一株胶红酵母及其在发酵生产类胡萝卜素和油脂中的应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一株胶红酵母及其在发酵生产类胡萝卜素和油脂中的应用。本发明的技术方案要点为：一株胶红酵母菌Rhodotorulamucilaginosa，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，CGMCCNo.8926。本发明提供的胶红酵母可用于发酵生产类胡萝卜素和油脂。本发明利用红酵母生产类胡萝卜素并且同时产生油脂，并对生产菌株进行多轮ARTP（常压室温等离子体）诱变，获得产量较高的诱变菌株，对类胡萝卜素和油脂的工业化生产提供有良好的应用前景和经济效益。
【专利说明】一株胶红酵母及其在发酵生产类胡萝卜素和油脂中的应用
【技术领域】
[0001]本发明属于酵母菌【技术领域】，具体涉及一株胶红酵母及其在发酵生产类胡萝卜素和油脂中的应用。
【背景技术】
[0002]类胡萝卜素是一组具有抗氧化性的脂溶性色素的总称，其作为人和动物体内的一类重要生物活性物质，具有增强机体免疫力、抗辐射、抗肿瘤和治疗光敏性疾病等重要作用，在食品、化妆品、医药和饲料等行业有着广泛的应用。目前，类胡萝卜素已被FA0、欧共体及WHO等国际组织认定为A类营养色素，而近年来，围绕类胡萝卜素的产业化开发也正在逐步形成。
[0003]类胡萝卜素的工业化生产方法可以采用化学合成法或植物提取法。化学合成类胡萝卜素不仅技术复杂，而且其作为食品添加剂使用会影响食品的味道，降低人体吸收的比例，同时还存在一定的副作用。因此，伴随着人们崇尚绿色食品的心理日益增强，近年来越来越多的学者将研究方向转向天然色素的开发和利用。由于从植物中提取类胡萝卜素的传统制备工艺具有较高的成本和操作复杂性，因此，类胡萝卜素的工业化生产受到了巨大的限制。利用微生物发酵生产类胡萝卜素，不仅成本低廉，工艺简单，而且能够保证产品的优质和稳产，因此，利用微生物生产类胡萝卜素是生物资源型类胡萝卜素来源的主要途径。
[0004]目前，已报道的能产生类胡萝卜素的微生物菌株主要是三孢布拉氏霉菌和红酵母，前者已经处于中试和产业化应用阶段，后者则尚处于实验室小试阶段。三孢布拉氏霉菌虽然色素产量高，但是培养工艺复杂，生产周期长，而红酵母生产类胡萝卜素则具有营养要求简单，培养周期短，菌体含有丰富的蛋白质、氨基酸和维生素等可综合利用的优点。
[0005] 微生物油脂(Microbial Oils)是微生物利用碳水化合物或碳氢化合物等原料，在体内合成的油脂且其含量达到细胞干重的20%以上，通常又称单细胞油脂。随着自然资源的日益短缺以及油脂需求量的不断增长，传统油脂工业的发展受到了限制，供需矛盾日益突出，因此，以可再生资源为原料，开辟一种新的油脂资源-微生物油脂，对满足人们日益增长的油脂需求具有重要的意义。与传统的油脂生产方法相比，微生物发酵生产油脂因成本低，细胞增速快，生长周期短，并且不受季节、气候变化的影响而受到越来越多的关注。目前报道的产油脂微生物主要有:细菌、霉菌、酵母菌以及藻类，其中以霉菌和酵母菌的真核微生物居多。开辟微生物油脂这一新的生产油脂的途径，是开发油脂资源的一个新的方向，不仅可以缓解传统生产油脂紧缺的局面，还可以为工业化生产油脂增加一个新的重要途径。
【发明内容】
[0006]本发明解决的技术问题是提供了一株胶红酵母及其在发酵生产类胡萝卜素和油脂中的应用。
[0007]本发明提供的胶红酵母菌(Rhodotorula mucilaginosa),该菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为=CGMCC N0.8926，保藏地址:北京市朝阳区北辰西路I号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101，保藏日期:2014年3月17日。
