专利名称：一种细胞结构的检测方法
技术领域：
本发明涉及到用细胞器显色剂检测细胞结构的方法。
近年来，细胞结构的研究已经取得很大进展，然而，现有的方法多以免疫反应为基础，其中所用的抗原抗体及荧光标记物的制备均较复杂，条件要求很高，需较昂贵的设备且耗时较长。因此，探讨一种新的简单快速省事而可靠的方法便成为当前之重要课题。
本发明的目的之一在于提供一种利用细胞器显色剂检测细胞结构、信息传递、细胞周期及小分子物质运转的方法。
本发明的目的之二在于提供一种利用细胞器显色剂诊断恶性肿瘤的方法。
本发明利用细胞器显色剂检测细胞结构的方法包括步骤如下1)培养细胞；2)加入细胞器显色剂；和3)观察细胞结构。
本发明中可用的细胞器显色剂包括四唑及其复合物。
上述四唑及其复合物包括3-(4,5-二甲噻唑-2-基)-2,5-联苯四唑溴(MTT，又称四唑溴，英文名为3-(4,5-dimethylthiazole-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide)；噻唑兰(TB)，英文名为thiazolyl blue,2-(2 Benzothiazolyl)-5-styryl-3-(4phthalhydrazidyl)tetrazolium chloride;
四唑兰，又称二氧3,3’-[3,3’-二甲氧基(1,1’-联苯)-4,4’-二基]-二[2,5联苯-2H-四唑]，英文名为tetrazolium blue:3,3’-[3,3’-dimethoxy(1,1’-biphenyl)-4,4’-diyl]-bis[2,5-diphenyl-2H-tetrazolium]dichloride;
(1H)-四唑，英文名为1H-tetrazole；四唑红(1,3,5-三苯四唑，或氯化2,3,5-三苯四唑)，英文名为tetrazolium red:1,3,5-triphenyltetrazolium or 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride:
氯化(2,3,5-三苯-2-H-四唑，英文名为2,3,5-triphenyl-2-H-tetrazolium;
氯化5-氰基-2,3-二联甲苯四唑(CTC)，英文名为5-cyano-2,3-ditolyltetrazolium chloride;
P-碘硝基四唑紫罗兰，又称(2-[4-典苯]-3-[4-硝基苯]-5-苯基四唑氯)(INT)，英文名为p-iodonitrotetrazolium violet or(2-[4-iodophenyl]-3-[4-nitrophenyl]-5-phenyltetrazolium chloride;
硝基四唑紫罗兰；氯化碘硝基四唑；四唑紫罗兰；紫罗兰四唑，又称氯化(2,5-联苯-3-[α-奈基]-四唑)，英文名为tetrazoliumviolet:(2,5-diphenyl-3-[α-naphthyl]-tetrazolium chloride;
氯化2(P-碘苯)-P-硝基苯-5-苯四唑(INPT)，英文名为2-(p-iodophenyl)-p-itrophenyl-5-phenyltetrazolium chloride;
氯化P-硝基兰四唑；氯化硝基兰单四唑；氧化硝基新四唑；氯化m-硝基兰四唑；氯化兰四唑；胡椒基四唑兰，英文名为piperonyl tetrazolium blue；甲苯基四唑红(oTTR或p-TTR)，英文名为o-Tolyl tetrazolium red，或p-Tolyl tetrazolium red；氯化新四唑，又称氯化2,2’,5,5’-四苯-3,3’-[p-二亚苯]二四唑)，英文名为neotetrazolium chloride:(NT:2,2’,5,5’-tetraphenyl-3,3’-[p-diphenylene]ditetrazolium chlorid);
