新的神经毒性的分子靶的制作方法

专利名称：新的神经毒性的分子靶的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物学，遗传学和医学领域。本发明具体涉及检测，鉴定和/或治疗(或者控制)神经退行性疾病，尤其是肌萎缩侧索硬化症的新方法。本发明同时涉及鉴定或者筛选对这些疾病有活性的化合物的方法。本发明进一步涉及用于实施上述方法的化合物，基因，细胞，质粒或者组合物。本发明主要来自于鉴定磷酸二酯酶4B在这些疾病中的作用并且描述了磷酸二酯酶4B作为这些病症中的靶或者治疗、诊断或者试验标记的应用。
很多神经退行性疾病被描述为具有与兴奋毒性现象相关的组分或者阶段。这种情形诸如阿默氏症，帕金森症，多发性硬化和亨汀顿舞蹈症。
肌萎缩侧索硬化症(或者称作ALS)是伴随着不同类型的诸如路易士小体的包含体，并且特征在于脊髓和皮层运动神经元的细胞程序性死亡的神经退行性疾病，所述皮层运动神经元的死亡有时相关于额叶性痴呆症。没有突变记述的散发形式和与编码超氧化物歧化酶的SOD1基因的突变相关的家族性形式(FALS)共存。大多数病例是散发的，家族性形式(FALS)非常少见。很可能是长时间的无症状时期存在于临床症状出现之前，这些临床症状多变并难以分类。未来在治疗上的发展将使得用基于疾病分子原因的治疗策略代替症状性治疗成为可能。在细胞水平，这些症状相关于皮层运动神经元和脊髓运动神经元的死亡。这种神经元的死亡已经与不同的现象联系起来，这些现象是多种神经退行性疾病的基础。诸如与谷氨酸，氧化应激，针对神经元标记(在ALS情况下的钙通道)的自身免疫，以及细胞骨架异常联系起来的兴奋毒性的情况。虽然这些现象是已知的，但是包括ALS的这些疾病的一个或者多个病因仍然不清楚。即使FALS相关于编码超氧化物歧化酶的SOD1基因的突变，但是神经元开始进行细胞死亡的机制还是未知的，所述细胞死亡中至少一种是细胞程序性死亡。
阐述参与涉及细胞死亡的不同现象的分子事件将许可开发新的治疗策略。利用人活体组织检查样本很难进行这些事件的研究。这些活体组织检查样本显然来自于死后样品，这些样本的质量很难控制并且仅仅反应疾病的最后阶段出现的病理状态。
动物模型提供的生物样品使得不同发病阶段的分析和与健康对照的比较成为可能。就这一点来讲，如果使用许可获自西北大学(Northwestern University)，表达携带在FALS中普遍流行的一种突变(突变G93A)的人SOD1基因的转基因小鼠可获自Jackson实验室。这个模型在120天内重现具有类似于人类疾病的那些症状的疾病的致死结果。相关于SOD1基因的突变G93A的ALS症状的出现并非产生于超氧化物歧化酶活性的降低而是由于酶产生自由基能力的增强引起的。尽管拥有了这方面的认识，控制ALS不同阶段的分子事件依然知之甚少。这些分子事件的复杂性反应了疾病的进展在所研究的转基因模型中，在30天没有观察到神经元的异常或者临床表现。60天是症状出现不久之前的一个阶段，但是大脑已经具有细胞生理改变的特征，诸如线粒体代谢的改变，与兴奋毒性现象相关的应激和神经元死亡。在90天，50％的皮层和脊髓运动神经元死亡并且伴随着星形胶质细胞的激活开始了神经元细胞程序性死亡的活动过程。在这个阶段不再观察到兴奋毒性的现象。神经元死亡与半胱氨酸-天冬氨酸蛋白酶(caspase)的激活相关，所述半胱氨酸-天冬氨酸蛋白酶的激活似乎没有参与疾病的早期阶段。
阐明特异于疾病不同阶段的不同分子事件应允许鉴定新的治疗靶以及新的治疗标记。进行这种鉴定的一种最有效的方法在于鉴定基因和蛋白，所述蛋白的表达表征了病理生理状态。
本发明描述了鉴定参与兴奋毒性现象和神经元死亡的遗传事件。因此，本发明给相关于这些现象的疾病提供了新的治疗和诊断方法以及鉴定活性化合物的新的靶子。
更具体而言，对于提取自大脑和脊髓样品的RNA已经进行了定性差异分析，没有预先提取神经元目的是考虑与疾病发展相关的最大程度的选择性剪接事件。根据DATAS的方法(描述于申请WO99/46403中)通过定性差异筛选进行分析，所述方法具有无与伦比的优点。
本专利申请特别来自于申请人在60天龄ALS模型动物的大脑中选择性剪接的所有组成成分的构建物。这种含有多于200个不同序列的所有组成成分包括兴奋毒性现象中的主要参与成分，诸如钾通道和NMDA受体。来自编码参与应激反应的蛋白，包括热激蛋白的RNA的序列也是所有组成成分的组成部分，强调了后面的应激在ALS早期阶段的作用。改变的能量代谢明显表现出影响发生该种疾病的动物的皮层运动神经元。例如，线粒体肌酸激酶的内含子6特异性分离自60天龄的动物在病理状态下表达的信使RNA。通过保持这个内含子中断编码序列产生编码失活形式的酶的信使RNA。这个观察结果与下列生化发现一致线粒体肌酸激酶活性的减少与这种酶的量在相同转基因模型动物的神经元中的减少相关。
构成所有组成成分的序列特异性通过下列事实得以证实在90天龄的动物中，对基因表达进行相同定性差异分析导致不同的所有组成成分，在所有组成成分中，尤其是缺乏兴奋毒性的不同标记。剪接修饰的分析证实疾病的阶段不同，分子事件相异。
以特别有趣和意想不到的方式，对来自60天龄的转基因动物和对照动物的RNA进行DATAS分析引起从来自磷酸二酯酶4B的mRNA分离cDNA片段。这种片段相应于特异性存在于对照动物中的外显子片段，并因此在60天阶段的SOD1G93A转基因动物体内特异性缺失。这种片段跨越从小鼠PDE48终止子编号的核苷酸377到486(SEQ IDNO1)(序列也可获自GenBank，登录号AF208023)。这个序列包括2912个碱基，缺失的片段相应于碱基2760到2869。这是一个非编码区并且在对照动物和转基因动物中差异表达，原因在于选择性使用非编码3’外显子或者是使用两种选择性聚腺苷酸化位点。这种差异表达已经通过示于图1A和1B中的RT-PCR试验加以阐明。
因此，本申请阐述了磷酸二酯酶4B参与了兴奋毒性过程的发展以及神经元的死亡。获得的结果表明PDE4B在病理性神经组织中高水平表达，所述表达与相应的RNA的结构修饰有关，尤其是与在3’非编码部分区域的缺失有关。这个结果与通过DATAS在序列中鉴定到的mRNA不稳定序列完全一致。通过剪接或者通过使用选择性聚腺苷酸化序列，它们在PDE4B mRNA中的缺失能够引起稳定化，从而提高这个RNA编码部分的表达。这个事件特异性发生在病理受试者而非对照受试者的大脑中。
因此本发明描述了引起PDE4B mRNA在病理受试者大脑中表达提高的最初分子事件，并且所述原始分子事件随着时间的推移相关于兴奋毒性现象和/或神经元的死亡。此外，本发明首次表明PDE4B表达的提高相关于ALS的早期阶段。因此PDE4B是这些疾病的治疗发展中的一个新的和重要的治疗靶，尤其是用于这些疾病发展的早期阶段，并且提出了疾病的真正分子基础而非并发症或者炎性组分。本发明也提供了诊断，筛选，检测，确定这些疾病的趋势或者监控这些疾病的进展或者治疗效果的新方法。
