细胞选择方法、细胞检测方法、细胞选择装置及检测装置与流程

本发明涉及一种细胞选择方法、细胞检测方法、细胞选择装置及细胞检测装置。

背景技术：

专利文献1中记述了一种将流式细胞仪等运用于荧光原位杂交法(fish法)下的检测时的细胞的处理方法。利用fish法，让标记探针结合到细胞中的检测对象dna序列区并由此染色细胞，检测出因标记探针而产生的荧光，以此就能进行异常细胞的检测。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：日本专利（特表）2005-515408号公报。

技术实现要素：

发明要解决的课题

采用原位杂交法时，有时会出现标记探针的染色性差的细胞或引起非特异性反应的细胞。如此，如果分析对象细胞中混入染色不良的细胞，会导致无法精准地检测出异常细胞。因此，精确地检测出异常细胞成为人们的普遍要求。

解决课题的手段

本发明第一技术方案涉及一种细胞选择方法。本技术方案涉及的细胞选择方法包括以下步骤：试样制备步骤，用第一荧光色素对细胞中的核酸染色，并使含第二荧光色素的评价用探针与细胞中dna的评价对象区杂交，以此制备试样；受光步骤，用光照射试样，并接收来自第一荧光色素的荧光和来自第二荧光色素的荧光；选择步骤，根据来自第一荧光色素的荧光的强度和来自第二荧光色素的荧光的强度选择分析对象细胞。第一荧光色素是发出第一波长的荧光的色素，第二荧光色素是发出不同于第一波长的第二波长荧光的色素。

本发明第二技术方案涉及一种细胞选择方法。本技术方案涉及的细胞选择方法包括以下步骤：试样制备步骤，用第一荧光色素对细胞中的核酸染色，并使含第二荧光色素的评价用探针与细胞中dna的评价对象区杂交，以此制备试样；拍摄步骤，用光照射试样，并对试样中的细胞进行拍摄；亮度获取步骤，根据在拍摄步骤拍摄的细胞图像获取来自第一荧光色素的荧光的图像的亮度和来自第二荧光色素的荧光的图像的亮度；选择步骤，根据来自第一荧光色素的荧光的图像的亮度和来自第二荧光色素的荧光的图像的亮度选择分析对象细胞。第一荧光色素是发出第一波长的荧光的色素，第二荧光色素是发出不同于第一波长的第二波长荧光的色素。

本发明第三技术方案涉及一种细胞检测方法。本技术方案涉及的细胞检测方法包括：试样制备步骤，用第一荧光色素对细胞中的核酸染色，用含第二荧光色素的评价用探针与细胞中dna的评价对象区进行杂交，并用含第三荧光色素的检测用探针与细胞中dna的检测对象区杂交，以此制备试样；受光步骤，用光照射试样，并接收来自第一荧光色素的荧光、来自第二荧光色素的荧光和来自第三荧光色素的荧光；选择步骤，根据来自第一荧光色素的荧光的强度和来自第二荧光色素的荧光的强度选择分析对象细胞；检测步骤，根据来自第三荧光色素的荧光从分析对象细胞检测出异常细胞。第一荧光色素是发出第一波长荧光的色素，第二荧光色素是发出不同于第一波长的第二波长荧光的色素，第三荧光色素是发出不同于第一和第二波长的第三波长的荧光的色素。

本发明第四技术方案涉及一种细胞选择装置。本技术方案涉及的细胞选择装置包括：试样制备部件，其混合细胞、含用于染色细胞中的核酸的第一荧光色素的核酸染色用试剂、以及含有与细胞中dna的评价对象区杂交的且含第二荧光色素的评价用探针的试剂，以此制备试样；流动室，供试样流动；光源，用光照射在流动室流动的试样；受光部件，接收来自第一荧光色素的荧光和来自第二荧光色素的荧光；处理部件。第一荧光色素是发出第一波长荧光的色素，第二荧光色素是发出不同于第一波长的第二波长荧光的色素。处理部件根据来自第一荧光色素的荧光的强度和来自第二荧光色素的荧光的强度选择分析对象细胞。

本发明第五技术方案涉及一种细胞选择装置。本技术方案涉及的细胞选择装置包括：试样制备部件，混合细胞、含染色细胞中核酸的第一荧光色素的核酸染色用试剂、以及含有与细胞中dna的评价对象区杂交的且含第二荧光色素的评价用探针的试剂，以此制备试样；流动室，供试样流动；光源，用光照射在流动室流动的试样；拍摄部件，拍摄试样中的细胞；处理部件。第一荧光色素是发出第一波长荧光的色素，第二荧光色素是发出不同于第一波长的第二波长荧光的色素。处理部件根据拍摄部件所拍摄的细胞图像获取来自第一荧光色素的荧光的图像的亮度和来自第二荧光色素的荧光的图像的亮度，根据来自第一荧光色素的荧光的图像的亮度和来自第二荧光色素的荧光的图像的亮度选择分析对象细胞。

本发明第六技术方案涉及一种细胞检测装置。本技术方案涉及的细胞检测装置包括：试样制备部件，混合细胞、含染色细胞中核酸的第一荧光色素的核酸染色用试剂、含有与细胞中dna的评价对象区杂交的且含第二荧光色素的评价用探针的试剂、以及含有与细胞中dna的检测对象区杂交的且含第三荧光色素的检测用探针的试剂，以此制备试样；流动室，供试样流动；光源，用光照射在流动室流动的试样；受光部件，接收来自第一荧光色素的荧光、来自第二荧光色素的荧光、以及来自第三荧光色素的荧光；处理部件。第一荧光色素是发出第一波长荧光的色素，第二荧光色素是发出不同于第一波长的第二波长荧光的色素，第三荧光色素是发出不同于第一和第二波长的第三波长的荧光的色素。处理部件根据来自第一荧光色素的荧光的强度和来自第二荧光色素的荧光的强度选择分析对象细胞，并根据来自第三荧光色素的荧光从分析对象细胞中检测出异常细胞。

发明效果

通过本发明能够精确地检测出异常细胞。

附图说明

图1为实施方式1涉及的细胞检测方法的流程图；

图2（a）为实施方式1涉及的检测用探针结合于检测对象区的状态图；图2（b）为实施方式1涉及的评价用探针结合于评价对象区的状态图；

图3（a）为实施方式1的变更例涉及的从图像的各像素获取亮度值的说明图；图3（b）为实施方式1的变更例涉及的从亮度值获取图像的亮度的说明图；

图4（a）为实施方式1涉及的用于选择分析对象细胞的散点图和区域的示图；图4（b）为实施方式1涉及的用于计算中值的直方图；

图5（a）、（b）为实施方式1涉及的用于选择分析对象细胞的区域的变更例；

图6为实施方式1涉及的从用于选择分析对象细胞的散点图的三个不同区域中的细胞获取的明视野图像和荧光图像的例示图；

图7（a）~（f）为实施方式1的验证中为除去不需要的粒子而绘制的散点图和区域的示图；

图8（a）~（f）为实施方式1涉及的验证中绘制的散点图和在散点图中设定的用于筛选分析对象细胞的区域的示图；

图9（a）、（b）为实施方式1涉及的验证中用于选择分析对象细胞的散点图和区域的示图；

图10为实施方式1和比较例涉及的验证结果的示图；

图11（a）、（b）为实施方式2涉及的基于双融合判断易位时荧光标记一例的示意图；图11（c）、（d）为实施方式2涉及的基于双融合判断易位时合并的荧光图像一例的示意图；

图12（a）、（b）为实施方式2涉及的基于断裂判断易位时荧光标记的一例的示意图；图12（c）、（d）为实施方式2涉及的基于断裂判断易位时合并的荧光图像一例的示意图；

图13为实施方式1~4涉及的判断各种基因组异常并检测出异常细胞的说明图；

图14为实施方式5涉及的细胞检测装置的结构框图；

图15为实施方式5涉及的光学检测部件的结构示意图；

图16为实施方式5涉及的细胞分析装置进行的异常细胞检测处理的流程图；

图17为实施方式5涉及的用于接受通过肉眼观察来分类图像所得到的结果的肉眼观察结果输入界面的结构图；

图18为实施方式6涉及的细胞选择装置的结构框图；

图19为实施方式6涉及的粒子甄别部件、存放部件和流动室的结构示意图；

图20为实施方式6涉及的细胞选择装置进行分析对象细胞选择处理的流程图。

具体实施方式

本发明提供的选择方法将标记探针的染色性差的细胞和产生了标记探针的非特异性结合的细胞从分析对象中排除，选择标记探针恰当地与检测对象dna序列区杂交的细胞作为分析对象。本发明还提供一种从所选择的细胞检测出出现了基因组异常的异常细胞的检测方法。

