专利名称：牙鲆病毒性神经坏死病的检测方法
技术领域：
该技术属于水生动物病害诊断与检测的发明，特别涉及牙鲆病毒性神经坏死病(i^ra/fc/^/z;^" o/z'vaceiw viral nervous necrosis ， PONNV )的检领'j方法。
背景技术：
鱼类病毒性神经坏死病是近年来严重危害海淡水鱼类，引起世界范围内暴发性流行的重大传染病之一。目前，已知包括鱼S鲡目、鳕形目、鲈形目、鲽形目和飩形目在内的40多种鱼类受神经坏死病毒感染，病毒可通过垂直和水平两种途径传播。仔鱼和稚鱼易受感染，病死率达90%以上，甚至100%，给海水工厂化养殖企业造成了巨大的经济损失。该传染病被国际兽疫局(0正)列为重要的鱼类病害(0正，2000)。抗生素及化学药物等均对该病作用很小，目前尚无有效的治疗方法。该病于本世纪初传入我国南方，主要感染鱼类为石斑鱼，此次牙鲆病毒性神经坏死病为我国北方地区属首次发现。
目前，应用于鱼类神经坏死病毒检测的方法主要有分子生物学方法和免疫学方法。
分子生物学方法包括RT-PCR、实时荧光定量PCR以及NASBA(nucleic acid sequencebased amplification)等技术。
应用RT-PCR方法检测编码NNV病毒核衣壳蛋白的RNA2特异性片段，可以检测到组织中极微量的病毒RNA，是目前应用最多的诊断方法。最早应用PCR方法检测NNV的鱼类是日本的黄带拟鲮，根据SJNNV的RNA2设计的一对引物，可以特异性地扩增一段427bp的核酸片段。后来的实验证明该对引物可以用于检测多种鱼类的诺达病毒，扩增片段长约420-430bp。但是运用同一种检测方法对不同鱼类神经坏死病毒进行检测，其检测的灵敏度也存在着不小的差异，甚至会出现漏检的情况
实时荧光定量PCR技术是近几年才发展起来的一种核酸定量检测技术，该技术通过引入l种荧光化学物质，使PCR扩增反应中循环产物的荧光信号强度等比例增加，通过荧光强度变化监测产物量的变化，从而实现对起始模板定量及定性的分析。因其具有比普通PCR技术更加准确、灵敏和快速的特点，而且可以实现定量分析，所以被广泛应用于人类和动物的传染病诊断以及其它基础科学研究。传统方法如EB染色或放射性核素掺入标记后的光密度扫描等，测定的都是PCR的终产物，而实时荧光定量技术能够对起始模板进行定量，比传统方法具有更大的优势。目前比较成熟的荧光定量PCR技术有TaqMan探针、Amplisensor复合探针、分子信标(Molecularbeacon)等技术，尤其以TaqMan探针技术使用最为广泛。近两年发生的SARS、禽流感的快速检测就是基于TaqMan探针技术。此外该技术还被用于霍乱、炭疽等烈性传染病的检测等。但TaqMan探针技术在水生动物病害的检测中的应用还未见报道。
NASBA(nucleic acid sequence based amplification)技术是另一种核酸实时定量扩增的方法，近年来开始应用于人和动物传染病病原的检测中。该技术基于特异性的引物和探针，以及AMV逆转录酶、HRNase和T7RNA聚合酶3种酶的协同作用。Starkey等将NASBA技术用于检测鱼类诺达病毒，证明实时NASBA技术比单管RT-PCR检测灵敏度高100倍。该技术虽然灵敏、特异性强，但因为需要特异性的酶，检测成本较高。