检测，诊断和筛选因此，本发明的一个目的就是提供检测受试者兴奋毒性状态或者神经元应激的方法，所述方法包括测定来自受试者的样品中磷酸二酯酶4，尤其是磷酸二酯酶4B的体外表达。本方法优选包括测定PDE4B基因的3’非编码区和基因的其它区，尤其是编码区的差异表达。
因此本发明的进一步的目的就是提供检测受试者兴奋毒性状态或者神经元应激的方法，包括检测来自受试者样品中的磷酸二酯酶4，尤其是磷酸二酯酶4B的突变RNA的存在，尤其是全部或者部分3’非编码区缺失的形式。
本发明的另一个目的是将包括所有或者部分来自PDE4B基因或者信使RNA的序列的核酸用于实施诊断或者检测神经元应激的状态以及更具体是兴奋毒性状态的方法。
本发明总体上基于使用互补于所有或者部分PDE4B基因或者信使的核酸用于检测相关于兴奋毒性，应激，神经元死亡等的病理事件。更一般而言，本发明提供了诊断，筛选，鉴定或者监控退行性疾病的方法，包括阐明在PDE4基因中或者在相应的RNA中，典型的在PDE4B中的改变。
PDE4的表达，或者差异表达，或者改变形式的存在可以通过传统分子生物学的方法，诸如，例如测序，杂交，扩增，RT-PCR，凝胶迁移等进行确定。本发明可以应用于诊断或者检测不同的病理现象，包括兴奋毒性现象，诸如，阿默氏症，帕金森氏症，多发性硬化，ALS，亨汀顿舞蹈症或者脑局部缺血。可以用于早期检测，以阐明倾向性，指导治疗的选择和适应性，监控疾病的进展等等。尤其适于检测早期阶段的多发性硬化或者ALS。
为了实施根据本发明的诊断或者检测的遗传方法，更优选使用能够阐明PDE4B mRNA的缺失形式，尤其是所有或者部分3’非编码区缺失形式的核酸。特定的例子为使用互补于位于序列SEQ ID NO1的残基2760到2869之间的所有或者部分区域的核酸，或者相应的人PDE4B基因或者mRNA序列的残基。编码人PDE4B的cDNA序列和相应的蛋白显示在序列SEQ ID NO3和4(也可参见Genbank，登录号NM 002600)中。人PDE4B基因或者RNA的3’非编码区对应于SEQID NO3的残基2461到4068。
以有利的方式，使用的核酸(作为探针)包括所有或者部分编码位于序列SEQ ID NO1的核苷酸2384到2869之间或者序列SEQ IDNO3的核苷酸2461和4068之间的PDE4B基因或者RNA的3’非编码区的序列或者其互补序列。
根据具体的实施方案，本发明使用互补于位于下列的一种序列中的区域的核酸-SEQ ID NO1的残基2384到2869-SEQ ID NO1的残基2500到2869-SEQ ID NO1的残基2760到2869-SEQ ID NO1的残基2780到2850-SEQ ID NO1的残基2790到2810-SEQ ID NO3的残基2600到4040-SEQ ID NO3的残基3000到4040-SEQ ID NO3的残基3500到4040-SEQ ID NO3的残基3900到4040在另一个具体的实施方案中，使用互补于缺失了所有或者部分3’非编码部分产生的PDE4 RNA区域序列的核酸。区域的缺失实际上在序列中建立了新的连接，所述序列特异于缺失形式并且可被用于阐明这种形式在样品中的存在。
优选的，探针和靶序列之间的互补程度是完全的从而确保更加特异性的杂交。但是，应该明白也可以允许一些错配。用于实施上述方法的核酸可以是DNA或者RNA，优选为合成的DNA。优选包括10到500个碱基，通常10到100个碱基。应该理解如果需要，可以使用更长的核酸，虽然这不是优选的。核酸优选为单链DNA，从10到500个碱基，至少互补于PDE4B的3’非编码序列的区域。核酸可通过，例如放射性，酶，发光，荧光，化学方法等进行标记。
用于检测PDE4基因中存在改变的另一方法使用可以选择性扩增部分PDE4 RNA的引物或者核酸引物对，优选含有3’非编码区的部分。通常使用允许选择性扩增PDE4 RNA改变形式的引物，尤其是通过缺失部分RNA 3’区建立的特异性连接的引物。
在这个方面，本发明的一个目的就是基于互补于PDE4B 3’非编码区部分的引物，并且允许扩增这个区的一部分。引物优选包括8到20个碱基。引物优选由位于SEQ ID NO1的核苷酸2384到2869之间或者序列SEQ ID NO3的核苷酸2461和4068之间序列的8到20个连续残基的片段或者其互补序列组成。本发明的另一个目的就是提供允许对至少部分PDE4 3’非编码区进行特异性扩增的引物对，所述引物对包括至少一个如上所述的引物。
为了实施本发明的方法，将来自受试者的含有核酸的生物样品与诸如上述的核酸(探针，引物等等)体外接触，并且检测杂交体或者扩增产物的形成。生物样品可以是血液，体液，细胞，组织等样品。核酸可以固定在玻璃，二氧化硅，尼龙等载体上。
检测，筛选或者诊断的过程可以通过使用来自受试者的不同类型的样品，诸如，例如活体检查组织，尤其是神经组织进行。以尤其令人惊讶和有利的方式，本发明进一步显示与兴奋毒性现象相关的PDE4表达的去调节可直接在肌肉组织中加以阐明。这种情况在神经退行性疾病诸如ALS的病例中尤其显著。
在ALS的发展期间，退行性现象通过缺陷性神经支配不仅发生在大脑中也发生在脊髓中并且随之发生在肌肉中。图2描述了来自对照小鼠和转基因小鼠的肌肉中PDE4B mRNA表达的修饰，通过利用与来自同样这些动物大脑的RNA进行试验的相同的PCR引物进行检测。以类似的但是稍逊的方式，在症状出现之前阶段的末期，即90天龄时，动物的肌肉中特异性观察到PDE4B的3’非编码区而非这种mRNA的其它区域(尤其是编码区)表达的降低。
研究和治疗ALS过程中遇到的一个困难就是建立早期诊断。观察到PDE4B mRNA在ALS肌肉中去调节使得有可能从病人的活体检查组织肌肉中建立早期诊断。这种诊断基于检测PDE4B的3’非编码区和其它的序列，尤其是编码部分之间的差异表达。
用于检测受试者神经元应激，显著的兴奋毒性，尤其是相关于神经退行性疾病的状态的特异性方法包括测定来自所述受试者肌肉细胞样品中PDE4B基因的表达，或者PDE4B信使缺失形式的存在。
为了测定差异表达，人们使用例如相应于(换言之，特异于)部分3’非编码区的探针以及相应于部分PDE4B编码区的探针。用这些探针分别检测的信号可以评估差异表达。另一方法使用允许一方面扩增部分3’非编码区而另一方面扩增部分编码区的两对引物。
另一个目的是提供分析PDE4表达的试剂盒，尤其是3’非编码区和编码区之间差异表达的试剂盒，所述试剂盒包括特异于3’非编码区部分序列的核苷酸探针和特异于编码区部分序列的核苷酸探针。
本发明的另一个目的是提供用于分析PDE4表达的试剂盒，尤其是3’非编码区和编码区之间差异表达的试剂盒，所述试剂盒包括一对允许特异性扩增至少部分的PDE4的3’非编码区的核苷酸引物以及一对允许特异性扩增至少部分的PDE4编码区的核苷酸引物。
