一种紫菜蛋白抑菌肽的制备方法
【专利摘要】一种紫菜蛋白抑菌肽的制备方法，属于天然活性物质提取领域。本发明以条斑紫菜为原料，经过烘干、粉碎等预处理后，将原料经过超声波破碎以及硫酸铵沉淀蛋白后，利用木瓜蛋白酶特定条件下酶解紫菜原料得到抑菌肽的粗品，该粗品经过离子交换层析、G-25凝胶层析等色谱方法分离纯化，得到紫菜蛋白抑菌肽。该紫菜蛋白抑菌肽分子量主要分布在1000Da以下，最适作用pH为6.5，热稳定性好；对革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌都有效果，其中对革兰氏阳性菌抑制效果更强，其抑菌效果主要是通过对细胞膜的破坏作用达到的。该紫菜蛋白抑菌肽分子量小，抑菌活性较好，在制备抗菌性药物、食品保鲜剂等领域具有很好的应用前景。
【专利说明】一种紫菜蛋白抑菌肽的制备方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及海洋植物活性成分提取，具体涉及一种紫菜蛋白抑菌肽的制备方法，属于天然活性物质提取领域。
【背景技术】
[0002]随着抗生素的滥用，自然界中具有抗药性的微生物越来越多，2013在多个国家发现了曾出现在英国的超级细菌。上世纪90年代以来，由于全球性禽流感的蔓延，众多科学家担心家禽和各种动物的耐药性疾病会通过食物链传染给人类，造成难易治愈的病患感染，人们开始关注高效安全的抑菌药物。因为研制新型化学合成的抗菌药物需要周期长、费用高、技术要求苛刻。所以目前很多医药公司开始把目光转移到天然的抗菌药物，抑菌肽具有抗菌广谱性、抗病毒和肿瘤等活性，以及促进动物生长、促进肠道对矿物质的吸收、维持机体的生理平衡、增强免疫调节活性。抑菌肽一般分子量很小、水溶性好、具有温度稳定性、PH稳定性以及不易产生耐药性和无溶血性等优点，作为一种低毒和高效的新型抑菌药、食品保鲜剂和保健品将会拥有广阔的发展前景。
[0003]我国是紫菜资源生产加工及利用的大国，沿海的浙江、广东、江苏等省均有大面积种植，紫菜产量全球第一，据统计，全国紫菜年产量约6万吨，产品远销日本、东南亚以及欧美等国家和地区，但是目前国内的产品主要是通过简单地干燥后加工成粗加工食品或产品附加值相对低的调味料。通常，每100克干紫菜中含有20%-45%的蛋白质、20%-40.5%的碳水化合物、0.6%-2.1%的脂肪和大量的维生素等，其氨基酸种类齐全，具有抑菌活性、抗氧化性、降血压、降血糖、增强免疫性等多种功能。可见紫菜是典型的高蛋白、高纤维、低脂肪的健康食品。紫菜中的蛋白质含量是海带的8.8倍，并且含有各种必需氨基酸，氨基酸指数高于大米、大豆、马铃薯等，说明紫菜属于良好的蛋白质来源，具有较高的营养价值。
【发明内容】
[0004]本发明目的是提供紫菜酶解产物中一种紫菜蛋白抑菌肽的制备方法，从天然产物中分离出一种紫菜蛋白抑菌肽，该方法操作简单、安全性高，成本低。
[0005]本发明的技术方案，将紫菜烘干经过粉碎后，采用超声波辅助破碎紫菜细胞，采用硫酸铵盐析法沉淀蛋白，然后采用酶解技术处理紫菜蛋白后，经过离子交换层析、G-25凝胶层析等色谱方法分离纯化，得到纯度较高的紫菜蛋白抑菌肽。
[0006]通过色谱技术测定肽分子量分布情况；通过实验考察紫菜蛋白抑菌肽的热稳定性以及最佳作用PH ;采用电镜观察的方法考察紫菜蛋白抑菌肽对革兰氏阳性菌的作用机理；通过比较该抑菌肽与氨苄青霉素以及硫酸卡那霉素对金黄色葡萄球菌的抑菌活性来反映紫菜蛋白抑菌肽的效价。
[0007]一种紫菜蛋白抑菌肽的制备方法，步骤为:
(I)紫菜蛋白的提取和酶解:
a、以条斑紫菜为原料，烘干后粉碎，过筛，取60-80目部分溶于0.02mol/L、pH 7.0的Na2HPO4-KH2POj^冲液中，溶解时紫菜与缓冲液料液质量体积比为1:25 ;
