本发明属于动物肠衣提取
技术领域：
，具体涉及一种肝素钠的提取方法。
背景技术：
：肝素是一种由d-葡糖胺、d-葡糖醛酸、n-乙酰葡萄糖胺和l-艾杜糖醛酸交替组成的酸性黏多糖，广泛存在于哺乳动物肠黏膜、心脏、肝脏、肺、血液、胰腺和胎盘等组织中，具有良好的抗凝血、降血脂、促纤维蛋白溶解、抗中膜平滑肌细胞增殖等方面的活性，被广泛用于心脑血管疾病的治疗。在肝素提取过程中，通常将其以钠盐的形式制备—肝素钠，便于药效和活性的保存，同时可作为药物制剂使用，其在于临床应用上已具有60多年的历史，但目前仍然只能从动物部分组织中提取，无法通过人工合成制备，其中以小肠黏膜为提取最佳原料；但现有企业通过小肠黏膜提取得到的肝素钠纯度低，收率低。技术实现要素：针对现有技术中的上述不足，本发明提供一种肝素钠的提取方法，可有效解决肝素钠提取收率低和纯度低的问题。一种肝素钠的提取方法，包括以下步骤：(1)收集新鲜猪小肠黏膜，于0～4℃保存备用；(2)向小肠黏膜中加入为其重量4～5倍的水，升温至60～65℃，并在升温的同时搅拌分散，保温20～30min，再降温至30～45℃；(3)向步骤(2)所得的小肠黏膜溶液中加入0.4～0.8％小肠黏膜重量的复合蛋白酶，调节溶液ph值为8.5～9，于40～45℃下酶解3～4h，过滤，收集酶解液ⅰ和滤渣；以滤渣为底物，重复上述酶解操作，离心，收集酶解液ⅱ，将酶解液ⅰ和酶解液ⅱ合并；(4)用2～3倍树脂重量的20％～25％氯化钠溶液浸泡树脂，并搅拌2～3h，再分别使用0.5～1.5倍树脂重量的10％氯化钠溶液和5％氯化钠溶液洗脱树脂，每次1～2h；(5)向合并后的酶解液中加入氯化钠溶液，搅拌混合5～10min，于60～70℃保温10～20min，再加入步骤(4)中处理后的树脂，于室温下搅拌吸附4～6h，搅拌速度为50～100r/min，过滤，分别收集滤液和树脂；并向滤液中加入为其体积6％～8％的氯化钠溶液，再加入过量90％乙醇沉淀，收集并干燥析出物ⅰ；其中，酶解液与树脂的体积重量比v:m＝12～15；氯化钠溶液体积占酶解液体积的1％～4％；所述氯化钠溶液浓度为0.5～1mol/l；(6)向树脂中加入1～2倍树脂重量的氯化钠溶液洗脱2～3次，每次3～5h，合并洗脱液，再加入0.4％的胰蛋白酶酶解2～3h，然后等体积95％乙醇沉淀，收集并干燥析出物ⅱ；(7)将析出物ⅰ和析出物ⅱ混合，加水溶解，再分别加入0.1％混合物重量的过氧化氢和4％～8％混合物重量的单宁酸，搅拌混合，放置5～10min，过滤，然后向滤液中加入等体积的90％乙醇沉淀，收集并干燥析出物，得肝素钠纯品。进一步地，步骤(3)中复合蛋白酶的重量为小肠黏膜重量的0.4％。进一步地，步骤(3)中复合蛋白酶包括胰蛋白酶和木瓜蛋白酶，胰蛋白酶和木瓜蛋白酶的重量比为2:1。进一步地，步骤(5)中氯化钠浓度为0.8mol/l，加入量为1.5％酶解液体积。进一步地，步骤(5)中树脂为粒径为150～200目的d-254树脂或wd-1701树脂，其粒径为150～200目。进一步地，步骤(6)中氯化钠溶液浓度为1.6mol/l。进一步地，步骤(7)中单宁酸的重量为混合物重量的4％。本发明的有益效果为：1、复合蛋白酶有助于使小肠黏膜中的肝素提取更加完全，同时，由于溶液中带负电的游离蛋白会与树脂反应，被树脂吸附，因此，在保证提取更加完全的条件下，尽可能少的添加复合蛋白酶，同时在树脂吸附前，高温使蛋白酶变性，降低溶液中游离蛋白的量，提升树脂的吸附率。