新型天冬氨酸脱氢酶及在天冬氨酸族氨基酸生产上的应用的制作方法

本发明涉及一种新型天冬氨酸脱氢酶，以及其在生产天冬氨酸族氨基酸中的应用。
背景技术：
：天冬氨酸族氨基酸包括天冬氨酸，苏氨酸，赖氨酸，异亮氨酸，甲硫氨酸以及β-丙氨酸。天冬氨酸组氨基酸是重要的前体原料，在食品添加剂、化妆品、医药领域有广泛的应用，因此具有重要的商业价值。微生物转化法，包括酶催化和微生物发酵，是目前生产天冬氨酸族氨基酸的主要方法。在天冬氨酸族氨基酸的生物转化过程中，天冬氨酸是生理代谢的关键节点。目前已知自然界存在三条合成天冬氨酸的催化反应：一、由天冬氨酸酶催化，以富马酸与铵根为底物合成天冬氨酸；二、由天冬氨酸转氨酶催化，以谷氨酸和草酰乙酸为底物反应生成天冬氨酸和2-酮戊二酸，这实质是一个以谷氨酸为氨基供体的转氨反应；三、由天冬氨酸脱氢酶(aspartatedehydrogenase，aspdh)催化的、以游离铵根为氨基供体的加氨反应。目前，以天冬氨酸为前体的氨基酸发酵过程，主要是好氧发酵。在这个过程中，从草酰乙酸生成天冬氨酸，主要依靠天冬氨酸转氨酶的催化实现。好氧发酵会导致高耗能和碳的损失，因此厌氧发酵生产氨基酸从成本上更具有吸引力。但在厌氧过程中，由于tca途径活力很弱，不能够为草酰乙酸的胺化提供足够的氨基供体-谷氨酸，因此可以预见在厌氧发酵中由转氨酶介导的胺化反应效率将显著降低。与之对比，天冬氨酸脱氢酶可直接以铵根离子为氨基供体，而不依赖谷氨酸的供给，因此在厌氧发酵过程中将具有重要的应用潜力。与天冬氨酸酶和天冬氨酸转氨酶相比，天冬氨酸脱氢酶发现的较晚。首次关于天冬氨酸脱氢酶的报道是在2003年，yang等人[1]在一种极端嗜热菌海栖热袍菌thermotogamaritima中发现编号为tm1643的orf具备天冬氨酸脱氢酶活性，但是其氨基酸序列与其他氨基酸脱氢酶序列并没有显著同源性。2006年，yoneda[2]据海栖热袍菌天冬氨酸脱氢酶序列，发现来源于古菌archaeoglobusfulgidus的天冬氨酸脱氢酶，并对其结构[2]和酶学性质做了进一步的研究。虽然以上两种天冬氨酸脱氢酶都有很好的热稳定性，但是它们在常温下表现出来的酶活力都很低，限制了天冬氨酸脱氢酶的应用价值。2011年li先后对来源于pseudomonasaeruginosa[3](在下文缩写为pae)和ralstoniaeutropha[4](在下文中缩写为reu)的天冬氨酸脱氢酶进行了研究。与之前嗜热型天冬氨酸脱氢酶不同，这两种天冬氨酸脱氢酶最适反应温度都在37℃，比酶活达到127和137u/mg。2013年，来源于rhodopseudomonaspalustris和bradyrhizobiumjaponicum两种nadph依赖型的天冬氨酸脱氢酶也被报道[5]。目前为止，只有以上六种天冬氨酸脱氢酶被报道。目前天冬氨酸脱氢酶在实际应用中存在的主要问题是：1.胺化活力较低。经实际测试，pseudomonasaeruginosa和ralstoniaeutropha来源的天冬氨酸脱氢酶比活力低于1u/mg；2.最适ph偏碱性，在中性条件下酶活很低。由于细菌胞内ph通常在7.3～7.7范围内，因此这限制了该酶在大肠杆菌等模式菌株中的应用。3.蛋白不稳定，纯化后的蛋白很容易聚集，这可能导致表达出的有效酶活很低。本专利通过对基因数据库的深入挖掘，筛选到了催化效率高、在中性条件下仍能保持较高活力，且稳定性好的新天冬氨酸脱氢酶，并在天冬氨酸族氨基酸如天冬氨酸和β-丙氨酸的生物转化过程中显示出了良好的效果。技术实现要素：本发明的主要目的是提供一些天冬氨酸脱氢酶。本发明的第二个目的在于提供一种利用所述天冬氨酸脱氢酶在其他微生物异源表达生产天冬氨酸族氨基酸如天冬氨酸和β-丙氨酸的方法。为实现上述目的，本发明通过以下技术方案逐一实现：一种天冬氨酸脱氢酶(aspdh)，催化草酰乙酸与铵根以及nad(p)h反应生成天冬氨酸与水以及nad(p)+的可逆反应，由以下微生物中的一种或几种产生：克雷伯氏肺炎菌(klebsiellapneumoniae)、变形斑沙雷氏菌(serratiaproteamaculans)、需盐色盐杆菌(chromohalobactersalexigens)、鲍氏不动杆菌(acinetobacterbaumannii)、戴尔福特菌csl-4(delftiasp.csl-4)、人苍白杆菌(ochrobactrumanthropi)、柄杆菌(caulobactersp.)、马氏甲烷嗜盐菌(methanohalophilusmahii)、柴氏海洋玫瑰杆菌(dinoroseobactershibae)、嗜酸产甲烷菌(methanosphaerulapalustris)、瘤胃甲烷短杆菌(methanobrevibacterruminantium)、roseibacteriumelongatum。所述天冬氨酸脱氢酶基因序列分别如seqidno：2-seqidno：13所示。所述的天冬氨酸脱氢酶基因可以通过pcr由所述微生物扩增得到，也可以通过全基因合成，可根据宿主密码子偏好性进行密码子优化。本发明还保护一种利用上述天冬氨酸脱氢酶生产天冬氨酸族氨基酸如天冬氨酸和β-丙氨酸的生物转化方法。由表达克雷伯氏肺炎菌、变形斑沙雷氏菌、需盐色盐杆菌、鲍氏不动杆菌、戴尔福特菌csl-4、人苍白杆菌、柄杆菌、马氏甲烷嗜盐菌、柴氏海洋玫瑰杆菌、嗜酸产甲烷菌和瘤胃甲烷短杆菌来源的天冬氨酸脱氢酶的基因工程菌作为催化剂进行生物转化合成天冬氨酸族氨基酸如天冬氨酸和β-丙氨酸。其中上述菌株来源的aspdh基因可采用常规的基因工程手段获得，如以上述菌株染色体dna为模板通过pcr获得或根据其序列合成。采用合成方法时，可根据不同的表达系统对密码子的偏好，将编码这些aspdh基因中部分或者全部对宿主而言稀有的密码子替换为宿主偏好密码子。所述aspdh基因可以通过在宿主细胞内独立复制的表达载体引入宿主细胞，也可以通过如同源重组等方法整合到受体染色体上。通常所用于进行基因表达的宿主菌都可以作为表达aspdh的受体菌，包括细菌，如大肠杆菌、谷氨酸棒状杆菌、芽孢杆菌等；酵母菌，如酿酒酵母，巴斯德毕赤酵母，多型汉逊酵母等；霉菌，包括米曲霉、黑曲霉等；光合细菌，包括聚球藻、集胞藻等。aspdh基因的表达可以采用通用的高效诱导型启动子，组成型启动子，也可以采用宿主自身的启动子。过量表达aspdh基因的重组菌可以采用常规方法发酵培养，可以是好氧发酵培养，也可以是厌氧发酵培养。培养基底物可以是葡萄糖、甘油、木糖、甲醇或者co2。也可以通过直接催化的方式，添加的底物可以是乳酸、丙酮酸、草酰乙酸、富马酸等。具体地，本发明的一个方面涉及天冬氨酸脱氢酶，其特征在于氨基酸序列如seqidno：99，100，101或102所示。在本发明的一个实施方案中，所述天冬氨酸脱氢酶的氨基酸序列与seqidno：99，100，101或102所示的氨基酸序列具有至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％的同源性，并且分别来源于克雷伯氏肺炎菌(klebsiellapneumoniae)，戴尔福特菌cs1-4(delftiasp.cs1-4)，或变形斑沙雷氏菌(serratiaproteamaculans)或人苍白杆菌(ochrobactrumanthropi)。在本发明的一个方面，提供了编码所述天冬氨酸脱氢酶的核苷酸序列。在本发明的一个实施方案中，所述的天冬氨酸脱氢酶分别由seqidno：2，3，6或7的核苷酸序列所编码。在本发明的一个实施方案中，涉及包含所述的天冬氨酸脱氢酶的表达载体。在本发明的一个实施方案中，涉及包含所述表达载体的宿主细胞。在本发明的一个实施方案中，seqidno：2，3，6或7所示的核苷酸序列针对宿主细胞进行了密码子优化。在本发明的一个实施方案中，所述宿主细胞为细菌、光合细菌、酵母或霉菌的细胞。在本发明的一个实施方案中，所述宿主细胞为大肠杆菌。在本发明的一个实施方案中，涉及所述的天冬氨酸脱氢酶用于生产天冬氨酸族氨基酸的用途，其中所述天冬氨酸族氨基酸选自天冬氨酸，苏氨酸，赖氨酸，异亮氨酸，甲硫氨酸以及β-丙氨酸，或其组合。本发明的有益效果是利用过量表达所述微生物产生的天冬氨酸脱氢酶的重组微生物生产天冬氨酸族氨基酸如天冬氨酸或β-丙氨酸，生产水平有大幅提高或产物得率显著提升。附图说明图1.合成pllaco1-tac-duet序列。图2.不同来源天冬氨酸脱氢酶可溶性表达sds-page。图3.不同来源天冬氨酸脱氢酶不可溶性表达sds-page。图4.变形斑沙雷氏菌来源天冬氨酸脱氢酶sds-page。图5.天冬氨酸脱氢酶c端插入histag的sds-page。图6.天冬氨酸脱氢酶纯化sds-page。图7.kpnaspdh纯酶在不同ph条件下酶活。图8.delaspdh纯酶在不同ph条件下酶活。图9.speaspdh纯酶在不同ph条件下酶活。图10.