在此，在本说明书中，“基因组异常”指出现了与野生型dna序列不同的序列，包括如基因扩增、缺失、倒位、易位等情况。

“基因扩增”指基因组中特定的基因扩增，“缺失”是染色体的一部分，如长臂或短臂等缺失，“易位”指染色体的一部分断开，并附着、融合于其他染色体，“倒位”指染色体上的dna的碱基序列的顺序部分颠倒。

“基因”不区分功能区，例如包括表达调控区、编码区、外显子或内含子。因此，“基因”这一用语除了编码区外还包括启动子、增强子和终止信号等的调控序列。基因的调控序列也可以位于编码区的近侧、同区内或同区的远侧。

“异常细胞”指出现了基因扩增、缺失、倒位和易位中的至少一种的基因组异常的细胞，“正常细胞”指未出现基因扩增、缺失、倒位和易位中的任何一种情况的细胞。

“检测用探针”包括与细胞中dna的检测对象区的碱基序列互补的多核苷酸、以及标记多核苷酸的荧光物质。荧光物质可以直接与多核苷酸结合，也可以间接与其结合。在此，所谓间接结合指荧光物质通过抗体等其他物质（以下称中介物）与多核苷酸结合。中介物可以使用半抗原、抗半抗原抗体等，比如可以使用与多核苷酸结合的半抗原、抗半抗原第一抗体、与第一抗体结合的标记第二抗体。也可以不用第二抗体而用标记后的抗半抗原第一抗体。使用中介物时，在本说明书中将多核苷酸、中介物和荧光物质的复合物统称为“检测用探针”。半抗原可列举出生物素、脱硫生物素及其他衍生物、二硝基苯酚（dnp）、地高（dig）等。抗半抗原第一抗体比如可以使用抗dnp抗体、抗dig抗体。与生物素结合的捕获剂可以是亲和素、链霉亲和素（streptavidin）或抗体。抗体可以用作其他半抗原的捕获剂。第二抗体只要能与第一抗体结合即可，比如可以是来自山羊的抗兔抗体、来自山羊的抗鼠抗体。

“评价用探针”包括与细胞中dna的评价对象区的碱基序列互补的多核苷酸、标记多核苷酸的荧光物质。荧光物质可以直接与多核苷酸结合，也可以间接与其结合。在此，间接结合的含义同上所述。使用中介物时，在本说明书中将多核苷酸、中介物、荧光物质的复合物统称为“评价用探针”。半抗原、抗半抗原第一抗体、第二抗体同上所述。

检测用探针包括中介物时，中介物必须是与检测用探针的多核苷酸特异性结合，且实质上不与评价用探针的多核苷酸结合的物质。同样，评价用探针包括中介物时，该中介物必须是与评价用探针的多核苷酸特异性结合，且实质上不与检测用探针的多核苷酸结合的物质。

此外，检测用探针和评价用探针分别包括与半抗原特异性结合的标记抗体时，在检测用探针和评价用探针之间，与多核苷酸结合的半抗原必须是不同物质，比如将dnp用作与检测用探针的多核苷酸结合的半抗原时，需要用dig作为与评价用探针的多核苷酸结合的半抗原。

此外，检测用探针和评价用探针分别包括与第一抗体结合的标记第二抗体时，检测用探针中所包括的标记第二抗体必须是与检测用探针用第一抗体特异性结合，且实质上不与评价用探针用第一抗体结合的物质。同样，评价用探针中所包括的标记第二抗体必须是与评价用探针用第一抗体特异性结合，且实质上不与检测用探针用第一抗体结合的物质。比如，可以用不同种类的动物制作检测用探针用的第一抗体和评价用探针用的第一抗体，并将针对该特定种类的动物的抗体的抗体用作第二抗体。比如可以用鼠抗体作为检测用探针用第一抗体，将抗鼠抗体作为第二抗体，将兔抗体作为评价用探针用第一抗体，将抗兔抗体作为第二抗体。使用标记第二抗体时，最好在检测用探针与评价用探针之间使与多核苷酸结合的半抗原和第一抗体的结合方式不同。

检测用探针和评价用探针中所包括的荧光物质分别使用发出不同波长荧光的荧光物质。荧光物质如有荧光素（fluorescein）、或其衍生物（如异硫氰酸荧光素（fluoresceinisothiocyanate）（fitc））、藻红蛋白（phycoerythrin）（pe）、texasred（注册商标）（tr）、cy染料（cydye）、罗丹明（rhodamine）、alexa色素（alexafluor（注册商标））等。

“抗体”包括但不限于fab、fv、scfv和fd片段、嵌合抗体、人源化抗体、单链抗体和含有抗体的抗原结合部分及非抗体蛋白质的融合蛋白，其包括任意的同种型（isotype）抗体或免疫球蛋白（immunoglobulin）、能保持与抗原特异性结合的抗体片段。“抗体”还可以与其他部分结合，例如与生物素（生物素-亲和素特异性结合体的成员）等特定结合体的成员结合。“抗体”中还包括fab’、fv、f(ab’)2、以及能保持与抗原特异性结合的其他抗体片段。

“多核苷酸”和“核酸”在本说明书通篇可互换使用，其包括dna分子（如cdna或基因组dna）、rna分子（如mrna）、使用核苷酸类似物（如肽核酸和非天然核苷酸类似物）生成的dna或rna的类似物、以及上述物质的杂合体。核酸分子可以是单链或双链。

“杂交”（hybridization或hybridize）指在互补性核苷（nucleoside）碱基间或互补性核苷酸碱基间形成氢键(可以是watson-crick氢键、hoogsteen氢键或逆向hoogsteen氢键)。比如，腺嘌呤（adenine）和胸腺嘧啶（thymine）是通过氢键的形成而配对的互补核酸碱基。“互补”在本说明书中使用时，指二个核苷酸间正确配对的能力。比如，当多核苷酸的特定位置的核苷酸能够在dna分子的相同位置与核苷酸进行氢键结合时，可以认为此多核苷酸与dna在该位置是互补的。此多核苷酸与此dna中，各分子中足够数目的相对应位置被能够相互进行氢键结合的核苷酸所占据时，两者就是互补的。因此，“特异性杂交”和“互补”这些用语用于表示能够在此多核苷酸与此dna目标之间产生稳定且特异性的键合的、足够的互补性或正确的配对。

如果多核苷酸在严格（stringent）条件下能与检测对象区或评价对象区的碱基序列杂交的话就是“互补的”。

“严格条件”指多核苷酸有选择地与特定核酸序列杂交，且几乎或完全不与其他序列杂交的条件，本领域技术人员可以适当选择。比如，可以参照《molecularcloning,alaboratorymannual》（《分子克隆实验指南》）第二版中的[j.sambrook､coldspringharborlaboratorypress,1989]（[j.萨姆布鲁克等人，冷泉港实验室出版社,1989年发行）上所记述的关于短链核苷酸杂交的条件等来设定“严格条件”。该“严格条件”例如可列举出下述条件：在含有30~70质量%甲酰胺（formamide）的ph7.4的溶液中，在44℃环境下进行杂交后，用2×ssc(1×ssc的组成：0.15m氯化钠、0.015m柠檬酸钠（sodiumcitrate），ph7.0)在60℃以上条件下进行清洗等条件。但本发明不仅限于这一例示。

“检测对象区”指细胞核中存在的dna序列区中要检测有无基因扩增、缺失、易位和倒位中的某种异常的dna序列区。

“评价对象区”是细胞核中存在的dna序列区中，与细胞周期s期的dna复制一起增加，且不会发生起因于基因组异常的扩增和序列变化的dna序列区。要检测出现了基因扩增的异常细胞时，评价对象区只要如下选择即可：细胞核中存在的dna序列区中，除产生扩增的dna序列区的dna序列区的一部分。比如，要检测出出现了her2基因扩增的异常细胞时，只要将除her2基因的dna序列区的一部分作为评价对象区即可，比如，可以将17号染色体的着丝粒(centromere)区作为评价对象区。要检测出出现了缺失的异常细胞时，只要将细胞核中存在的dna序列区中除出现缺失的dna序列区的dna序列区中的一部分作为评价对象区即可。要检测出出现了易位的异常细胞时，评价对象区可以是基因组上的任何区域。可以将因易位而转移到其他染色体的dna序列区作为评价对象区，也可以将包括易位造成的断裂点在内的dna序列区作为评价对象区。比如，9号染色体中的abl基因因易位而转移到22号染色体并与22号染色体上的bcr基因融合而生成了bcr-abl融合基因，要检测出出现了上述bcr-abl融合基因的异常细胞时，可以将bcr基因或abl基因作为评价对象区。要检测出出现了倒位的异常细胞时，评价对象区可以是基因组上的任何区域。可以将因倒位而转移的dna序列区作为评价对象区，也可以将包括倒位所造成的断裂点在内的dna序列区作为评价对象区。

