一种多糖及其制备方法与流程

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种多糖及其制备方法。

背景技术：

微生物产生多糖来适应各种环境条件，胞外多糖可以帮助微生物生长，如粘附，存储营养，保护层，是形成生物被膜的重要组成组分。细菌产生的多糖，在许多领域具有非常广泛的应用价值，如作为抗氧化剂，金属螯合剂，乳化剂，增稠剂等。而极端古菌产生的多糖被研究与报道的并不多，嗜盐古菌的生存环境很极端，其产生的多糖，也许更具价值。目前报道的可以产生胞外多糖的几种嗜盐古菌有haloferax、halococcus、haloarcula、natronococcus、haloterrigena和halobacterium，只有五种来自嗜盐古菌的多糖，其组成与结构被报道，而关于嗜盐古菌多糖的生物合成途径，知之甚少。对于嗜盐古菌多糖及其生物合成途径的研究，可以丰富人类对古菌的认识，并且开发出更具价值的多糖。

技术实现要素：

本发明的一个目的是提供一种制备多糖的方法。

本发明提供的方法，包括如下步骤：发酵嗜盐古菌har.hispanicatcc33960，得到多糖。

上述方法中，所述发酵的条件为37℃培养至稳定期。

上述方法中，在所述发酵后还包括如下步骤：

1)收集发酵产物的上清液，将上述上清液依次经乙醇沉淀、透析、浓缩、干燥，得到干燥产物；

2)将所述干燥产物依次经离子交换层析和凝胶层析，得到多糖。

上述方法中，所述透析采用截留量为8000-12000分子量的透析袋进行。

上述方法中，所述离子交换层析为将所述干燥产物溶解后，流进离子交换层析柱，再用离子交换层析洗脱缓冲液洗脱，收集离子交换层析产物；

所述离子交换层析洗脱缓冲液为含有0到2.5mnacl的20mmnaac水溶液；

所述离子交换层析洗脱的方式为梯度洗脱；

所述离子交换层析柱填充的介质为deae-sepharosefastflow(购自sigma，体积为120ml，长30cm)；

所述离子交换层析柱体积为120ml，长30cm；

所述收集离子交换层析产物为收集nacl浓度在含有1.25m-1.55mnacl的20mmnaac水溶液；

所述凝胶层析为将所述离子交换层析产物二次透析后，再流进凝胶柱，再用凝胶层析洗脱缓冲液洗脱，收集凝胶层析产物；

所述凝胶层析洗脱缓冲液为水，洗脱用量为150ml(1个柱体积)；

所述收集凝胶层析产物为收集2/15-1/3的柱体积的洗脱液(20-50ml)；

所述凝胶柱填充的介质为sephacryls-400(购自gehealthcare，150ml，长100cm)；

所述凝胶柱体积为150ml，长100cm；

所述二次透析采用截留量为14000da的透析袋进行。

由上述方法制备的多糖也是本发明保护的范围。

所述多糖为酸性多糖；

或，所述多糖为酸性多糖；

或，所述多糖包括或为如下几种组分形成的聚合物：1)甘露糖、2)半乳糖、3)葡萄糖、4)1)-3)中至少一种的硫酸化修饰产物；

或，所述多糖包括或为如下几种组分形成的聚合物：1)甘露糖、2)半乳糖、3)葡萄糖、4)1)-3)中至少一种的硫酸化修饰产物；

所述甘露糖、所述半乳糖和所述葡萄糖的摩尔比为55.9:43.2:0.9；

所述多糖中硫酸根的质量百分含量为26％；

所述多糖中碳水化合物的质量百分含量为51％。

上述多糖在制备如下1)-3)中任一中的应用也是本发明保护的范围：

1)维持细菌保湿产品；

2)吸附阳离子维持细菌细胞形态产品；

3)细菌保护屏障产品。

上述应用中，所述细菌为嗜盐古菌。

本发明的实验证明了，这种来自极端嗜盐古菌的酸性多糖，其组成与已经报道的嗜盐古菌多糖都不尽相同，具有高硫酸根含量和高甘露糖含量的特点，且分子量大，在溶液中呈现出规则颗粒状，有很好的延展性。在嗜盐古菌中，该酸性多糖可以使菌落保持湿润状态，并且结合金属阳离子维持嗜盐古菌的细胞形态。

