本发明涉及生物化学技术领域,更具体地涉及一种基于同步光源的x-射线遗传标记探针及其制备方法以及应用。
背景技术:
显微成像技术是细胞生命科学发展的主要推动力之一。特别在过去的几十年中,荧光显微技术的出现结合标记技术实现了对细胞内各种生物大分子的示踪,给探究细胞的各种生命活动提供了革命性的手段。但是,亚细胞结构和细胞内各种生物大分子大多处于10-100nm尺度,由于阿贝(ernstabbe)光学衍射极限的存在(200-300nm),传统的荧光显微技术很难对100nm以下的细胞超微结构和细胞内重要生物分子进行成像观测。免疫电镜技术或电镜遗传标记技术可在极高的空间分辨率(<10nm)下对感兴趣的生物分子进行成像,但是由于电子的穿透深度较差(100-150nm),并且实验中需要对细胞样品进行复杂的预处理,常常导致污染,并且超薄切片还会导致结构信息的损失。上世纪九十年代发展的超分辨荧光成像技术在纳米分辨细胞成像领域取得了长足的发展。这类技术主要通过减小激光焦点的尺寸(以受激发射损耗显微技术sted为代表)或单分子定位和位置重构提高分辨率(以随机光学重建显微技术storm为代表)。但是,这些技术仍普遍存在成像速度慢,难以实现对多种生物分子同时标记等问题。并且,超分辨荧光成像大多只能对标记的蛋白分子成像,缺乏对亚细胞形态和结构进行观察的手段。
基于同步辐射的x射线成像技术是纳米分辨细胞成像领域的“第三条道路”。由于x射线的波长在0.1-10nm范围内,因此其天然就是一种纳米显微成像技术,分辨率理论上能够达到数个纳米。该技术具有独特的优势:1)与电子束相比,x射线对生物样品的穿透力更强,因此不需要经过切片等处理就能对完整细胞进行成像。2)x射线显微技术能够对细胞形貌结构进行自然衬度成像,较好地反映细胞的自然状态。3)x射线显微成像技术具有很好的能量分辨,能精确分辨很多元素的吸收谱。因此,结合x射线敏感的纳米探针,能够给出多种生物大分子的细胞内空间定位信息。目前,研究人员已经尝试在含金属元素的纳米颗粒上连接生物分子,赋予其对特异生物分子识别定位的功能。但是,这些工作中大多采用免疫标记的原理,而细胞内含有大量竞争性生物分子,如何保证对感兴趣蛋白(proteinofinterest,poi)的标记特异性是一大瓶颈。并且,当应用多种纳米颗粒-生物分子同时标记多个蛋白分子时还会互相干扰,影响识别效率。因此,现阶段迫切需要开发高特异性的x射线探针,实现对细胞内生物分子的精确识别和定位。
技术实现要素:
本发明的目的是提供一种基于同步光源的x-射线遗传标记探针及其制备方法以及应用,从而解决现有x射线显微成像技术还无法对细胞内生物分子进行高特异性识别和成像的问题。
为了解决上述技术问题,本发明采用以下技术方案:
根据本发明的第一方面,提供一种基于同步光源的x-射线遗传标记探针的制备方法,该制备方法包括以下步骤:1)构建同时包括酶和目的蛋白的融合表达质粒,并将所述融合表达质粒转染进入细胞;2)使用戊二醛固定液冰浴固定所述细胞;3)加入底物分子反应液,冰浴反应;4)去除反应液,使用固定液固定细胞;以及5)同步x射线成像观察;其中,所述酶具有针对所述底物的催化活性。
根据本发明所提供的方法,其工作原理为:质粒在细胞内同时表达具有催化活性的酶和目的蛋白,酶催化底物分子聚合,生成x射线可见的聚合物,从而实现目的蛋白在细胞内的定位的观察。
其中,步骤1)中的所述酶包括:抗坏血酸过氧化物酶(apex、apex2)、迷你单线态氧产生蛋白(minisog)、四半胱氨酸肽(tetracysteine)或辣根过氧化物酶(hrp)等等。最优选为apex2。其中,apex、apex2、minisog、tetracysteine适用于细胞内任意蛋白,hrp最适用于内质网相关蛋白。
步骤1)中所采用的转染试剂为lipofectamine3000transfectionreagent、lipofectamine2000transfectionreagent、lipofectamine2000cdtransfectionreagent、lipofectamineltxreagent或jetprimetransfectionreagent。