天冬氨酸脱氢酶最适反应温度结果。图11.天冬氨酸脱氢酶热稳定性结果。图12.天冬氨酸发酵生产评价。图13.β-丙氨酸发酵生产评价。图14.β-丙氨酸的得率。图15.四种来源的天冬氨酸脱氢酶(oanaspdh，speaspdh，delaspdh和kpnaspdh)的序列比对。图16.paeaspdh和reuaspdh表达sds-page电泳图，其中泳道1和1’表示空白载体对照的可溶和不可溶表达；2和2’表示reuaspdh的可溶和不可溶表达；3和3’表示paeaspdh的可溶和不可溶表达；泳道m表示分子量标记。图17.四种来源的天冬氨酸脱氢酶(oanaspdh，speaspdh，delaspdh和kpnaspdh)的三维结构图，图17a为oanaspdh与speaspdh比对结果。深灰色为oanaspdh，浅灰色为speaspdh；图17b为oanaspdh与delaspdh比对结果。深灰色为oanaspdh，浅灰色为delaspdh；图17c为oanaspdh与kpnaspdh比对结果。深灰色为oanaspdh，浅灰色为kpnaspdh。具体实施方式以下结合附图通过具体实施例来进一步详细地说明本发明。本领域技术人员应理解，以下具体实施例仅用于说明本发明，而非对本发明的限制。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试剂材料，如无特殊说明，均购于常规生化试剂商店。1.酶以及主要试剂所用克雷伯氏肺炎菌、变形斑沙雷氏菌、需盐色盐杆菌、鲍氏不动杆菌、戴尔福特菌cs1-4、人苍白杆菌、柄杆菌、马氏甲烷嗜盐菌、柴氏海洋玫瑰杆菌、嗜酸产甲烷菌、瘤胃甲烷短杆菌、roseibacteriumelongatum来源天冬氨酸脱氢酶基因及其它基因序列均由苏州金唯智公司合成。载体pet30a：novagen公司，大肠杆菌bl21(de3)：transgen公司，限制性内切酶ndei，bglii：neb公司。限制性内切酶sphi和xhoi，t4连接酶购自neb公司。2.分子生物学操作pcr条件，大肠杆菌感受态制备以及转化方法参考《分子克隆实验指南》，dna凝胶回收，质粒抽提，dna纯化、酶切以及连接等均按产品说明书操作。实施例1.诱导型表达载体ped31构建1、合成序列pllaco1-tac-duet(seqidno：1)。2、用限制性内切酶sphi和xhoi分别酶切序列1和载体pet30a，两片段在t4连接酶中连接过夜，转化大肠杆菌dh5α，得到ped31。实施例2.重组大肠杆菌bl21(ped31-kpnaspdh)的构建1、合成序列表的seqidno：2所示的双链dna分子，即kpnaspdh。2、克雷伯氏肺炎菌天冬氨酸脱氢酶基因kpnaspdh的克隆上游引物：5’-tatacatatgaaaaaagtaatgctgattggt-3’(seqidno：14)，下划线是ndei酶切位点。下游引物：5’tacccagatctttaagccagttcgcgacaag-3’(seqidno：15)，下划线是bglii酶切位点。以步骤1合成的双链dna为模板，用以上引物pcr扩增目的基因。采用降落pcr扩增目的基因，反应条件如下：95℃预变性5min；95℃变性15s，退火温度从60℃开始，每个循环降低1℃，退火15s，72℃延伸30s，共10个循环后退火温度降至50℃；在最适退火温度55℃的条件下进行20个循环，同样退火15s，72℃延伸30s；最后在72℃延伸7min。扩增得到的dna片段经琼脂糖凝胶电泳验证后，用cyclepure试剂盒进行纯化。3、将pcr扩增的kpnaspdh基因和表达载体ped31用限制性内切酶ndei、bglii于37℃双酶切过夜，琼脂糖电泳分别回收目的条带，两片段在t4连接酶中连接过夜，转化大肠杆菌dh5α，得到ped31-kpnaspdh质粒。4、将重组质粒ped31-kpnaspdh导入bl21(de3)，得到的重组菌即为bl21(ped31-kpnaspdh)。实施例3.重组大肠杆菌bl21(ped31-speaspdh)的构建1、合成序列表的seqidno：6所示的双链dna分子，即speaspdh。2、变形斑沙雷氏菌天冬氨酸脱氢酶基因speaspdh的克隆上游引物：5’-tatacatatgaaaaaaatcatgatgatcggtt-3’(seqidno：16)，下划线是ndei酶切位点。下游引物：5’-tacccagatctttatgcgataaagccacc-3(seqidno：17)’，下划线是bglii酶切位点。以步骤1合成的双链dna为模板，用以上引物pcr扩增目的基因。pcr反应条件如下：95℃预变性5min；95℃变性15s，退火温度从60℃开始，每个循环降低1℃，退火15s，72℃延伸30s，共10个循环后退火温度降至50℃；在最适退火温度55℃的条件下进行20个循环，同样退火15s，72℃延伸30s；最后在72℃延伸7min。扩增得到的dna片段经琼脂糖凝胶电泳验证后，用cyclepure试剂盒进行纯化。3、将pcr扩增的speaspdh基因和表达载体ped31用限制性内切酶ndei、bglii于37℃双酶切过夜，琼脂糖电泳分别回收目的条带，两片段在t4连接酶中连接过夜，转化大肠杆菌dh5α，得到ped31-speaspdh质粒。4、将重组质粒ped31-speaspdh导入bl21(de3)，得到的重组菌即为bl21(ped31-speaspdh)。实施例4.重组大肠杆菌bl21(ped31-csaaspdh)的构建1、合成序列表的seqidno：4所示的双链dna分子，即csaaspdh。2、需盐色盐杆菌天冬氨酸脱氢酶基因csaaspdh的克隆上游引物：5’-tatacatatgactgcgaaaaccgttatg-3’(seqidno：18)，下划线是ndei酶切位点。下游引物：5’tacccagatctttatacaacaaccggttcc-3’(seqidno：19)，下划线是bglii酶切位点。以步骤1合成的双链dna为模板，用以上引物pcr扩增目的基因。pcr反应条件如下：95℃预变性5min：95℃变性15s，退火温度从60℃开始，每个循环降低1℃，退火15s，72℃延伸30s，共10个循环后退火温度降至50℃；在最适退火温度55℃的条件下进行20个循环，同样退火15s，72℃延伸30s；最后在72℃延伸7min。扩增得到的dna片段经琼脂糖凝胶电泳验证后，用cyclepure试剂盒进行纯化。3、将pcr扩增的csaaspdh基因和表达载体ped31用限制性内切酶ndei、bglii于37℃双酶切过夜，琼脂糖电泳分别回收目的条带，两片段在t4连接酶中连接过夜，转化大肠杆菌dh5α，得到ped31-csaaspdh质粒。4、将重组质粒ped31-csaaspdh导入bl21(de3)，得到的重组菌即为bl21(ped31-csaaspdh)。实施例5.重组大肠杆菌bl21(ped31-abcaspdh)的构建1、合成序列表的seqidno：5所示的双链dna分子，即abcaspdh。2、鲍氏不动杆菌天冬氨酸脱氢酶基因abcaspdh的克隆上游引物：5’-tatacatatgaaaaaactgatgatgattg-3(seqidno：20)’，下划线是ndei酶切位点。下游引物：5’-tacccagatctttaaatctggatagcttctac-3’(seqidno：21)，下划线是bglii酶切位点。以步骤1合成的双链dna为模板，用以上引物pcr扩增目的基因。pcr反应条件如下：95℃预变性5min；95℃变性15s，退火温度从60℃开始，每个循环降低1℃，退火15s，72℃延伸30s，共10个循环后退火温度降至50℃；在最适退火温度55℃的条件下进行20个循环，同样退火15s，72℃延伸30s；最后在72℃延伸7min。扩增得到的dna片段经琼脂糖凝胶电泳验证后，用cyclepure试剂盒进行纯化。3、将pcr扩增的abcaspdh基因和表达载体ped31用限制性内切酶ndei、bglii于37℃双酶切过夜，琼脂糖电泳分别回收目的条带，两片段在t4连接酶中连接过夜，转化大肠杆菌dh5α，得到ped31-abcaspdh质粒。4、将重组质粒ped31-abcaspdh导入bl21(de3)，得到的重组菌即为bl21(ped31-abcaspdh)。实施例6.重组大肠杆菌bl21(ped31-delaspdh)的构建1、合成序列表的seqidno：3所示的双链dna分子，即delaspdh。2、戴尔福特菌csl-4天冬氨酸脱氢酶基因delaspdh的克隆上游引物：5’-tatacatatgaacatcgctgtaatcggttg-3’(seqidno：22)，下划线是ndei酶切位点。下游引物：5’tacccagatctttagatagcgattgcggtag-3’(seqidno：23)，下划线是bglii酶切位点。