本发明涉及一种高热稳定性中华鳖副产物胶原蛋白的制备方法，属于胶原蛋白制备技术领域。
背景技术：
近年来，由于胶原蛋白越来越多地用于医药、食品、高档化妆品、生物肥料等工业领域，造成市场供不应求。目前，工业胶原蛋白主要来源于牛、猪等陆产动物。由于畜产动物中重大疾病的频繁发生，如牛的海绵状脑病(疯牛病)；猪的口蹄疫等，使用户对胶原蛋白的安全性产生怀疑。
实际上，水产动物的皮、骨、鳍等含丰富的胶原蛋白，而且是安全的胶原蛋白的来源。从水产动物中提取胶原蛋白并对其进行深入研究在国外已相当普遍。中华鳖(pelodiscussinensiswiegmann)是我国传统的名贵水产品，俗称甲鱼、团鱼、水鱼、王八、神守等。鳖类的生理活性物质及其抗癌药品、保健食品的开发是研究的热点。据世界粮农组织统计,我国2013年中华鳖产量347587t，按比例计算大约有43000t的壳、骨下脚料。有关中华鳖裙边胶原蛋白的研究已有报道，但关于含钙组织如中华鳖壳、骨中胶原蛋白的研究报道极少。如果这些下脚料能得到有效利用，将会为企业带来可观的经济效益。
技术实现要素：
本发明的目的是克服上述不足之处，提供一种高热稳定性中华鳖副产物胶原蛋白的制备方法。
本发明的技术方案，一种高热稳定性中华鳖副产物胶原蛋白的制备方法，步骤如下：
(1)清洗：取中华鳖壳，彻底清除附着的肌肉后立即使用或置于-20℃冰箱中待用；
(2)脱盐：中华鳖壳充分剁碎后，按照料液比1：6～8g/ml加入0.3～0.7mol/l的盐酸溶液，温度10～20℃；静置放置，每隔1～3h换液1次；换液3～5次后，用水清洗至洗出液呈中性，收集得到脱盐中华鳖壳，冷冻干燥24～48h备用；
(3)碱液浸泡：用步骤(2)所得脱盐中华鳖壳质量15～25倍的0.05～0.15mol/l的naoh溶液于20℃下浸泡3～5h；
(4)醇浸泡：取步骤(3)所得中华鳖壳用蒸馏水反复洗涤，充分沥干后加入中华鳖壳质量计15～25倍的质量浓度为10％的异丙醇溶液，于20～25℃下浸泡12～24h，以去除脂肪；
(5)超声酶提：步骤(4)所得中华鳖壳经蒸馏水反复洗涤，沥干后再加入以中华鳖壳质量计15～25倍的0.3～0.7mol/l的乙酸溶液，在超声波100～200w下预处理4～8min，然后添加100～200u/g的胃蛋白酶，并在37℃下磁力搅拌3～5h，以未进行超声处理的酶提胶原蛋白进行对照；
(6)后处理：在0～8℃下，以8000～12000×g离心25～35min后得上清液即为粗胶原蛋白；
(7)重复盐析：取步骤(6)所得粗胶原蛋白加入nacl至溶液终浓度为0.8～1.0mol/l，同时析出絮状沉淀，于4℃，5000～10000×g离心10～20min得沉淀物，用0.5mol/l冰醋酸重新溶解，重复盐析一次，5000～10000×g离心10～20min得沉淀物即为盐析后的胶原蛋白；
(8)透析：对步骤(7)所得胶原蛋白用0.3～0.7mol/l乙酸溶解，在0.05～0.15mol/l乙酸中透析24～48h，每6～10h更换一次透析液，冷冻干燥后置-40℃冰箱中待用，即得产品高热稳定性中华鳖副产物胶原蛋白。
