专利名称：一种融合基因载体的构建表达及应用的制作方法
技术领域：
本发明属生物技术，涉及一种融合基因载体的构建表达及在制备肿瘤生物治疗药物中的应用。
背景技术：
白细胞介素18(IL-18)是1995年克隆的一种新型细胞因子，又称γ干扰素诱导因子。能刺激γ干扰素的分泌，增强ThI型免疫反应。诱生IL-18的早期研究主要集中于肝脏，后来有研究者用体外培养的巨噬细胞经适当诱导来获得IL-18cDNA。本研究从健康人外周血单核细胞的RNA中，直接经RT-PCR法扩增出IL-18基因，说明生理情况下，单核细胞就有IL-18 MRNA的表达。在功能上，IL-18更接近于IL-12，被认为是一种很有潜力的抗肿瘤，抗感染的细胞因子。近年的研究发现IL-18可以促进DC的成熟，显著提高DC的抗原递呈功能，并且能吸引II类DC和诱导ThI型免疫反应，国内陈吉泉等报道以mIL-18基因修饰和3LL Lewis肺癌细胞提取物致敏的DC治疗后，小鼠肺部转移癌有明显的抑制，肺转移结节减少，而且CTL、NK杀伤活性显著增强，但这种CTL效应只针对3LL Lewis肺癌细胞，而对其他肿瘤细胞株几乎无杀伤作用。
目前研究表明，绝大多数人类恶性肿瘤均存在高水平的端粒酶活性，端粒酶活性被认为是肿瘤细胞持续生长所必需的。而构成端粒酶复合物的成分--人端粒酶逆转录酶(hTERT)是端粒酶的催化亚单位，为端粒酶的限速因素，在端粒酶的激活和肿瘤的发生中起关键作用，也是抗细胞凋亡的主要因子。新近，Nair等在Natural Medicine上报道以小鼠为模型，将hTERT mRNA转染DC后产生抗肿瘤作用，肿瘤明显缩小，生存期延长。Zhen Su等在2002年CancerResearch上报道用人端粒酶逆转录酶(hTERT)编码的mRNA转染DC具有潜在的诱导CTL与抗肿瘤免疫作用。Vonderheide等也有类似研究，并且针对TERT表达的肿瘤细胞均有杀伤作用。
随着分子生物学、免疫学技术的不断发展，加上计算机技术的引入，将功能类似或功能互补的2种细胞因子，通过人工接头改造并构建出具有复合功能的细胞因子融合蛋白的研究取得令人瞩目的成就。自构建出IL-3/GM-CSF融合蛋白(该融合蛋白的生物学活性是两因子配合应用时的10～30倍，已经进入III期临床试验。)以来，蛋白相继产生。实验表明，这些融合蛋白不仅保留了融合前各因子的功能，而且可能产生更强更新的生物学效应。
本发明构建的PCDNA3.1(+)/hTERT-hIL18经限制性内切酶验证以及DNA测序和同源性对比分析该基因片段与NCBI基因库hIL-18和hTERT基因CDS序列同源性均达到99.9％，近期xia等的研究也证实IL-18与肿瘤抗原共同结合能明显增强DC的抗肿瘤作用，而不会有负向影响。本发明之所以将两者构建在同个载体上形成融合基因转染，是因为与两个单个基因分别转染比较，转染的效率高。单个基因的共转染，不能保证两个基因均转染入同个细胞，从而不能同时发挥TERT对DC的刺激作用和IL-18显著增强抗原递呈的作用。
发明内容
本发明的目的是提供人端粒酶逆转录酶(hTERT)/人白细胞介素18(hIL18)融合蛋白载体，SEQ ID NO1为该融合蛋白的基因序列。
本发明的第二个目的是提供人端粒酶逆转录酶(hTERT)/人白细胞介素18(hIL18)融合蛋白载体的构建，通过以下步骤实现1.PCR引物IL-18基因克隆的引物设计参照Genebank登录序列，采用计算机辅助设计，由上海博亚公司合成， 序列如下引物1CTGGCTAGCATGGCTGCTGAACCAGTAGAAG(Nhe I位点)。
引物2GGGAAGCTTGTCTTCGTTTTGAACCAGTGA(Hind III位点)。