免疫学方法主要是利用抗NNV的单克隆抗体或多克隆抗体检测病毒抗原，包括用酶联免疫吸附试验(ELISA)、间接荧光抗体(IFAT)以及免疫组织化学(IHC)等方法，可以快速、准确地进行检测。Arimoto等用SJNNV病鱼组织中分离纯化的病毒作为抗原，制备了抗血清，建立了 ELISA检测SJNNV方法，检测灵敏度达到每孔5ng。但该技术的灵敏度还不能对潜伏期感染或带毒鱼的抗体进行检测。因为免疫学方法都需要制备抗NNV的单克隆或多克隆抗体，由于病毒纯化难度大，可用于NNV细胞培养的细胞株还不理想，目前用于鱼类病毒培养的细胞系大部分运用于淡水鱼类病毒。能用于鱼类NNV培养的细胞系主要有SSN-1细胞株、E-11细胞系和SB细胞系等。但其特异性和稳定性等方面还远不能满足实验的需求。要制备NNV病毒的抗体有一定困难。而且ELISA的特异性常常因为各种原因不够稳定，因此，这些方法较少在实际检测中应用。
发明内容
本发明的目的是在PONNV衣壳蛋白高度保守区设计1套nested RT-PCR引物，通过特异性、灵敏性实验建立了 nested RT-PCR反应体系并对其进行了优化。提供了一种牙鲆(i>flm//c/"/y^0/Zra"HS)病毒性神经坏死病的检测方法。该方法操作简单、快速灵敏、特异性好，可运用于牙鲆养殖过程中的病毒跟踪监测和水质监测，具有很高的实用价值。上述nested RT-PCR引物序列如下表:
引物 Primers引物序列(5 '-3 ') Sequences of primers引物长度(bp) Primer sizes产物长度(bp) Product sizes
M2ATGGTGGGAAAGCAGAAC18
L2TAACCCAACAGCCCAAAG18886
M5TGGTCGGCTGATACTCCT18
CAACGCCATCTGTGAACG18398
本发明的牙鲆病毒性神经坏死病的检测方法步骤如下
1、 取病鱼眼和脑组织约lOOmg于1.5 ml离心管中，加入1ml Ttizol提取液，迅速放在冰盒中用玻璃匀浆器匀浆(大约lmin);
2、 超静台中加入200ul氯仿，充分混匀，室温5min;
3、 4°C， 12000 r/min离心lOrain;
4、 取上层水相400ul于新的离心管中。加入等体积的异丙醇，混匀后放置5min;
5、 4。C， 12000 r/min离心10min，弃上清。
6、 加入700ul预冷的70%酒精轻轻吹打，°C， 12000 r/min离心lOmin，弃上清；
7、 重复上一个步骤一次，超静台通风吹干；
8、 加20ul DEPC灭菌双蒸水溶解，得到PCR模板；
9、 将10ul PCR模板置于PCR管中，先9(TC预热变性5min，立即冰浴(放入冰盒中)，并加入5ul
5 X逆转录酶buffer、 0. lul M-mLV逆转录酶(200U/ul) 、 0. 25ul RNA酶抑制剂(40U/ul)、2. 5ul L2(40 mol)、 2ul dNTP、 5ul (25mM) MgCL2，于42。C孵育30min;
10、 混合物在99。C加热lOrain，以灭活逆转录酶，立即冰浴(放入冰盒中)；
11、 混合液中再加入3. 5ul M2(40urao1)、 lul R3(40umo1) 、 lul Tag酶、lul dNTP、 lOul10XPCRbuffer 、 5ul 25腿olMgCL2、 50ul灭菌双蒸水，50ul甘油，混匀后置于PCR仪；
12、 PCR程序设定为72°C 10min， 94°C 2min ，然后94°C 30 s 、 61°C 40 s 、 72。C 60s，循环35次，最后72。C延伸，10min,4i:保存；
13、 将PCR产物5ul作为模板，加入4ullOXPCR buffer、 2ul MgCU、 0. 4ul dNTP、 2ulM2(40umo1)、 2ul R3(40umo1)、 0.4ul Tag酶、20ul灭菌双蒸水，15ul甘油，混匀后置于PCR仪；
14、 PCR程序设定为94°C 2min，然后94°C 30 s 、 61°C 40 s 、 72°C 60s ，循环35次'最后72。C延伸，10rain,4'C保存； .