治疗磷酸二酯酶水解诸如cAMP和cGMP的环核酸，调节不同信号级联。PDE4B水解cAMP，从而调节细胞内这种第二信使的浓度。cAMP在细胞存活和细胞程序性死亡平衡中的作用已被广泛描述于文献中。具体而言，cAMP级联在包括例如Akt和P13K激酶的细胞存活级联中以及在调节转录因子CREB的活性中具有综合作用。值得提及的是这种转录因子参与神经元存活和神经突出的生长。但是，PDE以及，优选PDE4抑制剂的使用从未被设想用于提高神经元的存活并且尤其是用于保护神经元抗兴奋毒性。已经有人提出用于抑制炎性现象的PDE4抑制剂，可能在诸如阿默氏症的神经退行性疾病中是有用的。这种认识是基于减少在神经退行性活动期间大脑中观察到的炎症的目的，并且完全不是基于直接抑制神经元死亡的基本目的。
本发明阐述了相关于神经元兴奋毒性的进展的剪接事件和影响PDE4B基因的选择性聚腺苷酸化位点的存在，并且提供了证实使用PDE4抑制剂治疗ALS更通常用于提高兴奋毒性现象期间神经元存活性，尤其是从这些疾病的早期阶段开始的分子基础。
因此本发明的另一个目的就是基于使用能够抑制或者降低PDE4B表达或者活性的化合物，目的在于制备设计用来治疗神经退行性疾病，尤其是早期阶段的神经退行性疾病，更优选用来降低与神经退行性疾病，诸如ALS，阿默氏症或者帕金森症相关的早期神经元兴奋毒性的组合物。
一个特别的目的在于使用PDE4抑制剂用于制备设计用来治疗ALS，尤其是用来降低患有ALS的受试者兴奋毒性或者增加患有ALS的受试者的神经元存活率的组合物。
本发明的另一个目的是使用能够抑制(优选以选择的方式)序列SEQ ID NO2或者4的PDE4B的表达或者活性的化合物，目的在于制备设计用于降低神经元兴奋毒性的组合物。
本发明的另一个目的是提供治疗与神经元应激相关的疾病，尤其是兴奋毒性的方法，所述方法包括给受试者施用抑制PDE4B活性或者表达的化合物，优选是选择性抑制PDE4的化合物。
本发明的另一个目的是基于治疗ALS的方法，尤其是用于提高患有ALS的受试者神经元存活率的方法，所述方法包括给受试者施用PDE4抑制剂，优选是一种选择性抑制PDE4的化合物。
在本发明的上下文，术语“治疗”是指预防，治愈，缓解治疗，以及病人处理(减轻痛苦，提高生命期望值，减缓疾病的恶化)等等。治疗可以连同其它药物或者治疗一起进行，尤其是疾病的晚期阶段，诸如半胱氨酸-天冬氨酸蛋白酶抑制剂或者其它的活性化合物。
使用的化合物可以是能够抑制PDE4表达，尤其是PDE4B表达的任一化合物，也就是说，特别是抑制基因转录，RNA成熟加工，mRNA翻译，翻译后蛋白修饰等的任何化合物。所述化合物可以是抑制RNA修饰，尤其是3’非编码区的部分缺失的化合物。
在一个具体的实施方案中，化合物为能够抑制PDE4B基因转录或者相应的mRNA翻译的反义核酸。反义核酸可以包括PDE4B基因的所有或者部分序列，其片段，PDE4B信使或者其互补序列。反义核酸可以主要包括互补于位于SEQ ID NO1的残基218到2383之间或者SEQ ID NO3的残基766到2460之间序列的区域，并且抑制(或者减少)其翻译成蛋白。反义核酸可以为DNA，RNA，核酶等。它可以为单链或者双链。它也可以是由反义基因编码的RNA。如果它为反义寡核苷酸，通常含有少于100个碱基，例如从10到50个碱基。这种寡核苷酸可被修饰以提高其稳定性，其对核酸酶的抗性，其进入细胞的穿透性等。
根据其它的实施方案，化合物为肽，例如包括PDE4蛋白(尤其是PDE4B)的区域并且能够拮抗其活性。
根据本发明的另一实施方案，化合物为天然或者合成来源的化合物，尤其是植物，细菌，病毒，动物，真核生物，合成或者半合成来源，能够调节PDE4B的表达或者活性的有机或者无机分子。
在一个优选的变体中，化合物为抑制PDE4的合成化合物。可以使用不同类型的抑制剂。优选为来自吡唑并吡啶家族的化合物，其中一个具体的例子为etazolate，或者来自黄嘌呤(或者2，6-二氧嘌呤)衍生物家族，尤其是包括己酮可可碱(pentoxifylline)的化合物。
来自吡唑并吡啶家族的化合物尤其选自下列化合物具有下式的etazolate 4-丁基氨基-1-乙基-6-甲基-1H-吡唑并[3，4-b]吡啶-5-羧酸乙酯(tracazolate)，4-丁基氨基-1-乙基-1H-吡唑并[3，4-b]吡啶-5-羧酸乙酯，1-(4-氨基-吡唑并[3，4-b]吡啶-1-基)-β-D-1-脱氧-呋喃核糖，1-乙基-4-(N’-异亚丙基-联氨基)-1H-吡唑并[3，4-b]吡啶-5-羧酸乙酯(SQ 20009)，4-氨基-6-甲基-1-正戊基-1H-吡唑并[3，4-b]吡啶，4-氨基-1-乙基-6-甲基-1H-吡唑并[3，4-b]吡啶-5-羧酸乙酯(去丁基tracazolate)，4-氨基-1-戊基-1H-吡唑并[3，4-b]吡啶-5-甲酰胺(carboxamide)，
1-乙基-6-甲基-4-甲基氨基-1H-吡唑并[3，4-b]吡啶-5-羧酸乙酯，4-氨基-6-甲基-1-丙基-1H-吡唑并[3，4-b]吡啶-5-羧酸乙酯，1-乙基-4-乙基氨基-6-甲基-1H-吡唑并[3，4-b]吡啶-5-羧酸乙酯，4-氨基-1-丁基-6-甲基-1H-吡唑并[3，4-b]吡啶-5-羧酸乙酯，5-(4-氨基-吡唑并[3，4-b]吡啶-1-基)-2-羟甲基-四氢呋喃-3-醇，1-烯丙基-4-氨基-6-甲基-1H-吡唑并[3，4-b]吡啶-5-羧酸烯丙酯，4-氨基-6-甲基-1-戊基-1H-吡唑并[3，4-b]吡啶-5-羧酸，4-氨基-1-乙基-3，6-二甲基-1H-吡唑并[3，4-b]吡啶-5-羧酸乙酯，4-二甲基氨基-1-乙基-6-甲基-1H-吡唑并[3，4-b]吡啶-5-羧酸乙酯，1-乙基-6-甲基-4-丙基氨基-1H-吡唑并[3，4-b]吡啶-5-羧酸乙酯，4-氨基-1-戊基-1H-吡唑并[3，4-b]吡啶-5-羧酸乙酯，4-氨基-6-甲基-1-戊-4-炔基-1H-吡唑并[3，4-b]吡啶-5-羧酸乙酯，4-氨基-1-丁-3-烯基-1H-吡唑并[3，4-b]吡啶-5-烯丙酰胺，4-氨基-1-戊基-1H-吡唑并[3，4-b]吡啶-5-异丙酰胺，4-氨基-1-戊基-N-正丙基-1H-吡唑并[3，4-b]吡啶-5-甲酰胺，4-氨基-1-丁基-6-甲基-1H-吡唑并[3，4-b]吡啶-5-羧酸烯丙酯，4-氨基-6-甲基-1-戊-3-炔基-1H-吡唑并[3，4-b]吡啶-5-羧酸乙酯，4-氨基-1-戊基-1H-吡唑并[3，4-b]吡啶-5-丙-2-炔基酰胺，4-氨基-1-(3-甲基-丁基)-1H-吡唑并[3，4-b]吡啶-5-羧酸烯丙酯，4-氨基-1-戊基-1H-吡唑并<3，4-b>吡啶-5-N-(2-丙烯基)甲酰胺，4-氨基-1-戊基-1H-吡唑并[3，4-b]吡啶-5-羧酸烯丙酯，4-氨基-1-戊基-1H-吡唑并[3，4-b]吡啶-5-丁酰胺，4-氨基-1-丁-3-炔基-6-甲基-1H-吡唑并[3，4-b]吡啶-5-羧酸烯丙酯，4-氨基-1-丁-3-烯基-6-甲基-1H-吡唑并[3，4-b]吡啶-5-羧酸烯丙酯，4-氨基-6-甲基-1-戊基-1H-吡唑并[3，4-b]吡啶-5-烯丙酰胺，4-氨基-6-甲基-1-戊基-1H-吡唑并[3，4-b]吡啶-5-羧酸烯丙酯，4-氨基-6-甲基-1-(3-甲基-丁基)-1H-吡唑并[3，4-b]吡啶-5-羧酸烯丙酯，