2.PCDNA3.1(+)/hTERT-hIL18质粒的构建(1)标本的采取标本为正常人外周血10毫升，淋巴细胞分离液分离单个核细胞。
(2)RNA提取用Trizol试剂盒提取总RNA(步骤按其说明书进行)，检测A260/A280＞1.8。
(3)hIL18 cDNA的合成及基因扩增hIL18 cDNA的合成采用Promega公司的逆转录试剂盒。基因扩增采用PCR法，PCR产物经2％琼脂糖凝胶电泳检测有无目的基因。
(4)PCDNA3.1(+)/hTERT-hIL18质粒的构建将IL-18 PCR扩增、电泳、回收和纯化片段，通过T-A克隆，经DNA测序鉴定后亚克隆到PCDNA 3.1(+)/hTERT质粒中Nhe I和Hind III位点之间。在两个基因连接区插入直链氨基酸，连接后，以氯化钙沉淀法转化大肠杆菌DH5α，接种于含有氨苄抗性的琼脂平皿，挑选阳性菌落，接种于2毫升含有氨苄的LB液体培养基中过夜，抽提质粒。
3.PCDNA3.1(+)/hTERT-hIL18融合基因的鉴定(1)PCDNA 3.1(+)/hTERT+hIL-18的酶切鉴定提取的少量质粒分别经Nhe I、Not I双酶切；Nhe I、Hind III双酶切和EcoR I、Not I双酶切，酶切产物经1％琼脂糖凝胶电泳后，根据分子量的大小判断是否有hIL-18，hTERT及hTERT+hIL-18片段，(2)PCDNA 3.1(+)/hTERT+hIL-18的DNA序列分析阳性的hTERT+hIL-18融合基因克隆，DNA序列的分析委托上海博亚生物技术有限公司完成。
本发明的另一个目的是提供人端粒酶逆转录酶(hTERT)/人白细胞介素18(hIL18)融合蛋白载体的表达，通过一下步骤实现1.转染真核细胞将培养的3T3细胞按1×105/孔接种24孔板，培养24h至细胞达80％-85％，然后按试剂说明书步骤用lipofectamineTM2000分别包裹需要转染的质粒到Opti-MEM I培养基(Invitrogen公司)并混匀，逐滴加入已换无血清培养基的3T3细胞中，转染后6小时换上20％胎牛血清的DMEM。
2.免疫荧光染色转染48h后1孔细胞免疫荧光染色∶无水乙醇固定后加入1∶50的hTERT一抗，室温90m，PBS洗涤后加入荧光标记的1∶200的二抗(FITC)30m，PBS洗涤后在倒置荧光显微镜下观察。
3.Western-blot检测融合蛋白的表达收集5×106个细胞，用全细胞蛋白抽提试剂盒。40μg蛋白样品加上样缓冲液煮沸变性后，进行10％SDS-PAGE，并转移至PVDF膜，用5％的脱脂奶粉封闭1小时，分别加入抗人IL-18(1∶1000，Santa Cruz)、抗人TERT(1∶1000，Santa Cruz)，于4℃冰箱过夜，洗膜3次，加HRP标记的二抗(1∶2000，SantaCruz)，室温反应2小时，洗膜后作ECL化学发光，X片曝光显影。结果与MARKER(Novagen 71047-3)比较TERT/IL-18的分子量大小。
本发明的又一个目的是提供这种融合基因载体在制备肿瘤生物治疗药物中的应用。
发明的有益之处是1.利用基因工程技术，将功能类似或功能互补的2种细胞因子，通过人工接头改造并构建出具有复合功能的细胞因子融合蛋白。
2.IL-18与TERT融合蛋白表达，使其有可能既具有对肿瘤细胞杀伤靶向性强的特点，有能明显提高树突状细胞介导的免疫效应。
3.为制备理想的树突状细胞疫苗奠定了实验基础，进一步研究的疫苗用于消灭微小残留病，在恶性血液病患者达到异基因骨髓移植相当的疗效。预计每例病人费用比异基因骨髓移植减少20万元以上，可明显降低医疗费用。
4.本发明构建的融合基因经免疫荧光染色和Western bloting证实，能在真核细胞内高效表达融合蛋白。同时，该融合基因的IL-18能刺激KG-1细胞分泌γ干扰素，而TERT蛋白能发挥抗MTX诱导凋亡的能力，说明融合蛋白中的IL-18和TERT各自都能发挥生物学功能，而且互不干扰。
