用于鉴别国家级茶树良种‘迎霜’的分子特异性标记引物及其鉴别方法与流程

本发明涉及一种鉴别国家级茶树良种‘迎霜’camelliasinensiscv.‘yingshuang’的分子特异性标记引物，以及利用该特异性标记引物对‘迎霜’进行快速鉴别的方法。

背景技术：

‘迎霜’camelliasinensiscv.‘yingshuang’是由杭州市农业科学研究院茶叶研究所选育而成的茶树品种，具有芽叶生育力强、持嫩性强、产量高、扦插繁殖力强、品质好等优点。1980年通过浙江省级鉴定，1987年被全国农作物品种审定委员会认定为国家级茶树良种，编号为gs13041-1987。该品种适于制作红茶、绿茶，其茶品质优、香高、味浓鲜。浙江省农业厅将‘迎霜’茶树品种列为浙江省种植业主导品种之一。全国大部分产茶区有引种。目前，浙江、江苏、江西、安徽、河南、湖南、湖北及广西等省区有较大面积栽培。

‘迎霜’芽叶呈绿色，其形态学特征与其他芽叶为绿色的茶树品种非常相似(见附图1)。因此，利用传统形态学鉴别方法很难将它们区分开，特别是在种苗交易过程中，茶农常常因为难以辨认而买到假冒伪劣种苗，导致经济损失严重。这也为该茶树良种的保护和利用带来了一定的困难。

dna分子标记技术可以通过基因序列差异比较分析为植物鉴别、系统分类提供直接的证据。作为我国的热点经济作物，目前，常规分子标记技术在茶树品种的遗传多样性研究方面有了较多的应用。例如：rapd(陈志丹等，闽南乌龙茶茶树种质资源rapd指纹图谱构建及遗传多样性分析，分子植物育种，2012，10(6)：731-739)、ssr(张明泽，黔南60份茶树种质资源遗传多样性的ssr分析，西北植物学报，2016，36(6)：1117-1124)、scot(陈熙等，scot标记分析陕西茶树资源的遗传多样性，茶叶科学，2016，36(2)：131-138)、issr及srap(利用srap和issr标记分析广东茶树种质资源的遗传多样性，核农学报2010，24(5)：948-955)。这些研究为茶树品种的遗传多样性评价和保护奠定了重要基础。然而，常规的分子标记技术大多采用通用随机引物进行pcr扩增，其pcr产物指纹图谱比较复杂、重复性较差。因此，这些方法在植物种质特别是品种鉴定中的应用性不强。特异性分子标记技术的引物具有很好的稳定性和专一性，能够进行特异性扩增，因此该技术在植物种质鉴定中具有很好的应用前景。目前尚未有特异性分子标记技术应用茶树品种‘迎霜’鉴别的研究报道。本专利通过开发一种迎霜的分子特异性标记引物，并建立其鉴别方法，为实现该名优茶树品种的真伪鉴别及保护提供技术支持。

技术实现要素：

本发明的第一个目的是提供用于鉴别‘迎霜’camelliasinensiscv.‘yingshuang’的分子特异性标记引物，该引物序列如下：

上游引物s4ysf：5’-tgagctgagtgagttgaa-3’,如seqidno.1所示；

下游引物s4ysr：5’-gtcggtactgactatgaa-3’,如seqidno.2所示。

该特异性标记引物组合是采用常规pcr技术，经过大量dna指纹图谱比较分析，筛选获得迎霜特异性dna片段。然后，通过切胶回收、ta克隆及测序，获得该dna序列，在此基础上设计迎霜分子特异性标记引物，以该引物作为pcr引物，对‘迎霜’及其相近茶树品种进行pcr扩增，该引物只与迎霜样本dna发生反应，获得1346bp大小的特异性片段，而与其他茶树品种样品不发生反应。为了进一步验证特异性引物s4ysf/s4ysr的稳定性，用该引物组合对来自10个不同迎霜个体的样本dna进行pcr扩增，结果所有迎霜样品都能扩增出1346bp大小特异性条带，说明该引物具有较高的稳定性和应用范围。

本发明的第二个目的是提供上述分子特异性标记引物对迎霜进行鉴别的方法。所述方法为：采用上述引物组合(s4ysf/s4ysr)作为特异性扩增引物，以待测茶树植物样品dna为模板，进行pcr扩增，经琼脂糖凝胶电泳检测，若电泳结果出现分子量为1346bp大小的特异性片段，则待测茶树植物样品为‘迎霜’，反之则不是。

具体的，所述方法如下：

(1)基因组dna提取：取待测茶树植物样品新鲜叶片，加液氮研磨至粉末，然后，利用uniq-10柱式植物基因组dna抽提试剂盒(订购于上海生工生物工程股份有限公司)提取待测样品的基因组dna。

(2)pcr扩增：以步骤(1)提取的待测样品dna为模板，以所述分子特异性标记引物(s4ysf/s4ysr)作为扩增引物，进行pcr扩增。

pcr反应体系(总体积20μl)：1μl上游引物s4ysf(10μm)，1μl下游引物s4ysr(10μm)，10μl2×pcrsupermix(订购于北京全式金生物技术有限公司)，1μl模板dna(50ng/μl)，7μlddh2o。

pcr反应程序：94℃预变性5min；94℃变性50s，57℃退火50s，72℃延伸1.5min,共32个循环；最后，72℃延伸10min。

(3)电泳检测：取10μl步骤(2)pcr产物,用1.5﹪琼脂糖凝胶进行电泳检测，然后利用凝胶成像系统(bio-radmoleculargeldoc^tmxr+systemwithimagelab^tmsoftware)拍照检测。若电泳图通道出现分子量为1346bp大小的dna条带，则待测样品为迎霜，反之则不是。