以步骤1合成的双链dna为模板，用以上引物pcr扩增目的基因。pcr反应条件如下：95℃预变性5min；95℃变性15s，退火温度从60℃开始，每个循环降低1℃，退火15s，72℃延伸30s，共10个循环后退火温度降至50℃；在最适退火温度55℃的条件下进行20个循环，同样退火15s，72℃延伸30s；最后在72℃延伸7min。扩增得到的dna片段经琼脂糖凝胶电泳验证后，用cyclepure试剂盒进行纯化。3、将pcr扩增的delaspdh基因和表达载体ped31用限制性内切酶ndei、bglii于37℃双酶切过夜，琼脂糖电泳分别回收目的条带，两片段在t4连接酶中连接过夜，转化大肠杆菌dh5α，得到ped31-delaspdh质粒。4、将重组质粒ped31-delaspdh导入bl21(de3)，得到的重组菌即为bl21(ped31-delaspdh)。实施例7.重组大肠杆菌bl21(ped31-oanaspdh)的构建1、合成序列表的seqidno：7所示的双链dna分子，即oanaspdh。2、人苍白杆菌天冬氨酸脱氢酶基因oanaspdh的克隆上游引物：5’tatacatatgtccgtatctgaaacc-3’(seqidno：24)，下划线是ndei酶切位点。下游引物：5’-tacccagatcttcagataacggtagttgc-3’(seqidno：25)，下划线是bglii酶切位点。以步骤1合成的双链dna为模板，用以上引物pcr扩增目的基因。pcr反应条件如下：95℃预变性5min；95℃变性15s，退火温度从60℃开始，每个循环降低1℃，退火15s，72℃延伸30s，共10个循环后退火温度降至50℃；在最适退火温度55℃的条件下进行20个循环，同样退火15s，72℃延伸30s；最后在72℃延伸7min。扩增得到的dna片段经琼脂糖凝胶电泳验证后，用cyclepure试剂盒进行纯化。3、将pcr扩增的oanaspdh基因和表达载体ped31用限制性内切酶ndei、bglii于37℃双酶切过夜，琼脂糖电泳分别回收目的条带，两片段在t4连接酶中连接过夜，转化大肠杆菌dh5α，得到ped31-oanaspdh质粒。4、将重组质粒ped31-oanaspdh导入bl21(de3)，得到的重组菌即为bl21(ped31-oanaspdh)。实施例8.重组大肠杆菌bl21(ped31-cakaspdh)的构建1、合成序列表的seqidno：8所示的双链dna分子，即cakaspdh。2、柄杆菌天冬氨酸脱氢酶基因cakaspdh的克隆上游引物：5’-tatacatatggaacgtcgcgttgcac-3’(seqidno：26)，下划线是ndei酶切位点。下游引物：5’tacccagatctttatgcgaagcgaacgatagc-3’(seqidno：27)，下划线是bglii酶切位点。以步骤1合成的双链dna为模板，用以上引物pcr扩增目的基因。pcr反应条件如下：95℃预变性5min；95℃变性15s，退火温度从60℃开始，每个循环降低1℃，退火15s，72℃延伸30s，共10个循环后退火温度降至50℃；在最适退火温度55℃的条件下进行20个循环，同样退火15s，72℃延伸30s；最后在72℃延伸7min。扩增得到的dna片段经琼脂糖凝胶电泳验证后，用cyclepure试剂盒进行纯化。3、将pcr扩增的cakaspdh基因和表达载体ped31用限制性内切酶ndei、bglii于37℃双酶切过夜，琼脂糖电泳分别回收目的条带，两片段在t4连接酶中连接过夜，转化大肠杆菌dh5α，得到ped31-cakaspdh质粒。4、将重组质粒ped31-cakaspdh导入bl21(de3)，得到的重组菌即为bl21(ped31-cakaspdh)。实施例9.重组大肠杆菌bl21(ped31-mmhaspdh)的构建1、合成序列表的seqidno：9所示的双链dna分子，即mimhaspdh。2、马氏甲烷嗜盐菌天冬氨酸脱氢酶基因mmhaspdh的克隆上游引物：5’-tatacatatgctgaaaatcggtgttttc-3’(seqidno：28)，下划线是ndei酶切位点。下游引物：5’-tacccagatctttaggtgccaacattgaag-3’(seqidno：29)，下划线是bglii酶切位点。以步骤1合成的双链dna为模板，用以上引物pcr扩增目的基因。pcr反应条件如下：95℃预变性5min；95℃变性15s，退火温度从60℃开始，每个循环降低1℃，退火15s，72℃延伸30s，共10个循环后退火温度降至50℃；在最适退火温度55℃的条件下进行20个循环，同样退火15s，72℃延伸30s；最后在72℃延伸7min。扩增得到的dna片段经琼脂糖凝胶电泳验证后，用cyclepure试剂盒进行纯化。3、将pcr扩增的mmhaspdh基因和表达载体ped31用限制性内切酶ndei、bglii于37℃双酶切过夜，琼脂糖电泳分别回收目的条带，两片段在t4连接酶中连接过夜，转化大肠杆菌dh5α，得到ped31-mmhaspdh质粒。4、将重组质粒ped31-mmhaspdh导入bl21(de3)，得到的重组菌即为bl21(ped31-mmhaspdh)。实施例10.重组大肠杆菌bl21(ped31-dshaspdh)的构建1、合成序列表的seqidno：10所示的双链dna分子，即dshaspdh。2、柴氏海洋玫瑰杆菌天冬氨酸脱氢酶基因dshaspdh的克隆上游引物：5’-tatacatatgcgtctggcgctgatc-3’(seqidno：30)，下划线是ndei酶切位点。下游引物：5’tacccagatctttaaaccacccatgctgcatc-3’(seqidno：31)，下划线是bglii酶切位点。以步骤1合成的双链dna为模板，用以上引物pcr扩增目的基因。pcr反应条件如下：95℃预变性5min；95℃变性15s，退火温度从60℃开始，每个循环降低1℃，退火15s，72℃延伸30s，共10个循环后退火温度降至50℃在最适退火温度55℃的条件下进行20个循环，同样退火15s，72℃延伸30s；最后在72℃延伸7min。扩增得到的dna片段经琼脂糖凝胶电泳验证后，用cyclepure试剂盒进行纯化。3、将pcr扩增的dshaspdh基因和表达载体ped31用限制性内切酶ndei、bglii于37℃双酶切过夜，琼脂糖电泳分别回收目的条带，两片段在t4连接酶中连接过夜，转化大肠杆菌dh5α，得到ped31-dshaspdh质粒。4、将重组质粒ped31-dshaspdh导入bl21(de3)，得到的重组菌即为bl21(ped31-dshaspdh)。实施例11.重组大肠杆菌bl21(ped31-mplaspdh)的构建1、合成序列表的seqidno：11所示的双链dna分子，即mplaspdh。2、嗜酸产甲烷菌天冬氨酸脱氢酶基因mplaspdh的克隆上游引物：5’-tatacatatggtaatggttggtatgc-3’(seqidno：32)，下划线是ndei酶切位点。下游引物：5’-tacccagatctttaagtgcccacaacgatc-3’(seqidno：33)，下划线是bglii酶切位点。以步骤1合成的双链dna为模板，用以上引物pcr扩增目的基因。pcr反应条件如下：95℃预变性5min；95℃变性15s，退火温度从60℃开始，每个循环降低1℃，退火15s，72℃延伸30s，共10个循环后退火温度降至50℃；在最适退火温度55℃的条件下进行20个循环，同样退火15s，72℃延伸30s；最后在72℃延伸7min。扩增得到的dna片段经琼脂糖凝胶电泳验证后，用cyclepure试剂盒进行纯化。3、将pcr扩增的mplaspdh基因和表达载体ped31用限制性内切酶ndei、bglii于37℃双酶切过夜，琼脂糖电泳分别回收目的条带，两片段在t4连接酶中连接过夜，转化大肠杆菌dh5α，得到ped31-mplaspdh质粒。4、将重组质粒ped31-mplaspdh导入bl21(de3)，得到的重组菌即为bl21(ped31-mplaspdh)。实施例12.重组大肠杆菌bl21(ped31-mruaspdh)的构建1、合成序列表的seqidno：12所示的双链dna分子，即mruaspdh。2、瘤胃甲烷短杆菌天冬氨酸脱氢酶基因mruaspdh的克隆上游引物：5’-tatacatatgatcgttggtattctgg-3’(seqidno：34)，下划线是ndei酶切位点。下游引物：5’tacccagatctttaagtgccaacgctgaag-3’(seqidno：35)，下划线是bglii酶切位点。以步骤1合成的双链dna为模板，用以上引物pcr扩增目的基因。