5.本发明融合蛋白的表达和生物学功能测定，为以后转染DC奠定实验基础，即既能增强树突状细胞介导的免疫反应，同时扩大树突状细胞介导的抗肿瘤范围，为发挥树突状细胞诱导的免疫反应，研制肿瘤的治疗性疫苗提供基础。
图1为IL-18 cDNA的RT-PCR产物的SDS-PAGE电泳图；图2为融合基因酶切后产物的SDS-PAGE电泳图；图3为融合基因载体PCDNA 3.1(+)/hTERT+hIL-18 CDNA的序列测定图；图4为转染hIL-18，hTERT和hTERT+hIL-18的DC诱导的CTL对K562和A549杀伤效应的比较；图5为3T3细胞表达hTERT/IL-18融合蛋白(绿色荧光)右侧为同一视野对照图；图6为3T3细胞表达hTERT/IL-18融合蛋白Western bloting检测图；图7为hTERT/IL-18融合蛋白刺激KG-1细胞分泌γ-干扰素图；图8为hTERT/IL-18融合蛋白转染细胞抗MTX诱导凋亡的能力图。
具体实施例方式
本发明结合附图和实施例作进一步的说明。
实施例一1.材料1.1.1菌株及质粒 大肠杆菌感受态细胞DH5α；真核表达质粒PCDNA3.1(+)/hTERT和PCDNA3.1(+)。
1.1.2试剂 限制性内切酶Hind III、Nhe I、EcoR I、Not I，T4DNA连接酶、Taq DNA聚合酶、dNTPs、逆转录试剂盒，质粒抽提试剂盒等均购自美国Promega公司；IL-18和TERT抗体和γ-干扰素ELISA试剂盒购自R&D公司，总RNA提取试剂盒为Invitrogene公司产品；凋亡检测试剂盒购自Bender公司；MTX购自Sigma公司；酵母提取物、胰蛋白胨等细菌培养试剂为英国Oxford产品；琼脂糖、RNA酶、胶回收试剂盒为Sangon公司产品；氯化钙、SDS、淋巴细胞分离液、醋酸钠为国产试剂。
1.1.3PCR引物 IL-18基因克隆的引物设计参照Genebank登录序列，采用计算机辅助设计，由上海博亚公司合成，序列如下引物1CTGGCTAGCATGGCTGCTGAACCAGTAGAAG(Nhe I位点)。
引物2GGGAAGCTTGTCTTCGTTTTGAACCAGTGA(Hind III位点)。
2.方法2.1人端粒酶逆转录酶(hTERT)/人白细胞介素18(hIL18)载体的构建2.1.1PCDNA3.1(+)/hTERT-hIL18质粒的构建(1)标本的采取 标本为正常人外周血10毫升，淋巴细胞分离液分离单个核细胞。
(2)RNA提取 用Trizol试剂盒提取总RNA(步骤按其说明书进行)，检测A260/A280＞1.8。
(3)hIL18 cDNA的合成及基因扩增hIL18 cDNA的合成采用Promega公司的逆转录试剂盒。基因扩增采用PCR法，PCR产物经2％琼脂糖凝胶电泳检测有无目的基因。
(4)PCDNA3.1(+)/hTERT-hIL18质粒的构建将IL-18 PCR扩增、电泳、回收和纯化片段，通过T-A克隆，经DNA测序鉴定后亚克隆到PCDNA 3.1(+)/hTERT质粒中Nhe I和Hind III位点之间。在两个基因连接区插入直链氨基酸，连接后，以氯化钙沉淀法转化大肠杆菌DH5α，接种于含有氨苄抗性的琼脂平皿，挑选阳性菌落，接种于2毫升含有氨苄的LB液体培养基中过夜，抽提质粒。
