一种与脑卒中发生发展相关的基因的用途的制作方法

本发明属于生物医药领域，涉及一种与脑卒中发生发展相关的基因的用途，具体地该基因为lncrnaloc103611081。

背景技术：

脑卒中是严重危害人类生命安全的难治性疾病，具有高发病率、高致残率和高死亡率的特点。流行病学调查显示近年来青年脑卒中的发病率越来越高，其中45岁以下成人发生的脑卒中，在西方国家及国内报道的比例分别为5％和13.44％。脑卒中按其性质分为缺血性脑卒中和出血性脑卒中，其中缺血性脑卒中占卒中病人总数的75％～85％。缺血性脑卒中又名脑梗塞/死，是指由于脑部血液供应障碍，缺血、缺氧引起的局限性脑组织的缺血性坏死或脑软化。

目前临床上对于脑卒中的治疗主要分为溶栓类药物治疗和神经保护类药物治疗两种方法。其中，溶栓类药物治疗是迄今为止唯一被认为确切有效的方法，但因治疗时间窗较短而出血风险高，目前仅有约5％患者能获得有效的溶栓治疗。神经保护类药物的研发则进展缓慢，临床多用于脑卒中的辅助治疗。此外，针对兴奋性氨基酸样神经递质、活性氧自由基等病因假说设计的拮抗剂(如甘氨酸抑制剂gv150526、自由基清除剂nxy059等)治疗均尚未取得明显临床疗效，提示我们需从新的角度和方向对急性脑缺血的病理机制进行深入探讨，以寻求临床治疗的新突破。

随着生物学技术的发展，人们发现基因在脑卒中的发生发展中起着重要的作用，人们发现lncrna在dna甲基化、组蛋白修饰、转录后调控、rna干扰、印迹基因等多种不同的机制、在多种层面上影响基因的表达水平，调节各种细胞过程，如细胞生长、增殖及凋亡。lncrna的异常表达与疾病的发生发展密切相关，随着对脑卒中发病原因和疾病机制研究的深入，我们对治疗靶点的认识也逐渐清晰、全面，这为脑卒中治疗药物的研究和临床使用提供了更多的研究方向。现有技术中如专利201510853891.x和201510853894.3已经公开了基因在脑卒中临床诊断中的应用，相信随着对脑卒中基础研究的不断深入，研究lncrna与脑卒中发生发展的关系为脑卒中的诊断和治疗提供新的可能性。

技术实现要素：

为了弥补现有技术的不足，本发明提供了一种与脑卒中发生发展相关的基因，为脑卒中的早期诊断提供了一种产品和手段，相比传统的脑卒中的诊断方法，使用标志物来诊断脑卒中具有及时性、灵敏性，从而使患者在疾病早期就能知晓疾病风险，从而采取相应的预防和治疗措施。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明提供了一种loc103611081的用途，用于制备诊断缺血性脑卒中的产品。

进一步，所述产品通过测定样本中通过测定样本中loc103611081的表达水平与参考水平相比上调而确定。

进一步，所述产品通过测序技术、核酸杂交技术、核酸扩增技术的方法检测loc103611081基因的表达水平。

进一步，所述核酸扩增技术选自聚合酶链式反应(pcr)、逆转录聚合酶链式反应(rt-pcr)、转录介导的扩增(tma)、连接酶链式反应(lcr)、链置换扩增(sda)和基于核酸序列的扩增(nasba)。其中，pcr需要在扩增前将rna逆转录成dna(rt-pcr)，tma和nasba直接扩增rna。

进一步，所述loc103611081包括如seqidno.1所示核苷酸序列的多核苷酸或其片段、同系物、变体或衍生物。

本发明提供了一种体外检测样本中loc103611081表达水平的产品，所述产品包括制剂、芯片或试剂盒。其中，所述芯片包括固相载体；以及固定在固相载体上的寡核苷酸探针。所述试剂盒包括基因芯片或sybrgreen聚合酶链式反应体系。