氧化硝基兰四唑，也称氯化P-硝基兰四唑，或氯化2,2’-双-硝基苯-5,5’-二苯基-3,3’[3,3’-二甲氧-4,4二次苯基]-二四唑(NBT)，英文名为nitro blue tetrazoliumor p-nitrotetrazolium blue or 2,2’di-p-nitrophenyl-5,5’-diphenyl-3,3’[3,3’-dimethoxy-4,4’diphenylene]-tetrazolium chloride；四硝基兰四唑(TNBT)，英文名为tetranitro blue tetrazolium；硝基兰四唑(NBT)，英文名为nitro blue tetrazolium氯化2,2’-二[p-硝苯]-5,5’-二[p-硫代氨基甲酰苯]-3,3’-[3,3’-二甲氧-4,4’-二亚苯]二四唑(TC-NBT)，英文名为2,2’-di[p-nitrophenyl]-5,5’di[p-thiocarbamylphenyl]-3,3’-[3,3’-dimethoxy-4,4’-biphenylene]ditetrazolium chloride，又称硫代氨基甲酰硝基兰四唑，英文名为thiocarbamylnitro blue tetrazolium；四唑化联茴香胺(TTD)，英文名为tetrazotized 0-dianisidine；3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-5-(3-羧基甲氧苯基)-2-(4-磺苯基)-2 H-四唑盐(MTS)，英文名为3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium salt;
4-(3-碘苯基)-2-(4-硝基苯)-2H-5-四唑]-1,3-苯二磺酸盐(WST-1)，英文名为4-[3-(4-iodophenyl)-2-(4-nitrophenyl)-2H-5tetrazolio]-1,3-benzene disulfonate;
2,2-双(2-甲氧基-4-硝基-5-磺苯基)-2H-四唑-5-羧基酰基苯胺(XTT)，英文名为2,2-bis(2-methoxyl-4-notro-5-sulfophenyl)-2H-tetrazolium-5-carboxanilide;
1-[4,5-二甲基噻唑-2-基]-2,5-二苯四唑溴(1-DDTT)，英文名为1-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5-iphenyltetrazolium bromide;
四唑溴，又称3-[4,5-二甲基噻唑-2-基]-2,5-二苯四唑溴(3-DDTT)，英文名为3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5-iphenyltetrazolium bromide;
3’-[1-[(苯基氨基)-碳酰]-3,4-四唑]-双(4-甲氧基-6-硝基)苯-磺基酸氢氧化钠(PCTT)，英文名为sodium 3’-[1-[phenylamino)-carbonyl]-3,4-tetrazolium]-bis(4-methoxy-6-nitro)benzene-sulfonic acid hydrate)；氯化茴香兰四唑(pABT或pApNBT)，英文名为p-Anisyl blue tetrzolium chloride，或p-Anisyl-p-nitro blue tetrazolium chloride；藜胡基四唑兰。
以上细胞器显色剂(细胞器晶体化物质)可单选或多选。
多选较单选作用效果好。可根据不同目的选用不同的细胞器显色剂。如，四唑红可用于中心体的染色，而MTT则用于微丝微管、内织网、细胞核、核膜、中心粒、中心体、纺锤体等的染色。