2.2PCDNA3.1(+)/hTERT-hIL18融合基因的鉴定2.2.1PCDNA 3.1(+)/hTERT+hIL-18的酶切鉴定提取的少量质粒分别经Nhe I、Not I双酶切；Nhe I、Hind III双酶切和EcoR I、Not I双酶切，酶切产物经1％琼脂糖凝胶电泳后，根据分子量的大小判断是否有hIL-18，hTERT及hTERT+hIL-18片段，2.2.2PCDNA 3.1(+)/hTERT+hIL-18的DNA序列分析阳性的hTERT+hIL-18融合基因克隆，DNA序列的分析委托上海博亚生物技术有限公司完成。
2.2.3人端粒酶逆转录酶(hTERT)/人白细胞介素18(hIL18)载体的表达(1)转染真核细胞将培养的3T3细胞按1×105/孔接种24孔板，培养24h至细胞达80％-85％，然后按试剂说明书步骤用lipofectamineTM2000分别包裹需要转染的质粒到Opti-MEM I培养基(Invitrogen公司)并混匀，逐滴加入已换无血清培养基的3T3细胞中，转染后6小时换上20％胎牛血清的DMEM。
(2)免疫荧光染色转染48h后1孔细胞免疫荧光染色∶无水乙醇固定后加入1∶50的hTERT一抗，室温90m，PBS洗涤后加入荧光标记的1∶200的二抗(FITC)30m，PBS洗涤后在倒置荧光显微镜下观察。
(3)Western-b1ot检测融合蛋白的表达收集5×106个细胞，用全细胞蛋白抽提试剂盒。40μg蛋白样品加上样缓冲液煮沸变性后，进行10％SDS-PAGE，并转移至PVDF膜，用5％的脱脂奶粉封闭1小时，分别加入抗人IL-18(1∶1000，Santa Cruz)、抗人TERT(1∶1000，Santa Cruz)，于4℃冰箱过夜，洗膜3次，加HRP标记的二抗(1∶2000，SantaCruz)，室温反应2小时，洗膜后作ECL化学发光，X片曝光显影。结果与MARKER(Novagen 71047-3)比较TERT/IL-18的分子量大小。
实施例二 人端粒酶逆转录酶(hTERT)/人白细胞介素18(hIL18)融合基因的生物学功能检测1.融合基因刺激KG-1细胞分泌γ-干扰素的生物学功能检测细胞培养上清液γ-干扰素含量的检测取出转染融合基因的3T3细胞培养上清液0.1ml，从1×106/ml的KG-1细胞中取0.1ml至96孔板，分别以原液，1∶2稀释，1∶5稀释，1∶10稀释，1∶20稀释，正常3T3细胞培养上清液(阴性对照)，以及标准IL-18刺激液(阳性对照)和空白对照(PBS)。每个浓度设3个复孔。采用定量酶联免疫技术(ELISA法)，按试剂盒说明书操作步骤进行。在酶标仪490nm波长处测吸光度(A值)。根据CurveExpert软件分析计算。
2.融合基因抗凋亡的功能检测用已知的凋亡诱导剂甲氨蝶聆(MTX)，分别以不同浓度0nm，1nm，10nm，50nm，100nm作用于转染的5×105/ml 3T3细胞和正常的3T3细胞24小时。参照Annexin V细胞凋亡检测试剂盒说明书操作。收集细胞，冷PBS洗涤2次，1000rpm/min离心，4℃7min，弃上清。将细胞重悬于1ml 1×Bindingbuffer，取100μl细胞置于流式细胞仪专用试管中，加5μl Aannexin V FITC和5μlPI，轻轻混匀，避光室温反应15min，加入300μl 1×Binding buffer，立即用流式细胞仪检测，Cellquest 1.2分析软件分析结果。
实施例三1.融合基因电转染树突状细胞(1)取2×106个细胞，用无血清无抗生素的培养基洗涤2次后，混悬于400微升的hypo-osmolarbuffer(Eppendorf公司产品)电转缓冲液。
(2)取10微克无菌无热源的融合基因质粒加于上述细胞悬液中，轻柔混匀后，转移至400微升的电转杯中(Electroporation cuvette)2mm间距，400ul容积。
(3)将电转杯置于电转仪(Multiporator Eppendorf)中，300V/20us电流冲击2次，期间间隔1分钟。