附图说明

图1为嗜盐古菌har.hispanicatcc33960酸性多糖的分离纯化与分子量测定；a,发酵液经过deae-sepharosefastflow柱纯化。蛋白含量测定，紫外检测器检测od280nm值；多糖含量测定，苯酚硫酸法测定od490nm值；nacl％，nacl浓度。b，洗脱组分的酸性多糖电泳。40-47管。c，多糖的均一性分析及分子量测定。

图2为多糖的单糖组成分析，gc-ms检测多糖的完全酸水解产物。

图3为多糖的红外光谱ftir检测。

图4为多糖的nmr检测a，¹h谱。b，¹³c谱。。

图5为野生株、多糖缺失突变株与回复株的菌落特征比较。

图6为野生株与多糖缺失突变株的生长速率(左)及形态观察(右)。

图7为嗜盐古菌har.hispanicatcc33960的基因敲除突变株的pcr鉴定及southern鉴定。

图8为野生株、基因敲除突变株与表达回复菌株的rt-pcr鉴定分析。

图9为酸性多糖的7.5％page电泳检测。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1、多糖的制备

1、发酵制备多糖

嗜盐古菌har.hispanicatcc33960在1l的as-168培养基中，37℃200rpm转速的摇床中，培养4-5天至稳定期，13,000×g离心30分钟离心去除菌体，保留上清。

将发酵上清用4倍体积的无水乙醇在4℃沉淀过夜，13,000×g离心30分钟收集沉淀；将沉淀用500ml蒸馏水复溶后，在截留量为8000-12000分子量的透析袋内用蒸馏水透析除盐，然后在透析袋内加入核酸酶10μl(购自sigma,≥250units/μl,mw30kda)，37℃放置12小时；再加入3mg蛋白酶k(购自sigma,≥30units/mg,mw29kda)，37℃放置12小时；期间换水继续透析。将透析液再经过13,000×g离心30分钟，收集上清，将上清溶液经过100kda截留量的超滤浓缩装置，浓缩到250ml,冷冻干燥成粉末，得到粗多糖，将冻干粉末溶于缓冲液a(20mmnaac溶液)中，得到粗多糖溶液，粗多糖浓度为10mg/ml。

2、纯化

(1)离子交换柱纯化

上述粗多糖溶液经deae-sepharosefastflow(购自sigma，体积为120ml，长30cm)离子交换柱吸附后，用缓冲液b,含2.5mnacl的20mmnaac(146gnacl,1.64gnaac定容到1l，0.22μm滤膜过滤)梯度洗脱，洗脱体积为600ml，即5个柱体积洗脱，在这个过程中，缓冲液b的含量从0到100％，也就是nacl梯度从0到2.5m；流速为0.5ml/min。将洗脱下来的组分收集，用紫外检测器(280nm)、苯酚硫酸法和酸性多糖电泳法鉴定每管洗脱组分。当nacl浓度在1.25m-1.55m时，洗脱下来的组分即为纯化的酸性多糖。

结果见图1中a和b，其中41-47管(nacl浓度在1.25m-1.55m)即为洗脱下来的酸性多糖。将酸性多糖各管组分合并(41-47管)，装进透析袋(截留量14000da)用蒸馏水透析除盐后，冻成干粉。

(2)sephacryls-400/hr柱纯化

将上述(1)的干粉用ddh2o溶解成多糖含量为2mg/ml的溶液，经过sephacryls-400/hr柱(购自gehealthcare，150ml，长100cm)，用150mlddh2o洗脱，流速为0.5ml/min。每管用苯酚硫酸法检测多糖含量，并收集主峰(20-50ml，2/15-1/3的柱体积)，冻成干粉，称重，1las-168培养基可以获得纯多糖30mg。

3)多糖的均一性分析及分子量的测定

将上述2)得到的纯多糖干粉溶于ddh2o中，配制成3mg/ml的溶液，取40μl溶液经过tskg4000分子筛柱分析样品的均一性，流动相为0.1mnano3，流速为0.5ml/min，柱温为30℃，利用示差折光检测器来检测。利用不同分子量的dextran(50kda,80kda,150kda,270kda,410kda,670kda,1100kda)来做标准曲线，确定该酸性多糖的分子量。经测定，该酸性多糖分子量为1100kda,见图1c。