进一步，所述体外检测样本中loc103611081表达水平的产品包括：

特异性识别loc103611081的探针；或

特异性扩增loc103611081的引物。

进一步，所述特异性扩增loc103611081的引物序列如seqidno.2和seqidno.3所示。

本发明提供了体外检测样本中loc103611081表达水平的产品在制备诊断脑卒中工具中的用途。

本发明提供了一种诊断缺血性脑卒中的试剂盒，包括：

检测loc103611081的一种或多种试剂；和

选自下组的一种或多种物质：容器、使用说明书、阳性对照物、阴性对照物、缓冲剂、助剂或溶剂。

进一步，所述试剂盒用于通过下组的方法检测loc103611081：qrt-pcr、生物芯片检测法、dna印迹法、或rna印迹法原位杂交法。

附图说明

图1是利用芯片筛选缺血性脑卒中患者的差异表达基因图；

图2是利用qpcr检测loc103611081在缺血性脑卒中患者中的表达情况图。

具体实施方式

本发明经过广泛而深入的研究，通过高通量方法，采用目前覆盖数据库最广的lncrna芯片，检测lncrna在脑卒中患者和健康人标本中的转录水平，发现其中具有明显表达差异的lncrna片段，探讨其与脑卒中的发生之间的关系，从而为脑卒中的早期检测寻找更好的途径和方法。通过筛选，本发明首次发现了脑卒中患者中loc103611081显著性上调，提示loc103611081可作为检测指标应用于脑卒中的临床诊断。

loc103611081基因

loc103611081基因位于人11号染色体长臂2区4号带第3亚带上，一种代表性的loc103611081基因的核苷酸序列如seqidno.1所示。本发明中loc103611081基因包括如seqidno.1所示核苷酸序列的多核苷酸或其片段、同系物、变体或衍生物。

本领域技术人员将认识到，本发明的实用性并不局限于对本发明的靶标基因的任何特定变体的基因表达进行定量。如果当核酸或其片段与其它核酸(或其互补链)最佳比对时(具有适当的核苷酸插入或缺失)，在至少大约60％的核苷酸碱基、通常至少大约70％、更通常至少大约80％、优选至少大约90％、及更优选至少大约95-98％核苷酸碱基中存在核苷酸序列相同性，则这两个序列是“基本同源的”(或者基本相似的)。

因此，本发明的多核苷酸与seqidno.1优选具有至少75％、更优选至少85％、更优选至少90％同源性。更优选地，存在至少95％、更优选至少98％同源性。

本发明可以利用本领域内已知的任何方法测定基因表达。本领域技术人员应当理解，测定基因表达的手段不是本发明的重要方面。可以在转录水平上检测生物标志物的表达水平。

检测技术

本发明的lncrna使用本领域普通技术人员已知的多种核酸技术进行检测，这些技术包括但不限于：核酸测序、核酸杂交和核酸扩增技术。

本发明可在检测前或与检测同时地对核酸(例如，ncrna)进行扩增。核酸扩增技术的示例性非限制性实例包括但不限于：聚合酶链式反应(pcr)、逆转录聚合酶链式反应(rt-pcr)、转录介导的扩增(tma)、连接酶链式反应(lcr)、链置换扩增(sda)和基于核酸序列的扩增(nasba)。本领域的普通技术人员将认识到，某些扩增技术(例如，pcr)需要在扩增前将rna逆转录成dna(例如，rt-pcr)，而其他扩增技术则直接扩增rna(例如，tma和nasba)。

通常，pcr使用变性、引物对与相反链的退火以及引物延伸的多个循环，以指数方式增加靶核酸序列的拷贝数；rt-pcr则将逆转录酶(rt)用于从mrna制备互补的dna(cdna)，然后将cdna通过pcr扩增以产生dna的多个拷贝；tma在基本上恒定的温度、离子强度和ph的条件下自身催化地合成靶核酸序列的多个拷贝，其中靶序列的多个rna拷贝自身催化地生成另外的拷贝，tma任选地包括使用阻断，部分、终止部分和其他修饰部分，以改善tma过程的灵敏度和准确度；lcr使用与靶核酸的相邻区域杂交的两组互补dna寡核苷酸。dna寡核苷酸在热变性、杂交和连接的重复多个循环中通过dna连接酶共价连接，以产生可检测的双链连接寡核苷酸产物；sda使用以下步骤的多个循环：引物序列对与靶序列的相反链进行退火，在存在dntpαs下进行引物延伸以产生双链半硫代磷酸化的(hemiphosphorothioated)引物延伸产物，半修饰的限制性内切酶识别位点进行的核酸内切酶介导的切刻，以及从切口3'端进行的聚合酶介导引的物延伸以置换现有链并产生供下一轮引物退火、切刻和链置换的链，从而引起产物的几何扩增。

