本发明设计一种中草药的制备方法，具体涉及一种甘草次酸的制备方法，属于化学纯化技术领域。
背景技术：
甘草次酸是天然中药甘草的重要组成成分之一。甘草酸为甘草的主要组成成分，甘草中甘草次酸又是甘草酸的系列衍生物之一，且研究表明在体内甘草酸转化成甘草次酸后发挥药理作用，包括解毒、抑制肝纤维化、抗炎、抗肿瘤等作用。近年的研究表明，甘草酸和甘草次酸均有一定的防癌和抗癌作用.甘草次酸可抑制原癌。此外，甘草次酸及其衍生物可用于天然防腐剂、天然增色剂和天然增稠剂.takada制作了含甘草次酸的防晒霜,可用来治疗晒斑引起的炎症;fukushi等研究发现牙膏中含有甘草次酸时可抑制口腔疾病.由此可见甘草次酸及其衍生物在食品、化妆品、日用化学品领域也有着良好的应用前景。故此，甘草次酸在食品、医药、化妆品等各行各业中具有广泛的应用价值和应用前景。
目前工业生产甘草次酸以酸水解为主，对环境污染严重。还有在实验室条件下以生物转化方式进行甘草次酸的小规模生产，尽管转化率高，相对环保，但由于成本高等原因并未应用于工业生产。甘草酸转化为甘草次酸的生物转化方法已经成为国内外研究热点，其中微生物方法转化的研究思路有可能在未来应用于工业化生产，微生物转化方式环保、高效，将生物技术应用于中药有效物质的生产研究中来，解决药物甘草次酸的工业生产问题是目前主要存在的问题。
技术实现要素：
为解决现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种方法简单、环境友好的甘草次酸的制备方法。
为了实现上述目标，本发明采用如下的技术方案：
一种甘草次酸的制备方法，包括以下步骤：
s1配制基础液体培养基：所述的基础液体培养基的组成为：蒸馏水+土豆+蔗糖+链霉素；
s2接种：向发酵罐中的基础液体培养基中加入甘草酸，至基础液体培养基的ph值为5-6，同时将种子液接种到发酵罐中，种子液的接种体积为基础液体培养基体积的1.5-2.5%，并于20-30℃的温度条件下培养65-75h，得到发酵液；
s3提取：将步骤s2得到的发酵液，利用微波破壁5-8min，微波功率500w，然后过滤，再向滤液中加入0.5-1倍滤液体积的乙酸乙酯，同样条件提取3次，合并提取液后经50℃真空旋转蒸干，得甘草次酸粗品；
s4脱色：将步骤s3得到的甘草次酸粗品溶解到乙醇溶液中，甘草次酸粗品与乙醇溶液的料液比为：1g：（1-2）ml，然后向溶解液中加入活性炭脱色，活性炭的加入质量为甘草次酸粗品质量的6-8%，然后过滤后，滤液在20-25℃的条件下进行重结晶6-8h，再次过滤后，将结晶体在48-52℃的温度条件下烘干7-9h，得到甘草次酸成品。
进一步，s1步骤中，所述的基础液体培养基的具体配置过程为：
首先向发酵罐中加入蒸馏水，然后加入去皮切块的土豆，土豆和蒸馏水的料液比为：1g：5ml，煮沸30min，然后用4~6层纱布过滤，滤液中加入蔗糖，蔗糖与蒸馏水原始用量的料液比为：1g：50ml，再加蒸馏水定容至原始体积，并于121℃灭菌30min，当温度降至50℃时加入链霉素，链霉素与蒸馏水的料液比为：0.05mg：1ml。
s2步骤中，所述的种子液的制备方法为：将菌株从冰箱取出，室温放置0.5-1h，然后于无菌条件下接种于装有种子液培养基的250ml锥形瓶中，锥形瓶中种子液培养基的装样量为40%，置于30℃恒温振荡器中培养，转速为120r·min-1，监测菌液od600nm，当发酵液的od600nm为0.3-0.5时，即得种子液。
且，上述的菌株为自主诱导培养，编号为tsp-c-15，具体培养过程为：