4)、多糖的单糖组成测定

将200μg上述2)得到纯多糖，利用2m三氟乙酸(tfa)在121℃下水解2个小时，真空旋转干燥，利用硼氢化钠(nabd4)还原单糖，利用乙酸酐来乙酰化单糖。选择20μg的肌醇(inositol)作为内参。乙酰化的糖醇利用gc-ms分析确定其种类(agilent7890agcinterfacedtoa5975cmsd,electronimpactionizationmode)。分离柱为30msupelcosp-2331bondedphasefusedsilicacapillarycolumn。

gc-ms结果见图2，该多糖中的单糖由甘露糖，半乳糖和葡萄糖组成，其组成的摩尔比为甘露糖：半乳糖：葡萄糖＝55.9:43.2:0.9，碳水化合物(所有单糖)占该多糖总量的51％(质量百分含量)。

该多糖的组成不同于其他在嗜盐古菌中发现的多糖，见表1。

表1为已知嗜盐古菌多糖的单糖组成比较

5)、多糖的硫酸根含量测定

将上述2)得到纯多糖干粉与kbr粉末一起研磨后，取少量进行红外光谱检测(thermonicoletis5)，所选波长为500-4000cm^-1，结果见图3。多糖在3520cm^-1处有一大的吸收峰值，这是-oh基团的吸收特征；2937cm^-1处的吸收峰是由于c-h键的伸缩振动；1645cm^-1处的吸收峰来自于c＝o键的伸缩振动；900-1150cm^-1处的吸收峰来自c-o-c键的伸缩振动；而1258cm^-1和855cm^-1处的吸收峰则是来自s＝o键的伸缩振动。ftir的结果提示，该多糖是硫酸化的。利用离子色谱对该多糖的硫酸根含量进行了测定，取2mg纯多糖，用2mtfa，在121℃下密闭管中水解2小时后，真空旋转干燥，将水解后样品溶于ddh2o中，利用高效液相离子色谱仪(ics-2100,thermoscientific)检测so4^2-含量，选择ionpacas11-hc分析柱，柱温维持在30℃，流动相为30mmnaoh溶液，流速为1ml/min。利用na2so4做标准曲线，测定该多糖so4^2-含量为26％(w/w)。

7)、多糖的一维氢谱，碳谱测定

将40mg上述2)得到多糖溶于0.5ml重水中(99.96％纯度的d2o)，冷冻干燥交换3次，进行一维质谱检测(brukeravanceⅲ500mhzspectrometer)。¹h谱时用d2o(4.70ppm)作为内参，¹³c谱时用dmso(39.39ppm)作为内参。一维氢谱、碳谱结果见图4a，¹³cnmr结果(图4b)显示了四个异头碳原子，分别为δ104.12,103.85,102.52和96.07ppm,60-85ppm为糖环上的碳原子信号,意味着多糖的重复单位由4种类型的单糖(甘露糖，半乳糖，葡萄糖及一种硫酸化修饰的上述单糖)构成。

实施例2、多糖的生物学功能

一、基因敲除突变株嗜盐古菌atcc33960突变株(△hah_1662)的获得

hah_1662基因的核苷酸序列为序列1，其编码的蛋白的氨基酸序列为序列2。

用于敲出该基因的同源重组片段序列为序列3。

1、用于敲除的敲除质粒的制备

将序列表中序列3所示的同源重组片段用hindⅲ和kpni酶(neb公司生产)双酶切后，将双酶切片段用天根公司dna凝胶回收试剂盒回收，方法参考其说明书。

将敲除载体质粒pubp(记载在如下文献中：ppl.environ.microbiol.,2007,vol73,no19,page6058-6065)同样经过hindⅲ和kpni酶双酶切后，将双酶切片段用天根公司dna凝胶回收试剂盒回收，方法参考其说明书。将上述两个酶切片段用t4ligase(promega公司生产)连接，构建成敲除质粒pubpδhah_1662。

pubpδhah_1662为将序列表中序列3所示的片段替换质粒pubp的hindⅲ和kpni酶切位点间得到的载体。

2、导入目的菌实现敲除

1)感受态的制备：从平板上用牙签挑取少量har.hispanicatcc33960菌体，接种于as-168培养基中(bactocasaminoacids5g；bactoyeastextract5g；sodiumglutamate1g；trisodiumcitrate3g；mgso4·7h2o20g；kcl2g；nacl200g；feso4·7h2o微量；mncl2·7h2o痕量；加ddh2o至1l，用naoh调ph至7.0-7.2，固体培养基加1.2％琼脂，8p灭菌30分钟),37℃,200rpm培养到对数期(菌体呈淡红色)，然后以1:10转接于新鲜培养基中，约生长20-24h至菌体呈微红色，再以同样比例转接，生长20-24h，即可用于转化。