本发明的有益效果：本发明采用的超声辅助酶提工艺操作简单，既能有效缩短提取时间，又能获得具有良好热稳定性能的胶原蛋白,而且对环境的污染也较小。此外，还可充分有效开发和利用中华鳖副产物，避免资源的浪费，提高企业经济效益。
附图说明
图1是常规酶提和超声辅助酶提胶原蛋白的分数粘度变化趋势。
具体实施方式
实施例1
一种高热稳定性中华鳖副产物胶原蛋白的制备方法，步骤如下：
(1)清洗：取中华鳖壳，彻底清除附着的肌肉后立即使用或置于-20℃冰箱中待用；
(2)脱盐：中华鳖壳充分剁碎后，按照料液比1：6g/ml加入0.3mol/l的盐酸溶液，温度10℃；静置放置，每隔1h换液1次；换液5次后，用水清洗至洗出液呈中性，收集得到脱盐中华鳖壳，冷冻干燥24h备用；
(3)碱液浸泡：用步骤(2)所得脱盐中华鳖壳质量15倍的0.15mol/l的naoh溶液于20℃下浸泡3h；
(4)醇浸泡：取步骤(3)所得中华鳖壳用蒸馏水反复洗涤，充分沥干后加入中华鳖壳质量计15倍的质量浓度为10％的异丙醇溶液，于20℃下浸泡24h，以去除脂肪；
(5)超声酶提：步骤(4)所得中华鳖壳经蒸馏水反复洗涤，沥干后再加入以中华鳖壳质量计15倍的0.7mol/l的乙酸溶液，在超声波100w下预处理4min，然后添加200u/g的胃蛋白酶，并在37℃下磁力搅拌3h，以未进行超声处理的酶提胶原蛋白进行对照；
(6)后处理：在0℃下，以8000×g离心35min后得上清液即为粗胶原蛋白；
(7)重复盐析：取步骤(6)所得粗胶原蛋白加入nacl至溶液终浓度为0.8mol/l，同时析出絮状沉淀，于4℃，10000×g离心10min得沉淀物，用0.5mol/l冰醋酸重新溶解，重复盐析一次，5000×g离心20min得沉淀物即为盐析后的胶原蛋白；
(8)透析：对步骤(7)所得胶原蛋白用0.3mol/l乙酸溶解，在0.15mol/l乙酸中透析24h，每10h更换一次透析液，冷冻干燥后置-40℃冰箱中待用，即得产品高热稳定性中华鳖副产物胶原蛋白。
实施例2
一种高热稳定性中华鳖副产物胶原蛋白的制备方法，其特征是步骤如下：
(1)清洗：取中华鳖壳，彻底清除附着的肌肉后立即使用或置于-20℃冰箱中待用；
(2)脱盐：中华鳖壳充分剁碎后，按照料液比1：8g/ml加入0.3mol/l的盐酸溶液，温度20℃；静置放置，每隔1h换液1次；换液3次后，用水清洗至洗出液呈中性，收集得到脱盐中华鳖壳，冷冻干燥24h备用；
(3)碱液浸泡：用步骤(2)所得脱盐中华鳖壳质量25倍的0.05mol/l的naoh溶液于20℃下浸泡3h；
(4)醇浸泡：取步骤(3)所得中华鳖壳用蒸馏水反复洗涤，充分沥干后加入中华鳖壳质量计25倍的质量浓度为10％的异丙醇溶液，于20℃下浸泡12h，以去除脂肪；
(5)超声酶提：步骤(4)所得中华鳖壳经蒸馏水反复洗涤，沥干后再加入以中华鳖壳质量计25倍的0.3mol/l的乙酸溶液，在超声波100w下预处理8min，然后添加200u/g的胃蛋白酶，并在37℃下磁力搅拌3h，以未进行超声处理的酶提胶原蛋白进行对照；
(6)后处理：在8℃下，以8000×g离心25min后得上清液即为粗胶原蛋白；