（1）制备初筛菌液：取甘草酸，置于锥形瓶中，加蒸馏水，所述甘草酸和蒸馏水的料液比为：1g：20ml，置于20-25℃的阴凉处放置培养，每日轻摇锥形瓶两次，每4h一次，随时观察菌的生长情况，20天后得初筛菌液；
（2）将初筛菌液接种到初筛固体培养基上，置于30℃恒温培养箱中培养72h；
（3）从初筛固体培养基中挑取长势较好的单菌落，用“三段划线法”进行分离纯化后，再将分离纯化的菌株接种于斜面的初筛固体培养基中，进行编号，然后置于4℃冷藏保存，备用；
（4）在无菌条件下，将初筛所得菌株分别接种到复筛液体培养基中，于30℃恒温振荡器中发酵培养；
（5）于2、4、8、14、24h后，分别取样检测甘草次酸含量，最终选出（甘草酸转化为甘草次酸的转化率高于50%适合工业生产的菌株tsp-c-15。
更进一步，上述的初筛固体培养基的具体配置过程为：
200ml蒸馏水中加入20.00g去皮切块的土豆，煮沸30min，然后用4~6层纱布过滤，滤液中加入4.00g蔗糖，3.60g琼脂，加蒸馏水定容至200ml，121℃灭菌30min，当温度降至50℃加入2.00g灭菌的甘草酸充分混合后得到初筛固体培养基。且，上述的复筛固体培养基为基础液体培养基。
此外，上述的种子液培养基的具体配置过程为：
首先向发酵罐中加入蒸馏水，然后加入去皮切块的土豆，土豆和蒸馏水的料液比为：1g：5ml，煮沸30min，然后用4~6层纱布过滤，滤液中加入蔗糖，蔗糖与蒸馏水原始用量的料液比为：1g：50ml，再加蒸馏水定容至原始体积，并于121℃灭菌30min，当温度降至50℃时加入链霉素，链霉素与蒸馏水的料液比为：0.05mg：1ml。
s3步骤中，所述的乙醇的浓度为95%。
本发明的有益之处在于：本发明所述的方法利用生物转化方法，减少了有机溶剂的使用，整个制备过程对环境非常友好，同时生产工艺条件温和，操作简单，易于实现，减少了对甘草次酸的破坏，且工艺稳定，可实现工业化大规模生产。
附图说明
图1为目标产物和甘草次酸样品的hplc图谱。
具体实施方式
以下结合具体实施例对本发明作具体的介绍。
以下所有实施例中，所使用的基础液体培养基相同，且基础液体培养基的具体配置过程为：
1）制备种子液培养基：首先向发酵罐中加入蒸馏水，然后加入去皮切块的土豆，土豆和蒸馏水的料液比为：1g：5ml，煮沸30min，然后用4~6层纱布过滤，滤液中加入蔗糖，蔗糖与蒸馏水原始用量的料液比为：1g：50ml，再加蒸馏水定容至原始体积，并于121℃灭菌30min，当温度降至50℃时加入链霉素，链霉素与蒸馏水的料液比为：0.05mg：1ml；
2）选取菌株：具体过程为：
（1）制备初筛菌液：取甘草酸，置于锥形瓶中，加蒸馏水，所述甘草酸和蒸馏水的料液比为：1g：20ml，置于20-25℃的阴凉处放置培养，每日轻摇锥形瓶两次，每次4h，随时观察菌的生长情况，20天后得初筛菌液；
（2）将初筛菌液接种到初筛固体培养基上，置于30℃恒温培养箱中培养72h；
（3）从初筛固体培养基中挑取长势较好的单菌落，用“三段划线法”进行分离纯化后，再将分离纯化的菌株接种于斜面的初筛固体培养基中，进行编号，然后置于4℃冷藏保存，备用，且初筛固体培养基的具体配置过程为：200ml蒸馏水中加入20.00g去皮切块的土豆，煮沸30min，然后用4~6层纱布过滤，滤液中加入4.00g蔗糖，3.60g琼脂，加蒸馏水定容至200ml，121℃灭菌30min，当温度降至50℃加入2.00g灭菌的甘草酸充分混合后得到初筛固体培养；
（4）在无菌条件下，将初筛所得菌株分别接种到复筛液体培养基中，于30℃恒温振荡器中发酵培养；