pcr反应条件如下：95℃预变性5min；95℃变性15s，退火温度从60℃开始，每个循环降低1℃，退火15s，72℃延伸30s，共10个循环后退火温度降至50℃；在最适退火温度55℃的条件下进行20个循环，同样退火15s，72℃延伸30s；最后在72℃延伸7min。扩增得到的dna片段经琼脂糖凝胶电泳验证后，用cyclepure试剂盒进行纯化。3、将pcr扩增的mruaspdh基因和表达载体ped31用限制性内切酶ndei、bglii于37℃双酶切过夜，琼脂糖电泳分别回收目的条带，两片段在t4连接酶中连接过夜，转化大肠杆菌dh5α，得到ped31-mruaspdh质粒。4、将重组质粒ped31-mruaspdh导入bl21(de3)，得到的重组菌即为bl21(ped31-mruaspdh)。实施例13.重组大肠杆菌bl21(ped31-redaspdh)的构建1、合成序列表的seqidno：13所示的双链dna分子，即redaspdh。2、roseibacteriumelongatum天冬氨酸脱氢酶基因redaspdh的克隆上游引物：5’-tatacatatgcgctaccaaggggtc-3(seqidno；36)’，下划线是ndei酶切位点。下游引物：5’tacccagatcttcagatcaccaccggtctg-3’(seqidno：37)，下划线是bglii酶切位点。以步骤1合成的双链dna为模板，用以上引物pcr扩增目的基因。pcr反应条件如下：95℃预变性5min；95℃变性15s，退火温度从60℃开始，每个循环降低1℃，退火15s，72℃延伸30s，共10个循环后退火温度降至50℃；在最适退火温度55℃的条件下进行20个循环，同样退火15s，72℃延伸30s；最后在72℃延伸7min。扩增得到的dna片段经琼脂糖凝胶电泳验证后，用cyclepure试剂盒进行纯化。3、将pcr扩增的redaspdh基因和表达载体ped31用限制性内切酶ndei、bglii于37℃双酶切过夜，琼脂糖电泳分别回收目的条带，两片段在t4连接酶中连接过夜，转化大肠杆菌dh5α，得到ped31-redaspdh质粒。4、将重组质粒ped31-redaspdh导入bl21(de3)，得到的重组菌即为bl21(ped31-redaspdh)。实施例14.重组大肠杆菌bl21(ped31-paeaspdh)的构建1、根据文献[3]，合成序列表的seqidno：38所示的双链dna分子，即paeaspdh。2、pseudomonasaeruginosapao1天冬氨酸脱氢酶基因paeaspdh的克隆上游引物：5’-tatacatatgctgaatatcgtcatgatcg-3(seqidno；39)’，下划线是ndei酶切位点。下游引物：5’-tacccagatctctagatcgaaatcgcgtggg-3’(seqidno：40)，下划线是bglii酶切位点。以步骤1合成的双链dna为模板，用以上引物pcr扩增目的基因。pcr反应条件如下：95℃预变性5min；95℃变性15s，退火温度从60℃开始，每个循环降低1℃，退火15s，72℃延伸30s，共10个循环后退火温度降至50℃；在最适退火温度55℃的条件下进行20个循环，同样退火15s，72℃延伸30s；最后在72℃延伸7min。扩增得到的dna片段经琼脂糖凝胶电泳验证后，用cyclepure试剂盒进行纯化。3、将pcr扩增的paeaspdh基因和表达载体ped31用限制性内切酶ndei、bglii于37℃双酶切过夜，琼脂糖电泳分别回收目的条带，两片段在t4连接酶中连接过夜，转化大肠杆菌dh5α，得到ped31-paeaspdh质粒。4、将重组质粒ped31-paeaspdh导入bl21(de3)，得到的重组菌即为bl21(ped31-paeaspdh)。实施例15.重组大肠杆菌bl21(ped31-reuaspdh)的构建1、根据文献[4]，合成序列表的seqidno：41所示的双链dna分子，即reuaspdh。2、ralstoniaeutrophajmp134天冬氨酸脱氢酶基因reuaspdh的克隆上游引物：5’-tatacatatgtccatgctgcatgtgtc-3(seqidno；42)’，下划线是ndei酶切位点。下游引物：5’tacccagatcttcagatcgataccgcgtgcg-3’(seqidno：43)，下划线是bglii酶切位点。以步骤1合成的双链dna为模板，用以上引物pcr扩增目的基因。pcr反应条件如下：95℃预变性5min；95℃变性15s，退火温度从60℃开始，每个循环降低1℃，退火15s，72℃延伸30s，共10个循环后退火温度降至50℃；在最适退火温度55℃的条件下进行20个循环，同样退火15s，72℃延伸30s；最后在72℃延伸7min。扩增得到的dna片段经琼脂糖凝胶电泳验证后，用cyclepure试剂盒进行纯化。3、将pcr扩增的reuaspdh基因和表达载体ped31用限制性内切酶ndei、bglii于37℃双酶切过夜，琼脂糖电泳分别回收目的条带，两片段在t4连接酶中连接过夜，转化大肠杆菌dh5α，得到ped31-reuaspdh质粒。4、将重组质粒ped31-reuaspdh导入bl21(de3)，得到的重组菌即为bl21(ped31-reuaspdh)。实施例16.重组大肠杆菌聚丙烯酰胺凝胶电泳分别将实施例2-15构建的重组大肠杆菌进行如下操作：1、挑取单菌落，接种于5ml含50μg/ml卡那霉素的液体lb培养基中，37℃、200rpm震荡培养12小时。2、取步骤1中的培养液1ml接种于20ml含50μg/ml卡那霉素的液体lb培养基中，30℃、200rpm震荡培养至od600＝0.6-0.8，加入0.5mm异丙基硫代半乳糖苷(iptg)，30℃培养12小时。3、测定培养后步骤2的培养体系中的菌液od600值，取1ml的10od菌液10,000rpm离心5分钟，加入1ml的100mmtris-hcl缓冲液(ph8.0)，混匀后进行超声波破碎(功率200w，工作3秒，停止3秒，总时长5分钟)，10,000rpm离心5分钟。4、分别取步骤3中上清和沉淀20μl加入等体积的2xloadingbuffer，沸水中反应5分钟，反应后取10μl加到配好的12％聚丙烯酰胺凝胶(sds-page)中检测蛋白表达情况。5、表达结果如图2、图3和图4所示，克雷伯氏肺炎菌来源的天冬氨酸脱氢酶(kpnaspdh)不仅有可溶性表达还有一半的不可溶表达；来源瘤胃甲烷短杆菌(mruaspdh)、马氏甲烷嗜盐菌(mmhaspdh)、人苍白杆菌(oanaspdh)、戴尔福特菌cs1-4(delaspdh)、变形斑沙雷氏菌(speaspdh)的天冬氨酸脱氢酶都仅有可溶性表达；来源需盐色盐杆菌(csaaspdh)、嗜酸产甲烷菌(mplaspdh)、鲍氏不动杆菌(abcaspdh)的天冬氨酸脱氢酶仅有不可溶的表达；来源柄杆菌(cakaspdh)、柴氏海洋玫瑰杆菌(dshaspdh)、roseibacteriumelongatum(redaspdh)的天冬氨酸脱氢酶既没有可溶性表达也没有不可溶表达。paeaspdh和reuaspdh均有表达(见图16)，蛋白大小约为28kda，paeaspdh均为可溶性表达而reuaspdh有一般蛋白不可溶。实施例17.天冬氨酸脱氢酶粗酶活检测反应体系：4mm草酰乙酸，0.2mmnad(p)h，100mmnh4cl溶于100mmtris-hclbuffer(ph8.0-9.0)，通过在340nm处测得nad(p)h的消耗情况得出酶的反应速度。酶活单位采用国际单位u，即每分钟氧化1μmolnad(p)h所用的酶量为一个酶活单位。粗酶蛋白含量的测定采用brandford微量分析法测定蛋白浓度。表1.天冬氨酸脱氢酶粗酶活检测(nadph)(u/mg)*：：其他包括mpl，csa，cak，dsh，red天冬氨酸脱氢酶在辅因子为nadph情况下的粗酶活检测情况如表1所示，其中来源人苍白杆菌(oanaspdh)、戴尔福特(delaspdh)和变形斑沙雷氏菌(speaspdh)的天冬氨酸脱氢酶表现出比较高的比酶活，在ph9条件下分别是56.5u/mg，13.4u/mg和19.7u/mg；克雷伯氏肺炎菌天冬氨酸脱氢酶(kpnaspdh)也有3.3u/mg的粗酶活；其他来源的脱氢酶酶活均小于1，在sds-page中未表达或仅有不可溶表达的aspdh几乎都没有酶活。表2.天冬氨酸脱氢酶粗酶活检测(nadh)(u/mg)oandelspeph9.07.810.25.6ph8.05.711.44天冬氨酸脱氢酶在辅因子为nadh情况下的粗酶活检测情况如表2所示，结果显示人苍白杆菌(oanaspdh)、戴尔福特(delaspdh)和变形斑沙雷氏菌(speaspdh)的天冬氨酸脱氢酶可检测到显著的酶活力，其中delaspdh酶活力最高。实施例18.纯化载体ped31-oanaspdh-histag构建1、合成序列表的seqidno：7所示的双链dna分子，即oanaspdh。