其中的转染方法为常规方法,转染试剂和质粒的比例为3:1~1:1,最佳地为1.5:1。转染时间为12~48h,最佳地为24h。
所述细胞为常规传代或原代培养的细胞株,并在实际应用过程中根据细胞的种属来源在构建融合表达质粒时设计表达具有催化活性的酶和目的蛋白的dna序列。优选地,可根据不同物种在密码子使用上的偏好性,对dna序列进行设计与优化,使其在细胞中更好地表达。
步骤2)中所使用的固定液仅限戊二醛,因为戊二醛可以最大程度地保持酶的催化活性。所述戊二醛固定液的浓度为1.5~3%。其中较佳的为2%。固定时间为20~60min,最佳为40min。
步骤3)中的所述底物分子为3,3'-二氨基联苯胺盐酸盐(dab)、金属增强型dab(metalenhanceddab)或enzmet。
针对不同的酶,可考虑在底物分子反应液中增加双氧水的成分。例如,apex和apex2可以催化h2o2产生1o2,1o2可以进一步催化底物分子聚合,因此对于apex和apex2来说,底物分子反应液中必须含有双氧水。对于minisog和tetracysteine来说,双氧水则并非必需成分。
其中,步骤3)中的冰浴反应时间为30s~2h。根据不同目的蛋白选择最优冰浴反应时间。
步骤4)中所使用的固定液可选地是多聚甲醛、戊二醛、乙醇、甲醇、冰醋酸、丙酮或福尔马林等等。其中,最优选地为多聚甲醛,特别是4%多聚甲醛固定液。多聚甲醛固定液使得细胞内的蛋白固定,保持其结构,利于进一步的脱水和观察。
应当理解,步骤2)中所使用的固定液仅限戊二醛,而步骤4)中所使用的固定液并不仅限戊二醛,还可以是其他种类的固定液,但是最优选地是多聚甲醛。
步骤4)中固定液的固定时间为10min~2h。较佳时间为15min。
步骤5)中所述同步x射线成像能量为280~20000ev,根据不同的底物分子选择不同的入射能量。
其中,dab最优成像能量为350~850ev,金属增强型dab最优成像能量为500~8000ev。enzmet最优成像能量为500~7000ev。
步骤5)中所述同步x射线成像的分辨率可以达到20~200nm。
根据本发明的第二方面,还提供一种根据上述制备方法制得的基于同步光源的x-射线遗传标记探针。
根据本发明的第三方面,还提供一种基于同步光源的x-射线遗传标记探针在细胞成像中的应用。
该应用可包括细胞生命活动所涉及的任何蛋白的识别及成像。
本发明的积极进步效果在于:1)现有的电镜遗传标记主要应用锇酸染色形成的高电子密度产物进行成像,属于物理反应,而且该过程易引入高电子密度的杂质,对区分poi的空间分布形成干扰。而本发明提供的方法应用同步x射线对该聚合物的天然吸收进行成像,本质上属于化学反应,可使dab分子聚合到很小的区域(几十甚至几纳米),特异性非常好。2)目前已有的同步x射线敏感的纳米探针大都应用纳米颗粒-生物分子复合物,通过免疫染色过程识别细胞内poi,标记过程受到细胞内大量竞争性生物分子的影响,无法确保良好的特异性。并且,基于x射线的蛋白免疫成像技术也无法实时监测细胞在传代分裂中功能蛋白定位和分布的变化。该方法基于遗传标记的原理,因此在细胞分裂传代后也能保持非常好的特异性,不会丢失信号。3)应用先进的同步x射线进行成像,穿透深度较深,不但能对完整细胞进行成像,而且可达到组织水平。目前,组织甚至器官水平的高特异性遗传标记成像是生物医学领域的一大空白,而我们发展的基于同步光源的x-射线遗传标记探针预期能在该领域有良好的应用前景。
总之,本发明提供了一种能对细胞内生物分子进行高特异性识别和高分辨成像的方法,具有良好的生物医学应用前景。
附图说明
图1是同步x射线遗传探针对细胞连接蛋白的标记成像图;
图2a是同步x射线遗传探针对细胞微管蛋白的标记成像图,图2b是对图2a中虚线框的放大图;
图3a和图3b是x射线遗传探针与电镜遗传探针在同步x射线细胞成像中的应用比较图,以细胞连接蛋白为例,图3a为电镜遗传标记,图3b为x射线遗传标记,圆圈指示高电子密度的杂质;
