本发明属于分子生物学技术领域，涉及一种与苏淮猪肉色性状相关的snp标记及其引物和应用。
背景技术：
我国是猪肉消费及产量第一大国，猪肉品质一直是养猪生产者与消费者持续关注的热点之一。目前评价猪肉品质主要有肉色、嫩度、肌内脂肪、ph值、滴水损失、系水力等重要指标。随着人民生活水平的提高和养猪业的迅速发展，人们更加关注猪肉品质，而不是猪肉的产量，猪肉的肉色对于消费者而言是一项可直接感受的印象指标，因此是消费者购买优质猪肉时考虑的最主要的因素。
骨骼肌作为猪肉中的重要组成成分，直接决定着猪肉的肉质品质。因此，对猪骨骼肌生长发育调控机理的探究一直是畜牧科学领域中的热点。肌纤维类型的差异会直接导致肌肉颜色的变异。在氧化型纤维占比例较高的肌肉中，其肌红蛋白含量更高，肌肉颜色更鲜红，肉色评分相对较高。而在酵解型纤维占比例较高的肌肉中，其肌红蛋白含量较低，肉色便越显苍白，导致较低的肉色评分。
mirna基因遗传变异的出现可能会改变pri-mirna的转录，影响pre-mirna加工或稳定性，从而导致成熟mirna表达水平的增加或减少。另一方面，mirna基因序列的变化会进而影响它们与靶mrna之间的相互作用。也正因为mirna可潜在调控多个靶标的表达，所以其序列的变异往往会引发多功能效应，导致个体表型发生变异。例如，已有研究发现，mir-208b与mir-1前体序列所在基因片段上均存在一个遗传突变，可显著影响mir-208b和mir-1在骨骼肌中的表达，且该位点均与猪肌肉纤维特征及肉质性状表型变异存在显著相关。
苏淮猪是由江苏农业厅批准，由南京农业大学和淮阴种猪场联合培育的黑毛猪新品种。其以淮猪母本,大白猪为父本进行杂交选育而成。苏淮猪结合了淮猪的产仔性能和大白猪的生长性能，是一个优良的培育品种。苏淮猪面部较为清秀，呈轻微凹陷，全身被毛黑色，其具有抗逆性强，适应性强，耐粗饲，肉质好等优点。由于是培育的新品种，所以目前关于苏淮猪的肉质遗传机制的研究还较少，因此苏淮猪的肉质的遗传机制是一个值得研究的领域。
从国际猪qtl数据库网站(http://www.animalgenome.org/cgi-bin/qtldb/ss/index)知，目前在猪所有的常染色体及性染色体上都定位到影响肉质的qtl，肉色是肉质的一个重要的并且直观的指标，这些qtl大部分是利用微卫星标记定位的qtl，置信区间多在10-20cm，无法确定真正的主效基因及其关键变异位点，因此难以直接应用于种猪选育改良。
技术实现要素：
本发明的目的在于针对现有技术不足，肉色的较低的平均遗传力，提供与猪肉色相关的snp标记。
本发明的另一个目的在于提供用于检测上述snp标记的引物和检测方法。
本发明的另一个目的在于提供上述snp标记的用途。
一种与苏淮猪肉色性状相关的snp标记，所述mirna的前体序列的snp标记位于猪7号染色体上的核苷酸序列上，所述snp标记的位点为国际猪基因组10.2版本参考序列猪12号染色体g.45318896核苷酸位点，且具有g/a多态性，所述snp标记与苏淮猪屠宰后2小时a值(肌肉的红度值)极显著相关。g.45318896位点具有aa基因型苏淮猪个体的宰后2h肉色a值比gg型高，呈极显著水平，但与ga型之间无显著性差异；ga型苏淮猪个体的宰后2h肉色a值比gg型个体要高，且达到显著水平。
一种基于本发明所述的snp开发分子标记的方法，以含有本发明所述的snp标记的核苷酸序列为基础序列，设计引物对，以苏淮猪基因组dna为模板进行pcr扩增，使本发明所述的snp标记转化为分子标记。
其中，所述的引物对序列为上游引物：seqidno：2，下游引物：seqidno：3；所述的分子标记序列如seqidno：1所示，所述的snp位点位于第221位，存在g/a多态性。
按照本发明上述方法得到的分子标记。
所述的分子标记优选序列如seqidno：1所示，所述的snp位点位于第221位，存在g/a多态性。
一种用于检测所述的snp标记的引物对，上游引物为：seqidno：2，下游引物为：seqidno：3。
一种检测本发明所述的snp标记的方法，包含pcr扩增苏淮猪基因组中含有本发明所述的snp标记的一段序列，对扩增产物进行测序，判读该位点的g/a多态性。
所述的检测本发明所述的snp标记的方法，优选包括以下步骤：
(1)取苏淮猪的耳组织样品并提取总dna；
(2)用已提取的苏淮猪基因组dna为模板，使用所述的引物进行pcr扩增；
(3)扩增产物进行测序，分析测序结果，判读在seqidno：1第221位的g/a多态性。
本发明所述的snp标记、所述的分子标记、所述的引物对在筛选高肉色苏淮猪品系中的应用。
一种筛选苏淮猪品系肉色a值高的的方法，包括检测苏淮猪国际猪基因组10.2版本参考序列猪12号染色体上g.45318896核苷酸位点的基因型，选育g.45318896核苷酸位点的aa型或ga型个体作为种猪，所生产后代肉色更好。
有益效果：
本发明提供的snp标记与苏淮猪的肉色性状显著相关，因此，可以通过鉴定该snp标记来筛选肉色a值高的苏淮猪品系，所得的选肉色a值高的苏淮猪品系具有重要的经济效益与社会价值。
附图说明
图1为mir-22前体序列的不同基因型的dna测序结果峰图。
图中箭头所指的是g.45318896核苷酸位点的不同的基因型，由上指下分别为gg、ga和aa型。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和本质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。
