标记物”。

拟杆菌属(bacteroides_finegoldii)、shahii另枝菌属(alistipesshahii)、直肠真杆菌(eubacteriumrectale)、hominis罗氏菌属(roseburiahominis)、卵形拟杆菌(bacteroidesovatus)、布氏瘤胃球菌属(ruminococcusbromii)、普通拟杆菌(bacteroidesvulgatus)、超巨巨单胞菌(megamonashypermegale)、肺炎克雷伯菌(klebsiellapneumoniae)、去磺弧菌(desulfovibriodesulfuricans)、粪球菌属(coprococcuscatus)、肠枝罗氏菌(roseburiaintestinalis)、氨基酸球菌属(acidaminococcusintestini)、挑剔真杆菌(eubacteriumeligens)、殊异韦荣菌(veillonelladispar)、非典型韦荣菌(veillonellaatypica)、inulinivorans罗氏菌属(roseburiainulinivorans)、草酸杆菌(oxalobacterformigenes)、嗜热链球菌(streptococcusthermophilus)、putredinis另枝菌属(alistipesputredinis)、埃氏巨型球菌(megasphaeraelsdenii)、规则粪球菌(coprococcuseutactus)、瘤胃乳酸杆菌(lactobacillus_ruminis)、两岐双岐杆菌(bifidobacteriumbifidum)、青春双歧杆菌(bifidobacterium_adolescentis)、嗜黏蛋白阿克曼氏菌(akkermansia_muciniphila)在健康人(对照组)中被富集，因而在本文中可以统称为“有益生物标志物”。

可以通过检测对象肠道菌群中是否存在上述微生物物种的至少一种，尤其是选自有害生物标记物的至少一种，来有效地确定对象是否患有或者易感结核病，并且可以用于监控结核病患者的治疗效果。

根据本发明一个实施方式提供的上述结核病标志物在制备治疗结核病的药物和/或在制备功能性食品中的用途。所称结核病标志物是发明人通过差异比较分析各种肠道微生物在结核病患者疾病组和健康组的粪便样本中的丰度，以及经过大量已知状态的粪便样本的验证，而确定下来的。能够使所称结核病标志物中有益生物标志物丰度增加的物质能够用于治疗结核病或者益于结核病患者服用，能够使所称结核病标志物中有益生物标志物丰度增加的物质不限于治疗结核病的药物和有益肠道菌群平衡的功能性食品，该实施方式提供的结核病标志物能够用于制备治疗结核病的药物和/或用于制备益于平衡肠道菌群的功能性食品、保健药等。

根据本发明的另一个实施方式提供的一种利用上述任一实施例中的结核病标志物确定个体的状态的方法，该方法包括以下步骤(l)和(2)：

(l)确定待测个体中的结核病标志物的丰度；

(2)丰度比较，以确定个体状态。

上述步骤(1)中，确定待测个体的粪便样本中的结核病标志物中的各种微生物的丰度。

根据本发明的实施例，进行以下以完成该步骤：获得所述个体的粪便样本中的核酸序列的测序数据，所述测序数据包括多个读段；组装所述读段，获得基因集，所述基因集包括多个组装片段，所述基因集中的组装片段为非冗余序列；确定所述结核病标志物中的各种微生物包含的组装片段；依据所述测序数据，分别确定所述基因集中的各个组装片段的丰度，其中包括，分别确定所述结核病标志物中的各种微生物包含的组装片段的丰度；分别依据所述确定的组装片段的丰度，确定所述结核病标志物中的各种微生物的丰度。

所称的测序数据通过对样本中的核酸序列进行测序得来，测序依据所选的测序平台的不同，可选择但不限于半导体测序技术平台比如pgm,合成测序的技术平台比如illumina公司的hiseq、miseq序列平台以及单分子实时测序平台比如pacbio序列平台。测序方式可以选择单端测序，也可以选择双末端测序，获得的下机数据是测读出来的片段，称为读段(读段)。

所称的组装可以利用己知序列组装方法或软件进行，例如利用soapdenovo、velvet等。

所称的确定结核病标志物中的各种微生物包含的组装片段，根据本发明的一个实施例，是通过将基因集中的组装片段与微生物参考序列运用软件metagenemark比对，依据与某种微生物参考序列的相似程度来判断组装片段是否来自该种微生物。所称参考序列指预先确定的序列，可以是预先获得的待测样本所属或者所包含的生物类别的任意参考模板，例如，若目标是待测样本中的微生物，参考序列可选择ncbi数据库中的各种微生物的参考基因组和或metahit项目公开的dacc肠道基因组，进一步地，也可以预先配置包含更多参考序列的资源库，例如依据待测样本来源的个体的状态、地域等因素选择或是测定组装出更接近的序列作为参考序列。根据本发明的一个实施例，确定结核病标志物中的各种微生物包含的组装片段包括：将所述基因集中的组装片段分别与所述各种微生物的参考序列进行比对，确定与一种微生物的参考序列的相似性大于或者等于90％的组装片段来自该种微生物。