4-氨基-6-甲基-1-戊基-1H-吡唑并[3，4-b]吡啶-5-羧酸异丁酯，4-氨基-6-甲基-1-戊基-1H-吡唑并[3，4-b]吡啶-5-丁酰胺，4-氨基-6-甲基-1-(3-甲基-丁-2-烯基)-1H-吡唑并[3，4-b]吡啶-5-羧酸烯丙酯，4-氨基-1-戊基-1H-吡唑并[3，4-b]吡啶-5-环丙酰胺，4-氨基-1-戊基-1H-吡唑并[3，4-b]吡啶-5-异羟肟酸乙酯，4-氨基-6-甲基-1-戊基-1H-吡唑并[3，4-b]吡啶-5-羧酸丙-2-炔基酯，4-氨基-6-甲基-1-戊-4-炔基-1H-吡唑并[3，4-b]吡啶-5-羧酸烯丙酯，4-氨基-6-甲基-1-戊-4-烯基-1H-吡唑并[3，4-b]吡啶-5-羧酸烯丙酯，4-氨基-1-戊-3-炔基-1H-吡唑并[3，4-b]吡啶-5-丙酰胺，4-氨基-1-戊基-1H-吡唑并[3，4-b]吡啶-5-环丙基甲基-酰胺，4-氨基-6-甲基-1-戊基-1H-吡唑并[3，4-b]吡啶-5-羧酸2-甲基烯丙酯，4-氨基-1-戊-3-炔基-1H-吡唑并[3，4-b]吡啶-5-烯丙酰胺(ICI190，622)，4-氨基-1-戊-4-炔基-N-2-丙烯基-1H-吡唑并[3，4-b]吡啶-5-甲酰胺，4-氨基-1-戊-3-炔基-1H-吡唑并[3，4-b]吡啶-5-丙-2-炔基酰胺，4-氨基-1-戊基-1H-吡唑并[3，4-b]吡啶-5-丁-2-炔基酰胺，4-氨基-6-甲基-1-戊-3-炔基-1H-吡唑并[3，4-b]吡啶-5-羧酸烯丙酯，4-氨基-1-(2-环丙基-乙基)-6-甲基-1H-吡唑并[3，4-b]吡啶-5-羧酸烯丙酯，4-氨基-1-己-5-炔基-6-甲基-1H-吡唑并[3，4-b]吡啶-5-羧酸烯丙酯，4-氨基-1-戊-3-炔基-1H-吡唑并[3，4-b]吡啶-5-环丙基甲基-酰胺，4-氨基-6-甲基-1-戊基-1H-吡唑并[3，4-b]吡啶-5-羧酸丁-3-烯基酯，4-氨基-6-甲基-1-戊基-1H-吡唑并[3，4-b]吡啶-5-羧酸环丙基甲酯，4-丁基氨基-1-戊基-1H-吡唑并[3，4-b]吡啶-5-烯丙酰胺，4-氨基-6-甲基-1-戊基-1H-吡唑并[3，4-b]吡啶-5-羧酸2-环丙基-乙酯，4-氨基-6-甲基-1-戊-3-炔基-1H-吡唑并[3，4-b]吡啶-5-羧酸环丙基甲酯，4-氨基-6-甲基-1-戊-4-炔基-1H-吡唑并[3，4-b]吡啶-5-羧酸环丙基甲酯，4-氨基-1-苄基-6-甲基-1H-吡唑并[3，4-b]吡啶-5-羧酸乙酯，4-氨基-1-戊基-1H-吡唑并[3，4-b]吡啶-5-苄基酰胺，4-氨基-1-戊基-1H-吡唑并[3，4-b]吡啶-5-苯基酰胺，4-氨基-6-甲基-1-戊基-1H-吡唑并[3，4-b]吡啶-5-羧酸苄酯，4-叠氮基-1-β-D-呋喃核糖基吡唑并[3，4-b]吡啶，1-戊-3-炔基-N-2-丙烯基-4-丙酰胺基-1H-吡唑并[3，4-b]吡啶-5-甲酰胺，2-(4-氨基-吡唑并[3，4-b]吡啶-1-基)-5-羟甲基-四氢-呋喃-3，4-二醇，2-(6-甲基-1H-吡唑并[3，4-b]吡啶-4-基氨基)-乙醇，3-(6-甲基-1H-吡唑并[3，4-b]吡啶-4-基氨基)-丙-1-醇，3-(6-甲基-1H-吡唑并[3，4-b]吡啶-4-基氨基)-乙酸丙酯，2-(6-甲基-1H-吡唑并[3，4-b]吡啶-4-基氨基)-丙酸乙酯，2-(6-甲基-1H-吡唑并[3，4-b]吡啶-4-基氨基)-戊酸乙酯，2-(6-甲基-1H-吡唑并[3，4-b]吡啶-4-基氨基)-苯甲酸乙酯，3-(6-甲基-1H-吡唑并[3，4-b]吡啶-4-基氨基)-戊酸丙酯，N-苯亚甲基-N’-(3-甲基-1-苯基-1H-吡唑并[3，4-b]吡啶-4-基)-肼，N-呋喃-2-基亚甲基-N’-(3-甲基-1-苯基-1H-吡唑并[3，4-b]吡啶-4-基)-肼，N-(4-氟-苯亚甲基)-N’-(3-甲基-1-苯基-1H-吡唑并[3，4-b]吡啶-4-基)-肼，
N-(3-呋喃-2-基-亚丙烯基)-N’-(3-甲基-1-苯基-1H-吡唑并[3，4-b]吡啶-4-基)-肼，N-(4-甲氧基-苯亚甲基)-N’-(3-甲基-1-苯基-1H-吡唑并[3，4-b]吡啶-4-基)-肼，4-[(3-甲基-1-苯基-1H-吡唑并[3，4-b]吡啶-4-基)-亚肼甲基]-苄腈，N-苯并[1，3]间二氧杂环戊烯-5-基亚甲基-N’-(3-甲基-1-苯基-1H-吡唑并[3，4-b]吡啶-4-基)-肼，N-(3-甲基-1-苯基-1H-吡唑并[3，4-b]吡啶-4-基)-N’-(4-硝基-苯亚甲基)-肼，N-(3-甲基-1-苯基-1H-吡唑并[3，4-b]吡啶-4-基)-N’-(2-硝基-苯亚甲基)-肼，N-(3-甲基-1-苯基-1H-吡唑并[3，4-b]吡啶-4-基)-N’-(4-三氟甲基-苯亚甲基)-肼，N-(3-甲基-1-苯基-1H-吡唑并[3，4-b]吡啶-4-基)-N’-(5-硝基-呋喃-2-基亚甲基)-肼，N-(3-甲基-1-苯基-1H-吡唑并[3，4-b]吡啶-4-基)-N’-(2-三氟甲基-苯亚甲基)-肼，N-(3-甲基-1-苯基-1H-吡唑并[3，4-b]吡啶-4-基)-N’-(6-硝基-苯并[1，3]间二氧杂环戊烯-5-基亚甲基)-肼，4-(3-氯-4-甲氧基-苄基氨基)-1-乙基-1H-吡唑并[3，4-b]吡啶-5-羧酸，4-(3-氯-4-甲氧基-苄基氨基)-1-乙基-1H-吡唑并[3，4-b]吡啶-5-(吡啶-4-基甲基)-酰胺，4-(3-氯-4-甲氧基-苄基氨基)-1-乙基-1H-吡唑并[3，4-b]吡啶-5-(四氢-呋喃-2-基甲基)-酰胺，4-(3-氯-4-甲氧基-苄基氨基)-1-乙基-1H-吡唑并[3，4-b]吡啶-5-(5-羟基-戊基)-酰胺，4-(3-氯-4-甲氧基-苄基氨基)-1-乙基-1H-吡唑并[3，4-b]吡啶-5-[3-(2-氧-吡咯烷-1-基)-丙基]-酰胺，4-叔-丁基氨基-1-(2-氯-2-苯基-乙基)-1H-吡唑并[3，4-b]吡啶-5-羧酸乙酯，1-(2-氯-2-苯基-乙基)-4-环丙基氨基-1H-吡唑并[3，4-b]吡啶-5-羧酸乙酯，1-(2-氯-2-苯基-乙基)-4-丙基氨基-1H-吡唑并[3，4-b