2、带组氨酸标签的人苍白杆菌天冬氨酸脱氢酶基因oanaspdh-histag的克隆上游引物：5’tatacatatgtccgtatctgaaacc-3’(seqidno：44)，下划线是ndei酶切位点。下游引物：5’-tacccagatcttcagataacggtagttgctac-3’(seqidno：45)，下划线是bglii酶切位点，双下划线是6个组氨酸标签。以步骤1合成的双链dna为模板，用以上引物pcr扩增目的基因。pcr反应条件如下：95℃预变性5min；95℃变性15s，退火温度从60℃开始，每个循环降低1℃，退火15s，72℃延伸30s，共10个循环后退火温度降至50℃；在最适退火温度55℃的条件下进行20个循环，同样退火15s，72℃延伸30s；最后在72℃延伸7min。扩增得到的dna片段经琼脂糖凝胶电泳验证后，用cyclepure试剂盒进行纯化。3、将pcr扩增的oanaspdh基因和表达载体ped31用限制性内切酶ndei、bglii于37℃双酶切过夜，琼脂糖电泳分别回收目的条带，两片段在t4连接酶中连接过夜，转化大肠杆菌dh5α，得到ped31-oanaspdh-histag质粒。实施例19.纯化载体ped31-kpnaspdh-histag构建1、合成序列表的seqidno：2所示的双链dna分子，即kpnaspdh。2、带组氨酸标签的克雷伯氏肺炎菌天冬氨酸脱氢酶基因kpnaspdh-histag的克隆上游引物：5’-tatacatatgaaaaaagtaatgctgattggt-3’(seqidno：46)，下划线是ndei酶切位点。下游引物：5’-tacccagatctttaagccagttcgcgacaag-3’(seqidno：47)，下划线是bglii酶切位点，双下划线是6个组氨酸标签。以步骤1合成的双链dna为模板，用以上引物pcr扩增目的基因。pcr反应条件如下：95℃预变性5min；95℃变性15s，退火温度从60℃开始，每个循环降低1℃，退火15s，72℃延伸30s，共10个循环后退火温度降至50℃；在最适退火温度55℃的条件下进行20个循环，同样退火15s，72℃延伸30s；最后在72℃延伸7min。扩增得到的dna片段经琼脂糖凝胶电泳验证后，用cyclepure试剂盒进行纯化。3、将pcr扩增的kpnaspdh基因和表达载体ped31用限制性内切酶ndei、bglii于37℃双酶切过夜，琼脂糖电泳分别回收目的条带，两片段在t4连接酶中连接过夜，转化大肠杆菌dh5α，得到ped31-kpnaspdh-histag质粒。实施例20.纯化载体ped31-speaspdh-histag构建1、合成序列表的seqidno：6所示的双链dna分子，即speaspdh。2、带组氨酸标签的变形斑沙雷氏菌菌天冬氨酸脱氢酶基因speaspdh-histag的克隆上游引物：5’-tatacatatgaaaaaaatcatgatgatcggtt-3’(seqidno：48)，下划线是ndei酶切位点。下游引物：5’-tacccagatctttatgcgataaagccacc-3’(seqidno：49)，下划线是bglii酶切位点，双下划线是6个组氨酸标签。以步骤1合成的双链dna为模板，用以上引物pcr扩增目的基因。pcr反应条件如下：95℃预变性5min；95℃变性15s，退火温度从60℃开始，每个循环降低1℃，退火15s，72℃延伸30s，共10个循环后退火温度降至50℃；在最适退火温度55℃的条件下进行20个循环，同样退火15s，72℃延伸30s；最后在72℃延伸7min。扩增得到的dna片段经琼脂糖凝胶电泳验证后，用cyclepure试剂盒进行纯化。3、将pcr扩增的speaspdh基因和表达载体ped31用限制性内切酶ndei、bglii于37℃双酶切过夜，琼脂糖电泳分别回收目的条带，两片段在t4连接酶中连接过夜，转化大肠杆菌dh5α，得到ped31-speaspdh-histag质粒。实施例21.纯化载体ped31-delaspdh-histag构建1、合成序列表的seqidno：3所示的双链dna分子，即delaspdh。2、带组氨酸标签的戴尔福特菌cs1-4天冬氨酸脱氢酶基因delaspdh-histag的克隆上游引物：5’-tatacatatgaacatcgctgtaatcggttg-3’(seqidno：50)，下划线是ndei酶切位点。下游引物：5’-tacccagatctttagatagcgattgcggtag-3’(seqidno：51)，下划线是bglii酶切位点，双下划线是6个组氨酸标签。以步骤1合成的双链dna为模板，用以上引物pcr扩增目的基因。pcr反应条件如下：95℃预变性5min；95℃变性15s，退火温度从60℃开始，每个循环降低1℃，退火15s，72℃延伸30s，共10个循环后退火温度降至50℃；在最适退火温度55℃的条件下进行20个循环，同样退火15s，72℃延伸30s；最后在72℃延伸7min。扩增得到的dna片段经琼脂糖凝胶电泳验证后，用cyclepure试剂盒进行纯化。3、将pcr扩增的delaspdh基因和表达载体ped31用限制性内切酶ndei、bglii于37℃双酶切过夜，琼脂糖电泳分别回收目的条带，两片段在t4连接酶中连接过夜，转化大肠杆菌dh5α，得到ped31-delaspdh-histag质粒。实施例22.oanaspdh，kpnaspdh，speaspdh和delaspdh重组天冬氨酸脱氢酶的纯化i.kpnaspdh，speaspdh和delaspdh重组天冬氨酸脱氢酶的纯化分别将实施例18-21构建的纯化载体分别转化大肠杆菌bl21，对获得的重组大肠杆菌进行如下操作：1、挑取单菌落，接种于5ml含50μg/ml卡那霉素的液体lb培养基中，37℃、200rpm震荡培养12小时。2、取步骤1中的培养液1ml接种于20ml含50μg/ml卡那霉素的液体lb培养基中，30℃、200rpm震荡培养至od600＝0.6-0.8，加入0.5mm异丙基硫代半乳糖苷(iptg)，30℃培养12小时。3、培养后步骤2的培养体系中的菌液10,000rpm离心5分钟，加入5ml的结合液(50mm磷酸钠，300mm氯化钠，10mm咪唑ph8.0)，混匀后进行超声波破碎(功率200w，工作3秒，停止4秒，总时长10分钟)，10,000rpm离心5分钟。4、取步骤3中上清和沉淀20μl加入等体积的2xloadingbuffer，沸水中反应5分钟，反应后取10μl加到配好的12％聚丙烯酰胺凝胶(sds-page)中检测蛋白表达情况。结果如图5所示，oanaspdh在c端加入组氨酸标签后导致蛋白无法正常表达，其他三个天冬氨酸脱氢酶均正常表达。5、取步骤3中上清用0.22μm滤膜除去杂质，过滤后加入到预冷的亲和介质填充层析柱镍柱进行蛋白纯化，随后用漂洗液(50mm磷酸钠，300mm氯化钠，20mm咪唑ph8.0)洗脱杂蛋白后用洗脱液(50mm磷酸钠，300mm氯化钠，250mm咪唑ph8.0)将天冬氨酸脱氢酶进行洗脱。洗脱蛋白于4℃保存，并进行sds-page检测(图6)ii.oanaspdh重组天冬氨酸脱氢酶的纯化1、挑取将实施例7构建的大肠杆菌bl21(ped31-oanaspdh)单菌落，接种于5ml含50μg/ml卡那霉素的液体lb培养基中，37℃、200rpm震荡培养12小时。2、取步骤1中的培养液1ml接种于20ml含50μg/ml卡那霉素的液体lb培养基中，30℃、200rpm震荡培养至od600＝0.6-0.8，加入0.5mm异丙基硫代半乳糖苷(iptg)，30℃培养12小时。3、培养后步骤2的培养体系中的菌液10,000rpm离心5分钟收集细胞。将收集的细胞悬浮于10mm磷酸钾缓冲液中(ph6.5)，含有1mmedta和20％甘油。混匀后进行超声波破碎(功率200w，工作3秒，停止4秒，总时长10分钟)，并以37,000×g，在4℃。离心1小时4.deae-sepharoseff阴离子交换层析：将细胞破碎液加样于用0.02mol/ltris-hcl(ph7.5)缓冲液平衡的deae-sepharoseff阴离子交换柱，用平衡液充分衡洗，将未挂上柱的蛋白充分洗脱下来(衡洗阶段)后，用0.5mol/lnacl溶液以2.0ml/min的流速进行线性梯度(0-30％)洗脱(洗脱阶段)，收集浓缩衡洗阶段和洗脱阶段的酶活组分。5.superdex-g75/200凝胶层析：用含0.15mol/lnacl的0.02mol/ltris-hcl(ph7.5)缓冲液平衡凝胶柱，将1.2.6中的浓缩酶液加样于凝胶柱，平衡液洗脱，流速0.5ml/min。收集酶活峰，即为纯酶液。实施例23.天冬氨酸脱氢酶的酶学性质测定将纯化后的天冬氨酸脱氢酶分别测定其最适反应ph、最适反应温度、温度稳定性、底物特异性和动力学参数。