(4)吸出电转后的细胞，用10ml含血清的培养基洗涤细胞2次(800rpm×5min)；并培养于15％FCS的RPMI1640培养基中。
2.细胞毒性T淋巴细胞(CTL)的体外诱导及杀伤活性的检测分离正常人外周血的T淋巴细胞，与融合基因转染后的DC在含IL-250U/ml 15％FCS的RPMI1640完全培养基中共同孵育5天，比例为T∶DC为30∶1，第5天收集活细胞作为效应细胞，51Cr标记1h的hTERT高表达的K562细胞作为靶细胞，以100∶1、50∶1、25∶1不同的效靶比，用51Cr 4h释放法检测CTL的活性，同时设最大释放组和自然释放组，同时以取自正常人的滑膜细胞作为对照细胞(无hTERT表达)。以下式计算杀伤率∶杀伤率＝(实验组cpm-自然释放组cpm)/(最大释放组cpm-自然释放组cpm)×100％。
结果1.重组IL-18cDNA RT-PCR产物的初步鉴定根据所设计的引物，预计扩增片段的大小为510BP左右，2％琼脂凝胶电泳显示的条带基本符合预期的DNA片段，参见图1，其中1 IL-18 cDNA(510bp)；2阴性对照。说明扩增产物为IL-18 CDNA片段。说明扩增产物为IL-18 CDNA片段。
2.质粒PCDNA3.1(+)/hTERT+hIL-18的酶切鉴定将挑选出的阳性克隆扩增后取菌液初步抽提质粒，分别经Nhe I/Not I、Nhe I/Hind III和EcoR I/Not I三对内切酶酶切后，1％琼脂凝胶电泳显示三条分子量大小不同的条带，参见图2，图中1PCDNA3.1(+)/hTERT+IL-18经Nhe I/Hind III酶切，2PCDNA3.1(+)/hTERT+IL-18经EcoR I/NotI酶切，3PCDNA3.1(+)/hTERT+IL-18经Nhe I/Not I酶切，4PCDNA3.1(+)(5428bp)。Nhe I/Hind III双酶切，见到分子量510bp大小的条带(hIL-18)，证实插入的片段与PCR扩增产物的大小一致，所筛选的克隆含IL-18cDNA片段。EcoR I/Not I双酶切后，见到分子量3.4Kb大小的条带(hTERT)，Nhe I/Not I双酶切后，可以见到分子量约3.9Kb左右的条带(hTERT+hIL-18)，证实了PCDNA3.1(+)/hTERT+IL-18的融合基因。
3.PCDNA3.1(+)/hTERT+IL-18 CDNA的序列测定将质粒PCDNA3.1(+)/hTERT+IL-18DNA测序(参见图3)和同源性对比分析该基因片段与http://ncbi.nlm.nih.gov的基因数据库(AllGenBank+EMBL+DDBJ+PDB sequences(but no EST，STS，GSS，or phase 0，1 or2 HTGS sequences)比较融合基因的前面部分与hIL-18基因的符合率为570/574(99％)，融合基因的前面部分与hTERT基因的符合率为395/406(97％)，而与hTERT启动子基因的符合率为221/222(99％)。结果表明，所构建的cDNA片段即为人TERT和IL-18融合的编码基因。图3中融合基因载体PCDNA 3.1(+)/hTERT+hIL-18连接部分的DNA序列AAGCTTIL-18 Hind III的酶切点；GAATTC TERT EcoR I的酶切点。
实施例四 疫苗诱导的CTL细胞对白血病和肺癌细胞的杀伤1.对表达hTERT的白血病和肺癌细胞株的杀伤分别以融合基因(hTERT+hIL-18)以及hTERT，hIL-18转染后的DC，刺激诱导形成CTL细胞，作为效应细胞，51Cr标记1h的hTERT高表达的白血病细胞K562和肺癌细胞A549细胞株作为靶细胞，以上述不同的效靶比，检测CTL的活性，按照上述计算公式。