2)转化(所有操作均在室温下进行)：取1ml活化好的菌液于灭菌的离心管中，6000rpm离心3min；弃上清，用移液枪吸尽残余的上清，然后加入200μlbss-ls缓冲液(nacl5.85g；kcl0.201g；sucrose15g；先溶解于95ml蒸馏水中，8p×30min灭菌后再加入5ml灭菌的1m,ph8.2tris-hcl)，用移液枪轻轻吹匀，6000rpm离心3min；弃上清，用移液枪吸尽残余的上清，然后加入100μlbss-ls/加甘油缓冲液(nacl5.85g；kcl0.201g；sucrose15g；glycerol15ml；先溶解于95ml蒸馏水中，8p×30min灭菌后再加入5ml灭菌的1m,ph8.2tris-hcl)，用移液枪轻轻吹匀；加入10μl0.5mph8.0的edta缓冲液，用手轻轻拍打离心管壁，混匀后室温下放置10min(形成原生质体)；预先将待转化的质粒pubpδhah_16625μl与5μlbss-ls/加甘油缓冲液混匀，然后加入到原生质体溶液中，放置5min(阴性对照在原生质体溶液中加入10μlbss-ls/加甘油缓冲液)；加入120μl(与上面离心管中溶液等体积)60％的peg600溶液,peg600溶液使用时用ubss/ls缓冲液(nacl5.85g；kcl0.201g；sucrose15g；ddh2o加至100ml,用tris碱或naoh调至ph至7.0-7.5，8p×30min灭菌)配置，迅速上下颠倒离心管多次，直到溶液变得透亮均一，然后室温放置20-30min。加入1ml复苏培养基(30％seawater76.7ml；peptone0.5g；bactoyeastextract0.1g；sucrose15g；ddh2o加至100ml；用tris碱或naoh调至ph至7.0-7.5，8p×30min灭菌)，上下颠倒离心管混匀溶液，10000rpm离心2min；弃上清，再加入500μl-1ml的复苏培养基悬浮菌体，于37℃，200rpm摇床复苏过夜。

3)涂板：将复苏过夜的菌体10000rpm离心2min，剩余500-600μl复苏培养基用来重悬菌体，在含mevinolin(5μg/ml)的as-168固体培养基上，让液体在平板上流动直到均匀地吸附于平板。

4)生长：将涂好的平板放于37℃温箱，用塑料袋装好，以防板子干涸。7天左右可以看到淡红色的转化子，10天左右，可以将转化子在含mevinolin的as-168固体培养基上划线培养，生长3天左右即可用于dna抽提pcr检测。

pcr检测的引物为p1t:5’tatggccgagaacatcctcg3’；p4t:5’cgcatacctcttggtatag3’；得到1.2kb和2.4kb的片段，为目的菌株，为正确的转化子。

5)将正确的转化子在不含mevinolin的as-168的液体培养基中传代培养至少三次，在传代期间，个别菌体发生二次基因重组，选取可以在as-168/mev-平板上生长，而不能在as-168/mev⁺平板上生长的单菌落，经过pcr验证筛选基因敲除突变株。

选择p1t和p4t作为引物，单菌落基因组为模板，发生一次重组pop-in菌株可以扩增出1.2kb和2.4kb两条带，而发生两次重组pop-out菌株，只能扩增出1.2kb条带。pcr验证结果见图7a。因此，判断两次重组pop-out菌株为嗜盐古菌atcc33960突变株(△hah_1662)，即har.hispanicatcc33960菌体基因组敲除hah_1662基因得到的重组菌。