15、 用0.5X TBE电泳缓冲液配制1%的琼脂糖凝胶(0. 16g琼脂糖加0. 5 TBE电泳缓冲液16ml)，冷却至60。C加入EB 2ul，混匀倒入胶室。lul loading与3ul样品混合
5加入，Marker 3ul。 90V电压电泳50min; 16、电泳后在紫外检测仪上观察结果，在398bp DNA位置出现亮带者为PONNV阳性，说明 待侧样品含有病毒性神经坏死病毒，否则为阴性。
本发明的优点
利用牙鲆神经坏死病毒的衣壳蛋白高度保守区设计1套nested RT-PCR引物，通过优 化PCR反应条件和反应体系，建立起针对牙鲆病毒性神经坏死病的检测方法，检测灵敏度 达到了6.7fg，是普通RT-PCR检测灵敏度的106倍，可更加有效地运用于牙鲆各养殖时期的 病毒跟踪监测及水质监测，具有很高的实用价值。
图1是感染牙鲆病毒性神经坏死病的牙鲆样品的nested RT-PCR检测结果，其中M: DNA分子量标准； l禾口T: PONNV阳性对照；2禾Q2': PONNV阴性对照；3禾卩3':检测样品。
具体实施例方式
本牙鲆(i flni//c/^/i，o/Zvace s)病毒性神经坏死病的检测方法步骤如下
1、 取鱼眼和脑组织约lOOmg于1.5 ml离心管中，加入1ml Ttizol提取液，迅速放在 冰盒中用玻璃匀浆器匀桨(大约lmin);
2、 静台中加入200ul氯仿，充分混匀，室温5min;
3、 4°C， 12000 r/min离心lOmin;
4、 取上层水相400ul于新的离心管中。加入等体积的异丙醇，混匀后放置5min;
5、 4°C， 12000 r/min离心10rain，弃上清。
6、 加入700ul预冷的70%酒精轻轻吹打，°C， 12000 r/min离心10min，弃上清；
7、 重复上一个步骤一次，超静台通风吹干；
8、 加20ul DEPC灭菌双蒸水溶解，得到PCR模板；
9、 将10ul PCR模板置于PCR管中，先90。C预热变性5min，立即冰浴(放入冰盒中)， 并加入5ul 5X逆转录酶buffer、 0. lul MiLV逆转录酶(200U/ul) 、 0. 25ul RNA 酶抑制剂(40U/u1)、2. 5ul L2(40mol)、2ul dNTP、 5ul (25raM)MgCL2，于42。C孵育30min;
10、 混合物在99t:加热10min，以灭活逆转录酶，立即冰浴(放入冰盒中)；
11、 混合液中再加入3. 5ul M2(40umo1) 、 lulR3(40画l) 、 lul Tag酶、lul dNTP、 lOul lOXPCRbuffer 、 5ul 25腿olMgCL2、 50ul灭菌双蒸水，50ul甘油，混匀后置于PCR 仪；
12、 PCR程序设定为72°C 10min， 94°C 2min ,然后94°C 30 s 、 61°C 40 s 、 72°C 60 s ，循环30次，最后72。C延伸，10min,4。C保存；
13、 将PCR产物5ul作为模板，加入4ullOXPCR buffer、 2ul MgCL2、 0. 4ul dNTP、 2ulM2(40umo1)、 2ul R3(40umo1)、 0.4ul Tag酶、20ul灭菌双蒸水，15ul甘油，混匀后 置于PCR仪；
14、 PCR程序设定为94°C 2min，然后94°C 30 s 、 61°C 40 s 、 72°C 60s，循环30次， 最后72'C延伸，10min,4。C保存;
15、 用0.5X TBE电泳缓冲液配制1%的琼脂糖凝胶(0. 16g琼脂糖加0. 5 TBE电泳缓冲 液16ml)，冷却至6CTC加入EB 2ul，混匀倒入胶室。lul loading与3ul样品混合 加入，Marker 3ul。 90V电压电泳50min;