2.体外实验表明，融合基因转染的DC，诱导刺激形成的CTL细胞对高表达hTERT的白血病细胞和肺癌细胞均有较强的杀伤作用。25∶1、50∶1、100∶1不同的效靶比下，转染融合基因(hTERT+hIL-18)的DC激的CTL细胞对K562的杀伤率分别为(18.1％；32.7％；47.6％)，对A549的杀伤率为(16.2％；29.8％；45.3％)。转染hTERT的DC刺激的CTL细胞对K562的杀伤率分别为(17.3％；28.6％；40.9％)，对A549的杀伤率分别为(14.4％；23.5％；40.1％)转染hIL-18的DC刺激的CTL细胞对K562的杀伤率分别为(12.8％；18.8％；26.7％)，对A549的杀伤率分别为(12.2％；18.7％；25.9％)，参见图4，在同样实验条件下，对hTERT无表达的正常滑膜细胞无杀伤作用(杀伤率分别为9.7％；15.6％；18.4％)。由此可见，转染融合基因的DC刺激诱导的CTL对高表达hTERT的白血病和肺癌细胞都有杀伤作用，虽然hTERT与hTERT+hIL-18转染的DC诱导的CTL效应没有明显差异(p＞0.05)，但是其杀伤效应还是有提高的。而仅转染hIL-18的DC诱导的CTL效应，由于没有肿瘤抗原的刺激，其CTL效应是比较低的(p＜0.05)。所以，体外实验验证了我们的设想，这样也为制备理想的树突状细胞疫苗奠定了实验基础。图4A为K562的CTL杀伤效应，图4B为A549的CTL杀伤效应。
实施例五 融合蛋白的表达鉴定1.表达产物的免疫荧光鉴定48h后免疫荧光染色显示融合蛋白弥散表达于胞浆，参见图5，为3T3细胞表达hTERT/IL-18融合蛋白(绿色荧光)右侧为同一视野对照。
2.表达产物的Western bloting鉴定收集转染后的细胞提取全蛋白，分别加入抗人IL-18(参见图6)、抗人TERT抗体(图未显示)，目的基因表达产物可以分别与hTERT抗体及hIL-18抗体特异性结合。X片曝光显影后可见到融合蛋白分子量约127KD左右，与预期一致。证实了hTERT/hIL-18融合基因在3T3细胞内成功表达。图6为3T3细胞表达hTERT/IL-18融合蛋白Western bloting检测。
实施例六 hTERT/IL-18融合蛋白的生物学功能检测1.融合蛋白能明显刺激KG-1细胞分泌γ-干扰素。正常3T3细胞上清与空白对照组刺激KG-1细胞分泌γ-干扰素的能力明显较弱，与原液组有明显统计学差异(p＜0.05)。原液刺激KG-1细胞分泌γ-干扰素的能力与标准品相似(p＞0.05)。随着上清的稀释倍数增加，刺激KG-1细胞分泌γ-干扰素的能力逐步下降(见图7)。
2.融合蛋白抗MTX诱导凋亡的生物学功能检测Annexin VFITC及PIPE双标记细胞后流式细胞仪检测结果显示，MTX 0-100nm作用24h，正常3T3细胞凋亡(AnnexinVFITC阳性LR+UR象限)百分数分别为0.71％；2.46％；4.19％；6.68％；10.81％，转染融合基因的细胞组分别为0.82％；1.90％；2.13％；2.72％；2.94％(图8)；从以上数据可知，随着药物浓度上升，正常细胞组细胞凋亡数增加；而转染融合基因的细胞组凋亡不明显(在10nm浓度以上正常组与转染组之间有统计学差异)。
3.用途初步的实验表明，体外诱导的CTL细胞对高表达hTERT的细胞有较强的杀伤作用，而对hTERT无表达的正常滑膜细胞无杀伤作用，验证了本实验的设想，为制备理想的树突状细胞疫苗奠定了实验基础。
无需进一步详细阐述，相信采用前面所公开的内容，本领域技术人员可最大限度地应用本发明。因此，前面的实施方案应理解为仅是举例说明，而非以任何方式限制本发明的范围。