2、粒径为150～200目的树脂具有较大的比表面积，其立体空间外侧具有孔径较大的吸水树脂网，另外，使用氯化钠浸泡后的树脂具有更强的渗透性，可有效提升树脂的吸附效率，提升肝素钠的收率。3、肝素钠被树脂吸附后，浓度为1.6mol/l的氯化钠溶液对肝素钠具有最大洗脱效率。4、本发明经两次酶解、吸附、解吸附以及再次酶解的工艺提取小肠黏膜内的肝素钠，通过本发明方法，可使肝素钠的收率达到一亿u/1000～1200根小肠，效价可达160u/mg。5、加入1％混合析出物重量的过氧化氢对析出物进行氧化，使产物氧化彻底，提升产物效价，同时，还可避免产物因过度氧化而导致失活的问题。6、通过单宁酸的作用，可使析出物溶液中剩余的蛋白等杂质凝结沉淀，以提升制备得到的肝素钠的纯度。具体实施方式下面对本发明的具体实施方式进行描述，以便于本
技术领域：
的技术人员理解本发明，但应该清楚，本发明不限于具体实施方式的范围，对本
技术领域：
的普通技术人员来讲，只要各种变化在所附的权利要求限定和确定的本发明的精神和范围内，这些变化是显而易见的，一切利用本发明构思的发明创造均在保护之列。实施例1一种肝素钠的提取方法，包括以下步骤：(1)收集新鲜猪小肠黏膜，于4℃保存备用；(2)向小肠黏膜中加入为其重量4倍的水，升温至65℃，并在升温的同时搅拌分散，保温30min，再降温至45℃；(3)向步骤(2)所得的小肠黏膜溶液中加入0.8％小肠黏膜重量的胰蛋白酶和木瓜蛋白酶的混合物，调节溶液ph值为9，于45℃下酶解4h，过滤，收集酶解液ⅰ和滤渣；以滤渣为底物，重复上述酶解操作，离心，收集酶解液ⅱ，将酶解液ⅰ和酶解液ⅱ合并；其中，胰蛋白酶和木瓜蛋白酶的重量比为2:1；(4)用3倍粒径为180目的d-254树脂重量的25％氯化钠溶液浸泡树脂，并搅拌3h，再分别使用1.5倍树脂重量的10％氯化钠溶液和5％氯化钠溶液洗脱树脂，每次2h；(5)向合并后的酶解液中加入体积为酶解液体积的4％，浓度为1mol/l的氯化钠溶液，搅拌混合10min，于70℃保温20min，再加入步骤(4)中处理后的d-254树脂，于室温下搅拌吸附6h，搅拌速度为100r/min，过滤，分别收集滤液和d-254树脂；并向滤液中加入为其体积8％，浓度为1mol/l的氯化钠溶液，再加入过量90％乙醇沉淀，收集并干燥析出物ⅰ；其中，酶解液与d-254树脂的体积重量比v:m＝12；(6)向d-254树脂中加入1～2倍其重量，浓度为1.6mol/l的氯化钠溶液洗脱3次，每次3.5h，合并洗脱液，再加入0.4％的胰蛋白酶酶解3h，然后等体积95％乙醇沉淀，收集并干燥析出物ⅱ；(7)将析出物ⅰ和析出物ⅱ混合，加水溶解，再分别加入0.1％混合物重量的过氧化氢和8％混合物重量的单宁酸，搅拌混合，放置10min，过滤，然后向滤液中加入等体积的90％乙醇沉淀，收集并干燥析出物，得肝素钠纯品。