[0008]本发明提供的胶红酵母可用于发酵生产类胡萝卜素，通过以下步骤实现:将所述的胶红酵母进行斜面培养和种子培养，得到活化种子液；按照体积百分比10%的接种量将种子液接种到产类胡萝卜素发酵培养基中，于27-30°C，pH4.5-8.0，碳氮比25-35:1，190rpm振荡培养96h，即得到含有类胡萝卜素的发酵液，其中碳源为葡萄糖或蔗糖，所述的产类胡萝卜素发酵培养基成分以g/L计为:葡萄糖31.8，酵母膏1，硫酸铵2，磷酸二氢钾1，无水氯化钙0.1，七水硫酸镁0.5，氯化钠0.1，其余成分为水，pH7.0。
[0009]作为进一步优选的技术方案，发酵过程中的pH6.5-7.5。
[0010]本发明提供的胶红酵母同时可用于发酵生产油脂，通过以下步骤实现:将所述的胶红酵母进行斜面培养和种子培养，得到活化种子液；按照体积百分比10%的接种量将种子液接种到产油脂发酵培养基中，于26-30°C，pH4.5-8.0，碳氮比30-130:1，190rpm振荡培养96h，即得到含有油脂的发酵液，其中碳源为葡萄糖或蔗糖，所述的产油脂发酵培养基成分以g/L计为:葡萄糖85.6，酵母浸粉0.5，磷酸二氢钾1，硫酸铵2，七水硫酸镁0.5，其余成分为水，PH6.0。
[0011]本发明所述的斜面培养温度28°C，培养时间72h，斜面培养基成分以g/L计为:酵母膏1，蛋白胨2，葡萄糖2，琼脂粉2，其余成分为水。
[0012]本发明所述的种子培养温度28°C，160rpm培养24h，种子培养基成分以g/L计为:酵母膏1，蛋白胨2，葡萄糖2 ，其余成分为水。
[0013]本发明利用胶红酵母生产类胡萝卜素并且同时产生油脂，并对生产菌株进行多轮ARTP (常压室温等离子体)诱变，获得产量较高的诱变菌株，对类胡萝卜素和油脂的工业化生产提供有良好的应用前景和经济效益。
【专利附图】
【附图说明】
[0014]图1是本发明基于酵母菌26S rDNA序列构建的系统进化树，图2是β-胡萝卜素标准品的HPLC图谱，图3是本发明实施例1生产的含有类胡萝卜素的发酵液的HPLC图谱，图4是实施例2生产的含有油脂的发酵液的GC-MS图谱。
[0015]图面说明:1、棕榈油，2、油酸。
【具体实施方式】
[0016]以下通过实施例对本发明的上述内容做进一步详细说明，但不应该将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实施例。凡基于本发明上述内容实现的技术均属于本发明的范围。
[0017]菌株的筛选和诱变
从抗生素发酵废水的活性污泥中筛选得到。采用Yro培养基分离，Yro培养基配方:葡萄糖20g,蛋白胨1g,酵母膏5g,琼脂15-20g,蒸懼水100mL, pH自然，115°C灭菌30min,临用前加氯霉素，使其终浓度为100mg/L。筛选过程:取50mL活性污泥，150rpm、28°C下摇床震荡30min，把细胞分散后，分别稀释lO'lO'lO'lO'lO'lO—6，再取各稀释浓度0.1ml液体涂布到含有氯霉素的YPD培养基上，每个梯度做两个平行，28°C培养观察。对带有颜色的菌株进行纯化培养，得到单一菌落，然后接种到YPD液体发酵培养基中，最终筛选得到菌株KC8产量较高。
[0018]利用ARTP (常压室温等离子体)诱变条件:处理距离2mm ;处理功率120W ;气流量10SLM,点样量 10 μ L,处理时间分别为 Os，15s, 30s, 45s, 60s, 90s, 120s, 180s。处理后 6 小时内进行涂布接种，28°C培养3天。挑取单菌落分别接种液体发酵培养基，经多轮筛选后获得类胡萝卜素和油脂产量均提高最多的菌株KC8-AR62。
[0019]菌株的鉴定 (O形态观察