图4a、图4b、图4c是基于apex2、minisog、tetracysteine的同步x射线遗传标记探针在细胞成像中的应用比较图,以细胞连接蛋白为例,图4a为apex2,图4b为minisog,图4c为tetracysteine。
具体实施方式
以下结合具体实施例,对本发明做进一步说明。应理解,以下实施例仅用于说明本发明而非用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法,按照常规方法和条件,或按照商品说明书选择。
本专利选择人hek293t细胞,催化活性的酶以apex2为主,目的蛋白选择相邻细胞间的连接蛋白cx43和细胞内微管蛋白为代表,底物分子选择dab为代表,构建x-射线遗传标记探针并应用于该细胞的成像研究,以下实施例具体说明本专利的实施效果。
实施例1同步x射线遗传标记探针的制备及在细胞连接蛋白成像中的应用
pcdna3-cx43-apex2质粒的构建。该质粒的构建过程采用常规分子生物学手段进行,具体如下:首先,根据人源的cx43蛋白序列,使用人源偏性的密码子优化了其dna序列并合成全序列,全序列由上海权阳生物科技有限公司合成。apex2序列克隆自pegfp-apex2-tubulin质粒(addgeneplasmid#66171)。使用q5定点突变试剂盒(购自neb,货号e0552s)将该cx43序列和apex2序列之间连接linker序列。然后将cx43-apex2序列克隆进入pcdna3哺乳动物表达载体骨架中,从而构建出pcdna3-cx43-apex2质粒。测序并验证质粒序列。该质粒序列如seqidno:1所示。其中,pcdna3是一种商业化的哺乳动物表达载体骨架。将cx43-apex2融合蛋白的序列克隆进入pcdna3载体后,会驱动cx43-apex2融合蛋白的表达。在实际应用过程中根据细胞的种属来源在构建融合表达质粒时设计相应的dna序列为cx43的序列和apex2的序列。
hek293t细胞的培养。其中,hek293t细胞购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库。采用dmem(含10%fbs)培养基,37℃,5%co2,饱和湿度培养。将氮化硅窗置于细胞培养板中,紫外灭菌,2×105细胞/孔的密度接种,贴壁过夜。
将pcdna3-cx43-apex2质粒转染进入hek293t细胞。使用脂质体lipo3000法进行转染,每孔加入0.75μllipo3000,500ngpcdna3-cx43-apex2质粒和1μlp3000。24h后去除培养基,2%戊二醛冰浴固定。加入含有0.03%h2o2的3,3'-二氨基联苯胺(dab)反应液,冰浴反应1min,去除孔内反应液,4%多聚甲醛固定。梯度乙醇脱水,同步x射线成像观察。
x射线成像实验在上海光源bl08u1软x射线谱学显微线站进行,实验方法为软x射线透射成像。x射线经波荡器引出,经过平面光栅单色器单色化后由波带片聚焦到样品上,空间分辨率为30nm。样品放置在真空样品室中,选取x射线入射能量为525ev。移动运动电机,完成细胞样品的寻找、对焦,然后进行x射线成像。获得清晰的相邻细胞连接处连接蛋白的图像,成像分辨率为30nm。
标记结束后,可在同步x射线显微镜下清楚地观察到相邻细胞连接处连接蛋白的定位分布。结果见图1,其中虚线方框内黑色阴影即为细胞连接蛋白部分。
实施例2同步x射线遗传标记探针的制备及在细胞内微管蛋白成像中的应用
pegfp-apex2-tubulin质粒(addgeneplasmid#66171)购自addgene。该质粒序列如seqidno:2所示。
hela细胞的培养。其中,hela细胞购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库。mem(含10%fbs)培养基,37℃,5%co2,饱和湿度培养。将氮化硅窗置于细胞培养板中,紫外灭菌,8×104细胞/孔的密度接种,贴壁过夜。