本发明中非扩增或扩增的核酸可通过任何常规的手段检测。

本发明中的核酸杂交技术包括但不限于原位杂交(ish)、微阵列和southern或northern印迹。原位杂交(ish)是一种使用标记的互补dna或rna链作为探针以定位组织一部分或切片(原位)或者如果组织足够小则为整个组织(全组织包埋ish)中的特异性dna或rna序列的杂交。dnaish可用于确定染色体的结构。rnaish用于测量和定位组织切片或全组织包埋内的mrna和其他转录本(例如，ncrna)。通常对样本细胞和组织进行处理以原位固定靶转录本，并增加探针的进入。探针在高温下与靶序列杂交，然后将多余的探针洗掉。分别使用放射自显影、荧光显微术或免疫组织化学，对组织中用放射、荧光或抗原标记的碱基标记的探针进行定位和定量。ish也可使用两种或更多种通过放射性或其他非放射性标记物标记的探针，以同时检测两种或更多种转录本。

将southern和northern印迹分别用于检测特异性dna或rna序列。使从样本中提取的dna或rna断裂，在基质凝胶上通过电泳分离，然后转移到膜滤器上。使滤器结合的dna或rna与和所关注的序列互补的标记探针杂交。检测结合到滤器的杂交探针。该程序的一种变化形式是反向northern印迹，其中固定到膜的底物核酸为分离的dna片段的集合，而探针是从组织提取并进行了标记的rna。

芯片、试剂盒

本发明所述的芯片包括：固相载体；以及有序固定在所述固相载体上的寡核苷酸探针，所述的寡核苷酸探针特异性地对应于loc103611081所示的部分或全部序列。

具体地，可根据本发明所述的lncrna，设计出适合的探针，固定在固相载体上，形成“寡核苷酸阵列”。所述的“寡核苷酸阵列”是指具有可寻址位置(即以区别性的，可访问的地址为特征的位置)的阵列，每个可寻址位置均含有一个与其相连的特征性寡核苷酸。根据需要，可将寡核苷酸阵列分成多个亚阵。

在本发明中，所述固相载体包括塑料制品、微颗粒、膜载体等。所述塑料制品可通过非共价或物理吸附机制与抗体或蛋白抗原相结合，最常用的塑料制品为聚苯乙烯制成的小试管、小珠和微量反应板；所述微颗粒是由高分子单体聚合成的微球或颗粒，其直径多为微米，由于带有能与蛋白质结合的功能团，易与抗体(抗原)形成化学偶联，结合容量大；所述膜载体包括硝酸纤维素膜、玻璃纤维素膜及尼龙膜等微孔滤膜。

“探针”指能与另一分子的特定序列或亚序列或其它部分结合的分子。除非另有指出，术语“探针”通常指能通过互补碱基配对与另一多核苷酸(往往称为“靶多核苷酸”)结合的多核苷酸探针。根据杂交条件的严谨性，探针能和与该探针缺乏完全序列互补性的靶多核苷酸结合。探针可作直接或间接的标记，其范围包括引物。杂交方式，包括，但不限于：溶液相、固相、混合相或原位杂交测定法。

“探针”指能与另一分子的特定序列或亚序列或其它部分结合的分子。除非另有指出，术语“探针”通常指能通过互补碱基配对与另一多核苷酸(往往称为“靶多核苷酸”)结合的多核苷酸探针。根据杂交条件的严谨性，探针能和与该探针缺乏完全序列互补性的靶多核苷酸结合。探针可作直接或间接的标记，其范围包括引物。杂交方式，包括，但不限于：溶液相、固相、混合相或原位杂交测定法。