在冰浴条件下用350 W功率的超声波处理15 min，处理时以工作3 S，间隔3 s为一个循环；将超声处理后的物料以4000 r/min的速度离心15 min,去沉淀,取上清液,添加硫酸铵至60%饱和度，通过盐析提取，离心收集固体物目的紫菜蛋白；
b、将步骤a中硫酸铵盐析得到的紫菜蛋白按湿重计，以紫菜蛋白与缓冲液料液质量体积比为1:10加入？册.5的Na2HPO4-KH2PO4缓冲液，木瓜蛋白酶加入量为4000 U/g湿重计紫菜蛋白，充分混合均匀后65°C酶解4 h，反应过程中保持pH的稳定；酶解结束后，煮沸灭酶15 min，静置冷却后以10000 r/min的速度离心15 min，弃去沉淀得到含有紫菜蛋白抑菌肽的上清液；
(2)紫菜蛋白抑菌肽的纯化制备:
c、DEAE-52阴离子交换层析:采用阶段洗脱的方法，流动相:0-74min用10mmol/mL的平衡液洗脱，平衡液为PH6.8的Na2HPO4-柠檬酸溶液，74-120 min用含有0.2mol/mL的NaCl溶液洗脱，120-200 min用含有0.4mol/mL的NaCl溶液洗脱，200_250min用含有0.6mol/mL的NaCl的溶液洗脱；流速均为I mL/min，检测波长:220 nm ；
收集各峰组分，并对收集的各峰组分浓缩至紫菜蛋白抑菌肽浓度为6mg/mL后进行抑菌活性比较，取抑菌活性较好的离子交换层析峰组分冷冻干燥备用；
d、SephadexG_25凝胶层析:取上述步骤c冷冻干燥的抑菌活性较好的离子交换层析峰组分溶解在超纯水中，浓度为0.lmg/mL ;采用Sephadex G_25凝胶层析柱经超纯水平衡后，进样量2mL，用超纯水进行洗脱；
检测波长为220 nm,流速:0.5mL/min, 80min后不再出峰,收集各峰组分，并对各峰组分浓缩至紫菜蛋白抑菌肽浓度为6mg/mL后进行抑制剂活性比较，取抑菌活性较好的凝胶层析峰组分冷冻干燥，即得产品紫菜蛋白抑菌肽。
`[0008]制备的紫菜蛋白抑菌肽的应用:所述紫菜蛋白抑菌肽的最适pH为6.5，最小抑菌浓度为 0.25mg/mL。
[0009]紫菜蛋白抑菌肽特性分析鉴定:
I)、肽分子量分布:将细胞色素(MW1250)、乙胺酸-乙胺酸-酪氨酸-精氨酸(MW451 )、杆菌酶(MW1450)、乙胺酸-乙胺酸-乙胺酸(MW189)标准品用0.22 μ m微孔滤膜处理后，经过以下色谱条件上样:色谱柱TSKgel 2000 Sffxl (300 mmX 7.8 mm, 5 μ m);柱温30°C,流动相:水:三氯乙酸:乙腈=550:450:1 (V:V:V);流速为I mL/min，进样量为5 μ L，检测波长为220nm，根据出峰图绘制相对分子质量校正曲线；取紫菜蛋白酶解液5mL与10%的三氯乙酸(TCA) 5mL混合均匀，放置桌面静止IOmin, 8000r/min离心10min,上清液用0.22 μ m微孔滤膜处理，相同色谱条件下上样测量抑菌肽的分子量分布。结果表明紫菜蛋白酶解液中分子量主要分布在1000Da以下的肽占96.68%。
[0010]2)、最适pH与热稳定性:
将纯化的紫菜蛋白抑菌肽溶于水中(浓度为0.1 mg/mL)并调节至不同的pH值，同时用对应PH的0.2 mol/L磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液做对照，经0.22 μ m膜过滤除菌后，测定紫菜蛋白抑菌肽对金黄色葡萄球菌抑菌活性，观察抑菌圈直径，结果表明抑菌肽最适作用pH 为 6.5。
[0011]将纯化的紫菜蛋白抑菌肽经沸水浴处理不同时间后立即水浴待冷却到室温再检测其抑菌活性，结果表明紫菜蛋白抑菌肽沸水处理过程中其抑菌活性基本不受影响，沸水处理Ih后抑菌活性仍然保持在90%左右，这说明紫菜蛋白抑菌肽具有较好的热稳定性。
[0012]3)、抑菌机理:以不添加抑菌肽的金黄色葡萄球菌为空白对照组，添加抑菌肽的金黄色葡萄球菌为实验组，比较两组菌的电镜图发现空白组的金黄色葡萄球菌正常生长，而实验组的金黄色葡萄球菌在7h后细胞膜变得模糊和破裂，部分细胞质流出细胞外。由此可以得知，该抑菌肽对金黄色葡萄球菌的抑菌效果主要是通过对细胞膜的破坏作用达到的。