]吡啶-5-羧酸乙酯，1-(2-氯-2-苯基-乙基)-4-苯基氨基-1H-吡唑并[3，4-b]吡啶-5-羧酸乙酯，4-丁基氨基-1-(2-氯-2-苯基-乙基)-1H-吡唑并[3，4-b]吡啶-5-羧酸乙酯，1-(2-氯-2-苯基-乙基)-4-(2-乙氧基-乙基氨基)-1H-吡唑并[3，4-b]吡啶-5-羧酸乙酯，4-苄基氨基-1-(2-氯-2-苯基-乙基)-1H-吡唑并[3，4-b]吡啶-5-羧酸乙酯，1-(2-氯-2-苯基-乙基)-4-苯乙基氨基-1H-吡唑并[3，4-b]吡啶-5-羧酸乙酯，在黄嘌呤衍生物中，人们尤其使用(i)(ω-1)-羟烷基-二烷基黄嘌呤，其中(ω-1)-羟烷基含有5或者6个碳原子，并且在1或者7位，在其他7或者1位的烷基含有1到12个碳原子并且在3位的烷基含有1到4个碳原子，(ii)(ω-1)-氧烷基-二甲基黄嘌呤，其中(ω-1)-氧烷基含有5或者6个碳原子并且在1或者7位，或者(iii)具有含4到12个碳原子的烷基或者在1或者7位具有苄基的二甲基黄嘌呤的衍生物。
通常，氧烷基-二烷基黄嘌呤包括，例如1-(5-氧己基)-3，7-和7-(5-氧己基)-1，3-二甲基黄嘌呤。也可使用其他黄嘌呤，诸如尤其是在1或者7位用丁基，异戊基，己基，月桂基或者苄基取代的3，7-二甲基黄嘌呤和1，3-二甲基黄嘌呤，以及在(ω-1)-位用羟基或者氧基取代的这些化合物的类似物，例如1-(4-羟戊基)-和1-(5-羟己基)-3，7-二甲基黄嘌呤，7-(4-羟戊基)-和7-(5-羟己基)-1，3-二甲基黄嘌呤，1-(4-氧戊基)-和1-(5-氧己基)-，1-(2-甲基-3-氧丁基)-和1-(2-乙基-3-氧丁基)-3，7-二甲基黄嘌呤和相应的在7位具有(ω-1)-羟烷基或者(ω-1)-氧烷基的1，3-二甲基化合物。上述羟烷基-二甲基黄嘌呤的类似物是那些在1或者7位没有被羟烷基占据，具有除了甲基以外的2到12个碳原子的烷基，诸如，1-乙基-，1-丙基-，1-丁基-和1-异丁基-3-甲基-7-(5-羟己基)-黄嘌呤和7-乙基-，7-丙基-，7-丁基-和7-异丁基-1-(5-羟己基)-3-甲基黄嘌呤，和相应的在位点上具有除了甲基以外的含有2到4个碳原子的烷基，诸如尤其是，乙基，正丙基，异丙基，异丁基或者正丁基的化合物。
在这些黄嘌呤衍生物中，人们尤其使用具有下式的己酮可可碱(Pentoxifylline) 因此，本发明首次提议PDE4B作为治疗靶用于治疗与兴奋毒性相关的分子事件。根据具体的实施方案，本发明可被用于抑制或者降低神经退行性疾病早期阶段的神经元的兴奋毒性。尤其是应用于治疗阿默氏症，帕金森氏症，多发性硬化，ALS，亨汀顿舞蹈症和脑局部缺血。
本发明的其它目的基于使用上述化合物，尤其是etazolate或者己酮可可碱用于治疗ALS，以显著降低ALS早期阶段的神经元兴奋毒性，或者使用上述化合物，尤其是己酮可可碱或者etazolate用于制备设计用来抑制患有ALS的病人PDE4B活性的组合物。
本发明同时涉及治疗ALS的方法，所述方法包括施用选择性抑制序列SEQ ID NO2或者4的PDE4B的表达或者活性的化合物。优选的，本发明的方法用于治疗神经退行性疾病的早期阶段。
可以根据本领域技术人员公知的任一方法进行给药，优选通过口服途径或者通过注射，通常通过腹膜内，脑内，静脉内，动脉内或者肌内的途径给药。优选使用口服途径给药。给药剂量可以是本领域技术人员所接受的剂量。通常，对于天然是化合物的抑制剂化合物而言，注射大约0.01mg到100mg/kg。对于核酸化合物而言，给药剂量例如从大约0.01mg到100mg每剂量。应该理解，可以进行反复注射，有可能与其它活性制剂或者任一药学上可接受的介质(例如，在稳定剂等存在下，缓冲液，等渗盐溶液等)联合使用。
本发明可用于哺乳动物，尤其用于人类。实施例中列举的结果显示了PDE4B抑制剂对提高处于兴奋毒性状态的神经元的存活率的效果。
可选择的方法和手段本发明的其它目的涉及选择，鉴定或者鉴别对与兴奋毒性，或者神经元应激相关疾病有活性的化合物的方法，所述方法包括将化合物与表达PDE4B(尤其是缺乏3’非编码区的变体)的细胞接触，并且鉴定抑制这个蛋白表达或者活性的化合物。
所述方法可用于不同的细胞群，诸如哺乳动物来源(人，鼠等等)的初级细胞或者细胞系。优选的，使用不天然表达PDE4B，用编码需要的变体的核酸转化的细胞。用这种方式，方法的可选择性提高了。也可使用低等真核生物(酵母等)或者原核生物的细胞。
筛选方法也可通过测定试验化合物结合PDE4B或者其变体或者其片段的能力在无细胞系统中实施。
本发明的另一个目的涉及如上所述的编码多肽的任一核酸，含有核酸的载体，重组细胞，及其应用。载体可以为质粒，噬菌体，粘粒，病毒，人工染色体等等。优选的载体的例子为质粒载体，诸如来自市售的质粒(pUC，pcDNA，pBR等等)。这种载体优选含有选择的基因和/或复制起点和/或转录启动子。其它的具体载体为例如，病毒或者噬菌体，尤其是复制缺陷型重组病毒，诸如来自逆转录病毒，腺病毒，AAV，疱疹病毒，杆状病毒等的病毒。载体可用于任一感受态宿主，诸如，例如原核或者真核细胞。它们可以为细菌(例如大肠杆菌)，酵母(例如，糖酵母或者克鲁维氏酵母)，植物细胞，昆虫细胞，哺乳动物细胞，尤其是人等等。它们可以是细胞系，初级细胞，混合培养物等。
本发明的其它方面和优点根据下列用于说明而非限制目的的实施例将更加明显。


图1大脑(1A)和肌肉(1B)样本中PDE4B的半定量PCR。
图2己酮可可碱(Pentoxifylline)保护初级神经元防止形成与由红藻氨酸诱导的兴奋毒性相关的小脑颗粒体。
图3己酮可可碱(Pentoxifylline)保护初级神经元防止形成与由NMDA/丝氨酸诱导的兴奋毒性相关的小脑颗粒体。
图4etazolate的神经元保护效果防止由大脑颗粒细胞上的NMDA/丝氨酸诱导的毒性。
图5etazolate的神经元保护效果防止由大脑颗粒细胞上的红藻氨酸诱导的毒性。
图6己酮可可碱(Pentoxifylline)的神经元保护效果防止由皮层神经元上的NMDA/丝氨酸诱导的毒性。
图7己酮可可碱(Pentoxifylline)的神经元保护效果防止由皮层神经元上的红藻氨酸诱导的毒性。
图8etazolate的神经元保护效果防止由皮层神经元上的NMDA/丝氨酸诱导的毒性。
图9etazolate的神经元保护效果防止由皮层神经元上的红藻氨酸诱导的毒性。
图108-溴-cAMP的神经元保护效果防止由大脑颗粒细胞上的NMDA/丝氨酸诱导的毒性。
图118-溴-cAMP的神经元保护效果防止由大脑颗粒细胞上的红藻氨酸诱导的毒性。
实施例实施例1鉴定作为兴奋毒性分子靶的PDE4对从不同阶段的动物样本的大脑中提取的聚腺苷酰化(poly A+)的RNA进行定性差异分析，不用预先分离神经元从而考虑与疾病的发展相关的可选择剪接事件的最大值。