“核酸染色用色素”是染色细胞中全体核酸的物质，其发出的荧光波长不同于与dna特定区域杂交并进行荧光标记的检测用探针的荧光物质和评价用探针的荧光物质。核酸染色用色素包括用于对核酸特异性染色的嵌入剂（intercalator）和结合于小沟(minorgroove)的荧光色素。上述嵌入剂可举出花青类、吖啶（acridine）类和菲啶（phenanthridium）类的众所周知的色素。比如，花青类的嵌入剂有sybr（注册商标）greeni、噻唑橙（thiazoleorange）。吖啶（acridine）类嵌入剂有吖啶橙（acridinorange）。菲啶（phenanthridium）类嵌入剂有碘化丙啶（propidiumiodide）、溴化乙锭（ethidiumbromide）。结合于小沟的色素如有dapi、赫斯特（hoechst）等众所周知的色素。比如，赫斯特（hoechst）可列举出赫斯特（hoechst）33342、赫斯特（hoechst）33258等。

“细胞”可以是天然存在的细胞，也可以是人工改造的细胞（如融合细胞、ips细胞）。细胞可以是体细胞也可以是生殖细胞。这类细胞包括但不限于：胚胎干细胞（embryonicstemcell）、成体干细胞(somaticstemcell)、分化（differentiation）细胞（如表皮细胞、胰实质细胞、胰管细胞、肝细胞、血细胞、心肌细胞、骨骼肌细胞、成骨细胞、骨骼肌成肌细胞、神经细胞、血管内皮细胞、色素细胞、平滑肌细胞、脂肪细胞、骨细胞、软骨细胞等）等。动物物种的细胞以使用脊椎动物的细胞为宜，使用哺乳动物的细胞更好。使用灵长类（如黑猩猩、日本猴、人）的细胞则更佳。最好的是使用人的细胞。在流式细胞仪上检测细胞时，最好将细胞块分散成分散状的细胞后进行检测。此外，使检测用探针和评价用探针与dna的特定区域杂交前，最好用甲醇、乙醇等极性有机溶剂固定细胞。

“试样”指的是：包括细胞的、检测用探针和评价用探针与细胞中的dna杂交且细胞中全体核酸被染色的样本。

在试样制备步骤中，用核酸染色用色素对核酸染色，并让评价用探针与基因组杂交，由此制备试样。

核酸染色和评价用探针杂交前，最好先固定细胞以防止核酸降解等。固定细胞可以使用乙醇、甲醇、甲醛等众所周知的固定液。

让评价用探针与基因组dna杂交前，最好先通过加热或利用表面活性剂的化学处理等众所周知的方法使基因组dna变性并成为单链状态。同时使用评价用探针和检测用探针二者（以下有时统称为“探针”）时也一样。

探针杂交后，也可以通过清洗除去与dna非特异性杂交了的检测用探针和评价用探针。可以用盐浓度低的溶液清洗探针。

探针包括标记抗体时，在使抗体反应前也可以先进行封闭处理，以降低背景。封闭剂可以使用bsa、脱脂乳等。也可以在进行了标记抗体的反应后，进行b/f分离处理，b/f分离处理是指分离与目标物质结合了的标记抗体以及未与目标物质结合并处于游离状态的标记抗体的处理，然后除去游离的标记抗体。例如可以通过离心处理来进行b/f分离处理。

探针包括第一抗体和标记第二抗体时，可以在第一抗体与探针的多核苷酸的反应中实施上述封闭处理和/或b/f分离处理。此外，在使标记第二抗体反应时也可以进行上述封闭处理和/或b/f分离处理。

核酸染色和评价用探针的杂交可以同时进行，也可以分别进行。同时进行时，可以通过使核酸染色用色素和含评价用探针的染色试剂与细胞混合来实现。评价用探针包括多核苷酸和抗体时，核酸染色可以与多核苷酸和基因组dna的杂交同时进行，也可以与抗体反应同时进行。核酸染色和评价用探针的杂交分别进行时，其顺序无特别限定。

在受光步骤中，对制备的试样照射激发光，并获取所产生的荧光的信息。获取染色细胞中的核酸的核酸染色色素在激发光的照射下所产生的荧光、以及评价用探针的荧光色素在激发光的照射下产生的荧光的信息。

在选择步骤中，根据来自核酸染色用色素和评价用探针的荧光色素的荧光信息选择分析对象细胞。

以检测出有基因组异常的细胞为目的时，分析对象细胞可以选择来自核酸染色用色素的荧光强度和来自评价用探针的荧光色素的荧光强度的比率在一定范围内的细胞。比如，可以选择来自核酸染色用色素的荧光强度和来自评价用探针的荧光色素的荧光强度的比率在一定数值范围内的细胞作为分析对象细胞。此外，也可以在以从试样中各细胞获得的上述比率为轴的直方图数据中，确定其中值的比率，并选择相对于所确定的中值的比率来说有一定幅度的范围内的细胞作为分析对象细胞。

选择分析对象细胞时，例如可以从测定试样中各细胞所获得的测定数据中只提取分析对象细胞的测定数据，也可以通过物理手段从试样中所有细胞中只将分析对象细胞与其他细胞分离开来并将其回收。物理手段比如可以是：通过热来产生气泡，让气泡撞击在流路流动的细胞，以此将其与其他细胞分离开来；物理手段还可以是：通过开关二条流路中的其中一者，改变在流路流动的液体的方向，只让所需要的细胞流入其中一流路并将其收集起来。

根据从与所选择的细胞中的dna结合的检测用探针的荧光物质获得的荧光强度就能检测出基因组异常。比如，可以算出来自检测用探针的荧光物质的荧光强度和来自评价用探针的荧光物质的荧光强度之比，并由此检测出基因组异常。例如，也可以检测出来自检测用探针的荧光物质的荧光强度除以来自评价用探针的荧光物质的荧光强度所得到的值超过阈值的细胞作为出现了基因组异常的细胞。还可以算出来自检测用探针的荧光物质的荧光强度和来自评价用探针的荧光物质的荧光强度之差，检测出差超过阈值的细胞作为出现了基因组异常的细胞。

（实施方式1）

实施方式1中，将本发明用在了基于fish法将仅细胞中特定dna序列区出现了扩增的细胞作为异常细胞检测出来的方法中。实施方式1中将her2基因扩增并癌变的细胞作为异常细胞检测出来。

如图1所示，用于检测出异常细胞的细胞检测方法包括试样制备步骤、受光步骤、选择步骤和检测步骤。以下说明操作人员用流式细胞仪和能够分析流式细胞仪获取的荧光的强度的处理装置实现图1所示细胞检测方法的情况进行说明。

在步骤s11的试样制备步骤中，操作人员进行检测用探针与细胞核中dna的检测对象区的杂交、评价用探针与细胞核中dna的评价对象区的杂交、以及细胞中核酸的染色，以此制备试样。试样包括采自受检者的细胞。

在实施方式1中，检测对象区是her2基因，评价对象区是17号染色体中除her2基因的dna序列区的部分序列。以下称17号染色体中除her2基因的dna序列区的部分序列为“ch17”。评价对象区只要是细胞核中存在的dna序列区中与细胞周期s期的dna复制一起增加、且不会出现起因于基因组异常的扩增和序列变化的dna序列区即可。比如，评价对象区只要是细胞核中dna序列区中的、除发生扩增的dna序列区的区域即可。由此观点出发，评价对象区例如可以列举出17号染色体的着丝粒区。

如图2（a）所示，检测用探针包括与作为检测对象区的her2基因特异性结合的多核苷酸（her2dna探针）、第一抗体（兔抗-dnp抗体）、第二抗体（山羊抗-兔抗体）、荧光色素（alexafluor（注册商标）647）。多核苷酸用二硝基苯酚（dnp）标记。通过步骤s11的试样制备步骤，多核苷酸与检测对象区结合，荧光色素通过第一抗体和第二抗体结合到多核苷酸。如图2（b）所示，评价用探针包括与作为评价对象区的ch17特异性结合的多核苷酸（ch17dna探针）、第一抗体（鼠抗-dig抗体）、第二抗体（山羊抗-鼠抗体）、荧光色素（alexafluor（注册商标）488）。多核苷酸由地高辛（dig）标记。通过步骤s11的试样制备步骤，多核苷酸与评价对象区结合，荧光色素通过第一抗体和第二抗体结合到多核苷酸。此外，通过步骤s11的试样制备步骤，细胞核被特异性染色核酸的核酸染色用色素，具体而言，被与dna的at序列的小沟结合的荧光色素（hoechst33342）染色。细胞核中的全体核酸通过此色素得到染色。

