一种调血脂活性多糖的制备方法与流程

本发明涉及活性多糖的技术领域，尤其涉及一种调血脂活性多糖的制备方法。

背景技术：

血脂是指血液中的脂类物质，包括中性脂肪和类脂类物质，其中甘油三酯和胆固醇属于中性脂肪，磷脂、固醇、类固醇类物质属于类脂。它们均广泛存在于人体之中，是人体生命细胞进行基础代谢功能的必须物质。高血脂症是人体脂类代谢或转运发生异常，使得血液中一种或多种脂质含量超过正常范围的一类全身性疾病。

随着现代医学的发展，对于高血脂的发病机制以及产生的影响都有了更加深入的了解，所以研究实用有效的降脂方法对于高血脂症的预防和治疗极具意义，当血脂过高或者已经引起某些疾病的时候，就要适当的采取药物治疗，来达到快速降低血脂的目的。目前用于临床治疗的大多数降低血脂的药物主要可以分为两类：他汀类(statins)和贝特类(fibrates)。各种西药的作用机理都不尽相同，临床上针对患者不同的身体状态，通常几类药物结合治疗。但西药的副作用，例如：腹痛、便秘、胃肠胀气，疲乏无力，头痛等逐渐引起人们的注意。所以亟需寻找一种天然的可调节血脂的药物。红毛藻具有降血糖、降血脂、预防心脑血管疾病等功效，具有较高的食用和药用价值。有鉴于此，本发明人研究和设计了一种从红毛藻中提取调血脂活性多糖的方法。

技术实现要素：

本发明目的是提供一种从红毛藻中提取调血脂活性多糖的方法，制备工艺简单，成本低，所提取的多糖有较高的降血脂活性。

为了解决上述目的，本发明采用的技术方案是：

一种从红毛藻中提取调血脂活性多糖的方法，包括以下步骤：

步骤一、抽提：将新鲜红毛藻清洗、烘干、粉碎，得到藻粉，加入15～20倍体积量的蒸馏水，于90℃下水浴抽提1～3次，每次2h～3h，离心、合并上清液，将上清液蒸发浓缩得到浓缩液；

步骤二、醇沉：向所述浓缩液中缓慢滴加乙醇，至乙醇终浓度体积分数为75％，静置过夜后，10000r/min离心10min，取沉淀完全溶解于适量蒸馏水中，冷冻干燥，制得粗多糖；

步骤三、凝胶层析：将所述粗多糖溶解于蒸馏水中，上样于经0.1mnacl溶液平衡的凝胶层析柱上，用0.1mnacl溶液洗脱，苯酚硫酸法跟踪检测，收集洗脱峰，透析脱盐，冷冻干燥，获得初步纯化多糖；

步骤四、离子交换层析：将所述初步纯化多糖溶解于蒸馏水中，上样于阴离子交换层析柱，依次采用0.1m、0.3m、0.5m浓度的nacl溶液梯度洗脱，苯酚-硫酸法跟踪监测，分别收集不同浓度下的洗脱峰，透析脱盐，冷冻干燥，获得纯化多糖，即制得调血脂活性多糖。

优选地，所述步骤一中，还包括脱色：在抽提前，向所得藻粉加入3～5倍体积量的甲醇溶液，反复清洗三次，浸泡过夜，浸泡后4000r/min，离心15分钟，所得沉淀再进行抽提。

优选地，所述步骤一中，烘干温度为50℃。

优选地，所述步骤一中，加入蒸馏水，于90℃水浴抽提2小时，4000r/min离心20分钟后取上清液，沉淀重复热水抽提2小时，再离心，合并两次离心的上清液后进行蒸发浓缩。

优选地，所述步骤一及步骤二之间，还包括sevage法除蛋白：将三氯甲烷与正丁醇按照体积比4：1的比例混合配制成sevage试剂，再将粗多糖浓缩液与sevage试剂按照体积比5：1的比例混合后，剧烈振荡40分钟，8000r/min离心除去蛋白质沉淀层，将上清液回收按照同样方法，重复三次，分离取出上清液，备用。

优选地，所述步骤三中，采用sephadexg75凝胶柱对所述粗多糖进行纯化，具体操作如下：上样粗多糖液浓度5mg/ml，上样量为3ml，用0.1mnacl溶液洗脱；采用自动收集器接收，接收50管，每管5ml；用苯酚硫酸法于490nm跟踪检测洗脱情况，以管号为横坐标，吸光度值为纵坐标，做洗脱图；合并洗脱峰，透析脱盐，冷冻干燥，制得初步纯化多糖。