poly A+RNA通过本领域技术人员公知的方法进行制备。尤其是，可以通过诸如，硫氰酸胍的离液剂处理，然后利用溶剂(例如，酚，氯仿)的方法提取总RNA。这种方法对于本领域技术人员是公知的[参见Maniatis等人，Chomczynsli等人，Anal.Biochem.162(1987)156]，而且通过使用市售的试剂盒可以很容易的进行操作。poly A+RNA根据本领域技术人员公知的常规方法从总RNA中制备，并且以市售试剂盒的形式提供。这些poly A+RNA作为利用逆转录酶进行逆转录反应的模板。以优选的方式，使用缺失RNase H活性的逆转录酶，从而获得在大小上大于用传统逆转录酶获得的第一个互补DNA链。这种不含RNase H的逆转录酶制备物可以市售获得。
在疾病发生的每个时间点(30天，60天和90天)，poly A+RNA以及单链cDNA从转基因动物(T)和同系基因的对照动物(C)制备而来。
根据DATAS方法，在每个时间点进行mRNA(C)与cDNA(T)的杂交，以及mRNA(T)与cDNA(C)的交互杂交。
然后根据DATA方法的操作流程纯化mRNA/cDNA异双链体。
不与互补DNA配对的RNA序列通过RNAse H的作用从这些异双链体释放，因为这种酶降解成对的RNA序列。这种未配对的序列代表在相互同源的RNA之间存在的定性差异。这种定性差异可以位于RNA序列上的任一位点，在序列的5’或者3’区或者在序列中间，尤其在编码序列中。根据他们的位点，这些序列可能不只是选择性剪接，还可能是易位或者缺失的结果。
然后根据本领域技术人员公知的方法，更具体的是描述于DATAS方法专利中的那些方法，克隆代表定性差异的RNA序列。
这些序列进入组成定性差异文库的cDNA文库。一种这样的文库含有健康状态特异的外显子和内含子；另一种文库就含有病理状况下的剪接事件的特征。
通过与探针杂交检测克隆的差异表达，所述探针由研究中的差异状态下提取的信使RNA的反转录获得。保留显示差异杂交的克隆用于后面的分析。通过DATAS鉴定的序列对应于通过在病理状态和正常状态中的剪接而差异表达的内含子和/或外显子。这些剪接事件可以特异于疾病发展的特定阶段或者为正常状态的特征。
将这些序列与数据库比较可以将获得的信息进行分类，并且提议根据诊断和治疗目的对序列加以合理选择。
对来自60天龄转基因动物和对照动物的RNA实施DATAS已经分离了来自磷酸二酯酶4B mRNA的cDNA片段。这个片段相应于特异性存在于对照动物中的外显子片段，并且因此在60天龄阶段的SOD1G93A转基因动物体内特异性缺失。这个片段包括从鼠PDE4B的终止密码子开始编号的核苷酸377到486(SEQ ID NO1)。这个序列包括2912个碱基，缺失的片段相应于碱基2760到2869。由于选择性使用3’非编码外显子或者由于使用两种可选择的聚腺苷酰化位点，这个区是非编码的并且在对照动物和转基因动物之间差异表达。
实施例2RT-PCR试验证实差异表达PDE4B在神经元应激状态下的差异表达和参考状态相比通过描述于图1的RT-PCR试验进行证实。
这些实验根据本领域技术人员公知的方法进行并且使随后表达PDE4B mRNA两个不同区域成为可能。这样的一个区域跨越了这个mRNA的起始密码子(PDE4B 5’)，其它区域部分跨越了通过DATAS(PDE4B DATAS)方法鉴定的片段。所使用的PCR引物的位置显示在图1中。
PO RNA是核糖体RNA，作为内部对照以检测相同量的RNA用于每个试验点。用从30天龄，60和90天龄，即，在病理症状出现之前的对照动物(C)和转基因(T)动物提取的RNA进行分析。
来自对照或者30，60，或者90天龄的SOD1 G93A小鼠大脑的总RNA利用标准SuperscriptTM操作流程(Invitrogen)转录为cDNA。为了进行半定量PCR，逆转录反应产物稀释10倍。DATAS片段的特异性引物对应于有义链的核苷酸2526到2545(5’GCC AGG CCG TGAAGC AAA TA3’；SEQ ID NO5)，和反义链核苷酸2790到2807(5’TCAAAG ACG CGA AAA CAT 3’；SEQ ID NO6)并且对于5′引物片段而言，引物对应于有义链的核苷酸145到165(5’CCG CGT CAG TGC CTTTGC TAT 3’；SEQ ID NO7)，和反义链的核苷酸426到404(5’CGC TGTCGG ATG CTT TTA TTC AC 3’；SEQ ID NO8)。P0基因作为参考并且利用下列引物进行扩增，有义链5’TCG CTT TCT GGA GGG TGT C3’(SEQ ID NO9)和反义链CCG CAG GGG CAG CAG TGG 3’(SEQ IDNO10)。
如下所述进行30个PCR循环的扩增-在94℃ 30秒-在57℃ 1分钟-在72℃ 30秒，然后在72℃ 2分钟一个循环不同的PCR产物加样到1.5％的琼脂糖凝胶上。用两种不同的逆转录反应重复试验三次。
图1显示了从动物的大脑或者肌肉提取的RNA获得的结果。
如果从所有样品的PO RNA扩增相同量的cDNA，用PDE4BmRNA观察到变化。在90天龄的动物体内检测到最显著的改变在转基因动物的大脑中观察到PDE4 5’片段表达增加的同时，在转基因动物的大脑中出现PDE4B(DATAS)表达非常显著的降低。
这种发现建立了PDE4B的3’非编码区mRNA片段表达的降低和这个相同的信使的5’编码区表达的提高之间的关联。这个结果和在由DATAS鉴定的序列中存在mRNA去稳定序列完全一致，并且表明PDE4B表达和兴奋毒性现象之间的关联。
实施例3通过PDE4的抑制剂抑制兴奋毒性对于这个实施例，大鼠大脑颗粒以及皮层神经元根据本领域技术人员公知的技术进行培养。
初级大鼠大脑颗粒细胞的培养7天龄Wistar大鼠去头并且解剖大脑。除去脑膜后，将组织切割成小块并在37℃胰酶消化15分钟。细胞在研磨机上进行研磨分离并以300,000细胞/cm2接种在添加了10％胎牛血清和2mM谷氨酰胺的基础Eagle培养基上。第二天，添加10μM的ARA-C(一种抗有丝分裂剂)以抑制神经胶质细胞的生长。培养9天以后，用磷酸二酯酶抑制剂己酮可可碱和etazolate处理细胞，3小时后在10μg的D-丝氨酸的存在下加入毒素50μM的红藻氨酸或者100μM的N-甲基-D-天冬氨酸。在毒素之前立即加入8-溴-cAMP。所有处理至少重复两次并在至少两种不同的培养物中进行。温育6小时以后，通过MTT试验评估毒性。结果归一化到未处理对照的平均数，用Wilcoxon试验进行统计分析。显著性水平设定为p＜0.05。