16、 电泳后在紫外检测仪上观察结果，在398bp DNA位置出瑰亮带者为PONNV阳性，说明 待侧样品含有病毒性神经坏死病毒，否则为阴性。
权利要求
1、一种牙鲆病毒性神经坏死病的检测方法步骤如下1)病鱼眼和脑组织约100mg于1.5ml离心管中，加入1ml Ttizol提取液，迅速放在冰盒中用玻璃匀浆器匀浆，大约1min；2)静台中加入200ul氯仿，充分混匀，室温5min；3)4℃，12000r/min离心10min；4)取上层水相400ul于新的离心管中。加入等体积的异丙醇，混匀后放置5min；5)4℃，12000r/min离心10min，弃上清。6)加入700ul预冷的70％酒精轻轻吹打，℃，12000r/min离心10min，弃上清；7)重复上一个步骤一次，超静台通风吹干；8)加20ul DEPC灭菌双蒸水溶解，得到PCR模板；9)将10ul PCR模板置于PCR管中，先90℃预热变性5min，立即冰浴，放入冰盒中，并加入5ul m5×逆转录酶buffer、0.1ul M-mLV逆转录酶“200U/ul”、0.25ul RNA酶抑制剂“40U/ul”、2.5ul L2“40mol”、2ul dNTP、5ul“25mM”MgCL2，于42℃孵育30min；10)混合物在99℃加热10min，以灭活逆转录酶，立即冰浴，放入冰盒中；11)混合液中再加入3.5ul M2“40umol”、1ul R3“40umol”、1ul Tag酶、1ul dNTP、10ul 10×PCRbuffer、5ul 25mmolMgCL2、50ul灭菌双蒸水，50ul甘油，混匀后置于PCR仪；12)PCR程序设定为72℃ 10min，94℃ 2min，然后94℃ 30s、61℃ 40s、72℃ 60s，循环35次，最后72℃延伸，10min，4℃保存；13)、将PCR产物5ul作为模板，加入4ul10×PCR buffer、2ul MgCL2、0.4ul dNTP、2ulM2“40umol”、2ul R3“40umol”、0.4ul Tag酶、20ul灭菌双蒸水，15ul甘油，混匀后置于PCR仪；14)、PCR程序设定为94℃ 2min，然后94℃ 30s、61℃ 40s、72℃ 60s，循环35次，最后72℃延伸，10min，4℃保存；15)、用0. 5×TBE电泳缓冲液配制1％的琼脂糖凝胶--0.16g琼脂糖加0.5TBE电泳缓冲液16ml，冷却至60℃加入EB 2ul，混匀倒入胶室。1ul loading与3ul样品混合加入，Marker 3ul。90V电压电泳50min；16)、电泳后在紫外检测仪上观察结果，在398bp DNA位置出现亮带者为PONNV阳性，说明待侧样品含有病毒性神经坏死病毒，否则为阴性。
全文摘要
本发明牙鲆(Paralichthys olivaceus)病毒性神经坏死病的检测方法。在PONNV衣壳蛋白高度保守区设计1套nested RT-PCR引物，通过特异性、灵敏性实验建立了nestedRT-PCR反应体系并对其进行了优化。本发明牙鲆(Paralichthys olivaceus)病毒性神经坏死病的检测方法提供了一种该方法操作简单、快速灵敏、特异性好，可运用于牙鲆养殖过程中的病毒跟踪监测和水质监测，具有很高的实用价值。
文档编号C12Q1/70GK101463394SQ20081015367
公开日2009年6月24日 申请日期2008年12月2日 优先权日2008年12月2日
发明者爽 刘, 孙金生, 毛海涛, 白东清 申请人:天津农学院