(7)重复盐析：取步骤(6)所得粗胶原蛋白加入nacl至溶液终浓度为1.0mol/l，同时析出絮状沉淀，于4℃，10000×g离心10min得沉淀物，用0.5mol/l冰醋酸重新溶解，重复盐析一次，10000×g离心20min得沉淀物即为盐析后的胶原蛋白；
(8)透析：对步骤(7)所得胶原蛋白用0.7mol/l乙酸溶解，在0.05mol/l乙酸中透析48h，每10h更换一次透析液，冷冻干燥后置-40℃冰箱中待用，即得产品高热稳定性中华鳖副产物胶原蛋白。
实施例3
一种高热稳定性中华鳖副产物胶原蛋白的制备方法，其特征是步骤如下：
(1)清洗：取中华鳖壳，彻底清除附着的肌肉后立即使用或置于-20℃冰箱中待用；
(2)脱盐：中华鳖壳充分剁碎后，按照料液比1：7g/ml加入0.5mol/l的盐酸溶液，温度15℃；静置放置，每隔2h换液1次；换液4次后，用水清洗至洗出液呈中性，收集得到脱盐中华鳖壳，冷冻干燥34h备用；
(3)碱液浸泡：用步骤(2)所得脱盐中华鳖壳质量20倍的0.1mol/l的naoh溶液于20℃下浸泡4h；
(4)醇浸泡：取步骤(3)所得中华鳖壳用蒸馏水反复洗涤，充分沥干后加入中华鳖壳质量计20倍的质量浓度为10％的异丙醇溶液，于23℃下浸泡20h，以去除脂肪；
(5)超声酶提：步骤(4)所得中华鳖壳经蒸馏水反复洗涤，沥干后再加入以中华鳖壳质量计20倍的0.5mol/l的乙酸溶液，在超声波150w下预处理6min，然后添加150u/g的胃蛋白酶，并在37℃下磁力搅拌4h，以未进行超声处理的酶提胶原蛋白进行对照；
(6)后处理：在4℃下，以10000×g离心30min后得上清液即为粗胶原蛋白；
(7)重复盐析：取步骤(6)所得粗胶原蛋白加入nacl至溶液终浓度为0.9mol/l，同时析出絮状沉淀，于4℃，8000×g离心15min得沉淀物，用0.5mol/l冰醋酸重新溶解，重复盐析一次，8000×g离心15min得沉淀物即为盐析后的胶原蛋白；
(8)透析：对步骤(7)所得胶原蛋白用0.5mol/l乙酸溶解，在0.1mol/l乙酸中透析36h，每8h更换一次透析液，冷冻干燥后置-40℃冰箱中待用，即得产品高热稳定性中华鳖副产物胶原蛋白。
应用实施例1热变性温度(td)的测定
通过测定胶原蛋白溶液分数粘度的变化来确定其热变性温度。取一定量的胶原蛋白样品溶于0.1mol/l的乙酸中的配制成0.1％(m/v)浓度的溶液，将胶原蛋白溶液置于ostwald粘度计中，再将粘度计浸入15℃的水浴中后，保持30min，使得胶原溶液达到15℃。然后将温度从15℃逐步升高至50℃，用ostwald粘度计测定胶原蛋白溶液在15-50℃(间隔5℃)区间内的粘度，各温度保持恒温30min，并进行8次实验，取平均值。然后，利用公式计算每个温度的分数粘度。绘制分数粘度-温度曲线，td值为该曲线线性部分的中点。
式中：t为任意时间的温度，℃；t0为0min时的温度，℃。
实验结果如图1所示，常规酶提中华鳖壳胶原蛋白的热变性温度大约为35.3℃，而超声辅助酶提中华鳖壳得到的胶原蛋白的热变性温度为38.5℃左右。水生动物由于其生活的环境，一般情况下的热变形温度均比陆生哺乳动物低7～12℃，以上试验方法得到的胶原蛋白的热变形温度已接近陆生哺乳动物，因此，超声辅助酶提所得的胶原蛋白热稳定性较好，可在生物材料、制药等领域有潜在的应用价值。