（5）于2、4、8、14、24h后，分别取样检测甘草次酸含量，最终选出（甘草酸转化为甘草次酸的转化率高于50%适合工业生产的菌株tsp-c-15。
3）制备种子液：将菌株从冰箱取出，室温放置0.5-1h，然后于无菌条件下接种于装有种子液培养基的250ml锥形瓶中，锥形瓶中种子液培养基的装样量为40%，置于30℃恒温振荡器中培养，转速为120r·min-1，监测菌液od600nm，当发酵液轻微浑浊状态（当od600nm为0.3-0.5时），即得种子液；
4）配置基础液体培养基：首先向发酵罐中加入蒸馏水，然后加入去皮切块的土豆，土豆和蒸馏水的料液比为：1g：5ml，煮沸30min，然后用4~6层纱布过滤，滤液中加入蔗糖，蔗糖与蒸馏水原始用量的料液比为：1g：50ml，再加蒸馏水定容至原始体积，并于121℃灭菌30min，当温度降至50℃时加入链霉素，链霉素与蒸馏水的料液比为：0.05mg：1ml。
实施例1
首先，在发酵罐中配制5l基础液体培养基，然后向发酵罐中的基础液体培养基中加入35g甘草酸，此时，基础液体培养基的ph值为5.2，同时将体积百分比为2.5%的20ml种子液接种到发酵罐中，于20℃的温度条件下培养65h，得到发酵液，再取发酵液进行微波破壁5min，然后过滤，再向滤液中加入0.5倍滤液体积的乙酸乙酯，同样条件提取3次，合并提取液后经浓缩、干燥得甘草次酸粗品；最后将得到的甘草次酸粗品溶解到1bv的乙醇溶液中，然后向溶解液中加入6%的活性炭脱色，再过滤，滤液进行重结晶，再一次过滤后，将结晶体烘干得到甘草次酸成品。
最终产物甘草次酸的确认过程为：
将甘草次酸对照品加入到样品中，同时和制备得到的甘草次酸进行hplc图谱分析，由图1所示的hplc图谱可知：二者在同一位置出峰，可证明制备得到的甘草次酸与甘草次酸对照品的保留时间相同，故可说明制备得到的产品为甘草次酸。
实施例2
首先，在发酵罐中配制6l基础液体培养基，然后向发酵罐中的基础液体培养基中加入42g甘草酸，此时，基础液体培养基的ph值为5.6，同时将体积百分比为2.0%的种子液24ml接种到发酵罐中，于25℃的温度条件下培养70h，得到发酵液，再取发酵液进行微波破壁6min，然后过滤，再向滤液中加入0.5倍滤液体积的乙酸乙酯，同样条件提取3次，合并提取液后经浓缩、干燥得甘草次酸粗品；最后将得到的甘草次酸粗品溶解到1.5bv的乙醇溶液中，然后向溶解液中加入7%的活性炭脱色，再过滤，滤液进行重结晶，再一次过滤后，将结晶体烘干得到甘草次酸成品。
实施例3
首先，在发酵罐中配制8l基础液体培养基，然后向发酵罐中的基础液体培养基中加入56g甘草酸，此时，基础液体培养基的ph值为6.0，同时将体积百分比为1.6%的种子液32ml接种到发酵罐中，于20-30℃的温度条件下培养65-75h，得到发酵液，再取发酵液进行微波破壁8min，然后过滤，再向滤液中加入1倍滤液体积的乙酸乙酯，同样条件提取3次，合并提取液后经浓缩、干燥得甘草次酸粗品；最后将得到的甘草次酸粗品溶解到2bv的乙醇溶液中，然后向溶解液中加入8%的活性炭脱色，再过滤，滤液进行重结晶，再一次过滤后，将结晶体烘干得到甘草次酸成品。
实施例1-3制备得到的甘草次酸的质量以及纯度和得率如表1所示：
表1：
由表1可知：甘草次酸产品的纯度为90%以上，得率为60%左右。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和优点。本行业的技术人员应该了解，上述实施例不以任何形式限制本发明，凡采用等同替换或等效变换的方式所获得的技术方案，均落在本发明的保护范围内。