采用划线的方法将菌株接种到固体YPD培养基上，固体YPD培养基的成分以g/L计为:酵母膏1，蛋白胨2，葡萄糖2，琼脂粉2，其余成分为水。28°C培养72h，可观察到呈圆形、红色、表面凸起、湿润的单一菌落。菌体经苏丹黑染色在1000倍油镜下观察，可以看到椭圆形具芽孢的酵母菌形态，同时还能看到红色色素的存在，以及被染为蓝色的产油脂细胞的存在。经过ARTP诱变之后，菌株的菌落形态明显变大。
[0020](2)利用CTAB法提取菌株DNA，进行26S rDNA D1/D2区扩增，测序序列为:TAAAAGGATTGCCCTAGTAGCGGCGAGCGAAGCGGGAAGAGCTCAAATTTATAATCTGGCACCTTCGGTGTCCGAGTTGTAATCTCTAGAAATGTTTTCCGCGTTGGACCGCACACAAGTCTGTTGGAATACAGCGGCATAGTGGTGAGACCCCCGTATATGGTGCGGACGCCCAGCGCTTTGTGATACATTTTCGAAGAGTCGAGTTGTTTGGGAATGCAGCTCAAATTGGGTGGTAAATTCCATCTAAAGCTAAATATTGGCGAGAGACCGATAGCGAACAAGTACCGTGAGGGAAAGATGAAAAGCACTTTGGAAAGAGAGTTAACAG TACGTGAAATTGTTGGAAGGGAAACGCTTGAAGTCAGACTTGCTTGCCGAGCAATCGGTTTGCAGGCCAGCATCAGTTTTCCGGGATGGATAATGGTAGAGAGAAGGTAGCAGTTTCGGCTGTGTTATAGCTCTCTGCTGGATACATCTTGGGGGACTGAGGAACGCAGTGTGCCTTTGGCGGGGGTTTCGACCTCTTCACACTTAGGATGCTGGTGGAATGGCTTTAAACGACCCGTCTTAA。经过Blast序列比对并构建系统发育树，如下图1所示。
[0021]实施例1
将所述的胶红酵母进行斜面培养和种子培养，得到活化种子液；按照体积比10%的接种量将种子液接种到产类胡萝卜素发酵培养基中，于27-30°C，pH4.5-8.0，碳氮比25-35:1，190印111振荡培养9611，即得到含有类胡萝卜素的发酵液，其中碳源为葡萄糖或蔗糖，以葡萄糖为最好，类胡萝卜素的最高产量可达到22.93mg/L，所述的产类胡萝卜素发酵培养基成分以g/L计为:葡萄糖31.8，酵母膏1，硫酸铵2，磷酸二氢钾1，无水氯化钙0.1，七水硫酸镁0.5，氯化钠0.1，其余成分为水，PH7.0。所生产的色素经过高效液相色谱测定，主要成分为类胡萝卜素，如图2和图3所示。
[0022]该菌株在pH4.5-8.0均可以产生较高的类胡萝卜素，但是最高产类胡萝卜素范围在pH6.5-7.5之间，葡萄糖和蔗糖都可以作为产生类胡萝卜素的碳源，但是以葡萄糖最好，碳氮比为25-35:1，温度为27-30°C之间，发酵96h类胡萝卜素产量最高，最高产量可达到22.93mg/L。
[0023]实施例2
将所述的胶红酵母进行斜面培养和种子培养，得到活化种子液；按照体积比10%的接种量将种子液接种到产油脂发酵培养基中，于26-30°C，pH4.5-8.0,碳氮比30-130:1，190rpm振荡培养96h，即得到含有油脂的发酵液，其中碳源为葡萄糖或蔗糖，葡萄糖和蔗糖为碳源的条件下都可以产生油脂，生产的油脂最高达到27.8%，所述的产油脂发酵培养基成分以g/L计为:葡萄糖85.6，酵母浸粉0.5，磷酸二氢钾1，硫酸铵2，七水硫酸镁0.5，其余成分为水，PH6.0，利用索式抽提法进行油脂抽提，经过GC-MS对产生的油脂进行鉴定，所生产的油脂主要为C16和C18不饱和脂肪酸，例如棕榈酸和油酸，如图4所述，其中棕榈酸的含量为14.57%，油酸的含量为70.21%，其它还有硬脂酸和亚油酸等。