检测用探针中所含有的荧光色素、评价用探针中所含有的荧光色素、以及染色细胞核中全体核酸的荧光色素使用的是当分别照射一定波长的光时产生互不相同的波长的荧光的不同种类的荧光色素。

返回图1，在步骤s12的受光步骤中，操作人员使用流式细胞仪，让在步骤s11制备的试样流入流动室，用光照射流经流动室的试样，通过受光部件接收来自检测用探针所含有的荧光色素的荧光、来自评价用探针所含有的荧光色素的荧光、以及来自核酸染色用色素的荧光。在步骤s12，也可以用荧光显微镜取代流式细胞仪。荧光显微镜例如可以使用蔡司（zeiss）公司制造的axioimager。此时，操作人员将试样置于基材(如载玻片)上，并操作显微镜来用光照射基材上的试样。此外，基材不限于载玻片，也可以是金属或其他任意适当的固体支撑体，比如也可以是硅片（siliconwafer）制作的基板。

在步骤s12，受光部件接收荧光，由此就各细胞生成来自检测用探针所含有的荧光色素的荧光的强度、来自评价用探针所含有的荧光色素的荧光的强度、来自核酸染色用色素的荧光的强度。在此所说的“荧光的强度”是受光部件输出的荧光信号波形（横轴为时间，纵轴为强度）中的峰值。荧光的强度不限于荧光信号波形的峰值，也可以是荧光信号波形的面积。如上所述，与检测对象区结合的检测用探针所含有的荧光色素、与评价对象区结合的评价用探针所含有的荧光色素和染色细胞核中核酸的荧光色素在光的照射下会产生互不相同波长的荧光。因此，例如，只要用不同受光部件接收波长各异的三种荧光，就能识别出检测对象区、评价对象区和细胞核整体。

也可以实施拍摄步骤和亮度获取步骤并由此取代步骤s12的受光步骤。在拍摄步骤中，操作人员使用能够拍摄粒子图像的流式细胞仪，让在步骤s11制备的试样流入流动室，用光照射流经流动室的试样，并通过拍摄部件拍摄来自检测用探针所含有的荧光色素的荧光、来自评价用探针所含有的荧光色素的荧光、来自核酸染色用色素的荧光。以此就各细胞获取来自检测用探针所含有的荧光色素的荧光的图像、来自评价用探针所含有的荧光色素的荧光地图像、来自核酸染色用色素的荧光的图像。然后在亮度获取步骤，操作人员用处理装置算出各图像中的亮度。

下面参照图3（a）、（b）就图像中亮度的计算进行说明。如图3（a）所示，在荧光图像中，就每个像素分别获取表示明暗的亮度值。如果拍摄的图像为黑白的，例如可以将基于灰度（gradation）的值作为亮度值。当所拍摄的图像为彩色时，例如可以在转换为黑白后再获取亮度值。针对图像上的所有像素获取亮度值。

接着，如图3（b）所示，例如基于图像上全部像素的亮度值绘制以亮度值为横轴、以像素数为纵轴的直方图。在此直方图上，与像素数相应地生成用虚线表示的曲线，算出此曲线所围起的范围的面积作为图像的亮度。另外，图像的亮度也可以是全部像素亮度值的总和。操作人员用处理装置进行上述演算，在各图像中算出亮度。如此算出的图像的亮度与通过受光部件接收荧光而生成的荧光的强度相对应。因此，可以将以下处理中使用的荧光的强度置换为荧光图像中的亮度。

接下来，在步骤s13的选择步骤，处理装置根据来自评价用探针所含有的荧光色素的荧光的强度和来自核酸染色用色素的荧光的强度选择分析对象细胞。更详细地说，在步骤s13，处理装置将下述细胞作为分析对象细胞：来自评价用探针所含有的荧光色素的荧光的强度和来自核酸染色用色素的荧光的强度之间存在着将评价用探针与评价对象区的杂交状态评价为恰当杂交的关系的细胞。然后，处理装置从通过测定试样中的各细胞所获得的测定数据中提取从分析对象细胞获得的、来自评价用探针所含有的荧光色素的荧光的强度数据和来自检测用探针所含有的荧光色素的荧光的强度数据。

如图4（a）所示，在步骤s13，绘制以来自评价用探针所含有的荧光色素的荧光的强度为纵轴，以来自核酸染色用色素的荧光的强度为横轴的散点图100。在散点图100中与试样所含有的各细胞相应地标绘出点。散点图100中设定了区域101，关于该区域101，来自评价用探针所含有的荧光色素的荧光的强度和来自核酸染色用色素的荧光的强度之比率被评价为位于一定范围。

区域101比如如下设定。就各细胞算出来自评价用探针所含有的荧光色素的荧光的强度和来自核酸染色用色素的荧光的强度的比率。根据就所有细胞分别算出的比率，如图4（b）所示绘制以比率为横轴、以粒子数为纵轴的直方图。在绘制的直方图中确定其中值的比率。然后，设定区域101，使该区域能够圈起相对于所确定的中值的比率来说有一定幅度的范围内的粒子。

在散点图100中设定的区域101不限于图4（a）所示形状，也可以是图5（a）、（b）所示形状。图5（a）的区域101是以直线101a为中心并具有一定幅度的区域。直线101a的倾斜度是如上算出的中值的比率，直线101a通过原点。即直线101a可以被视为纵轴与横轴的值存在正比例关系的直线。图5（b）的区域101是由曲线围起来的、以直线101a为中心并具有一定幅度的区域。设定如图5（a）、（b）所示的以直线101a为中心的区域101的幅度时只要保证能精确地选择出恰当地进行了杂交的细胞即可，比如，通过设定使其包括以直线101a为中心偏离3~5%的范围内的细胞。

在此，检测对象区和评价对象区中通过杂交使荧光标记探针进行结合，但细胞核整体的染色不同，其是用核酸染色用色素进行的。相对于用核酸染色用色素对细胞核中的全体核酸进行染色来说，如her2基因那样局部扩增的基因相对于全体核酸而言极其少，因此，从全体核酸染色用色素获得的荧光的强度大致上会随着细胞周期s期中dna的复制所伴随的细胞核中核酸量的增加而变化。

而如上所述，评价对象区是细胞核中存在的dna序列区中不发生起因于基因组异常的扩增和序列变化的dna序列区。评价对象区会与细胞周期s期中的dna的复制一起增加，所以如果在步骤s11的试样制备步骤中评价用探针与评价对象区的杂交恰当进行的话，来自评价用探针中所含有的荧光色素的荧光的强度就会与来自全部核酸染色用色素的荧光的强度相应地变化。因此，恰当进行了杂交的细胞会包含在区域101中，关于该区域101，可以认为来自评价用探针所含有的荧光色素的荧光强度与来自核酸染色用色素的荧光强度之比率在一定范围内。

然而，实际上并不一定在全部细胞中都能恰当地进行杂交。当有细胞未恰当地进行杂交时，来自评价用探针所含有的荧光色素的荧光强度并非仅与来自核酸染色用色素的荧光强度相应地变化，其还会因杂交的状态而变化。即，杂交未恰当进行的细胞会包含在区域101上下的区域102、103中。

区域101上面的区域102和区域101下面的区域103均包含可视为评价用探针与评价对象区的杂交未恰当进行的细胞。区域102是来自评价用探针所含有的荧光色素的荧光较大的区域，因此，区域102中包含被认为出现了评价用探针的非特异性结合的细胞。评价用探针的非特异性结合例如是因评价用探针与评价对象区以外的dna序列区结合而产生的。区域103是来自评价用探针所含有的荧光色素的荧光较小的区域，所以区域103中包含被认为评价用探针染色效率下降的细胞。评价用探针的染色效率下降比如因评价用探针杂交不良而产生。

在步骤s13的选择步骤，根据点绘在散点图100的试样中的所有细胞，即根据本次试样所含有的全部细胞设定区域101。然后，选择区域101内的细胞作为分析对象细胞。或者，区域101也可以是根据以前的试样预先设定并储存在处理装置中的区域。在预先设定区域101的情况下，可以在就一个细胞获取到荧光强度时便将其点绘在散点图上，如果此细胞包含在区域101的话，便将该细胞选为分析对象细胞。

在上述步骤s13的选择步骤中，为便于说明，在处理装置中绘制了散点图100。但实际上选择细胞时不会使用散点图100，处理装置会在以来自核酸染色用色素的荧光的强度和来自评价用探针所含有的荧光色素的荧光的强度为轴的假想的坐标空间上进行处理，并选择分析对象细胞。在以下说明中也不使用散点图，而是在以荧光强度为二条轴的假想的坐标空间上进行处理并由此选择细胞。另外，如上所述，处理装置也可以绘制散点图并选择细胞。