最适反应ph实验中所用反应buffer如下：100mm磷酸钠(ph6.5-7.5)，100mmtris-hcl(ph7.5-9.5)，和100mmglycine-naoh(ph9.5-10.5)。结果如图7-图9所示，kpnaspdh的最适反应ph为8.5，比酶活可达26.5u/mg(图7)；delaspdh和speaspdh在ph8处比酶活最高，分别是32.8和106.2u/mg(图8和图9)；oan最适ph在8.0～8.5范围内，比酶活达到220u/mg以上。四种天冬氨酸脱氢酶都在偏碱性的环境表现出较高的酶活性，而在中性条件下的酶活仍可以保持一定的酶活。四种天冬氨酸脱氢酶在ph7.0和7.5时的酶活如下表所示。atris-hcl缓冲液测定b磷酸钠缓冲液测定实施例24生产天冬氨酸的大肠杆菌底盘菌株asp005的构建重组菌株asp005的构建(表5)，包含以下5步：表5，天冬氨酸生产菌株1、乳酸脱氢酶基因ldha基因的敲除(1)敲除片段δldha的pcr扩增第一步，以野生型大肠杆菌bw25113(coligeneticstockcenter(cgsc)strain7636)的基因组dna为模板，使用引物ldha-up和ldha-2(表6)进行pcr扩增。pcr反应条件如下：95℃预变性5min；95℃变性15s，退火温度从60℃开始，每个循环降低1℃，退火15s，72℃延伸30s，共10个循环后退火温度降至50℃；在最适退火温度55℃的条件下进行20个循环，同样退火15s，72℃延伸30s；最后在72℃延伸7min。扩增得到的产物1dha1大小为446bp，该产物包含大肠杆菌bw25113的乳酸脱氢酶编码基因ldha上游约400个碱基和下游20个碱基。第二步，以bw25113的基因组dna为模板，使用引物ldha-1和ldha-down(表6)进行pcr扩增。pcr反应条件如下：95℃预变性5min；95℃变性15s，退火温度从60℃开始，每个循环降低1℃，退火15s，72℃延伸30s，共10个循环后退火温度降至50℃；在最适退火温度55℃的条件下进行20个循环，同样退火15s，72℃延伸30s；最后在72℃延伸7min。扩增得到的产物ldha2大小为403bp，该产物包含大肠杆菌bw25113的乳酸脱氢酶编码基因ldha下游约400个碱基。第三步，以上述两步得到的片段ldha1和ldha2为模板，使用引物ldha-up和ldha-down(表6)进行融合pcr扩增。pcr反应条件如下：95℃预变性5min；95℃变性15s，退火温度从60℃开始，每个循环降低1℃，退火15s，72℃延伸30s，共10个循环后退火温度降至50℃；在最适退火温度55℃的条件下进行20个循环，同样退火15s，72℃延伸30s；最后在72℃延伸7min。扩增得到的产物δldha大小为829bp，该产物包含大肠杆菌bw25113的乳酸脱氢酶编码基因ldha的上、下游各约400个碱基。(2)质粒ptargetf-δldha的构建第一步，以质粒ptargetf(购自addgene)为模板，使用引物ptargetf-2和ptarget-f-ldhan20(表6)进行pcr扩增。pcr反应条件如下：95℃预变性5min；95℃变性15s，退火温度从60℃开始，每个循环降低1℃，退火15s，72℃延伸30s，共10个循环后退火温度降至50℃；在最适退火温度55℃的条件下进行20个循环，同样退火15s，72℃延伸30s；最后在72℃延伸7min。扩增得到的产物大小为2138bp，产物包含载体ptargetf和大肠杆菌bw25113的乳酸脱氢酶编码基因ldha的pam序列附近的20个碱基。使用omega公司的cyclepure试剂盒将得到的pcr产物清洁、回收，然后转化入dh5α感受态细胞中。复苏后涂布在含壮观霉素的固体lb平板上，37℃过夜培养。选择2-3个单克隆，抽提质粒，并使用引物ptargetf-f进行测序。测序正确的质粒命名为ptargetf-δldha。(3)质粒pcas的电转化将质粒pcas(购自addgene)电转化至野生型大肠杆菌bw25113的感受态细胞中，30℃复苏后涂布在含卡那霉素的固体lb平板上，30℃过夜培养。(4)ldha的敲除将含有pcas质粒的bw25113在液体lb中，30℃培养，并用终浓度10mm的阿拉伯糖诱导，然后做感受态细胞。将(1)和(2)中得到的敲除片段δldha和质粒ptargetf-δldha共转入上述感受态中。30℃复苏后，涂布在含有卡那霉素和壮观霉素的固体lb平板上，30℃过夜培养。得到单克隆后使用引物ldha-up和ldha-down进行菌落pcr验证，正确的pcr产物大小为829bp。(5)质粒ptargetf-δldha的去除选择(4)中一株验证正确的菌株，接种到2ml含有卡那霉素和iptg(终浓度0.5mm)的液体lb中。30℃过夜培养，然后平板划线。筛选可以在含有卡那霉素的lb平板上生长、不能再含有壮观霉素的lb平板上生长的单克隆，并命名为asp001/pcas。(6)质粒pcas的去除将菌株asp001/pcas接种到2ml液体lb中，37℃过夜培养。然后平板划线，得到单克隆。筛选只能在lb平板生长、不能在含有卡那霉素的lb平板上生长的单克隆，并命名为asp001。表6，引物2、乙醛-乙醇脱氢酶adhe基因的敲除从重组菌株asp001出发，使用本实施例上文1部分(乳酸脱氢酶基因ldha基因的敲除)中相同的方法敲除adhe基因，获得重组大肠杆菌asp002。使用的引物见表6，其中引物的名称对应于敲除ldha基因过程中所使用的引物的名称，仅将ldha替换为adhe。3、富马酸还原酶frdbc基因的敲除从重组菌株asp002出发，使用本实施例上文1部分(乳酸脱氢酶基因ldha基因的敲除)中相同的方法敲除frdbc基因，获得重组大肠杆菌asp003。使用的引物见表6，其中引物的名称对应于敲除ldha基因过程中所使用的引物的名称，仅将ldha替换为frdbc。4、葡萄糖pts通透酶ptsg基因的敲除从重组菌株asp003出发，使用本实施例上文1部分(乳酸脱氢酶基因ldha基因的敲除)中相同的方法敲除ptsg基因，获得重组大肠杆菌asp004。使用的引物见表6，其中引物的名称对应于敲除ldha基因过程中所使用的引物的名称，仅将ldha替换为ptsg。5、甲基乙二醛合酶mgsa基因的敲除从重组菌株asp004出发，使用本实施例上文1部分(乳酸脱氢酶基因ldha基因的敲除)中相同的方法敲除ptsg基因，获得重组大肠杆菌asp005。使用的引物见表6，其中引物的名称对应于敲除ldha基因过程中所使用的引物的名称，仅将ldha替换为mgsa。实施例25.生产天冬氨酸的重组大肠杆菌的构建1、质粒水平表达aspdh的重组菌株的构建从重组菌株asp005出发，分别将表达来源于人苍白杆菌(ochrobactrumanthropi)和变形斑沙雷氏菌(serratiaproteamaculans)的天冬氨酸脱氢酶的载体ped31-oanaspdh(实施例7)和ped31-speaspdh(实施例3)电转化入重组菌株asp005的感受态中。提取质粒用ndei和bglii酶切验证，验证正确的菌株命名为asp006和asp007。2、基因组水平表达oanaspdh的重组菌株的构建从重组菌株asp005出发，将表达来源于苍白杆菌(ochrobactrumanthropi)的天冬氨酸脱氢酶基因oanaspdh整合在asp005的丙酮酸甲酸裂解酶基因pflb位点。具体步骤如下：(1)整合片段pflb-oanaspdh的pcr扩增第一步，以大肠杆菌bw25113的基因组dna为模板，使用引物pflb-up和pflb-2(表6)进行pcr扩增。pcr反应条件如下：95℃预变性5min；95℃变性15s，退火温度从60℃开始，每个循环降低1℃，退火15s，72℃延伸30s，共10个循环后退火温度降至50℃；在最适退火温度55℃的条件下进行20个循环，同样退火15s，72℃延伸30s；最后在72℃延伸7min。扩增得到的产物pflb1大小为340bp，该产物包含大肠杆菌bw25113的丙酮酸甲酸裂解酶基因pflb上游340个碱基。第二步，以质粒ped31-oanaspdh为模板，使用引物pflb-oanaspdh-f和oanaspdh-r(表6)进行pcr扩增。pcr反应条件如下：95℃预变性5min；95℃变性15s，退火温度从60℃开始，每个循环降低1℃，退火15s，72℃延伸30s，共10个循环后退火温度降至50℃；在最适退火温度55℃的条件下进行20个循环，同样退火15s，72℃延伸30s；最后在72℃延伸7min。扩增得到的产物oanaspdh大小为827bp，该产物包含大肠杆菌bw25113的丙酮酸-甲酸裂解酶基因pflb的上游20bp和oanaspdh基因。