本发明中的主要成份可因不同需要而制成各种剂型，也可因不同需要而制成各种浓度。
本发明细胞器显色剂的浓度因具体情况而定，可从0.1微克/毫升-800微克/毫升，以5微克/毫升-500微克/毫升为佳，以20微克/毫升-200微克/毫升为最佳。
本发明明细胞器显色剂可制成多种剂型。如，针剂、浑悬液、软膏及固态如颗粒及粉末。但不限于此。
本发明中的细胞器包括所有细胞结构和微丝微管系统包括所有亚细胞结构，如，但不限于，内织网、细胞核、核膜、核板、核质、核孔复合体、核套、染色体、染色质、核心管、着丝粒、端粒、浆膜、高尔基体、中心粒、溶酶体、中心体、旁中心粒物质、收缩环、核糖体、核内体、吞噬体、蛋白酶体、过氧物酶体、纺锤体、微绒毛、鞭毛、纤毛、及其它微丝微管等。
本发明中的细胞器也包括位于上述结构上的蛋白及小分子肽等。
作为三羧酸循环的关键酶，琥珀酸脱氢酶除了存在于线粒体，还广泛分布于其它细胞器中，在肿瘤细胞中较正常细胞明显增高。当含四唑的复合物存在时，琥珀酸脱氢酶可将之转化为相应的晶体产物。由于琥珀酸脱氢酶借其膜嵌顿蛋白牢固结合于细胞器的膜性结构上，所形成的晶体并非游离于胞浆及细胞外液，而是集中在富含该酶的细胞器上。晶体化的细胞结构在显微镜下清晰可见。
癌细胞中的琥珀酸脱氢酶较正常细胞明显增高，癌细胞中的细胞结构较正常细胞明显异常。其中，中心体及微丝微管等数量明显增多。当含四唑的复合物存在时，琥珀酸脱氢酶可将之转化为相应的晶体产物从而使富含琥珀酸脱氢酶的细胞结构晶体化。由于琥珀酸脱氢酶借其膜嵌顿蛋白牢固结合于细胞器的膜性结构上，所形成的晶体并非游离于胞浆及细胞外液，而是集中在富含该酶的细胞器上。晶体化的细胞结构在显微镜下清晰可见。比较细胞结构晶体化的程度有利于细胞良恶性的鉴别。细胞结构的晶体化不仅导致细胞的机械性损失，还可引起功能停滞，信息传递受阻，细胞分裂停滞。
本发明检测细胞结构的方法的基础是新的细胞器显色剂的应用。琥珀酸脱氢酶除了存在于线粒体，还广泛分布于其它细胞器，在肿瘤细胞较正常细胞明显增高。琥珀酸脱氢酶是肿瘤赖以生存的物质基础，其作用是维持肿瘤细胞及其血管的无限增生除能够清除瘤细胞中的抗癌物质或降低肿瘤细胞对抗癌物质的摄取从而降低许多化疗药物的抗肿瘤作用并导致交叉耐药性的产生外并可调节保护系统及功能系统的活性及表达。因此，以琥珀酸脱氢酶为主的细胞器显色剂不仅可以用作细胞结构的检测，而且可以用于细胞性质的鉴别。具有广泛的应用基础。
本发明还确定了许多药物，特别是抗有丝分裂药物均作用于琥珀酸脱氢酶。因此，这一发现为评价此类药物的治疗效果提供了一种新的方法及理论指导。
本发明应用一种细胞器显色剂检测细胞结构的方法可通过以下实施例进一步加以说明，但不限于此。
实施例1观察脑肿瘤细胞中心体。
将9L胶质肉瘤细胞培养24小时，然后加入四唑紫罗兰20微克/毫升，处理5-10小时，观察细胞中心体，如
图1(放大200倍)。图中可见瘤细胞中心体呈星状结构。
实施例2观察肺肿瘤细胞中心体。
将SHP77肺癌细胞培养24小时，然后加入四唑红70微克/毫升处理12小时，观察细胞中心体，如图2(放大200倍)。图中可见瘤细胞中心体呈星状结构。
实施例3观察脑肿瘤细胞微管结构。
将9L胶质肉瘤细胞培养24小时，然后加入MTT30微克/毫升处理4-8小时，观察细胞微管结构，如图3(放大400倍)。图中可见瘤细胞做管结构放射状伸展。
实施例4观察肺肿瘤细胞微管结构。
将SHP77肺癌细胞4000培养24小时，然后加入MTT50微克/毫升处理12小时，观察细胞做管结构，如图4(放大400倍)。图中可见瘤细胞微管结构放射状伸展。
实施例5观察脑肿瘤细胞溶酶体结构。
将9L胶质肉瘤细胞培养24小时，然后加入MTT30微克/毫升处理12-18小时，观察脑肿瘤细胞线粒体结构。如图5(放大200倍)。图中可见肿瘤细胞线粒体呈珍珠状包围细胞核。
实施例6观察脑肿瘤细胞核膜和/或内织网结构。