通过步骤s13的选择步骤，仅将评价用探针与评价对象区的杂交得以恰当进行的细胞选择出来。当评价用探针与评价对象区的杂交恰当进行时，可以认为检测用探针与检测对象区的杂交也得以恰当进行。因此，通过步骤s13的选择步骤选择的是评价用探针和检测用探针的杂交都得以恰当进行的细胞。

参照图6所示细胞的例示图说明来自图4（a）所示散点图100的区域101~103的细胞的荧光强度。

“明视野”表示细胞的明视野图像。“ch17”是对来自评价用探针所含有的荧光色素的荧光、即ch17所对应的荧光进行拍摄所得到的图像。“细胞核”是拍摄来自核酸染色用色素的荧光所得到的图像。“her2”是拍摄来自检测用探针所含有的荧光色素的荧光、即her2基因所对应的荧光而得到的图像。横向排列的四幅图像是从一个细胞获取的图像。图6所示五个细胞均为正常细胞，所以是her2基因没有扩增且存在双链dna的细胞。因此，可以设想，不论在哪个细胞中，只要杂交得以恰当进行的话，就能判别出ch17所对应的二个光点和her2基因所对应的二个光点。

参照区域101的细胞图像可知，ch17的光点和her2基因的光点都是清晰地存在二个。参照区域102的细胞图像可知，ch17的光点和her2基因的光点由于细胞整体都发出荧光而难以判别。参照区域103的细胞图像可知，ch17的光点和her2基因的光点由于荧光强度不充分而难以判别。

如此，区域102、103的细胞无法恰当地评价光点，所以在后述检测步骤中就不能精确检测出异常细胞。即，区域102、103的细胞有可能产生假阳性或假阴性。然而，通过实施方式1，在步骤s13的选择步骤中能够只选择散点图100的区域101内所含有的细胞——即被认为恰当进行了杂交的细胞来作为分析对象细胞。因此，所选择的分析对象细胞中很难混入染色不良的细胞，因此在检测步骤中能够精确地检测出异常细胞。

返回图1，在步骤s14的检测步骤中，操作人员使用处理装置并根据来自检测用探针所含有的荧光色素的荧光从分析对象细胞中检测出异常细胞。更具体而言，在步骤s14，处理装置根据来自检测用探针所含有的荧光色素的荧光的强度与来自评价用探针所含有的荧光色素的荧光的强度之比从分析对象细胞检测出异常细胞。具体而言，在各细胞中，用来自检测用探针所含有的荧光色素的荧光强度除以来自评价用探针所含有的荧光色素的荧光的强度，当除法所得到的结果超过一定阈值时，判断该细胞中检测对象区扩增。再将检测对象区扩增的细胞作为异常细胞检测出来。也可以仅根据来自检测用探针所含有的荧光色素的荧光的强度超过一定阈值这一依据来判断检测对象区扩增。

另外，当通过拍摄部件来拍摄来自检测用探针所含有的荧光色素的荧光和来自评价用探针所含有的荧光色素的荧光并获取图像时，也可以根据图像中来自检测用探针所含有的荧光色素的荧光的分布和来自评价用探针所含有的荧光色素的荧光的分布来检测出异常细胞。比如，也可以用检测用探针的光点数除以评价用探针的光点数，当除法所得到的结果超过一定阈值时，将该细胞作为异常细胞检测出来。还可以当检测用探针的光点数与评价用探针的光点数的差超过一定阈值时将该细胞作为异常细胞检测出来。还可以用来自检测用探针所含有的荧光色素的荧光在图像上的总面积除以来自评价用探针所含有的荧光色素的荧光在图像上的总面积，当除法所得到的结果超过一定阈值时，将该细胞作为异常细胞检测出来。

在步骤s13的选择步骤中，选择被认为杂交得以恰当进行的细胞作为分析对象细胞，在步骤s14的检测步骤中，针对所选择的各细胞判断其是否为异常细胞。如此，经过选择步骤之后再进行检测步骤，这样，只针对杂交得以恰当进行的细胞来判断其是否为异常细胞，因此能够提高检测步骤中异常细胞的检测精度。

如上所述，在实施方式1中能够精确地将her2基因扩增并癌变的细胞作为异常细胞检测出来。因此，对于her2基因随着病情发展而扩增的乳腺癌等疾病，医生等能够根据检测出的异常细胞来精确地判断病情。另外，her2基因是乳腺癌预后因子之一，因此，医生等人能够根据检测出的异常细胞恰当地判断针对患者的治疗方针。在实施方式1中将her2基因作为充当治疗方针判断指标的检测对象区，但不限于此，也可以以其他疾病作为治疗对象，并与对象疾病相应地将其他基因作为治疗方针的判断指标，即检测对象区。

（实施方式1的验证）

下面就发明人针对实施方式1进行的验证进行说明。

1.制备试样

使用her2基因扩增阴性的mcf7作为对照细胞。异常细胞使用了her2基因扩增阳性的sk-br-3。

（1）固定

将2×10⁶个mcf7装入1.5ml的管中，将2×10⁶个sk-br-3装入1.5ml的管中。在24℃室温环境下以1500rpm将各管离心分离1分钟，除去上清。在各管中加入700μl的pbs，再次使内容物悬浮。一边轻轻搅拌，一边向各管添加300μl卡诺氏溶液（carnoy'ssolution），获得最终浓度为30%的卡诺氏溶液。卡诺氏溶液是一种甲醇与醋酸之比为3：1的溶液。在4℃环境下通过搅拌各管来防止内容物沉降，直至经过20分钟。

在24℃室温环境下以1500rpm对各管进行离心分离1分钟，除去上清。在各管中加入300μl的pbs，再次使内容物悬浮。一边轻轻搅拌，一边向各管添加700μl卡诺氏溶液，得到最终浓度为70%的卡诺氏溶液。在4℃环境下通过搅拌各管来防止内容物沉降，直至经过20分钟。

（2）杂交

混合288μlhybready（ventana公司制，#780-4409）和12μl的her2dna鸡尾酒探针（ventana公司制，#109509），制备出杂交用试剂。her2dna鸡尾酒探针包括二硝基苯酚（dnp）标记的her2dna探针、以及地高辛（dig）标记的ch17dna探针。ventana公司制的dig标记的ch17dna探针与17号染色体中除her2基因的dna序列区的部分序列杂交。

在24℃室温环境下以1500rpm将（1）的各管离心分离1分钟，除去上清。在各管中加入1ml反应缓冲液（reactionbuffer，ventana公司制，#950-300）并进行清洗。这种清洗进行二次。在各管中加入杂交用试剂120μl，使内容物充分悬浮。将各管的内容物分装入二支0.2ml的管。即，制作二支含有mcf7的管，制作二支含有sk-br-3的管。用热循环仪在95℃环境下加热各管5分钟，将dna解离成单链。在44℃环境下进行过夜（约16小时）杂交。

（3）清洗探针

预先用恒温仪(heatblock)将2×ssc（ventana公司制，#650-012）加热到65℃。在（2）的各管中添加100μl的2×ssc。在24℃室温环境下以1500rpm将各管离心分离1分钟。离心分离后，除去各管的上清。在各管添加100μl的2×ssc，用热循环仪在65℃环境下加热各管3分钟，在24℃室温环境下以1500rpm对各管进行1分钟离心分离，除去上清，这一作业共进行三次。在各管中加入100μl反应缓冲液，使用内容物再次悬浮。

（4）封闭

制备3ml的1%bsa/反应缓冲液作为封闭试剂。在24℃室温环境下以1500rpm对（3）的各管进行1分钟离心分离，除去上清。在各管中添加100μl封闭试剂，悬浮内容物。在37℃环境下封闭20分钟。

（5）第一抗体反应

混合24μl兔抗dnpab和216μl鼠抗digab，制备第一抗体反应试剂。在24℃室温环境下以1500rpm对（4）的各管进行1分钟离心分离，去上清。为制备检测用试样，在所有管中的二支管中添加第一抗体反应试剂80μl，使内容物悬浮。为制备后述区域设定用试样而在剩下的二支管中添加反应缓冲液而非第一抗体反应试剂，使内容物悬浮。在37℃环境下进行20分钟第一抗体反应。

（6）第二抗体·细胞核染色反应

混合荧光标记抗体——即1μl抗-鼠igg-alexa488（cellsignalingtechnology公司制#4408s）、荧光标记抗体——即1μl抗-兔igg-alexa647（cellsignalingtechnology公司制#4414s）、1μl的hoechst33342（同仁化学研究所制，#346-07951）、以及1000μl封闭试剂，制备第二抗体·细胞核染色反应试剂。在24℃室温环境下以1500rpm对（5）的各管进行1分钟离心分离，去上清。在各管中添加第二抗体·细胞核染色反应试剂100μl，使内容物悬浮。在37℃环境下保持遮光状态并进行20分钟第二抗体·细胞核染色反应。