第三步，以大肠杆菌bw25113的基因组dna为模板，使用引物oanaspdh-pflb-1和pflb-down(表6)进行pcr扩增。扩增得到的产物pflb2大小为332bp，该产物包含oanaspdh基因终止密码子前20bp和丙酮酸甲酸裂解酶基因pflb下游约300个碱基。第四步，以上述得到的三个片段作为模板，使用引物pflb-up和pflb-down(表6)进行融合pcr扩增，扩增得到的产物pflb-oanaspdh大小为1459bp，该产物包含大肠杆菌bw25113的丙酮酸-甲酸裂解酶基因pflb的上、下游各约300个碱基和oanaspdh基因。(2)～(6)和实施例22中1(乳酸脱氢酶基因ldha基因的敲除)中的(2)～(6)方法步骤一致，其中质粒和片段的名称对应于敲除ldha基因过程中所使用的引物和片段，仅将出发菌株bw25113替换为asp005；将质粒ptargetf-δldha替换为ptargetf-δpflb；将敲除片段δldha替换为整合片段pflb-oanaspdh。将整合成功的菌株命名为asp0103、基因组水平表达speaspdh，delaspdh和kpnaspdh的重组菌株的构建从重组菌株asp005出发，使用上文2部分(基因组水平表达oanaspdh的重组菌株的构建)中相同的方法分别将speaspdh，delaspdh和kpnaspdh整合在asp005的丙酮酸甲酸裂解酶基因pflb位点，分别获得重组大肠杆菌asp011-asp013。使用的引物见表6，其中引物的名称对应于整合oanaspdh基因过程中所使用的引物的名称，仅将oanaspdh分别替换为speaspdh、delaspdh和kpnaspdh对应的引物。实施例26.生产天冬氨酸的重组大肠杆菌的构建1.诱导型表达载体pad构建将pacyc184(nctt保藏)，用引物pad-15a-r(atgataagctgtcaaacatgag，seqidno：95)和pad-15a-f(tagcaccaggcgtttaagg，seqidno：96)扩增，pcr条件为：95℃预变性3min；95℃变性15s，61℃退火15s，72℃延伸1min；72℃延伸7min。获得扩增片段用试剂盒纯化。将ped31载体，用引物ped-duet-f(catgtttgacagcttatcatgcgcccaccggaaggagc，seqidno：97)和(cccttaaacgcctggtgctaatccggatatagttcctcctttcagcaaaaaacc，seqidno：98)扩增，pcr条件为：95℃预变性3min；95℃变性15s，70℃退火15s，72℃延伸1min；72℃延伸7min。获得扩增片段用试剂盒纯化。上述纯化后的片段，按gibsoncloningkit(neb公司)说明书操作，获得pad载体。2.pand基因的获得以解淀粉芽孢杆菌(cgmcc1.936)基因组dna为模板，使用引物pand-f和pand-r(表6)为模板进行pcr扩增，pcr反应条件如下：95℃预变性5min；95℃变性15s，退火温度从60℃开始，每个循环降低1℃，退火15s，72℃延伸30s，共10个循环后退火温度降至50℃；在最适退火温度55℃的条件下进行20个循环，同样退火15s，72℃延伸30s；最后在72℃延伸7min。3.重组载体和菌株的构建扩增得到的产物连接至pad载体的ndei和bglii位点，获得载体pad-pand。将载体转化至asp005～asp009，，获得菌株asp014～asp018。实施例27使用重组菌株发酵生产天冬氨酸和β-丙氨酸种子培养基由以下成分组成(溶剂为水)大量元素：葡萄糖20g/l，kh2po43.5g/l，k2hpo46.55g/l，nh4)2hpo43.5g/l，mgso4·7h2o0.12g/l，betaine-kcl0.15g/l，thiamine-hcl0.005g/l和mops100mm；微量元素：fecl3·6h2o1.5μg/l，cocl2·6h2o0.1μg/l，cucl2·2h2o0.1μg/l，zncl20.1μg/l，na2moo4.2h2o0.1μg/l，mncl2·4h2o0.2μg/l，h3bo30.05μg/l。发酵培养基大部分和种子培养基相同，区别是另外添加了100mmnahco3和100mmnh4cl。分别利用重组大肠杆菌菌株asp005-013厌氧发酵生产天冬氨酸和利用重组大肠杆菌菌株asp014-18厌氧发酵生产β-丙氨酸(1)种子培养：100ml三角瓶中种子培养基为20ml，115℃灭菌20min。冷却后将重组大肠杆菌按照1％(v/v)的接种量接种于种子培养基，在ph＝7.0,37℃和200rpm的条件下过夜培养得到种子液，用于发酵培养基接种。(2)发酵培养基：100ml厌氧小瓶中发酵培养基体积为50ml，将种子液按照终浓度od600＝0.1的接种量接种于发酵培养基，37℃静置培养6天，得到发酵液。发酵液为厌氧瓶中所有的物质，培养过程中没有通任何气体。分析方法：使用安捷伦(agilent-1260)高效液相色谱仪(hplc)对第六天发酵液中的组分进行测定。取1ml发酵液，12000rpm离心3min，取上清液进行测定。发酵液中的葡萄糖和有机酸浓度测定采用伯乐(biorad)公司的aminexhpx-87h有机酸分析柱。流动相为5mm的硫酸，流速为0.5ml/min，使用rid检测器检测。取上述上清液进行衍生化，然后使用hplc测定其中的天冬氨酸产量。衍生化的方法：取300μl稀释液，加入360μlph＝9.5，0.05mol/l的硼酸钠缓冲液，然后再加入240μl衍生剂，混用。室温震荡2min后进行hplc检测。衍生剂由1.3g邻苯二甲醛、0.59gn-乙酰半胱氨酸、20ml无水乙醇和78.11mlph＝9.5，0.05mol/l的硼酸钠缓冲液组成。hplc检测采用agilent色谱柱(eclipsexdb-c18，4.6×150mm)，流动相为2.871g/l的乙酸钠水溶液，流速为1ml/min，使用vwd检测器，在334nm(紫外)进行检测。重组大肠杆菌菌株asp005-013的天冬氨酸产量如图12所示。菌株asp014-asp018的β-丙氨酸产量如图13所示，得率如图14所示，得率0.20～0.38g/g，显著高于文献[6]报道的0.135g/g实施例28经序列比对(图15)，发现四种来源的天冬氨酸脱氢酶(oanaspdh，speaspdh，delaspdh和kpnaspdh)的序列相似度在35％-71％之前，在n端开始的位置都有标志性的辅因子nad(p)h结合序列gxgxxg/a。其中oanaspdh与speaspdh、delaspdh和kpnaspdh的序列相似性分别为37.1％，35.5％和38.6％。应用swiss-model(http：//www.swissmodel.expasy.org/)程序，以来源于archaeoglobusfulgidus的天冬氨酸脱氢酶结构(pdbid.2dc1)为模板，对oanaspdh、speaspdh、delaspdh和kpnaspdh进行同源建模。应用pymol(http：//www.pymol.org/)将以上获得的oanaspdh三维结构分别与speaspdh、delaspdh和kpnaspdh进行比对，从而得到两两对比结果如。图17a-c所示，其中图17a为oanaspdh与speaspdh比对结果。深灰色为oanaspdh，浅灰色为speaspdh；图17b为oanaspdh与delaspdh比对结果。深灰色为oanaspdh，浅灰色为delaspdh；图17c为oanaspdh与kpnaspdh比对结果。深灰色为oanaspdh，浅灰色为kpnaspdh。从比对结果可知，即使筛选得到的天冬氨酸脱氢酶序列的相似性不高，但是从三维结构上整体具有较高的相似性，差异部分主要在蛋白的外围的区域，标志性的n端的rossmann折叠模块(包含gxgxxg/a)的区域有较高的相似性。参考文献：[1].yang，z.，etal.，aspartatedehydrogenase，anovelenzymeidentifiedfromstructuralandfunctionalstudiesoftm1643.jbiolchem，2003.278(10)：p.8804-8.[2].yoneda，k.，etal.，thefirstarchaeall-aspartatedehydrogenasefromthehyperthermophilearchaeoglobusfulgidus：genecloningandenzymologicalcharacterization.biochimbiophysacta，2006.1764(6)：p.1087-93.[3].li，y.，etal.