将9L胶质肉瘤细胞培养24小时，然后加入MTT30微克/毫升处理12-24小时，观察脑肿瘤细胞核膜和/或内织网结构。如图6(放大200倍)。图中可见肿瘤细胞、脑肿瘤细胞核膜和/或内织网结构环层状包围细胞核。
除上述应用外本发明应用细胞器显色剂检测细胞结构的方法还可应用于肿瘤细胞的诊断及鉴别诊断、细胞结构的动态观察。监测抗癌药物特别是抗细胞分裂药物的疗效，以及小分子物质的运转、细胞信息传递以及细胞周期等领域的研究。因此，本发明将对细胞生物学及肿瘤学的研究产生巨大的推动作用，具有非常广泛的应用前景及显著的经济和社会价值。
上述实施例旨在举例说明而非仅局限于应用细胞器显色剂检测细胞结构的方法。
权利要求
1．一种细胞结构的检测方法，包括应用一种可经琥珀酸脱氢酶还原成晶体的细胞器显色剂，具体步骤如下1)培养细胞；2)加入细胞器显色剂；和3)观察细胞结构。
2．根据权利要求1所述的细胞结构的检测方法，其特征在于，所述细胞器显色剂包括四唑及其复合物。
3．根据权利要求2所述细胞结构的检测方法，其特征在于，所述细胞器显色剂四唑及其复合物包括3-(4,5-二甲噻唑-2-基)-2,5-联苯四唑溴、噻唑兰、四唑兰，(1H)-四唑、四唑红、氯化2,3,5-三苯-2-H-四唑、氯化5-氰基-2,3-二联甲苯四唑、P-碘硝基四唑紫罗兰、硝基四唑紫罗兰、氯化碘硝基四唑、四唑紫罗兰，紫罗兰四唑、氯化2(P-碘苯)-P-硝基苯-5-苯四唑、氯化P-硝基兰四唑、氯化硝基兰单四唑、氯化硝基新四唑、氯化m-硝基兰四唑、氯化兰四唑、胡椒基四唑兰、甲苯基四唑红、氯化新四唑、氯化硝基兰四唑、四硝基兰四唑、硝基兰四唑、氯化2,2’-二[p-硝苯]-5,5’-二[p-硫代氨基甲酰苯]-3,3’[3,3’-二甲氧-4,4’-二亚苯]二四唑、四唑化联茴香胺、3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-5-(3-羧基甲氧苯基)-2-(4-磺苯基)-2H-四唑盐、4-[3-(碘苯基)-2-(4-硝基苯)-2H-5-四唑]-1,3-苯二磺酸盐、2,2-双(2-甲氧基-4-硝基-5-磺苯基)-2H-四唑-5-羧基酰基苯胺、1-[4,5-二甲基噻唑-2-基]-2,5-二苯四唑溴、四唑溴、3’-[1-[(苯基氨基)-碳酰]-3,4-四唑]-双(4-甲氧基-6-硝基)苯-磺基酸氢氧化钠、氯化茴香兰四唑、藜胡基四唑兰，以上细胞器晶体化物质可单选或多选。
4．根据权利要求1所述细胞结构的检测方法，其特征在于，所述细胞器显色剂包括所有亚细胞结构，如，内织网、细胞核、核膜、核板、核质、核孔复合体、核套、染色体、染色质、核心管、着丝粒、端粒、浆膜、高尔基体、中心粒、溶酶体、中心体、旁中心粒物质、收缩环、核糖体、核内体、吞噬体、蛋白酶体、过氧物酶体、纺锤体、微绒毛、鞭毛、纤毛、及其它微丝微管。
5．根据权利要求1所述细胞结构的检测方法，其特征在于，所述细胞器显色剂可从0.1微克/毫升～800微克/毫升，以5微克/毫升～500微克/毫升为佳，以20微克/毫升～200微克/毫升为最佳。
6．根据权利要求1所述细胞结构的检测方法，其特征在于，所述的细胞包括源于人及动物的正常及肿瘤细胞、炎症细胞，具有亚细胞结构的微生物细胞、各种杂交瘤细胞。
7．根据权利要求1所述细胞结构的检测方法，其特征在于，所述细胞器显色剂可制成各种剂型及药合，如针剂、浑悬液、软膏及固态如颗粒及粉末。
8．一种诊断恶性肿瘤的方法，包括使用权利要求1-7所述的细胞结构的检测方法。
全文摘要
本发明涉及一种用细胞器显色剂检测细胞结构的方法。该方法细胞器显色剂可经琥珀酸脱氢酶还原成晶体,从而使富合该酶的细胞器及微管系统晶体化,便于显微镜观察。本发明的方法能简便、快速、有效地检测细胞结构,具有很高的应用价值。
文档编号C12Q1/00GK1299876SQ0012931
公开日2001年6月20日 申请日期2000年11月13日 优先权日2000年11月13日
发明者孔庆忠 申请人:孔庆忠