[0013]4)、最小抑制浓度与效价分析:
A液:取98mL的牛肉膏培养基，加入ImL的氯化三苯基四氮唑(TTC)溶液，ImL活化的金黄色葡萄球菌(108cfu/mL);B液:取98mL的牛肉膏培养基，加入ImL的TTC溶液，ImL灭菌的生理盐水。
[0014]取36个灭菌的试管分成三组每组12个，其中1-11号每管加入2.5mL的A液，再往I号试管加入2.5mL的过滤除菌的紫菜抑菌肽样品(2mg/mL)，混合均匀后从I号中取出
2.5mL加入2号试管中混合均匀,接着从2号试管中去2.5mL加入到3号试管中混匀,依次稀释直到10号试管，并将10号试管中多余的2.5mL液体弃去。11号做阳性对照，而12号试管中加入2.5mL的B液做阴性对照。37°C恒温箱过夜培养，观察培养液颜色变化，无色试管中样品的最低浓度即为该样品的最小抑制浓度。观察发现4号试管开始出现微红色，表明菌体开始生长，通过计算可以得出紫菜蛋白抑菌肽的最小抑菌浓度为0.25mg/mL。
[0015]采用已知效价的氨苄青霉素和硫酸卡那霉素作为样品的阳性对照，分别配制成不同浓度的抗生素溶液，过滤除菌后与2mg/mL的紫菜蛋白抑菌肽同时进行抑菌活性测定，比较各自形成抑菌圈直径的大小。结果表明2mg/mL抑菌肽形成的抑菌圈直径与分别用36 μ g/mL氨节青霉素和100 μ g/mL硫酸卡那霉素形成的抑菌圈直径大小一样。
[0016]本发明的有益效果:以条斑紫菜为原料，采用超声波辅助酶解的方式对紫菜中的蛋白质进行水解，生成短肽和游离氨基酸后，依次通过离子交换层析、G-25凝胶层析色谱方法分离纯化，富集浓缩冻干得到紫菜蛋白抑菌肽。该抑菌肽分子量小，抑菌活性较好，在制备抗菌性药物、食品保鲜剂等领域具有很好的应用前景。
【专利附图】
【附图说明】
[0017]图1是本发明提取紫菜蛋白抑菌肽的工艺流程图。
[0018]图2是用不同蛋白酶水解紫菜蛋白后产物的抑菌效果。1、胃蛋白酶；2、胰蛋白酶；
3、酸性蛋白酶；4、中性蛋白酶；5、碱性蛋白酶；6、木瓜蛋白酶；7、未加酶水解。图中各点光圈越大表明产物的抑菌活性越好，该图表明几种酶中，木瓜蛋白酶酶解紫菜产物的抑菌活性最好，因此选用木瓜蛋白酶作为研究用酶。
[0019]图3是紫菜蛋白酶解液肽分子量分布。
[0020]图4是pH对紫菜蛋白抑菌肽抑菌活性的影响。
[0021]图5是沸水浴 对紫菜蛋白抑菌肽抑菌活性的影响。
[0022]图6是紫菜蛋白抑菌肽未作用时金黄色葡萄球菌的电镜图。
[0023]图7是紫菜蛋白抑菌肽作用于金黄色葡萄球菌的电镜图。
【具体实施方式】[0024]下面结合实施例对本发明做进一步说明。
[0025]实施例1紫菜蛋白的制备和酶解:
取胃蛋白酶、胰蛋白酶、酸性蛋白酶、中性蛋白酶、碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶分别水解紫菜蛋白，并与未水解的样本做对比，结果如图2所示。几种酶中，木瓜蛋白酶酶解紫菜产物的抑菌活性最好，因此选用木瓜蛋白酶作为研究用酶。
[0026]a、以条斑紫菜为原料，烘干后粉碎，过筛，取60-80目部分溶于质量体积比为1:25的Na2HPO4-KH2PO4 (0.02mol/L,pH 7.0)缓冲液中，在冰浴条件下用350 W功率的超声波破碎15 min (工作方式为:工作时间3 S，时间间隔为3 S)，将超声处理后的物料离心(4000r/min, 15 min)后弃去沉淀,对上清液添加硫酸铵至60%饱和度提取目的紫菜蛋白； b、将硫酸铵盐析得到的紫菜蛋白以质量(湿重)体积比1:10加入？册.5的Na2HPO4-KH2POJ^冲液，木瓜蛋白酶加入量为E/S=4000 U/g,充分混合均匀后65°C酶解4 h，反应过程中保持pH的稳定；酶解结束后，煮沸灭酶15 min，静置冷却后离心(10000 r/min,15 min)，弃去沉淀得到含有紫菜蛋白抑菌肽的上清液。