，anovell-aspartatedehydrogenasefromthemesophilicbacteriumpseudomonasaeruginosapao1：molecularcharacterizationandapplicationforl-aspartateproduction.applmicrobiolbiotechnol，2011.90(6)：p.1953-62.[4].li，y.，etal.，anon-nadbtypel-aspartatedehydrogenasefromralstoniaeutrophastrainjmp134：molecularcharacterizationandphysiologicalfunctions.bioscibiotechnolbiochem，2011.75(8)：p.1524-32.[5].kuvaeva，t.m.，etal.，novelnadphdependentlaspartatedehydrogenasesfromthemesophilicnitrogenfixingbacteriarhodopseudomonaspalustrisandbradyrhizobiumjaponicum.appliedbiochemistryandmicrobiology，2013.49(2)：p.155-63.[6]chanws，leej，koys，etal.metabolicengineeringofescherichiacoli，fortheproductionof3-aminopropionicacid[j].metabolicengineering，2015,30(3)：121.sequencelisting<110>中国科学院微生物研究所<120>新型天冬氨酸脱氢酶及在天冬氨酸族氨基酸生产上的应用<130>ib178419<160>102<170>patentinversion3.1<210>1<211>397<212>dna<213>人工序列<400>1gactgagagtcgcatgcaattgtgagcggataacaattgacattgtgagcggataacaag60atactgagcacatcagcaggacgcactgacccctctagaaataattttgtttaactttaa120gaaggagatatacatatgttcgaaagatctgggtaccttaattaacctagggcggccgca180taatgcttaagtcgaacagaaagtaatcgtattgtacacggccgcataatcgaaatgagc240tgcaccggcgttgacaattaatcatcggctcgtataatgtgtggaattgtgagcggataa300caattgaattcctgtagaaataattttgtttaactttaataaggagatataccatgggca360gcagcggatccgagctccgtcgacaagcttactcgag397<210>2<211>765<212>dna<213>克雷伯氏肺炎菌（klebsiellapneumoniae）<400>2atgaaaaaagtaatgctgattggttacggcgcaatggctcaggcagttatcgaacgtctg60ccgccgcaggtacgcgttgaatggatcgttgcacgcgagagccatcacgcggctatctgt120ctgcaattcggccaggcggtaaccccgctgactgatccgctgcagtgcggtggcaccccg180gacctggttctggaatgcgctagccagcaggctgttgctcagtacggtgaggcggtactg240gctcgtggctggcacctggctgtaatctctaccggtgcactggcggactccgaactggaa300cagcgtctgcgccaagcgggtggtaagctgaccctgctggctggtgcagtggctggtatc360gatggccttgcggctgctaaagagggcggtctggaacgcgtaacctaccgctctcgtaag420tctccggcatcttggcgtggttcttacgcagaacagctgatcgatctgtccgctgtaaac480gaggctaaaatcttctttgaaggttctgcgcgcgaagcggcacgtctgttcccggctaac540gctaacgttgctgcaaccatcgcactgggtggtatcggtctggatgcaacccgtgttcag600ctcatggtagacccggctacccagcgtaacacccataccctgcatgctgaaggtctgttc660ggcgaatttcacctggaactgtctggtctgccgctggcttctaacccaaaaacttctacc720ctggcagctctgtctgctgtgcgtgcttgtcgcgaactggcttaa765<210>3<211>798<212>dna<213>戴尔福特菌cs1-4（delftiasp.cs1-4）<400>3atgaacatcgctgtaatcggttgcggtgcgattggcgcgtctgtactggaactgctgaag60ggtcacgctgcggttcaggtgggctgggttctggttccggaagttaccgacgctgtacgt120gcaaccctggcacgtcatgcgccgcaggcacgcgctctgccagcactgaccaccgaagac180cgtccggacctgatcgttgaatgtgcaggtcacactgctatcgaagagcacgtactgccg240gcgctgcgccgtggcatcccggctgtagtggctagcatcggtgctctgagcgctccgggt300atggcagaagcagtgcaggcagcagctgaggctggtggtactcaggtacagctgctgtcc360ggtgctatcggcggtgttgatgcactggctgctgctcgtatcggcggtctggacgaagta420gtttacactggccgtaaaccaccgctggcttggaccggtactccggctgaacagcgttgc480gatcttgcgagcctgaaagaggcattttgcatcttcgaaggctccgcacgtgaagctgct540cagctgtacccaaaaaacgcgaatgtggcagctaccctgtctctggcgggcatgggtctg600gatcgcactaccgtgcgtctgtacgcagatccagcagtggatgaaaacgtacaccatgta660gcggctcgcggcgcgttcggttctatggaactgactatgcgtggtaaaccgctggaagcg720aacccgaagacctctgctctgaccgtatactctgtagtgcgtgcggttctgaaccaggct780accgcaatcgctatctaa798<210>4<211>798<212>dna<213>需盐色盐杆菌（chromohalobactersalexigens）<400>4atgactgcgaaaaccgttatgatgatcggttacggtgcaatgggccgtgcagtacacgaa60ctgctgccgagcggcctggcactccgttgggtagttgttccagaactctctgttgcggaa120actgttgctcgtctgggccaggacgttgaagtaatgacttctgttgatacttgccgcgaa180cgtccggacctggttgttgaatgcgctggccaggctggcctggctgaacacggcggcgca240gttctggcacgtggctggtccctggctgttgtttctgtgggtgcgctggcagatgacgca300ctgtatggtcgtctgcatgacgcagctcgtcgctccggtggcaaactccacgtgctggct360ggcgctgttgcgggtatggacggtctggctgcagctcgcgagggcggcctcgaatccgta420acttacgaggctcgcaaagcaccggcaagctggcgtggttcccacgctgaagaactggtg480gatctggacgcggtaacccagccgaccgtgttctttgaaggttctgcgggcgacgctgca540cgccgttttccggctaacgcaaacgttgcggcaaccgtagcactggctggtctgggcatg600gaaaa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