将pegfp-apex2-tubulin质粒转染进入hela细胞。使用脂质体lipo3000法进行转染,每孔加入0.75μllipo3000,500ngpcdna3-cx43-apex2质粒和1μlp3000。24h后去除培养基,2%戊二醛冰浴固定。加入含有0.03%h2o2的3,3'-二氨基联苯胺(dab)反应液,冰浴反应1h,去除孔内反应液,4%多聚甲醛固定。梯度乙醇脱水,同步x射线成像观察,方法与实施例1相同。
标记结束后,可在同步x射线显微镜下清楚地观察到细胞内微管蛋白的分布。结果见图2a和图2b,其中,图2b为图2a中虚线框的放大图,特别是从图2b中可以清楚地观察到细胞内微管蛋白的分布。
实施例3电镜遗传探针的制备与x射线遗传探针在同步x射线细胞成像中的应用比较
将pcdna3-cx43-apex2质粒转染进入hek293t细胞。其中,hek293t细胞培养和pcdna3-cx43-apex2质粒的转染方法与实施例1相同。
电镜遗传探针的标记方法为:转染结束后,除去孔内培养基,使用2%戊二醛冰浴固定细胞。加入含0.03%h2o2的dab反应液,冰浴反应1min。去除孔内反应液,加入2%锇酸,冰浴复染1h。去除孔内反应液,梯度乙醇脱水,同步x射线成像观察,方法与实施例1相同。
x射线遗传探针的标记方法以及x射线成像观察方法和实施例1相同。
以细胞连接蛋白为例,标记结束后,结果见图3a和图3b。同步x射线显微镜下,电镜遗传探针标记方法难以区分细胞和相邻细胞间连接蛋白的分布,此外,锇酸复染引入了很多具有高电子密度的杂质,干扰了对目的蛋白定位分布的正确观察,如图3a所示。应用x射线遗传标记方法则能在x射线显微镜下很清楚地观察到目的蛋白的定位分布,并且没有任何高电子密度的杂质干扰,如图3b所示。
实施例4基于apex2、minisog、tetracysteine的同步x射线遗传标记探针在细胞成像中的应用比较
分别构建pcdna3-cx43-minisog和pcdna3-cx43-tetracyseine质粒。然后分别将pcdna3-cx43-minisog和pcdna3-cx43-tetracyseine质粒转染进入hek293t细胞。其中,hek293t细胞培养以及各质粒的转染方法和实施例1相同。
转染结束后,基于apex2的x射线遗传标记方法和x射线成像观察方法和实施例1相同。
基于minisog的x射线遗传标记方法为:除去孔内培养基,使用2%戊二醛冰浴固定细胞。加入dab反应液,向反应液中缓慢通入氧气。使用150w,488nm激光照射感兴趣的区域2min。去除孔内反应液,4%多聚甲醛固定。梯度乙醇脱水,同步x射线成像观察,方法与实施例1相同。
基于tetracyseine的x射线遗传标记方法为:除去孔内培养基,加入reash-edt2。使用2%戊二醛冰浴固定细胞。加入dab反应液,向反应液中缓慢通入氧气。使用150w,585nm激光照射感兴趣的区域10min。去除孔内反应液,4%多聚甲醛固定。梯度乙醇脱水,同步x射线成像观察步骤与实施例1相同。
结果见图4a、图4b和图4c。以细胞连接蛋白为例,标记结束后,可在同步x射线显微镜下观察到三种同步x射线遗传标记探针标记的细胞连接蛋白的定位分布,其中,图4a为apex2,图4b为minisog,图4c为tetracysteine。图中可见,基于apex2的同步x射线遗传标记探针在细胞成像中的应用效果明显优于其它两种。
以上所述的,仅为本发明的较佳实施例,并非用以限定本发明的范围,本发明的上述实施例还可以做出各种变化。即凡是依据本发明申请的权利要求书及说明书内容所作的简单、等效变化与修饰,皆落入本发明专利的权利要求保护范围。本发明未详尽描述的均为常规技术内容。
序列表
<110>中国科学院上海应用物理研究所
<120>一种基于同步光源的x-射线遗传标记探针及其制备方法以及应用
<160>2
<210>1
<211>7295
<212>dna
<213>人工
<220>
<223>pcdna3-cx43-apex2质粒
<400>1
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