[0027]实施例2紫菜蛋白抑菌肽的纯化制备:
a、DEAE-52阴离子交换层析:采用阶段洗脱的方法，流动相:(T74 min用10 mmol/mL的平衡液(PH6.8的Na2HPO4-柠檬酸)洗脱，74~120 min用含有0.2 mol/mL的NaCl洗脱，120~200 min 用含有 0.4 mol/mL 的 NaCl 洗脱，200~250 min 用含有 0.6 mol/mL 的 NaCl 的缓冲液洗脱，流速:1 mL/min,检测波长:220 nm,收集各峰组分,并对收集的各峰组分浓缩后(6 mg/mL)进行抑菌活性比较，取抑菌活性较好的峰组分冷冻干燥备用。
[0028]b、Sephadex G_25凝胶层析:取上述冷冻干燥的样品溶解在超纯水中，浓度为0.1mg/mL。S印hadex G-25凝胶层析柱经超纯水平衡后，进样量2 mL，用超纯水进行洗脱。检测波长为220 nm,流速:0.5 mL/min, 80min后不再出峰,收集各峰组分,并对各峰组分浓缩后(6 mg/mL)进行抑制剂活性比较，取抑菌活性较好的峰组分冷冻干燥备用。
[0029]实施例3紫菜蛋白抑菌肽的分子量分布
将细胞色素(丽1250)、乙胺酸-乙胺酸-酪氨酸-精氨酸(MW451)、杆菌酶(丽1450)、乙胺酸-乙胺酸-乙胺酸(丽189)标准品用0.22 μ m微孔滤膜处理后，经过以下色谱条件上样:色谱柱 TSKgel 2000 Sffxl (300 mmX7.8 mm，5ym);柱温 30 °C，流动相:水:三氯乙酸:乙腈=550:450:1 (V:V:V);流速为I mL/min，进样量为5 μ L，检测波长为220 nm，根据出峰图绘制相对分子质量校正曲线；取紫菜蛋白酶解液5mL与10%的三氯乙酸(TCA)5mL混合均匀，放置桌面静止10 min, 8000 r/min离心10 min,上清液用0.22 μ m微孔滤膜处理，相同色谱条件下上样测量抑菌肽的分子量分布。紫菜蛋白酶解液肽分子量分布如图3所不，由图可知紫菜蛋白酶解液中分子量分布在1000Da以下的肽占96.68%。
[0030]实施例4紫菜蛋白抑菌肽最适pH
将纯化的紫菜蛋白抑菌肽溶于水中(浓度为0.lmg/mL)并调节至不同的pH值，同时用对应PH的0.2 mol/L磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液做对照，经0.22 μ m膜过滤除菌后，测定紫菜蛋白抑菌肽对金黄色葡萄球菌抑菌活性，观察抑菌圈直径，PH对抑菌活性的影响图如图4所不,结果表明抑菌肽最适作用pH为6.5。
[0031]实施例5紫菜蛋白抑菌肽的热稳定性
将纯化的紫菜蛋白抑菌肽经沸水浴处理不同时间后立即水浴待冷却到室温再检测其抑菌活性，沸水浴对紫菜蛋白抑菌肽抑菌活性的影响如图5所示。结果表明紫菜蛋白抑菌肽沸水处理过程中其抑菌活性基本不受影响，I h后抑菌活性仍然保持在90%左右，这说明紫菜蛋白抑菌肽具有较好的热稳定性。
[0032]实施例6紫菜蛋白抑菌肽的抑制机理
以不添加抑菌肽的金黄色葡萄球菌为空白对照组，添加抑菌肽的金黄色葡萄球菌为实验组，比较两组菌的电镜图发现空白组的金黄色葡萄球菌正常生长，如图6所示，而实验组的金黄色葡萄球菌在7 h后细胞膜变得模糊和破裂，如图7所示，部分细胞质流出细胞外。由此可以得知，该抑菌肽对金黄色葡萄球菌的抑菌效果主要是通过对细胞膜的破坏作用达到的。
[0033]实施例7紫菜蛋白抑菌肽的最小抑制浓度与效价分析:
A液:取98 mL的牛肉膏培养基，加入I mL的氯化三苯基四氮唑(TTC)溶液，I mL活化的金黄色葡萄球菌(108 cfu/mL) ；B液:取98 mL的牛肉膏培养基，加入I mL的TTC溶液，I mL灭菌的生理盐水。