初级皮层细胞的培养取出来自Wistar大鼠的16天龄胚胎并且解剖皮层。在37℃用胰蛋白酶处理25分钟后，细胞在研磨机中研磨分离，然后以300,000细胞/cm2接种在添加了10％马血清，10％胎牛血清和2mM谷氨酰胺的极限必需培养基上。培养4天以后，一半的培养基用添加了5％马血清和2mM谷氨酰胺的极限必需培养基替换。同一天，添加10μM的5-氟-2-脱氧尿苷(一种抗有丝分裂剂)。培养7和11天以后，用由添加了5％马血清和2mM谷氨酰胺的MEM组成的条件培养基替换一半的培养基；这种培养物在使用前在一层皮层星形胶质细胞上传代。在第14天，在10μg的D-丝氨酸的存在下加入毒素50μM的红藻氨酸或者20μM的N-甲基-D-天冬氨酸之前1小时用磷酸二酯酶抑制剂己酮可可碱和etazolate处理细胞。所有的处理至少重复两次并在至少两种不同的培养物中进行。温育6小时以后，通过MTT试验评估毒性。结果归一化到未处理对照的平均数，用Wilcoxon试验进行统计分析。显著性水平设定为p＜0.05。
MTT利用MTT试验测定毒性。与化合物温育后，加入MTT使得每孔的终浓度为0.5mg/ml。然后，将微孔板在37℃黑暗条件下培养30分钟。对培养基抽气，并将晶体重新悬浮在500μl的DMSO(二甲基亚砜)中。读取550nm处的吸光度并且计算百分比存活率。
结果结果示于图2到10中。这些结果显示了本发明的化合物对于神经元存活的保护效果。当神经元用PDE4抑制剂共处理时，观察到对两种兴奋毒性诱导剂(NMDA/丝氨酸和红藻氨酸)的剂量依赖性保护效果。用己酮可可碱和etazolate观察到这样的保护效果。
图2和3显示利用己酮可可碱对大脑颗粒细胞获得的结果。它们显示在NMDA/丝氨酸处理的情况下己酮可可碱对这些细胞提供43％的保护，以及在红藻氨酸诱导的毒性的情况下对这些细胞提供33％的保护。
图4和5显示了利用etazolate对大脑颗粒细胞获得的结果。它们显示在NMDA/丝氨酸处理的情况下etazolate对这些细胞提供60％的保护，以及在红藻氨酸诱导的毒性的情况下对这些细胞提供57％的保护。
图6和7显示了利用己酮可可碱对皮层神经元获得的结果。它们显示在NMDA/丝氨酸处理的情况下己酮可可碱对这些细胞提供50％的保护，以及在红藻氨酸诱导的毒性的情况下对这些细胞提供66％的保护。
图8和9显示了利用etazolate对皮层神经元获得的结果。它们显示在NMDA/丝氨酸处理的情况下etazolate对这些细胞提供33％的保护，以及在红藻氨酸诱导的毒性的情况下对这些细胞提供25％的保护。
这种保护的相关性通过利用提高cAMP(一种PDE底物)的浓度获得的保护的百分比进行证实，作为大脑颗粒细胞的例子显示在图10和11中。NMDA/丝氨酸处理观察到40％的保护，而红藻氨酸处理观察到40％的保护。
因此本发明不仅显示PDE4B参与兴奋毒性的机制，尤其是在ALS模型中，而且还显示PDE4抑制剂在与兴奋毒性相关的应激中保持神经元存活率的能力。
实施例4人类的临床应用这个实施例描述了PDE4抑制剂临床应用在处理人ALS的条件。这个实施例显示了本发明的治疗潜能和其在人类中的实施条件。
在这个临床试验中，处理是基于己酮可可碱和2-氨基-6-三糖甲氧苯噻唑(riluzole)的联合使用，前者每天三次400mg的剂量，每天总共1200mg的剂量。己酮可可碱以片剂的形式给药。这是一个多中心、双盲、安慰剂对照的试验，试验对象是400名包括18到80年龄段的男性和女性的病人，代表散发或者家族性ALS，并且用2-氨基-6-三糖甲氧苯噻唑(50mg b.i.d)至少治疗3个月。用己酮可可碱治疗的计划时间为18个月。
最终的主要效果为存活率，生命质量和肌肉试验。
本发明的其它方面和应用涉及- 使用所有或者部分来自PDE4B信使RNA的序列用于诊断或者筛选或者鉴定具有与兴奋毒性现象相关的组分或者阶段的神经退行性疾病，诸如阿默氏症，帕金森氏症，多发性硬化，亨汀顿舞蹈症，ALS或者脑局部缺血，- 使用包括反义RNA的任一核酸用于在患有这种疾病的病人体内抑制PDE4B的表达，- 利用任一化合物，尤其是己酮可可碱，etazolate，或者含有它们的任一组合物用于在患有这种疾病的病人体内抑制PDE4B的活性，
- 利用所有或者部分来自PDE4B信使RNA的序列用于鉴定组织以及局部缺血的状态。
序列表<110>埃克森海特治疗股份有限公司(Exonhit Therapeutics SA)<120>新的神经毒性的分子靶(New Molecular Target of Neurotoxicity)<130>SCT040204-47<140>
<141>
<160>10<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>2912<212>DNA<213>Mus musculus<220>
<221>CDS<222>(218)..(2383)<400>1aaaggcagcc tgataaagct ccttgtgaca ggctgtcttg ccagtctccc agtatgctcc 60tcttgctctg aagtgctcca ggattgaaac cacagcttcc caaattagcc tgggaagagt 120gtgcggaccc agcagccttt taacccgcgt cagtgccttt gctatgttca agactgctgt 180tttggatggt gaatgctagc tagcactcca tcgagac atg aca gca aaa aat tct 235Met Thr Ala Lys Asn Ser1 5cca aaa gaa ttt act gct tcg gaa tct gag gtt tgc ata aag act ttc 283Pro Lys Glu Phe Thr Ala Ser Glu Ser Glu Val Cys Ile Lys Thr Phe10 15 20aag gag cag atg cgc ttg gaa ctt gag ctt cca aag cta cca gga aac 331Lys Glu Gln Met Arg Leu Glu Leu Glu Leu Pro Lys Leu Pro Gly Asn25 30 35aga cct aca tct ccc aaa att tct cca cgc agt tca cca agg aat tca 379