所述探针具有与靶点基因的特定的碱基序列互补的碱基序列。这里，所谓“互补”，只要是杂交即可，可以不是完全互补。这些多核苷酸通常相对于该特定的碱基序列具有80％以上、优选90％以上、更优选95％以上、特别优选100％的同源性。这些探针可以是dna，也可以是rna，另外，可以为在其一部分或全部中核苷酸通过pna(polyamidenucleicacid，肽核酸)、lna(注册商标，lockednucleicacid，bridgednucleicacid，交联化核酸)、ena(注册商标，2′-o,4′-c-ethylene-bridgednucleicacids)、gna(glycerolnucleicacid，甘油核酸)、tna(threosenucleicacid，苏糖核酸)等人工核酸置换得到的多核苷酸。

术语“同源性”是指互补性的程度。可以存在部分同源性或完全同源性(即，同一性)。部分互补的序列是至少部分地抑制完全互补的核酸分子与“基本上同源的”靶核酸杂交的核酸分子。完全互补序列与靶序列的杂交的抑制可通过在低严格性条件下使用杂交测定(southern或northern印迹、液相杂交等)进行检查。基本上同源的序列或探针将竞争并抑制完全同源的核酸分子在低严格性条件下与靶标的结合(即，杂交)。这并非是说，低严格性条件是使得允许非特异性结合的条件；低严格性条件要求两个序列彼此之间的结合为特异性(即，选择性)的相互作用。非特异性结合的不存在可通过使用基本上非互补(例如，低于约30％同一性)的第二靶标进行测试；在不存在非特异性结合的情况下，探针将不与第二非互补靶标杂交。

本发明中的术语“杂交”用于指代互补核酸的配对。杂交和杂交强度(即，核酸之间的缔合强度)受诸如以下的因素影响：核酸之间的互补程度、所涉及的条件的严格性、形成的杂交体的tm和核酸内的g:c比率。在其结构内含有互补核酸的配对的单个分子称为“自我杂交的”。

本发明针对loc103611081基因的寡核苷酸探针可以是dna、rna、dna-rna嵌合体、pna或其它衍生物。所述探针的长度没有限制，只要完成特异性杂交、与目的核苷酸序列特异性结合，任何长度都可以。所述探针的长度可短至25、20、15、13或10个碱基长度。同样，所述探针的长度可长至60、80、100、150、300个碱基对或更长，甚至整个基因。由于不同的探针长度对杂交效率、信号特异性有不同的影响，所述探针的长度通常至少是14个碱基对，最长一般不超过30个碱基对，与目的核苷酸序列互补的长度以15-25个碱基对最佳。所述探针自身互补序列最好少于4个碱基对，以免影响杂交效率。

本发明的试剂盒包括检测有效量的检测loc103611081基因的试剂，选自下组的一种或多种物质：容器、使用说明书、阳性对照物、阴性对照物、缓冲剂、助剂或溶剂。例如用于混悬或固定细胞的溶液，可检测的标签或标记，使核酸易于杂交的溶液，用于裂解细胞的溶液，或用于核酸纯化的溶液。

本发明的试剂盒中还可附有试剂盒的使用说明书，其中记载了如何采用试剂盒进行检测，和如何利用检测结果对疾病发展进行判断。

采用本发明的试剂盒，可通过选自下组的各种方法(包括但不限于)检测loc103611081：实时定量反转录pcr、生物芯片检测法、dna印迹法、或rna印迹法或原位杂交法。本领域普通技术人员可根据实际条件和需要对检测方式进行调整和改变。

本发明的芯片或试剂盒可用于检测包括loc103611081基因在内的多个基因(例如与缺血性脑卒中相关的多个基因)的表达水平。

样本

在本发明中，“样本”包括(但不限于)，可以是血液、组织、尿液、血清、血浆、羊水、脑脊液、胎盘细胞或者组织、内皮细胞、白细胞或单核细胞。样品可以得自患者或对象直接使用，或者进行预处理，如通过过滤、蒸馏、提取、浓缩、离心、失活干扰成分、加入试剂等方式处理，以如本文所述或者本领域已知的一些方式修饰样品的特性。在本发明的具体实施例中，所述“样本”为血液。

本发明中的术语“诊断”是指通过疾病的体征和症状或遗传分析、病理分析、组织学分析等识别疾病。

下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如sambrook等人，分子克隆：实验室手册(newyork:coldspringharborlaboratorypress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1筛选与缺血性脑卒中相关的基因标志物