（7）测定用样本的制备

在24℃室温环境下以1500rpm对（6）的各管进行1分钟离心分离，去上清。在各管中添加100μl的tbst，在24℃室温环境下以1500rpm对各管进行1分钟离心分离，去上清，该作业共进行三次。在各管加入100μl封闭试剂，再次使内容物悬浮。

2.用流式细胞仪测定

用amnis公司制的成像流式细胞仪（imagestream^xmarkiiimagingflowcytometer）测定经过（1）~（7）的处理后的四支管内的试样。对流经流式细胞仪的流动室的试样照射波长为405nm、488nm、642nm、785nm的激光。然后接收来自检测用探针所含有的荧光色素的荧光所对应的光、来自评价用探针所含有的荧光色素的荧光所对应的光、来自核酸染色用色素的荧光所对应的光、以及明视野所对应的光，获取各荧光的强度和图像。

3.设定区域以除去不需要的粒子

使用在上述（5）的步骤中添加了取代第一抗体反应试剂的反应缓冲液的二支管来设定用于除去不需要的粒子的区域。这二支管中分别装有含未进行第一抗体反应的对照细胞的试样和含未进行第一抗体反应的异常细胞的试样。

让未进行第一抗体反应的试样流入流动室，就试样中所含有的各个粒子分别获取明视野图像、来自评价用探针所包含的荧光色素的荧光所对应的光的强度、来自检测用探针所包含的荧光色素的荧光所对应的光的强度、来自核酸染色用色素的荧光所对应的光的强度。根据含对照细胞的试样和含异常细胞的试样，如图7（a）、（b）所示，绘制以明视野图像中粒子的球度为纵轴，以明视野图像中粒子的面积为横轴的散点图110。球度越接近1，粒子形状就越接近正圆球。能够成为分析对象的细胞球度接近1，并具有一定面积。因此，将散点图110的区域111设定为能成为分析对象的细胞分布的区域。

然后，根据散点图110的区域111中所包含的粒子，如图7（c）、（d）所示，绘制以来自评价用探针所含有的荧光色素的荧光所对应的光的强度为纵轴，以来自核酸染色用色素的荧光所对应的光的强度为横轴的散点图120。因为微小粒子的大部分只发出微弱荧光，所以将具有一定强度以上荧光的物质集团作为分析对象。因此，将散点图120的区域121设定为能成为分析对象的细胞所分布的区域，将散点图120的区域122设定为不能成为分析对象的微小粒子所分布的区域。

然后，根据散点图120的区域121中所含有的粒子，如图7（e）、（f）所示，绘制以来自检测用探针所含有的荧光色素的荧光所对应的光的强度为纵轴，以来自评价用探针所含有的荧光色素的荧光所对应的光的强度为横轴的散点图130。未进行第一抗体反应的试样中的细胞虽然会产生微量的自身荧光，但不会产生大于一定强度的荧光。因此，在散点图130中将包含此试样中几乎所有细胞的区域132设定为未进行第一抗体反应的细胞所分布的区域。然后，在散点图130，将纵轴和横轴的值都大于区域132的区域131设定为能成为分析对象的细胞所分布的区域。

4.选择分析对象细胞

用上述步骤（5）中添加了第一抗体反应试剂的二支管选择出分析对象细胞。这二支管中分别装有含对照细胞的试样和含异常细胞的试样。让试样流入流动室，就试样所含有的各个粒子分别获取明视野图像、来自评价用探针所含有的荧光色素的荧光所对应的光的强度、来自检测用探针所含有的荧光色素的荧光所对应的光强度、来自核酸染色用色素的荧光所对应的光的强度。

然后，根据含对照细胞试样和含异常细胞的试样，如图8（a）、（b）所示，绘制与图7（a）、（b）相同的散点图110。在此时的散点图110上设定与图7（a）、（b）相同的区域111。然后根据图8（a）、（b）的区域111中所包含的粒子，如图8（c）、（d）所示，绘制与图7（c）、（d）相同的散点图120。在此时的散点图120上设定与图7（c）、（d）相同的区域121。然后，根据图8（c）、（d）的区域121中所包含的粒子，如图8（e）、（f）所示，绘制与图7（e）、（f）相同的散点图130。在此时的散点图130上设定与图7（e）、（f）相同的区域131。

然后根据图8（e）、（f）的区域131中所包含的粒子，如图9（a）、（b）所示，绘制与图4（a）相同的散点图100。在此时的散点图100上，如上文参照图4（a）所作出的说明同样地，设定可以认为来自评价用探针所含有的荧光色素的荧光的强度和来自核酸染色用色素的荧光的强度之比率在一定范围内的区域101。然后，选择图9（a）、（b）的区域101所含有的粒子作为分析对象细胞。

如此，通过图8（a）~（f）所示的分析对象细胞的筛选，除去不需要的粒子。因此，通过图9（a）、（b）的区域101精确地选择出了被认为恰当地进行了杂交的细胞。

5.基于分析对象细胞的灵敏度和特异度

就在上述4中最终选择的各个分析对象细胞，获取来自检测用探针所含有的荧光色素的荧光强度除以来自评价用探针所含有的荧光色素的荧光强度所得到的值。如图10所示，将实施方式1获取的除法运算值分成对照细胞与异常细胞进行点绘。

此外，在图10上，将就比较例所选择的各分析对象细胞所获取的除法运算值分成对照细胞与异常细胞来点绘出来。在比较例，上述4中不使用图9（a）、（b）所示的散点图100，以图8（e）、（f）的区域131中所含有的粒子作为分析对象。即，比较例与实施方式1相比省略了选择恰当进行了杂交的细胞这一步骤。

在实施方式1与比较例，如图10中虚线所示，分别设定针对除法运算值的阈值，以使得灵敏度和特异度最大化。灵敏度是因位于阈值上侧而被判断为异常的细胞数除以试样中实际的异常细胞数所得到的。特异度是因位于阈值下侧而被判断为正常的细胞数除以试样中对照细胞数所得到的值。在比较例中，灵敏度和特异度均为94.5%。在实施方式1中，灵敏度和特异度均为99.1%，结果好于比较例。另外，阈值也可以使用别的值。例如，可以用实施方式1中从各对照细胞获得的除法运算值的最大值作为阈值，也可以用实施方式1中从各异常细胞获得的除法运算值的最小值作为阈值。

如上所示，通过本验证得知，如实施方式1所述地用散点图100的区域101来选择恰当进行了杂交的细胞就能提高灵敏度和特异度。因此，通过实施方式1就能精确地检测出异常细胞和正常细胞，因此能够准确监视药物治疗的效果。

（实施方式2）

实施方式2中，将本发明应用于基于fish法将出现了易位的细胞作为异常细胞检测出来的方法。关于检测出出现了易位的异常细胞的方法，以慢性粒细胞白血病中会出现的9号染色体和22号染色体之间出现的易位为例进行说明。

在正常细胞即易位阴性的细胞中，如图11（a）所示，abl基因的序列在9号染色体，bcr基因的序列在22号染色体。以下称bcr基因的序列为“bcr区域部分”，称abl基因的序列为“abl区域部分”。出现易位，则abl区域部分转移到22号染色体。以此，异常细胞即易位阳性的细胞中就如图11（b）所示地出现bcr-abl融合基因。

因为会出现如此易位，所以，如图11（a）、（b）所示，例如荧光标记abl区域部分以产生红色荧光，荧光标记bcr区域部分以产生绿色荧光。于是，正常细胞的图像成为图11（c）所示状态，异常细胞的图像成为图11（d）所示状态。图11（c）、（d）所示细胞图像是合成基于细胞产生的红色荧光的图像和基于细胞产生的绿色荧光的图像所得到的。在图11（c）的情况下，红色光点与绿色光点分离，所以可以知道细胞是正常细胞。而在图11（d），由于所谓的双融合（dualfusion）而出现了红色光点与绿色光点重叠形成的黄色光点。以此，当出现图11（d）的情况下，可以知道细胞是出现了bcr-abl融合基因的异常细胞，医生等能够就慢性粒细胞白血病的可能性作出诊断。

此外，为了检测出abl区域部分向22号染色体的易位，例如，还可以如图12（a）、（b）所示，荧光标记bcr区域部分和与bcr区域部分相邻的核酸序列并使其分别产生绿色荧光。以下称与bcr区域部分相邻的核酸序列为“bcr相邻区域部分”。如此，正常细胞的图像成为图12（c）所示状态，异常细胞的图像成为图12（d）所示状态。