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<212>PRT<213>智人(Homo sapiens)<400>4Met Lys Glu His Gly Gly Thr Phe Ser Ser Thr Gly Ile Ser Gly Gly1 5 10 15Ser Gly Asp Ser Ala Met Asp Ser Leu Gln Pro Leu Gln Pro Asn Tyr20 25 30Met Pro Val Cys Leu Phe Ala Glu Glu Ser Tyr Gln Lys Leu Ala Met35 40 45Glu Thr Leu Glu Glu Leu Asp Trp Cys Leu Asp Gln Leu Glu Thr Ile50 55 60Gln Thr Tyr Arg Ser Val Ser Glu Met Ala Ser Asn Lys Phe Lys Arg65 70 75 80Met Leu Asn Arg Glu Leu Thr His Leu Ser Glu Met Ser Arg Ser Gly85 90 95Asn Gln Val Ser Glu Tyr Ile Ser Asn Thr Phe Leu Asp Lys Gln Asn100 105 110Asp Val Glu Ile Pro Ser Pro Thr Gln Lys Asp Arg Glu Lys Lys Lys115 120 125Lys Gln Gln Leu Met Thr Gln Ile Ser Gly Val Lys Lys Leu Met His130 135 140Ser Ser Ser Leu Asn Asn Thr Ser Ile Ser Arg Phe Gly Val Asn Thr145 150 155 160Glu Asn Glu Asp His Leu Ala Lys Glu Leu Glu Asp Leu Asn Lys Trp165 170 175Gly Leu Asn Ile Phe Asn Val Ala Gly Tyr Ser His Asn Arg Pro Leu180 185 190Thr Cys Ile Met Tyr Ala Ile Phe Gln Glu Arg Asp Leu Leu Lys Thr195 200 205Phe Arg Ile Ser Ser Asp Thr Phe Ile Thr Tyr Met Met Thr Leu Glu210 215 220Asp His Tyr His Ser Asp Val Ala Tyr His Asn Ser Leu His Ala Ala225 230 235 240Asp Val Ala Gln Ser Thr His Val Leu Leu Ser Thr Pro Ala Leu Asp245 250 255Ala Val Phe Thr Asp Leu Glu Ile Leu Ala Ala Ile Phe Ala Ala Ala260 265 270Ile His Asp Val Asp His Pro Gly Val Ser Asn Gln Phe Leu Ile Asn275 280 285Thr Asn Ser Glu Leu Ala Leu Met Tyr Asn Asp Glu Ser Val Leu Glu290 295 300Asn His His Leu Ala Val Gly Phe Lys Leu Leu Gln Glu Glu His Cys305 310 315 320
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<223>引物<400>10ccgcaggggc agcagtgg 18
权利要求
1.检测受试者兴奋毒性状态或者神经元应激状态的方法，所述方法包括体外测定来自受试者的样品中磷酸二酯酶4，尤其是磷酸二酯酶4B的表达。
2.根据权利要求1的方法，所述方法包括检测来自受试者的样品中磷酸二酯酶4，尤其是磷酸二酯酶4B的突变RNA的存在，具体是全部或者部分3’非编码区缺失的形式。
3.根据权利要求1或者2的方法，所述方法包括将来自受试者的含有核酸的生物样品体外与包括全部或者部分来自PDE4B信使RNA或者基因的序列的核酸接触，并且检测杂交体的形成。
4.根据权利要求3的方法，其中样品包括神经或者肌肉细胞。
5.根据上述任一权利要求的方法，用于诊断或者检测阿默氏症，帕金森氏症，多发性硬化，亨汀顿舞蹈症，ALS或者脑局部缺血。
6.至少一种抑制或者降低PDE4B表达或者活性的化合物在制备设计用于治疗神经退行性疾病的组合物中的应用。
7.根据权利要求6的应用，其中化合物为能够抑制PDE4B基因转录或者相应的信使翻译的反义核酸。
8.根据权利要求6的应用，其中化合物为天然或者合成来源的化合物。
9.根据权利要求8的应用，其中化合物选自吡唑并吡啶家族，尤其是etazolate，以及黄嘌呤衍生物家族，尤其是己酮可可碱。
10.根据权利要求6到9中之一的应用，用于抑制或者降低神经退行性疾病早期阶段的神经元的兴奋毒性。
11.根据权利要求6到10中之一的应用，用于提高患有ALS的病人神经元的存活率。
12.根据权利要求6到11中之一的应用，用于治疗阿默氏症，帕金森氏症，多发性硬化，亨汀顿舞蹈症，或者脑局部缺血。
13.根据权利要求6到11中之一的应用，用于治疗ALS，尤其是用于降低ALS早期阶段的神经元的兴奋毒性。
14.己酮可可碱在制备设计用于提高患有ALS病人的神经元存活率的组合物中的应用。
15.etazolate在制备设计用于提高患有ALS病人的神经元存活率的组合物中的应用。
16.至少一种属于吡唑并吡啶家族的PDE4抑制剂化合物在制备设计用于提高患有ALS病人的神经元存活率的药物组合物中的应用。
17.核苷酸引物，其组成为位于序列SEQ ID NO1的核苷酸2384和2869之间或者序列SEQ ID NO3的核苷酸2461和4068之间的序列或者其互补序列的8到20个连续残基的片段。
18.分析PDE4表达，尤其是3’非编码区和编码区之间的差异表达的试剂盒，所述试剂盒包括特异于部分3’非编码区序列的核苷酸探针以及特异于部分编码区序列的核苷酸探针。
19.分析PDE4表达，尤其是3’非编码区和编码区之间的差异表达的试剂盒，所述试剂盒包括一对允许特异性扩增至少部分PDE4的3’非编码区的核苷酸引物以及一对允许特异性扩增至少部分PDE4编码区的核苷酸引物。
全文摘要
本发明涉及生物学，遗传学和医学领域。具体而言，本发明涉及检测，鉴定和/或治疗(或者控制)神经退行性疾病，尤其是肌萎缩侧索硬化症的新方法。本发明同时涉及鉴定或者筛选对这些疾病有活性的化合物的方法。本发明进一步涉及用于实施上述方法的化合物，基因，细胞，质粒或者组合物。特别地，本发明描述了PDE4B在这些疾病中的作用及其作为治疗、诊断或者试验靶的应用。
文档编号A61K48/00GK1541278SQ02815840
公开日2004年10月27日 申请日期2002年8月13日 优先权日2001年8月14日
发明者阿里·艾特·伊赫列夫, 安内利斯·热欣卡, 法比安·施魏格霍费尔, 施魏格霍费尔, 斯 热欣卡, 阿里 艾特 伊赫列夫 申请人:埃克森海特治疗股份有限公司