1、样品收集

各收集10例正常人血液和缺血性脑卒中患者的血液，患者均知情同意，上述所有标本的取得均通过组织伦理委员会的同意。

2、rna样品的制备

1)临床血清样本收集后12000rpm高速离心10min，重复2次。

2)吸取250μ1的血清样本至1.5m1ep管，加750μ1trizollsreagent，吹打混匀，静置5min。

3)加氯仿(chcl3：trizol250μ1:750μ1)，颠倒混匀，静置15min，4℃，12000rpm，离心15min。

4)小心吸取上层液体至一新ep管，加适量异丙醇(异丙醇：trizo1500μ1：750μ1)，颠倒混匀，静置10min；4℃，12000rpm离心10min。

5)弃上层离心液，加75％乙醇(rna酶灭活)；4℃，8000rpm离心5min；

6)保留沉淀，弃上层离心液，室温静置5-10min；加入适量depc水溶解沉淀，取适量rna溶液测浓度及观察rna抽提情况。

3、逆转录和标记

用lowrnainputlinearamplificationkit将mrna逆转录成cdna，同时用cy3分别标记实验组和对照组。

4、杂交

基因芯片采用康城生物-humanlncrnaarray，按芯片使用说明书的步骤进行杂交。

5、数据处理

杂交后芯片用agilent扫描仪扫描,分辨率为5μm，扫描仪自动以100％和10％pmt各扫描1次，2次结果agilent软件自动合并。扫描图像数据采用feature

extraction进行处理分析，得到的原始数据应用bioconductor程序包进行后续数据处理。最后ratio值为实验组和对照组。差异基因筛选标准：ratio≥4为上调基因，ratio≤0.25为下调基因。

6、结果

结果如图1所示，与健康人血液相比，loc103611081在缺血性脑卒中患者中的表达水平显著高于健康人的表达水平。

实施例2qpcr测序验证loc103611081基因的差异表达

1、对loc103611081基因差异表达进行大样本qpcr验证。按照实施例1中的样本收集方式选择正常人和缺血性脑卒中患者的血样样本各60例。

2、rna提取步骤同实施例1。

3、逆转录：

(1)逆转录反应：

配置25μl反应体系：depc水，5×逆转录缓冲液，10mmdntp，0.1mmdtt，30μmoligodt，200u/μlm-mlv，1μg模板rna。

将上述体系吹打混匀，42℃孵育1h，72℃10min，短暂离心。

(2)引物设计：

loc103611081基因的引物序列为：

正向引物：5’-aactgaagaaccacaagagaag-3’(seqidno.2)

反向引物：5’-ttgctgtccaggagaagg-3’(seqidno.3)

管家基因gapdh的引物序列为：

正向引物：5’-ccgggaaactgtggcgtgatgg-3’(seqidno.4)

反向引物：5’-aggtggaggagtgggtgtcgctgtt-3’(seqidno.5)

(3)qpcr扩增检验：

配制以下反应体系：sybrgreen聚合酶链式反应体系12.5μl，正反向引物(5μm)各1μl，模板cdna2.0μl，无酶水8.5μl；每个样本设置3个平行管，各项操作均于冰上进行。

扩增程序为：95℃60s，(95℃15s，60℃15s，72℃45s)×40个循环。

以sybrgreen作为荧光标记物，在lightcycler荧光实时定量pcr仪上进行pcr反应，通过融解曲线分析和电泳确定目的条带，δδct法进行相对定量。

3、统计学方法

实验都是按照重复3次来完成的，结果数据都是以平均值±标准差的方式来表示，采用spss18.0统计软件来进行统计分析的，两者之间的差异采用t检验，认为当p<0.05时具有统计学意义。

4、结果

结果如图2所示，与健康人相比，loc103611081基因在缺血性脑卒中患者中表达上调，差异具有统计学意义(p<0.05)，同rna-sep结果一致。

上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。

sequencelisting

<110>王思奎刘志国孙长法

<120>一种与脑卒中发生发展相关的基因的用途

<160>5

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>3999

<212>dna

<213>人源

<400>1

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