如图12（c）所示，细胞为正常细胞时，细胞核中的dna为双链，所以绿色光点与图12（a）所示状态相应地为二个。而如图12（d）所示，细胞为异常细胞时，染色体分离，即由于所谓的断裂（breakapart），bcr相邻区域部分从22号染色体断开，转移到9号染色体，绿色光点增加。另外，此时，9号染色体的abl区域部分转移到22号染色体上的bcr相邻区域部分曾经所在的部位。以此得知，图12（d）所示情况为异常细胞。此外，abl区域部分和与abl区域部分相邻的核酸序列也可以被荧光标记并产生绿色荧光。此时，与图12（c）、（d）同样地，可以检测出由于断裂产生的异常细胞。

在如上所述进行双融合和断裂的判断时，也进行图1步骤s11~s14的处理步骤，检测出异常细胞。

基于双融合进行判断时，如图11（a）所示，基因序列被荧光标记。此时，评价对象区是bcr区域部分或abl区域部分。当评价对象区是bcr区域部分时，检测对象区是abl区域部分，当评价对象区是abl区域部分时，检测对象区是bcr区域部分。即，检测对象区和评价对象区的组合只要是bcr区域部分和abl区域部分即可。

此时也与实施方式1同样地，在步骤s11的试样制备步骤，通过杂交使评价用探针结合到评价对象区，检测用探针结合到检测对象区。因此，与实施方式1同样地，通过步骤s11~s13，可以根据来自评价用探针所含有的荧光色素的荧光的强度和来自核酸染色用色素的荧光的强度选择恰当杂交的细胞。

在步骤s14的检测步骤中，用来自检测用探针所含有的荧光色素的荧光的图像和来自评价用探针所含有的荧光色素的荧光的图像来判断abl区域部分和bcr区域部分的分布。因此，在实施方式2中，在步骤s12的受光步骤获取上述图像。

在步骤s14，根据在步骤s12获取的图像中来自检测用探针所含有的荧光色素的荧光的分布和来自评价用探针所含有的荧光色素的荧光的分布，通过处理装置从分析对象细胞中检测出异常细胞。具体而言，由于基于检测用探针的光点位置与基于评价用探针的光点位置重合而如图11（d）所示在合成图像上产生了一定颜色的光点时，通过处理装置判断为出现了易位。然后，通过处理装置将出现了易位的细胞作为异常细胞检测出来。此外，也可以使显示部件上显示细胞的图像，通过操作人员肉眼观察，将基于检测用探针的光点位置和基于评价用探针的光点位置较接近或重合的细胞判断为出现了易位的异常细胞。

当基于断裂进行判断时，如图12（a）所示，bcr区域部分和与bcr区域部分相邻的核酸序列分别被荧光标记。此时，评价对象区是bcr区域部分或bcr相邻区域部分。当评价对象区是bcr区域部分时，检测对象区是bcr相邻区域部分，当评价对象区是bcr相邻区域部分时，检测对象区是bcr区域部分。即，检测对象区和评价对象区的组合只要是bcr区域部分和bcr相邻区域部分即可。另外，检测对象区和评价对象区的组合也可以是abl区域部分、以及与abl区域部分相邻的核酸序列。

此时也同样地，在步骤s11的试样制备步骤，通过杂交使评价用探针结合到评价对象区，使检测用探针结合到检测对象区。但此时的评价用探针和检测用探针能够与bcr区域部分和bcr相邻区域部分杂交，因此实际上其结构相同。然后，与上述双融合的情况同样地，通过步骤s11~s13，根据来自评价用探针所含有的荧光色素的荧光的强度和来自核酸染色用色素的荧光的强度选择恰当杂交的细胞。

在步骤s14，根据所获取的图像中来自检测用探针所含有的荧光色素的荧光的分布和来自评价用探针所含有的荧光色素的荧光的分布，通过处理装置从分析对象细胞中检测出异常细胞。如图12（b）所示，当检测对象区或评价对象区转移到其他染色体上时，可以认为出现了易位。因此，如图12（d）所示，当基于检测用探针和评价用探针的光点增加时，判断为出现了易位。然后将出现了易位的细胞作为异常细胞检测出来。此外，也可以使显示部件上显示细胞的图像，通过操作人员的肉眼观察检测出出现了易位的细胞。

在实施方式2中，同样地，针对被视为恰当地进行了杂交的细胞来判断是否为异常细胞。因此，与实施方式1同样地，能够提高异常细胞的检测精度。另外，在实施方式2，能够精确地检测出9号染色体与22号染色体之间出现了易位的异常细胞，所以医生等人能够准确判断慢性粒细胞白血病的病情。

（实施方式3）

实施方式3中，将本发明用于基于fish法将出现了缺失的细胞作为异常细胞检测出来的方法中。

正常细胞即缺失阴性的细胞中，一定dna序列区位于一定的染色体，但异常细胞即缺失阳性的细胞中，一定dna序列区从染色体上消失。要检测出缺失时，检测对象区为缺失的dna序列区的至少一部分序列，评价对象区为除缺失的dna序列区的dna序列区的部分序列。以此，与实施方式1同样地，能够选择出被视为恰当杂交的细胞。此外，当通过处理装置判断来自检测用探针所含有的荧光色素的荧光强度在一定阈值以下时，能够通过处理装置检测出出现了缺失的异常细胞。也可以使显示部件上显示图像，通过操作人员的肉眼观察检测出出现了缺失的异常细胞。

（实施方式4）

在实施方式4中，将本发明用于基于fish法将染色体上出现了倒位的细胞作为异常细胞检测出来的方法中。

倒位的情况下，染色体上的dna碱基序列的顺序部分颠倒。因此，例如，将与特定基因及其相邻的dna序列区这两种区域结合的探针混入试样，如果检测到来自该探针所含有的荧光色素的荧光，即可判断该细胞是未出现倒位的正常细胞。如果检测不到来自该探针所含有的荧光色素的荧光，则认为由于基因从染色体断开并出现了颠倒而导致探针未能结合，由此就能将细胞判断为出现了倒位的异常细胞。要检测出倒位，检测对象区为跨确定基因和与之相邻的dna序列区的区域，评价对象区为出现倒位的该特定基因。

另外，如图13所示，本发明适用于判断各种基因组异常（基因扩增、易位、缺失、倒位等）并检测异常细胞的情况。

（实施方式5）

在实施方式5中，将本发明用于基于实施方式1的细胞检测方法检测出异常细胞的细胞检测装置中。

如图14所示，细胞检测装置10包括处理部件11、试样制备部件12、光学检测部件13、信号处理部件14、显示部件15和输入部件16。

处理部件11由微型计算机和cpu等以及存储部件11a构成。存储部件11a由ram、rom和硬盘等构成。存储部件11a存储供处理部件11执行的处理程序。处理部件11与细胞检测装置10各部分传输信号，并控制各部分。试样制备部件12通过混合细胞和试剂来制备试样。

如图15所示，光学检测部件13包括流动室200、光源211~214、受光部件221~223、拍摄部件224、聚光镜231~239、分色镜241~244、半透射镜251、过滤器252和光学单元253。

光源211~214由半导体激光光源构成。光源211~214射出的光分别是波长λ11~λ14的激光。例如，波长λ11~λ14分别是405nm、488nm、642nm、785nm。聚光镜231~234分别聚集光源211~214射出的光。分色镜241反射波长λ12的光，让波长λ13的光透过。分色镜242反射波长λ11的光，并让波长λ12、λ13的光透过。于是，从光源211~214射出的波长λ11~λ14的光照射到流经流动室200的流路201的试样。

波长λ11~λ13的光照射到流经流动室200的试样，则染色了细胞的荧光色素会产生荧光。波长λ11的光照射到细胞核染色用色素上，则会产生波长λ21的荧光，波长λ12的光照射到评价用探针的荧光色素上，则会产生波长λ22的荧光，波长λ13的光照射到检测用探针的荧光色素上，则会产生波长λ23的荧光。波长λ14的光照射到流经流动室200的试样上，此光会透过细胞。透过细胞的波长λ14的光用于生成明视野图像。

聚光镜235聚集流经流动室200的试样所产生的波长λ21~λ23的荧光以及透过流经流动室200的试样的波长λ14的光。半透射镜251让透过聚光镜235的光中的大约一半透射，将约一半反射到过滤器252。

过滤器252使波长λ21~λ23的荧光透过，并阻断不需要的光。分色镜243反射波长λ21的荧光，并让波长λ22、λ23的荧光透过。分色镜244反射波长λ22的荧光，并让波长λ23的荧光透过。聚光镜236~238分别聚集波长λ21~λ23的荧光。受光部件221~223分别接收波长λ21~λ23的荧光，并输出与所接收的荧光的强度相应的信号。受光部件221~223由光电倍增管构成。受光部件221~223由光电倍增管构成，所以能够以高灵敏度生成与荧光强度相应的信号。