根据本发明的一个实施例，所称的分别依据所述确定的组装片段的丰度，确定所述结核病标志物中的各种微生物的丰度的步骤中，微生物的丰度为该种微生物包含的所有组装片段的丰度的中位数或者平均数。

在步骤(2)中，进行丰度比较，以确定个体状态。

具体地，分别将步骤(l)中确定的结核病标志物中的各种微生物的丰度与预设临界值进行比较，依据获得的比较结果确定所述个体的状态，所述对照组由一组或多组相同状态的个体的粪便样本组成，所述状态包括患有结核病状态和健康状态。所称结核病标志物是发明人通过差异比较分析各种肠道微生物在结核病疾病组和健康组的粪便样本中的丰度，以及经过大量已知状态的粪便样本的验证，而确定下来的。根据本发明的实施例，预定临界值可以通过实验获得，例如通过平行实验从已知生理状态的对象确定在已知生理状态的对象样品中生物标记物的相对丰度，从而得到预定的临界值。根据本发明的实施例，所采用的临界值(cutoff)为下表所示，其中，对于有益生物标记物(方向定义为0)，相对丰度值小于临界值就被诊断为疾病状态；对于有害生物标记物(方向定义为1)，相对丰度值大于临界值就被诊断为疾病状态。

根据本发明的实施例，拟杆菌属(bacteroides_finegoldii)、shahii另枝菌属(alistipesshahii)、直肠真杆菌(eubacteriumrectale)、hominis罗氏菌属(roseburiahominis)、卵形拟杆菌(bacteroidesovatus)、布氏瘤胃球菌属(ruminococcusbromii)、普通拟杆菌(bacteroidesvulgatus)、超巨巨单胞菌(megamonashypermegale)、肺炎克雷伯菌(klebsiellapneumoniae)、去磺弧菌(desulfovibriodesulfuricans)、粪球菌属(coprococcuscatus)、肠枝罗氏菌(roseburiaintestinalis)、氨基酸球菌属(acidaminococcusintestini)、挑剔真杆菌(eubacteriumeligens)、殊异韦荣菌(veillonelladispar)、非典型韦荣菌(veillonellaatypica)、inulinivorans罗氏菌属(roseburiainulinivorans)、草酸杆菌(oxalobacterformigenes)、嗜热链球菌(streptococcusthermophilus)、putredinis另枝菌属(alistipesputredinis)、埃氏巨型球菌(megasphaeraelsdenii)、规则粪球菌(coprococcuseutactus)、瘤胃乳酸杆菌(lactobacillus_ruminis)、两岐双岐杆菌(bifidobacteriumbifidum)、青春双歧杆菌(bifidobacterium_adolescentis)、嗜黏蛋白阿克曼氏菌(akkermansia_muciniphila)可以作为有益菌用于治疗或者预防结核病，例如可以将这些有益菌用于食品中。根据本发明的一个实施例，本发明提供了一种食品或药物组合物，该食品或药物组合物含有上述有益生物标志物的至少一种。利用该食品或者药物组合物，可以有效地预防或者治疗结核病。另外，根据本发明的实施例，本发明提出了一种将上述有益生物标志物的至少一种在制备预防和/或治疗结核病的药物中的用途。并且，根据本发明的实施例，本发明还提出了一种治疗结核病的方法，其包括为有需要的对象给药促进上述有益生物标志物丰度增加中的至少一种。

对于物种标志物和功能标志物，本领域技术人员还可以通过常规的菌种鉴别手段和生物活性检验手段来确定在肠道菌群中存或者消失所述物种和功能。例如，菌种鉴别可以通过进行16srna进行。

根据本发明的又一种实施方式，提供一种制备或筛选上述实施方式中的治疗结核病的药物的方法，该方法包括制备或者筛选能够促使上述本发明任一实施例中的结核病标志物中的有益标志微生物的丰度增加的物质作为所述药物的步骤。

利用本发明这一方面的生产或筛选治疗结核病的药物的方法，通过合理有效地应用确定的结核病生物标志物进行筛选，能够获得能扶持肠道有益菌的生长和/或抑制肠道潜在致病菌的药物，可以阻止肠道屏障的缺损，改善并恢复肠道微生态结构，对于减轻结核病的临床症状具有重要意义。

其他

根据本发明的又一方面，本发明提出了一种用于确定对象异常状态的试剂盒。根据本发明的实施例，该试剂盒包含适于检测前述生物标志物的至少一种的试剂，利用该试剂盒可以有效确定对象是否含有上述生物标记物进而确定对象是否为异常状态，根据本发明的实施例，这里所述的异常状态为疾病，优选地，所述异常状态为结核病。