实施例2一种肝素钠的提取方法，包括以下步骤：(1)收集新鲜猪小肠黏膜，于4℃保存备用；(2)向小肠黏膜中加入为其重量4倍的水，升温至60℃，并在升温的同时搅拌分散，保温20min，再降温至30℃；(3)向步骤(2)所得的小肠黏膜溶液中加入0.4～％小肠黏膜重量的胰蛋白酶和木瓜蛋白酶的混合物，调节溶液ph值为8.5，于4℃下酶解3h，过滤，收集酶解液ⅰ和滤渣；以滤渣为底物，重复上述酶解操作，离心，收集酶解液ⅱ，将酶解液ⅰ和酶解液ⅱ合并；其中，胰蛋白酶和木瓜蛋白酶的重量比为2:1；(4)用2倍粒径为200目的d-254树脂重量的20％氯化钠溶液浸泡d-254树脂，并搅拌2～3h，再分别使用0.5倍d-254树脂重量的10％氯化钠溶液和5％氯化钠溶液洗脱，每次1.5h；(5)向合并后的酶解液中加入体积为酶解液体积的1％，浓度为0.5mol/l的氯化钠溶液，搅拌混合5min，于60℃保温10min，再加入步骤(4)中处理后的d-254树脂，于室温下搅拌吸附4h，搅拌速度为80r/min，过滤，分别收集滤液和d-254树脂；并向滤液中加入为其体积6％的氯化钠溶液，再加入过量90％乙醇沉淀，收集并干燥析出物ⅰ；其中，酶解液与d-254树脂的体积重量比v:m＝13.5；(6)向d-254树脂中加入1倍其重量，浓度为1.6mol/l的氯化钠溶液洗脱2次，每次4h，合并洗脱液，再加入0.4％的胰蛋白酶酶解2h，然后等体积95％乙醇沉淀，收集并干燥析出物ⅱ；(7)将析出物ⅰ和析出物ⅱ混合，加水溶解，再分别加入0.1％混合物重量的过氧化氢和4％混合物重量的单宁酸，搅拌混合，放置8min，过滤，然后向滤液中加入等体积的90％乙醇沉淀，收集并干燥析出物，得肝素钠纯品。实施例3一种肝素钠的提取方法，包括以下步骤：(1)收集新鲜猪小肠黏膜，于4℃保存备用；(2)向小肠黏膜中加入为其重量5倍的水，升温至65℃，并在升温的同时搅拌分散，保温28min，再降温至40℃；(3)向步骤(2)所得的小肠黏膜溶液中加入0.4％小肠黏膜重量的胰蛋白酶和木瓜蛋白酶的混合物，调节溶液ph值为8.5，于40℃下酶解3h，过滤，收集酶解液ⅰ和滤渣；以滤渣为底物，重复上述酶解操作，离心，收集酶解液ⅱ，将酶解液ⅰ和酶解液ⅱ合并；其中，胰蛋白酶和木瓜蛋白酶的重量比为2:1；(4)用2倍粒径为200目的d-254树脂重量的25％氯化钠溶液浸泡树脂，并搅拌3h，再分别使用1倍d-254树脂重量的10％氯化钠溶液和5％氯化钠溶液洗脱，每次2h；(5)向合并后的酶解液中加入体积为酶解液体积的4％，浓度为1mol/l的氯化钠溶液，搅拌混合8min，于70℃保温20min，再加入步骤(4)中处理后的d-254树脂，于室温下搅拌吸附6h，搅拌速度为100r/min，过滤，分别收集滤液和d-254树脂；并向滤液中加入为其体积6％的氯化钠溶液，再加入过量90％乙醇沉淀，收集并干燥析出物ⅰ；其中，酶解液与树脂的体积重量比v:m＝12～15；(6)向树脂中加入2倍树脂重量，浓度为1.6mol/l的氯化钠溶液洗脱2次，每次4h，合并洗脱液，再加入0.4％的胰蛋白酶酶解2h，然后等体积95％乙醇沉淀，收集并干燥析出物ⅱ；(7)将析出物ⅰ和析出物ⅱ混合，加水溶解，再分别加入0.1％混合物重量的过氧化氢和4％混合物重量的单宁酸，搅拌混合，放置5min，过滤，然后向滤液中加入等体积的90％乙醇沉淀，收集并干燥析出物，得肝素钠纯品。检测例在相同条件下检测实施例1～3所得的肝素钠纯品的收率和纯度，其结果见表1。表1肝素钠收率和纯度收率(％)纯度(％)实施例194.297.6实施例293.596.4实施例396.897.3由表1可知，实施例1～3所得肝素钠收率均大于90％，纯度均高于95％，尤其是实施例3，收率达到96.8％，纯度为97.3％。当前第1页12