本发明主要有益效果表现为：设计的引物组合(s4ysf/s4ysr)为茶树品种‘迎霜’特异性扩增引物，若为其他茶树品种的样品dna，则pcr反应为阴性，进而实现茶树品种‘迎霜’的快速鉴别，检测结果准确，使用方法简便，操作耗时短。

附图说明

图1为本发明涉及到的18个茶树品种的一芽二叶表型照片。1、龙井43；2、龙井长叶；3、中茶102；4、中茶108；5、乌牛早；6、福鼎大白茶、7、茂绿；8、迎霜；9、春雨1号、10、春雨2号；11、浙农113；12、浙农117；13、劲峰；14、翠峰；15、中茶125；16、中茶126；17、中茶127；18、中茶128。图1表明‘迎霜’与其他17个茶树品种的叶片表型非常相似。

图2为利用本发明设计的分子特异性标记引物(s4ysf/s4ysr)对18个茶树样品dna进行pcr扩增的电泳图，其中m为dna分子量标准trans2kdnamarker(订购于北京全式金生物技术有限公司)；通道1：龙井43；2：龙井长叶；3：中茶102；4：中茶108；5：乌牛早；6：福鼎大白茶、7：茂绿；8：迎霜；9：春雨1号；10：春雨2号；11：浙农113；12：浙农117；13：劲峰；14：翠峰；15：中茶125；16：中茶126；17：中茶127；18：中茶128。电泳图显示只有‘迎霜’样品扩增出分子量为1346bp大小的特异性dna条带。

图3是采用迎霜分子特异性标记引物s4ysf/s4ysr对10份不同迎霜个体的dna进行检测的pcr扩增电泳图。其中，m为dna分子量标准trans2kdnamarker(订购于北京全式金生物技术有限公司)；通道1-10：对应为10个不同‘迎霜’样品，编号分别为ys1-ys10。

具体实施方式

本发明可以在分子水平上较为快速准确的鉴别茶树品种‘迎霜’的相关样品。下面结合具体实施例对本发明做进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

实施例1：茶树品种‘迎霜’分子特异性标记引物开发设计

1.样品基因组dna提取

剪取18个相似茶树样品(具体信息见附图1说明)新鲜叶片100mg放入研钵，立即加入液氮彻底磨碎，然后利用uniq-10柱式植物基因组dna抽提试剂盒(订购于上海生工生物工程股份有限公司)提取基因组dna，所得dna用1％琼脂糖胶进行电泳检测，并用紫外分光光度计检测浓度，稀释至50ng/μl，4℃保存，用于后续pcr扩增。

2.分子特异性标记引物s4ysf/s4ysr设计

利用常规pcr扩增技术，通过大量dna指纹图谱比较分析，筛选获得迎霜特异性核苷酸序列，经过切胶回收、克隆及测序，获得该dna序列(送上海生工生物工程股份有限公司测序)，然后基于该dna序列设计获得迎霜特异性引物s4ysf/s4ysr(s4ysf：tgagctgagtgagttgaa；s4ysr：gtcggtactgactatgaa)(引物序列由苏州泓迅生物科技有限公司合成)。

实施例2：特异性标记引物s4ysf/s4ysr的pcr扩增及电泳检测

以本发明开发的特异性标记引物组合s4ysf/s4ysr为扩增引物，对不同茶树品种样品dna(具体见附图1说明)进行pcr检测。

pcr反应体系(总体积20μl)：上游引物s4ysf(10μm)1μl，下游引物s4ysr(10μm)1μl，2×pcrsupermix(订购于北京全式金生物技术有限公司)10μl，模板dna(50ng/μl)1μl，ddh2o7μl。

pcr反应程序：94℃预变性5min；94℃变性50s，57℃退火50s，72℃延伸1.5min,共32个循环；最后，72℃延伸10min。

在1.5﹪琼脂糖凝胶上对pcr产物进行电泳检测，利用凝胶成像系统(bio-radmoleculargeldoc^tmxr+systemwithimagelab^tmsoftware)进行拍照检测。电泳图如附图2所示(图中，通道m为dna分子量标准trans2kdnamarker；通道1～18为18个不同茶树品种的样品，具体见附图说明)。从附图2可以看出只有迎霜样品(通道8)能扩增出1346bp大小的特异性dna片段。而其他茶树品种没有扩增出任何条带，这表明本发明的特异性标记引物专一性好，灵敏度高，可以用于茶树品种‘迎霜’的快速鉴别。

实施例3：分子特异性标记引物s4ysf/s4ysr进一步验证

为了进一步验证本专利开发的引物组合s4ysf/s4ysr的稳定性和应用范围，利用引物s4ysf/s4ysr对10份来自不同迎霜单株的样品dna进行pcr扩增检测，电泳图如附图3所示(图中，m为dna分子量标准trans2kdnamarker；通道1-10：对应为迎霜样品编号ys1-ys10)。附图3显示所有迎霜样品都能扩增出1346bp大小的特异性条带，因此，本发明的特异性标记引物s4ysf/s4ysr具有很好的稳定性和应用性。

sequencelisting

<110>中国农业科学院茶叶研究所

<120>用于鉴别国家级茶树良种'迎霜'的分子特异性标记引物及其鉴别方法

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