3、southern杂交验证突变株。

提取野生株嗜盐古菌atcc33960与嗜盐古菌atcc33960突变株(△hah_1662)基因组dna，选择ecorv(neb公司生产)进行酶切，得到的酶切产物选取hah_1662下游1550-bp片段作为探针，进行southern杂交(分子克隆实验指南)。

1550-bp片段用引物p55’aaccgtttcaatcgacggtatatcctgattattc3’和p65’atctcacaacatctgttgattctggcattcacaag3’进行扩增，以野生型菌株嗜盐古菌atcc33960基因组dna为模板进行pcr扩增。

pcr反应体系：10×extaqbuffer5μl，引物p5和引物p6各1μl(20μmol/l)，dna模板1μl(1μg/μl)，dntps(各2.5mm)4μl，extaqenzyme(takara，5u/μl)1μl，最后补水至50μl。反应条件：98℃热变性5min；95℃变性1min，50℃退火30s，72℃延伸1min30s，共30个循环；72℃最后延伸10min。pcr产物(1550-bp片段)用北京天根公司dna凝胶回收试剂盒回收，方法参考其说明书。

southern验证结果见图7b，野生菌可以杂交出3.3kb的条带，而嗜盐古菌atcc33960突变株(△hah_1662)可以杂出4.4kb的条带，表明，嗜盐古菌atcc33960突变株(△hah_1662)的确敲除hah_1662基因。

4、野生株、δhah_1662突变株rt-pcr鉴定

1)提取rna反转录得到cdna

野生株、δhah_1662突变株提取rna，并反转录得到cdna作为模板。

2)扩增

以各菌株cdna为模板，用p9(5’atggatatcctccacacgcc3’)和p10(5’catgtacctcgttatgatcg3’)引物扩增hah_1662；

以cdna为模板，用p11(5’gtgagtaatgttctgtatcc3’)和p12(5’gccctgtatgcttccagtgc3’)引物扩增hah_1667做对照(control)；

以cdna为模板，用p13(5’atggcaaatacaccggtatcag3’)和p14(5’tactacactgccaccgggttc3’)引物扩增质粒pwl-cbd-hah_1662上的cellulosebindingdomain(cbd)。

上述rt-pcr产物在1％的琼脂糖凝胶中电泳后，eb染色，结果如图8所示，说明野生株，基因敲除株，表达回复菌株正确。

二、嗜盐古菌atcc33960突变株(△hah_1662)降低胞外酸性多糖产量

嗜盐古菌har.hispanicatcc33960野生株和基因敲除突变株δhah_1662在40ml的as-168培养基中，37℃200rpm，培养至稳定期，13,000×g离心30分钟离心去除菌体，保留上清。将40ml发酵上清用4倍体积的无水乙醇在4℃沉淀过夜，13,000×g离心30分钟收集沉淀；将沉淀用40ml蒸馏水复溶后，在截留量为8000-12000分子量的透析袋内用蒸馏水透析除盐，然后在透析袋内加入核酸酶2μl(购自sigma,≥250units/μl,mw30kda)，37℃放置12小时；再加入20μl5mg/ml蛋白酶k(购自sigma,≥30units/mg,mw29kda)，37℃放置12小时；期间换水继续透析。将透析液再经过13,000×g离心30分钟，收集上清，将上清溶液经过100kda截留分子量的超滤浓缩管(millipore公司生产，50ml,操作见产品说明书)，浓缩到5ml,冷冻干燥成粉末，得到多糖。将冻干粉末溶于2mlddh2o中，即为粗多糖溶液。

配制7.5％的page胶，参见《分子克隆实验指南》，取20μl粗多糖溶液加入5μl的5×loadingbuffer(终浓度为312.5mmol/l的tris-hcl，甘油终浓度为50％，溴酚蓝终浓度为0.05％，ph6.8的水溶液)120v电泳，待溴酚蓝跑出，收胶。用0.5％的亚甲基蓝溶液(用3％的醋酸溶液配制)染色30min分钟后，3％的醋酸溶液脱色。

结果见图9，可以看出，敲除突变株δhah_1662中无多糖存在，即为多糖缺失突变株，而野生株atcc33960中可以提取到多糖。因此，表明hah_1662基因为与多糖合成相关的基因。