另外，根据本发明的实施例，本发明还提出了两种药物筛选方法。由此，根据本发明实施例，结核病密切相关的标志物作为药物设计靶点来进行药物的筛选，促进新的结核病药物的发现。例如，可以通过检测与候选药物接触前后生物标志物水平的变化，来确定候选药物是否可以作为治疗或预防结核病的药物；另外，还可以通过确定药物对上述生物标记物的至少一种的生物活性的直接影响或间接影响来对候选化合物是否可以作为治疗或预防结核病的药物来进行筛选。

以下结合具体实施例对本发明的方法和/或装置进行详细的描述。除另有交待，以下实施例中涉及的未特别交待的试剂、序列(接头、标签和引物)、软件及仪器，都是常规市售产品或者开源的。

实施例1：样品收集

所有20个粪便样品分别采自20个志愿者，由中国东莞第六人民医院医院进行粪便样品的采集。以诊断出的结核病患者作为病例组，其他非糖尿病个体作为对照组。

实施例2：dna提取及测序

2.1粪便样品的存储

将取好的粪便样品放入灭菌的粪便收集管，立即存储于冷冻室将粪便样本加入甘油冷冻。冷冻的样本被送到保存点后，保存于-80℃直至使用。

2.2dna提取

每份分别取200mg冷冻粪便样品，以qiagen粪便dna提取试剂盒提取。

实施例3：生物标志物的鉴定

参照图1和图2的实验流程，对结核病的生物标志物进行确定和鉴定。

3.1测序数据的基本处理

ebi原始数据已经经过质量控制和去宿主处理，数据处理步骤如下：

(1)去除接头污染的reads(reads中接头污染的碱基数大于5bp)；

(2)去除低质量的reads(超过15％的碱基质量值低于19的reads)；

(3)去除含n比例大于5％的reads。

3.2获得结核病微生物组基因集

宏基因组生物标志物主体是基因和相对应的功能，因此需要对测序序列进行组装和基因预测，去冗余，构建非冗余参考基因集。使用soapdonovo、velvet和spades短序列组装软件基于de-bruijn算法进行构图，对测序序列进行简化、纠错；reads取k-mer后基于overlap形成contig；contig基于reads的双末端关系组成scaffold；最后scaffold延伸等得到组装序列。随后采用软件metagenemark对组装序列进行基因预测，得到样品中物种的绝对丰度和相对丰度。

3.3关联分析/筛选结核病生物标记物

将所有结核病患者样品与健康人样品分成实验组与验证组。使用阂值(fdr<0.05)发现在健康组和结核病组之间的显著差异的标志物有43个。

其中，在结核病中被富集的如下：费格森埃希菌(escherichiafergusonii)、布氏弓形菌(arcobacterbutzleri)、肺炎链球菌(streptococcusmitisoralispneumoniae)、格氏链球菌(streptococcusgordonii)、婴儿链球菌(streptococcusinfantis)、前庭链球菌(streptococcusvestibularis)、哈氏梭菌(clostridiumhathewayi)、粪便拟杆菌(bacteroidesstercoris)、迟缓埃格特菌(eggerthellalenta)、圆柱状真杆菌(eubacteriumcylindroides)、大肠埃希氏菌(escherichiacoli)、芦苇链球菌(streptococcusaustralis)、脆弱拟杆菌(bacteroidesfragilis)、阴沟肠杆菌属(enterobactercloacae)、粪拟杆菌(bacteroidescaccae)、小韦荣球菌(veillonellaparvula)、芽胞拟杆菌(bacteroidesmassiliensis)、多型拟杆菌(bacteroidesthetaiotaomicron)。

在健康人(对照组)中被富集的如下：拟杆菌属(bacteroides_finegoldii)、shahii另枝菌属(alistipesshahii)、直肠真杆菌(eubacteriumrectale)、hominis罗氏菌属(roseburiahominis)、卵形拟杆菌(bacteroidesovatus)、布氏瘤胃球菌属(ruminococcusbromii)、普通拟杆菌(bacteroidesvulgatus)、超巨巨单胞菌(megamonashypermegale)、肺炎克雷伯菌(klebsiellapneumoniae)、去磺弧菌(desulfovibriodesulfuricans)、粪球菌属(coprococcuscatus)、肠枝罗氏菌(roseburiaintestinalis)、氨基酸球菌属(acidaminococcusintestini)、挑剔真杆菌(eubacteriumeligens)、殊异韦荣菌(veillonelladispar)、非典型韦荣菌(veillonellaatypica)、inulinivorans罗氏菌属(roseburiainulinivorans)、草酸杆菌(oxalobacterformigenes)、嗜热链球菌(streptococcusthermophilus)、putredinis另枝菌属(alistipesputredinis)、埃氏巨型球菌(megasphaeraelsdenii)、规则粪球菌(coprococcuseutactus)、瘤胃乳酸杆菌(lactobacillus_ruminis)、两岐双岐杆菌(bifidobacteriumbifidum)、青春双歧杆菌(bifidobacterium_adolescentis)、嗜黏蛋白阿克曼氏菌(akkermansia_muciniphila)。结果如下表1所示。

表1结核病生物标志物