优选地，所述步骤四中，采用deaecellulose52凝胶柱对所述初步纯化多糖进一步纯化，具体操作如下：将样品配制成3mg/ml溶液，上样量为5ml，分别用0.1m、0.3m、0.5m浓度的nacl溶液梯度洗脱，每个洗脱液，收集40管，每管收集5ml；用苯酚硫酸法跟踪监测，以管号为横坐标，吸光度值为纵坐标，做洗脱图；合并各洗脱峰，透析脱盐，冷冻干燥，制得调血脂活性多糖。

本发明具有以下有益效果：本发明从红毛藻中提取出了一种调血脂活性多糖，该活性多糖是一种天然的物质，具有明显调血脂的效果。本法得到的纯化的红毛藻多糖片段sf3，药理证明其具有抑制胰脂肪酶、降低甘油三酯(tg)和胆固醇(tc)作用，即具有调节血脂活性。

附图说明

图1为本发明实施例中提取的活性多糖的凝胶过滤洗脱图；

图2为本发明实施例中初步纯化的活性多糖的阴离子交换层析柱洗脱图；

图3为本发明实施例中最终纯化的红毛藻多糖对胰脂肪酶活性的抑制作用图；

图4为本发明实施例中最终纯化的红毛藻多糖片段sf3对加入胆固醇的hepg2细胞中甘油三酯(tg)含量的影响图；

图5为本发明实施例中最终纯化的红毛藻多糖片段sf3对加入胆固醇的hepg2细胞中总胆固醇(tc)含量的影响图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

实施例1：抑制剂的提取

所述新鲜红毛藻采购于福建莆田。利用水提醇沉法进行提取，具体操作如下：将新鲜红毛藻清洗干净，置于烘箱内50℃烘干，之后用粉碎机粉碎。干藻粉加入3～5倍体积量的甲醇，持续的搅拌，反复清洗三次，以保证脱色的充分，浸泡过夜。浸泡后4000r/min离心15分钟，沉淀取出加入蒸馏水90℃水浴加热2小时，4000r/min离心20分钟后取上清液，沉淀重复热水抽提2小时再离心，合并两次离心的上清液，蒸发浓缩，工作温度为50℃，将提取液浓缩至原体积的1/10。加入乙醇至终浓度75％(v/v)，静置过夜。10000r/min离心10分钟，取沉淀完全溶解于少量蒸馏水中，冷冻干燥，制得粗多糖。

sevage法除蛋白：将三氯甲烷与正丁醇按照体积比4：1的比例混合配制成sevage试剂，再将粗多糖浓缩溶液与sevage试剂按照体积比5：1的比例混合后，剧烈振荡40分钟，8000r/min离心除去蛋白质沉淀层，将上清液回收按照同样方法，重复三次，分离取出上清液，除蛋白。

实施例2：多糖的凝胶过滤纯化

采用sephadexg75凝胶柱(c16/100)对粗多糖进行纯化，具体操作如下：上样糖液浓度5mg/ml，上样量为3ml，用0.1mnacl溶液洗脱。采用自动收集器接收，接收50管，每管5ml。用苯酚硫酸法于490nm跟踪检测洗脱情况，以管号为横坐标，吸光度值为纵坐标，做洗脱图。合并洗脱峰，透析脱盐，冷冻干燥，制得初步纯化多糖f。结果如图1所示，红毛藻粗多糖的洗脱曲线得到单一对称峰，由于在纯化之前对粗多糖进行了蛋白质脱除，所以洗脱得到一个单一组分，将其命名为f，说明f组分中是分子量较为均一的多糖。

实施例3：抑制剂f的阴离子交换层析

采用deaecellulose52凝胶柱对初步纯化多糖f进行进一步纯化，具体操作如下：将样品配制成3mg/ml溶液，上样量为5ml，分别用0m(蒸馏水)、0.1m、0.3m、0.5m浓度的nacl溶液梯度洗脱，每个洗脱液，收集40管，每管收集5ml。同样用苯酚硫酸法跟踪监测，以管号为横坐标，吸光度值为纵坐标，做洗脱图。合并各洗脱峰，透析脱盐，冷冻干燥，制得纯化多糖sf1，sf2，sf3。结果如图2所示，当用蒸馏水洗脱时，未见有洗脱峰出现，而在nacl溶液浓度为0.1、0.3、0.5m下，各有一个洗脱峰出现，分别命名为sf1、sf2和sf3。