实施例1
1、实验动物来源
江苏省淮安市淮阴种猪场
2、snp标记的获得
苏淮猪群体肉色性状的观测值进行描述性统计分析，屠宰后24h肉色b值的变异系数高达28.35％，屠宰后2h肉色a值的变异系数也达到了25.82％。为初步解析引起苏淮猪肉色性状变异的分子机理，我们在300头苏淮猪中随机选择了8个个体，以其dna为模板，利用设计的特异性引物扩增包含ssc-mir-22前体序列在内的688bp长度片段。测序、比对后，发现存在多个突变位点，选择其中一个g/a突变位点即g.45318896核苷酸位点作为下一步研究的对象。
3、提取基因组dna
采集300头苏淮猪的耳组织样品，放置于装有70％酒精的离心管内，-20℃冰箱保存备用。
使用传统酚/氯仿法提取耳组织基因组dna，所需试剂包括：
裂解液实验室配备
蛋白酶k(德国merck生物科技有限公司)
tris饱和酚(北京索莱宝生物科技有限公司)
tris饱和酚：氯仿：异戊醇(25：24：1)(北京索莱宝生物科技有限公司)
氯仿(江苏永华精细化学品有限公司)
无水乙醇(广东光华科技股份有限公司)
3m乙酸钠(北京索莱宝生物科技有限公司)
具体步骤如下所述：
(1)取黄豆大小组织样，尽量剪碎放入2ml离心管中；
(2)加入裂解液(自己配备)800μl，及蛋白酶k30μl(20mg/ml)；
(3)样品置于55℃恒温箱中孵育过夜，至管中无组织块为止；
(4)加入tris饱和酚800μl，轻微混匀10min，4℃12000r/min离心12min；
(5)取650μl上清加tris饱和酚：氯仿：异戊醇(25：24：1)800μl，混摇10min，4℃12000r/min离心12min；
(6)取550μl上清，加氯仿800μl，混摇10min，4℃12000r/min离心12min；
以下步骤换1.5ml的离心管
(7)取450μl上清，加无水乙醇800μl，3m乙酸钠40μl，混摇6min，4℃1000r/min离心8min；
(8)弃上清留下dna沉淀团，加入1000μl70％乙醇(自己配备)，混摇5min，4℃1000r/min离心5min，弃上清(如需要可重复一次)；
(9)将离心管放入通风橱，吹干至管内无小滴；
(10)样品加100μl超纯水，轻微吹打至dna溶解，经过nanodrop-100分光光度计检测质量与浓度后将浓度统一稀释到50ng/μl于-20℃下保存备用。
4、300头苏淮猪的肉色性状的测定
具体测定方案如下：
(1)对每头猪最后肋骨处的背最长肌进行采样，200g。
(2)将色差计的镜头垂直置于镜面上，镜口紧扣肉面(不能漏光)，同时避开肌内脂肪和肌内结缔组织。测定并分别记录肉样的亮度值(l*)、红度值(a*)、黄度值(b*)。每个样品至少测定三个点，取平均值，肉色性状的测定在屠宰后2h进行。
5、目的片段pcr扩增与测序
用已提取的dna为模板，根据所设计的引物，进行pcr扩增：取dna模板2μl、seqidno：2和seqidno：3所示的引物各0.25μl、pcrmix试剂10.4μl、双蒸水7.1μl；设置pcr扩增体系：预变性96℃2min；变形96℃20s；退火60℃30s；延伸72℃45s；35个循环；然后延伸72℃7min。
pcr产物在1.2％琼脂糖凝胶中电泳检测，扩增的目的片段大小为688bp，将扩增产物进行测序，测序结果用dnaman软件与genbank中猪的相关基因片段序列比对、分析，判读g.45318896g/a的基因型，然后使用sas9.1软件中的一般线性模型对肉色值与基因型值间的相关效应进行分析。将性别、基因型作为固定效应，日龄作为协变量包括在模型中。对于确定关联的基因型的平均特征值进行对比，使用sas中的tukey-kramer程序检测显著性差异。显著性的p值经过10000次的随机抽样校正。
表1给出了g.45318896g/a突变位点在苏淮猪群体中对肉色a值的影响效应。由表1可知，苏淮猪群体中，g.45318896aa基因型个体的宰后2h肉色a值比gg型高0.83，呈极显著水平(p＝0.0037)，但与ga型之间无显著性差异；ga型个体的宰后2h肉色a值比gg型个体要高0.49，且达到显著水平(p＝0.013)。由此可见，在苏淮猪中，继代选育g.45318896g/a位点的aa型个体，均可逐步提高苏淮猪的肉色的a值，达到提高苏淮猪肉质的目的。
表1.g.45318896g/asnp位点与苏淮猪肉色性状a值的关联分析
<110>南京农业大学
<120>一种与苏淮猪肉色性状相关的snp标记及其引物和应用
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<212>dna
<213>人工序列
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<223>含a>g核苷酸位点的分子标记
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<212>dna
<213>人工序列
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<223>上游引物
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<212>dna
<213>人工序列
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