[0024]以上实施例描述了本发明的基本原理、主要特征及优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明原理的范围下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进均落入本发明保护的范围内。
【权利要求】
1.一株胶红酵母菌Rhodotorula mucilaginosa,保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为=CGMCC N0.8926。
2.权利要求1所述的胶红酵母在发酵生产类胡萝卜素中的应用。
3.根据权利要求2所述的胶红酵母在发酵生产类胡萝卜素中的应用，其特征在于通过以下步骤实现:将所述的胶红酵母进行斜面培养和种子培养，得到活化种子液；按照体积百分比10%的接种量将种子液接种到产类胡萝卜素发酵培养基中，于27-30°C，pH4.5-8.0，碳氮比25-35:1，190印111振荡培养9611，即得到含有类胡萝卜素的发酵液，其中碳源为葡萄糖或蔗糖，所述的产类胡萝卜素发酵培养基成分以g/L计为:葡萄糖31.8，酵母膏1，硫酸铵2，磷酸二氢钾I，无水氯化钙0.1，七水硫酸镁0.5，氯化钠0.1，其余成分为水，pH7.0。
4.根据权利要求2所述的胶红酵母在发酵生产类胡萝卜素中的应用，其特征在于通过以下步骤实现:将所述的胶红酵母进行斜面培养和种子培养，得到活化种子液；按照体积百分比10%的接种量将种子液接种到产类胡萝卜素发酵培养基中，于27-30°C，pH6.5-7.5，碳氮比25-35:l，190rpm振荡培养96h，即得到含有类胡萝卜素的发酵液，其中碳源为葡萄糖或蔗糖，所述的产类胡萝卜素发酵培养基成分以g/L计为:葡萄糖31.8，酵母膏1，硫酸铵2，磷酸二氢钾I，无水氯化钙0.1，七水硫酸镁0.5，氯化钠0.1，其余成分为水，pH7.0。
5.根据权利要求3或4所述的胶红酵母在发酵生产类胡萝卜素中的应用，其特征在于:所述的斜面培养温度28°C，培养时间72h，斜面培养基成分以g/L计为:酵母膏1，蛋白胨2，葡萄糖2，琼脂粉2，其余成分为水。
6.根据权利要求3或4所述的胶红酵母在发酵生产类胡萝卜素中的应用，其特征在于:所述的种子培养温度28° C，160rpm培养24h，种子培养基成分以g/L计为:酵母膏1，蛋白胨2，葡萄糖2，其余成分为水。
7.权利要求1所述的胶红酵母在发酵生产油脂中的应用。
8.根据权利要求7所述的胶红酵母在发酵生产油脂中的应用，其特征在于通过以下步骤实现:将所述的胶红酵母进行斜面培养和种子培养，得到活化种子液；按照体积百分比10%的接种量将种子液接种到产油脂发酵培养基中，于26-30°C，pH4.5-8.0,碳氮比30-130:1，190rpm振荡培养96h，即得到含有油脂的发酵液，其中碳源为葡萄糖或蔗糖，所述的产油脂发酵培养基成分以g/L计为:葡萄糖85.6，酵母浸粉0.5，磷酸二氢钾1，硫酸铵2，七水硫酸镁0.5，其余成分为水，pH6.0。
9.根据权利要求8所述的胶红酵母在发酵生产油脂中的应用，其特征在于:所述的斜面培养温度28°C，培养时间72h，斜面培养基成分以g/L计为:酵母膏1，蛋白胨2，葡萄糖2，琼脂粉2，其余成分为水。
10.根据权利要求8所述的胶红酵母在发酵生产油脂中的应用，其特征在于:所述的种子培养温度28°C，160rpm培养24h，种子培养基成分以g/L计为:酵母膏1，蛋白胨2，葡萄糖2，其余成分为水。
【文档编号】C12P7/64GK104130952SQ201410131054
【公开日】2014年11月5日 申请日期:2014年4月3日 优先权日:2014年4月3日
【发明者】杨清香, 张昊, 蒿洪欣, 王瑞飞, 刘冬, 董慧霞 申请人:河南师范大学