[0034]取36个灭菌的试管分成三组每组12个，其中1-11号每管加入2.5 mL的A液，再往I号试管加入2.5 mL的过滤除菌的紫菜蛋白抑菌肽样品(2 mg/mL)，混合均匀后从I号中取出2.5 mL加入2号试管中混合均匀,接着从2号试管中去2.5 mL加入到3号试管中混匀，依次稀释直到10号试管，并将10号试管中多余的2.5 mL液体弃去。11号做阳性对照，而12号试管中加入2.5 mL的B液做阴性对照。37°C恒温箱过夜培养，观察培养液颜色变化，无色试管中样品的最低浓度即为该样品的最小抑制浓度。观察发现4号试管开始出现微红色，表明菌体开始生长，通过计算可以得出紫菜蛋白抑菌肽的最小抑菌浓度为0.25mg/mL。`
[0035]采用已知效价的氨苄青霉素和硫酸卡那霉素作为样品的阳性对照，分别配制成不同浓度的抗生素溶液，过滤除菌后与2 mg/mL的紫菜蛋白抑菌肽同时进行抑菌活性测定，比较各自形成抑菌圈直径的大小。结果表明2 mg/mL紫菜蛋白抑菌肽形成的抑菌圈直径与分别用36 μ g/mL氨节青霉素和100 μ g/mL硫酸卡那霉素形成的抑菌圈直径大小一样。
【权利要求】
1.一种紫菜蛋白抑菌肽的制备方法，其特征在于步骤为: (1)紫菜蛋白的提取和酶解: a、以条斑紫菜为原料，烘干后粉碎，过筛，取60-80目部分溶于0.02mol/L、pH 7.0的Na2HPO4-KH2POj^冲液中，溶解时紫菜与缓冲液料液质量体积比为1:25 ; 在冰浴条件下用350 W功率的超声波处理15 min，处理时以工作3 S，间隔3 s为一个循环；将超声处理后的物料以4000 r/min的速度离心15 min,去沉淀,取上清液,添加硫酸铵至60%饱和度，通过盐析提取，离心收集固体物紫菜蛋白； b、将步骤a中硫酸铵盐析得到的紫菜蛋白按湿重计，以紫菜蛋白与缓冲液料液质量体积比为1:10加入？册.5的Na2HPO4-KH2PO4缓冲液，木瓜蛋白酶加入量为4000 U/g湿重计紫菜蛋白，充分混合均匀后65°C酶解4 h，反应过程中保持pH的稳定；酶解结束后，煮沸灭酶15 min，静置冷却后以10000 r/min的速度离心15 min，弃去沉淀得到含有紫菜蛋白抑菌肽的上清液； (2)紫菜蛋白抑菌肽的纯化制备: c、DEAE-52阴离子交换层析:采用阶段洗脱的方法，流动相:0-74min用10mmol/mL的平衡液洗脱，平衡液为PH6.8的Na2HPO4-柠檬酸溶液，74-120 min用含有0.2mol/mL的NaCl溶液洗脱，120-200 min用含有0.4mol/mL的NaCl溶液洗脱，200_250min用含有0.6mol/mL的NaCl的溶液洗脱；流速均为I mL/min，检测波长:220 nm ； 收集各峰组分，并对收集的各峰组分浓缩至紫菜蛋白抑菌肽浓度为6mg/mL后进行抑菌活性比较，取抑菌活性较好的离子交换层析峰组分冷冻干燥备用； d、SephadexG_`25凝胶层析:取上述步骤c冷冻干燥的抑菌活性较好的离子交换层析峰组分溶解在超纯水中，浓度为0.lmg/mL ;采用Sephadex G_25凝胶层析柱经超纯水平衡后，进样量2mL，用超纯水进行洗脱； 检测波长为220 nm,流速:0.5mL/min,80min后不再出峰,收集各峰组分，并对各峰组分浓缩至紫菜蛋白抑菌肽浓度为6mg/mL后进行抑制剂活性比较，取抑菌活性较好的凝胶层析峰组分冷冻干燥，即得产品紫菜蛋白抑菌肽。
2.根据权利要求1所述方法制备的紫菜蛋白抑菌肽的应用，其特征在于:所述紫菜蛋白抑菌肽的最适pH为6.5,最小抑菌浓度为0.25mg/mL。
【文档编号】C12P21/06GK103865973SQ201410131251
【公开日】2014年6月18日 申请日期:2014年4月3日 优先权日:2014年4月3日
【发明者】田亚平, 刘冬冬, 周锋 申请人:江南大学