本发明涉及的序列<110>浙江大学<120>一种融合基因载体的构建表达及用途<160>3<170>PatentIn Version 2.1<210>1<211>1033<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>CDS<222>(1)…(583)(619)…(624)(629)…(1033)<223>n＝a或g或c或t<400>1ATGgGCTGAC CAGTAGAAGA CAATTGCATC AACTTTGTGG CAATGAAATT TATTGACAAT60aCGTTtTact TTATAGCTGA AGATGATGAA AACCTGGAAT CaGATTActT TGGCAAGCTT120GAATCTAAAT TATCAGTCAT AAGAAATTTG AATGACCAAG TTCTCTTCAT TGACCAAGGA180AATCGGCCTC TATTTGAAGA TATGACTGAT TCTGACTGTA GAGATAATGC ACCCCGGACC240ATATTTATTA TAAGTATGTA TAAAGATAGC CAGCCTAGAG GTATGGCTGT AACTATCTCT300GTGAAGTGTG AGAAAATTTC AACTCTCTCC TGTGAGAACA AAATTATTTC CTTTAAGGAA360ATGAATCCTC CTGATAACAT CAAGGATACA AAAAGTGACA TCATATTCTT TCAGAGAAGT420GTCCCAGGAC ATGATAATAG GATGCAATTT GAATCTTCAT CATACGAAGG ATACTTTCTA480GCTTGTGAAA AAGAGAGAGA CCTTTTTAAA CTCATTTTGA AAAAAGAGGA TGAATTGGGG540GATAGATCTA TAATGTTCAC TGGTTCAAAA CGAAGACAAG CTTGGTACCG AGCTCGGATC600CACTAGTCCA GTGTGGTGGA ATTCCACCAT GCCGCGCGCT CCCCGCTGCC GAGCCGTGCG660
CTCCCTGCTG CGCAGCCACT ACCGCGAGGT GCTGCCGCTG GCCACGTTCG TGCGGCGCCT 720GGGGCCCCAG GGCTGGCGGC TGGTGCAGCG CGGGGACCCG GCGGCTTTCC GCGCGCTGGT 780GGCCCAGTGC CTGGTGTGCG TGCCCTGgGA CGCACGGCCG CCCCCCGCCG CCCCTCCTTC 840CGCCAGGTGT CCTGCCTGAA GGAGCTGGTG GCCCGAGTGC TGCAGAGGCT GTGCGAGCGC 900GGCGCGARAC GTGCTGGCCT TCGGCTTCSC GCTGCTGGAC GGGGCCGCGG GGCCCCCCGA 960GGTCTTCACC ACAGCGTGCG CAGCTACCTG CCCAACACGG TGACCGACGC ACTGSCGGGG 1020GAGCGGGCGT GGG 1033<210>2<211>31<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>CDS<222>(4)…(9)<223>n＝a或g或c或t<400>1CTGGCTAGCATGGCTGCTGAACCAGTAGAAG 31<210>3<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>CDS<222>(4)…(9)<223>n＝a或g或c或t<400>1GGGAAGCTTGTCTTCGTTTTGAACCAGTGA30