二、观察降低多糖含量的菌株的表型

1、多糖维持菌落的粘湿度

将野生株与多糖缺失突变株δhah_1662(δeps)在as-168固体培养基上培养，观察其菌落形态，发现缺失该多糖的突变株，菌落干涸，缺少了湿粘度，见图5，可见，该酸性多糖负责维持菌落的粘湿度。

2、多糖可以在嗜盐古菌中保湿，吸附阳离子维持细胞形态的作用，是一种菌体的天然保护屏障

正常as-168培养基中的nacl为200g/l,即3.4mnacl培养条件；

2.3mnacl培养基是将as-168培养基中的nacl浓度定为135g/l。

取150μlod600nm＝1.0的缺失多糖突变株δeps培养液和野生株培养液分别接种到40mlas-168培养基和2.3mnacl培养基中培养，培养条件为37℃，200rpm；每隔一定时间取样测定od600nm值，三个生物学重复取平均值；测定生长曲线，见图6左，可以看出，将缺失多糖突变株δeps在2.3mnacl低盐条件下培养时，生长迟缓，且细胞膨胀受损。

取3.4mnacl和2.3mnacl培养条件下的菌体(稳定期)，用含3％戊二醛的盐溶液固定后，进行扫描电镜观察(su8010,hitachiltd.,japan)，发现在低盐条件下，细胞膨胀受损，见图6右。

上述结果证实了，该酸性多糖在嗜盐古菌中，具有保湿，吸附阳离子维持细胞形态的作用，是一种菌体的天然保护屏障。

序列表

<110>中国科学院微生物研究所

<120>一种多糖及其制备方法

<160>3

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>1194

<212>dna

<213>嗜盐古菌haloarculahispanic

<400>1

atggatatcctccacacgccggtccgattctatccttatatcggcggtgtagagacgtac60

gtacacgacctttcgaagaaattggttaagttcaatcacaacgtaacagtggtctgtgcc120

aaagtcgacgaagagacagagcgttgtgaaactatcgacggtatcgatgtacggcgattg180

accagcgtaggtcagatggcgaacactaatataactcctgcgcttcctgcagtgctaatt240

gaggaagcgcaatccgcagacgtaattcacacacatctacctacaccttggttcgcggat300

ctcagtgtccttgctggggtggtaacgggaacaccggtcgttatcacctatcacaatgat360

atcgtgggtgatggaatagctaatcacattgcctatttctataaccagacttggctccga420

ctgacacttcgatattcagatcgaatcatcgtcacacagccagattacgtggagaactcc480

aagtatctcagtccggaaatggataaaattgagattatctcaaacggtgttgacgtcaac540

tattttgaaccgaagacagtctcagccgaggatttggctcgtcttgggttcgacgaatcg600

cgtcccacactattctttttgagtgttctcgacggacaccacgattacaaaggattgaca660

gacctgctagaagcgttggccctgctagtcaaagaagaagatacgactccacaacttctc720

gtcggtggagggggagagtccaagtcaacttatgaacatcgagctgcaaaactcggtgtc780

gatcagttcgttgatttcctcggtcgagttccagaagacgatctggtcaattattattcg840

gcagccgatctttttgtgctaccctcaacaagtagcgaccaagaggggttcggcttagtg900

ttactggaggcgctggcaagtgggactcccgtagtaactacgaatgtcgttggtatcgct960

gaagaggtcaaacaaaatcctgtcggaacgatcgctccaaaggaaaatcccgaggcactg1020

gcgtcttcgattcgaactacgttatcgaatgacgaatttgatttagaggtcgcacgcaac1080

ctctgtgtacagaactattcgtggcgagctagtgctgaagatctggaagccatctatgag1140

agagtttgcgaaacgtcaatcgatcataacgaggtacatgaagacttagtttag1194

<210>2

<211>403

<212>prt

<213>嗜盐古菌haloarculahispanic

<400>2

metgluthraspileleuhisthrprovalargphetyrprotyrile

151015

glyglyvalgluthrtyrvalhisaspleuserlyslysleuvallys

202530

pheasnhisasnvalthrvalvalcysalalysvalaspglugluthr

354045

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valglyglnmetgluthralaasnthrasnilethrproalaleupro

65707580

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leuprothrprotrpphealaaspleuservalleualaglyvalval

100105110

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115120125

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