光学单元253具有4片分色镜组合而成的结构。光学单元253的4片分色镜分别以略微不同的角度反射波长λ21~λ23的荧光和波长λ14的光，并在拍摄部件224的受光面上使其分离。聚光镜239聚集波长λ21~λ23的荧光和波长λ14的光。拍摄部件224由tdi（timedelayintegration，时间延迟积分）相机构成。拍摄部件224接收波长λ21~λ23的荧光和波长λ14的光，并将分别与波长λ21~λ23的荧光和波长λ14的光相应的粒子的图像信息作为拍摄信号输出。

返回图14，信号处理部件14由处理信号的复数条线路和存储部件构成。信息处理部件14根据从受光部件221~223输出的信号就各个粒子分别计算出荧光强度。处理部件11将就各个粒子分别算出的荧光强度存储在存储部件11a。此外，处理部件11根据拍摄部件224所输出的拍摄信号生成粒子图像，将生成的图像按照各个粒子分别存储到存储部件11a。显示部件15由显示器构成，用于显示异常细胞的检测结果等。输入部件16由鼠标和键盘构成。操作人员通过输入部件16向细胞检测装置10输入指示。

下面参照图16就细胞检测装置10的异常细胞检测处理进行说明。通过处理部件11控制细胞检测装置10的各部分来进行异常细胞检测处理。

在步骤s101，处理部件11驱动试样制备部件12，混合细胞、含与细胞中检测对象区杂交的检测用探针的试剂、含与细胞中评价对象区杂交的评价用探针的试剂、以及含细胞核染色用色素的试剂，以此制备试样。以此，如图2（a）、（b）所示，含有荧光色素的检测用探针与检测对象区结合，含有荧光色素的评价用探针与评价对象区结合。在步骤s102，处理部件11让步骤s101制备的试样流入流动室200。在步骤s103，处理部件11驱动光源211~214，向流经流动室200的试样照射光。在步骤s104，处理部件11通过受光部件221~223接收试样中的粒子所产生的波长λ21~λ23的荧光，并获取波长λ21~λ23的荧光的强度。

在步骤s105，处理部件11与实施方式1的步骤s13同样地根据来自评价用探针所含有的荧光色素的荧光的强度和来自核酸染色用色素的荧光的强度选择分析对象细胞。具体而言，处理部件11根据信号处理部件14算出的波长λ21、λ22的荧光的强度选择散点图100的区域101中的细胞作为分析对象细胞。此时，同样地，处理部件11实际上不使用散点图100，而是在以波长λ21、λ22的荧光的强度为二轴的假想坐标空间上进行处理，并选择分析对象细胞。另外，此时也同样地，如实施方式1的验证所示，最好除去不需要的粒子。

在步骤s106，处理部件11与实施方式1的步骤s14同样地根据来自检测用探针所含有的荧光色素的荧光从分析对象细胞中检测出异常细胞。具体而言，处理部件11使用的是信号处理部件14算出的波长λ22、λ23的荧光的强度。针对各分析对象细胞，处理部件11用波长λ23的荧光的强度除以波长λ22的荧光的强度，将除法运算结果超过一定阈值的细胞作为检测对象区扩增的异常细胞检测出来。在步骤s106，处理部件11也可以在从拍摄部件224的拍摄信号生成的图像中获取光点，并根据光点检测出异常细胞。

在实施方式5也可以将出现了实施方式2~4所述的易位、缺失、倒位的细胞作为异常细胞检测出来。关于易位，处理部件11根据从拍摄部件224的拍摄信号生成的图像获取荧光的分布，并根据荧光的分布检测出出现了易位的异常细胞。关于缺失或倒位，处理部件11检测出来自检测用探针所含有的荧光色素的荧光强度在一定阈值以下的细胞，并将其作为出现了缺失或倒位的异常细胞。或者还可以如下：处理部件11在从拍摄部件224的拍摄信号生成的图像上获取光点，将光点数比正常细胞少的细胞作为出现了缺失或倒位的异常细胞检测出来。

处理部件11也可以在显示部件15上显示用于接受通过肉眼观察获得的图像分类结果的肉眼观察结果输入界面300。

如图17所示，肉眼观察结果输入界面300包括图像显示区310、按钮321~324、结果显示区330、保存按钮340。处理部件11收到开始肉眼观察输入的指示后，在显示部件15上显示关于对象试样的肉眼观察结果输入界面300。

图像显示区310显示根据对象试样获取的、在步骤s105选择的细胞图像。图像显示区310内的图像能够被选择，图像被选择后，如图像显示区310内左上角的图像一样地，图像被双重线圈起来。按钮321~324用于接受图像显示区310内所选择的图像的肉眼观察结果。操作人员肉眼观察所选择的图像，如果判断在图像所示细胞中出现了基因扩增、易位导致的基因融合、易位造成的断开、以及缺失，则分别通过输入部件16按下按钮321~324。以此，结果显示区330内的相应项目的数值就会增加。

结果显示区330分别显示试样所含有的所有细胞中出现了基因扩增、融合、断开和缺失的细胞的个数。即，结果显示区330显示操作人员通过按钮321~324输入的个数。按下保存按钮340，则处理部件11将显示在结果显示区330的结果值存储到存储部件11a。如此，操作人员就能肉眼观察图像并输入各个细胞的状态，将输入的结果存储到存储部件11a。在肉眼观察结果输入界面300上只选择并显示染色状态良好的细胞，所以，操作人员能够观察良好的图像并高效地判断细胞状态。

（实施方式6）

在实施方式6中，将本发明用于选择细胞的细胞选择装置中。

如图18所示，实施方式6的细胞选择装置20与实施方式5的细胞检测装置10相比多了粒子甄别部件21和存放部件22。此外，如图19所示，在实施方式6中，与实施方式5相比，光学检测部件13的流动室200的结构不同。实施方式6的其他结构与实施方式5相同。

如图19所示，实施方式6的流动室200中除了流路201之外还有流路202、203。流路202在流路201的延长线上，流路203在流路201、202之间，其是从流路201分叉出来的。流路202连接着无图示的废弃部件，流路203连接着存放部件22。粒子甄别部件21设置在流路202上。粒子甄别部件21包括部件21a构件21a和使构件21a向流路202突出的驱动部件。构件21a位于打开流路202的位置时，流经流路201的试样不会运送到流路203，而是经由流路202运送到废弃部件。另一方面，构件21a位于堵塞流路202的位置时，流经流路201的试样不会运送到流路202，而是经过流路203被运送到存放部件22。

下面参照图20，就细胞选择装置20所进行的分析对象细胞的选择处理进行说明。图20的流程图与图16相比用步骤s111~s113取代了步骤s105、s106。

在步骤s101，处理部件11与实施方式5同样地制备试样。在步骤s102，处理部件11驱动粒子甄别部件21，预先打开流路202，让试样从试样制备部件12流入流动室200的流路201。在步骤s103，处理部件11与实施方式5同样地用光照射试样。此时，如图19所示，从光源211~214射出的光照射到位于流路201的位置201a上的粒子，从粒子产生的光被受光部件221~223和拍摄部件224接收。在步骤s104，处理部件11与实施方式5同样地获取粒子所产生的荧光的强度。

在步骤s111，处理部件11根据位置201a的粒子所产生的波长λ21、λ22的荧光的强度判断此粒子是否在图4（a）所示散点图100的区域101。即，关于位置201a的细胞，处理部件11根据来自评价用探针所含有的荧光色素的荧光的强度和来自核酸染色用色素的荧光的强度，判断杂交是否恰当进行。

如果就位置201a的细胞判断为杂交恰当进行，则在步骤s112中，处理部件11在此细胞位于流路201的位置201b时驱动粒子甄别部件21来堵塞流路202，将此细胞运送到存放部件22。另一方面，如果就位置201a的细胞判断为未恰当杂交，在步骤s113，处理部件11在此细胞位于位置201b时驱动粒子甄别部件21来打开流路202，将此细胞运送到废弃部件。

通过实施方式6，选择恰当杂交的细胞作为分析对象，并将其送入存放部件22。因此，使用存放在存放部件22的细胞，例如在通过其他检测装置或细胞检测装置10进行异常细胞的检测时，能够精确地检测出异常细胞。

在实施方式6，在步骤s101，与实施方式5同样地，以her2基因作为检测对象区，以ch17为评价对象区制备试样。然而，本发明不限于此，也可以与实施方式2~4同样地决定检测对象区和评价对象区的组合并制备试样。此时也能够选择恰当杂交的细胞作为分析对象。

编号说明

10细胞检测装置

11处理部件

12试样制备部件

20细胞选择装置

200流动室

211~214光源

221~223受光部件

224拍摄部件