实施例4：

4.1红毛藻多糖胰脂肪酶抑制活性

4.1.1材料与方法

材料及红毛藻多糖的制备：

胰脂肪酶(20000u/mg，源于猪胰腺，西格玛奥德里奇(上海)有限公司)；对硝基苯酚(pnp,分析纯,国药集团化学试剂有限公司)；4-硝基苯棕榈酸酯(pnpp,br,西格玛奥德里奇(上海)有限公司)；其余化学试剂均为分析纯。

多糖溶液：精密称取纯化多糖片段sf1、sf2和sf3并溶解于tris-hcl缓冲液中，反应体系中多糖终浓度为0.2mg/ml，0.4mg/ml，0.6mg/ml，0.8mg/ml，1.0mg/ml。

方法：

各取50μl多糖溶液和脂肪酶液混合，置于37℃水浴锅中温育10min，再向其中添加100μl底物溶液起始反应，在37℃下反应10min后，于405nm波长下测定其吸光度值。以奥利司他(orlistat)作为阳性对照，以同样体积tris-hcl代替多糖作为空白对照，每组实验体系设定3个平行实验。实验体系如下表1：

表1实验体系设计

4.1.2结果

由图3所示，纯化得到的三个多糖片段sf1，sf2和sf3对胰脂肪酶均有抑制作用。

4.2红毛藻多糖片段对hepg2细胞脂代谢的调节作用

4.2.1油酸诱导hepg2细胞模型的构建

材料：

dmem培养基(500mldmem培养基添加1％双抗和15％胎牛血清)；0.25％胰蛋白酶；磷酸盐缓冲液(pbs)；含油酸培养基(油酸与bsa按50：1的比例混合溶解，然后与含10％胎牛血清的生长培养基混合，使油酸终浓度为100μmol/l，bsa浓度不超过2μmol/l)。

方法：

造模：使用油酸来诱导hepg2细胞，模拟构建肝脏细胞脂类变性的模型，研究红毛藻多糖对hepg2细胞中总甘油三酯合成的影响。实验分为三组：

(1)空白组：用正常生长培养基培养的细胞；

(2)试验组：先用多糖样品预先孵育后，再加入油酸诱导的细胞；

(3)对照组：不用多糖处理，只用含油酸培养基培养的细胞。

首先同步化细胞，然后将试验组细胞用不同浓度多糖样品处理12h，之后，试验组和对照组细胞换成含油酸的培养基继续培养24h，空白组不做任何处理。检测各组细胞中总甘油三酯的含量。

4.2.2高胆固醇hepg2细胞模型的构建

材料：

dmem培养基(500mldmem培养基添加1％双抗和15％胎牛血清)；0.25％胰蛋白酶；磷酸盐缓冲液(pbs)；含胆固醇培养基(将胆固醇和25-羟胆固醇与含有10％fbs的生长培养基混合，使胆固醇终浓度为15μg/ml，bsa浓度不超过2μg/ml)。

方法：

造模：实验分为三组：

(1)模型组：在正常生长培养基中加入胆固醇；

(2)加样组：用不同浓度多糖样品处理后的细胞；

(3)对照组：在用含胆固醇培养基培养状态下加入0.2μg/ml辛伐他汀(sim)。

实验前，用无血清的dmem培养基孵育hepg2细胞约12h，使其生长同步化。首先将加样组细胞，用添加了不同浓度多糖样品的生长培养基处理24h，然后模型组、加样组和对照组均加入终浓度相同的含胆固醇的培养基培养24h，其中对照组加入辛伐他汀。孵育结束后，将培养基移除，用pbs小心漂洗三次，置于冰上裂解细胞，测定各组细胞内总甘油三酯含量及总脂类分泌情况。

4.2.3结果

由图4和图5可知，较少量的辛伐他汀对诱导后的hepg2细胞模型中tg和tc产生均有明显的抑制作用，同样的，红毛藻多糖片段sf3也表现出一定的抑制作用，并且抑制活性随着多糖浓度的降低而减弱，呈剂量依赖性。由此得知红毛藻多糖sf3片段具有明显的调节血脂活性。

以上所述，仅为本发明较佳实施例而已，故不能依此限定本发明实施的范围，即依本发明专利范围及说明书内容所作的等效变化与修饰，皆应仍属本发明涵盖的范围内。