权利要求
1.一种人端粒酶逆转录酶/人白细胞介素18融合蛋白载体，SEQ ID NO1为该融合蛋白的基因序列。
2.根据权利要求1所述的人端粒酶逆转录酶/人白细胞介素18融合蛋白载体的构建，其特征是通过以下步骤实现PCDNA3.1(+)/hTERT-hIL18质粒的构建标本为正常人外周血10毫升，淋巴细胞分离液分离单个核细胞，用Trizol试剂盒提取总RNA，检测A260/A280＞1.8，hIL18 cDNA的合成采用Promega公司的逆转录试剂盒，基因扩增采用PCR法，PCR产物经2％琼脂糖凝胶电泳检测有无目的基因，将IL-18PCR扩增、电泳、回收和纯化片段，通过T-A克隆，经DNA测序鉴定后亚克隆到PCDNA 3.1(+)/hTERT质粒中Nhe I和Hind III位点之间，在两个基因连接区插入直链氨基酸，连接后，以氯化钙沉淀法转化大肠杆菌DH5α，接种于含有氨苄抗性的琼脂平皿，挑选阳性菌落，接种于2毫升含有氨苄的LB液体培养基中过夜，抽提质粒。
3.根据权利要求2所述的人端粒酶逆转录酶/人白细胞介素18融合蛋白载体的构建，其特征是PCR引物1CTGGCTAGCATGGCTGCTGAACCAGTAGAAG，Nhe I位点，引物2GGGAAGCTTGTCTTCGTTTTGAACCAGTGA，Hind III位点。
4.根据权利要求2所述的人端粒酶逆转录酶/人白细胞介素18融合蛋白载体的表达，其特征是通过以下步骤实现(1)转染真核细胞将培养的3T3细胞按1×105/孔接种24孔板，培养24h至细胞达80％-85％，然后按试剂说明书步骤用lipofectamineTM2000分别包裹需要转染的质粒到Opti-MEM I培养基并混匀，逐滴加入已换无血清培养基的3T3细胞中，转染后6小时换上20％胎牛血清的DMEM；(2)免疫荧光染色转染48h后1孔细胞免疫荧光染色无水乙醇固定后加入1∶50的hTERT一抗，室温90m，PBS洗涤后加入荧光标记的1∶200的二抗FITC 30m，PBS洗涤后在倒置荧光显微镜下观察；(3)Western-blot检测融合蛋白的表达收集5×106个细胞，用全细胞蛋白抽提试剂盒，40μg蛋白样品加上样缓冲液煮沸变性后，进行10％SDS-PAGE，并转移至PVDF膜，用5％的脱脂奶粉封闭1小时，分别加入1∶1000，Santa Cruz的抗人IL-18和1∶1000，Santa Cruz的抗人TERT，于4℃冰箱过夜，洗膜3次，加HRP标记的1∶2000，Santa Cruz的二抗，室温反应2小时，洗膜后作ECL化学发光，X片曝光显影，结果与MARKER比较TERT/IL-18的分子量大小。
5.根据权利要求1所述的人端粒酶逆转录酶/人白细胞介素18融合蛋白载体在制备肿瘤生物治疗药物中的应用。
全文摘要
本发明利用基因工程技术，将功能类似或功能互补的2种细胞因子，通过人工接头改造并构建出具有复合功能的细胞因子融合蛋白人端粒酶逆转录酶(hTERT)/人白细胞介素18(hIL18)融合蛋白。并建立人端粒酶逆转录酶(hTERT)/人白细胞介素18(hIL18)融合蛋白载体的表达，使其有可能既具有对肿瘤细胞杀伤靶向性强的特点，又能明显提高树突状细胞介导的免疫效应，扩大其抗肿瘤范围，为制备理想的树突状细胞疫苗奠定了实验基础，研究表明在恶性血液病患者达到异基因骨髓移植相当的疗效，可明显降低医疗费用，为研制肿瘤的治疗性疫苗提供基础。
文档编号C12N15/79GK1995356SQ20061015520
公开日2007年7月11日 申请日期2006年12月14日 优先权日2006年12月14日
发明者童向民, 金洁, 姚航平 申请人:浙江大学