用于筛选莲雾低温胁迫下内参基因的引物及其应用的制作方法

本发明属于生物技术领域，具体涉及用于筛选莲雾低温胁迫下内参基因的引物及其应用。

背景技术：

莲雾〔syzygium.samarangense(bi.)merr.etperry〕为桃金娘科（mytaceae）蒲桃属（syzygium）常绿乔木，是典型热带果树。莲雾果实营养丰富，具止泻、镇痛、抗菌、消炎（tina等2011）等功效，且色泽艳丽，清脆爽口，受消费者喜爱，在我国适宜种植区发展迅速，是重要的热带特色果类。在生产上，莲雾果实品质不稳和冬季低温寒害是阻碍莲雾产业发展的两大突出问题，亟需解决。长期以来，一般都是采用优化栽培措施、改善栽培条件来提高莲雾果实品质及耐寒性，但品种的优质、抗寒遗传特性才是起决定作用的因素。因此，研究莲雾果实品质及对寒冻害的抗逆机制，解析其果实品质形成的整个代谢网络及响应低温的基因表达调控网络，有针对性地发掘相关基因加以利用，对莲雾分子育种具有重要意义。

基因表达与转录组分析是阐明植物复杂的代谢途径及逆境胁迫生理响应的重要手段。实时荧光定量pcr具灵敏度高、重复性好、特异性强和高通量等特点，被广泛应用于基因的表达及转录组分析等研究中。rna质量、反转录效率、内参基因的选择等因素影响着qrt-pcr的准确性和可靠性。其中，选择稳定表达的内参基因是保证基因表达分析结果准确可靠的重要前提条件。理想的内参基因应在所有的细胞中或各种生理状态下均能稳定低表达，但大量研究表明传统的看家基因在不同组织类型或试验条件下稳定性不一，因此，根据不同试验材料及条件，筛选合适的内参基因或同时使用多个内参基因，才能保障目标基因表达定量的准确性及可靠性。目前尚未见关于莲雾内参基因筛选的报道，本发明选取7个常用的内参基因，利用qrt-pcr技术对其在不同试验条件下的表达稳定性进行评价，以期筛选出在低温胁迫下稳定表达的内参基因，为后续的基因表达工作奠定基础。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供用于筛选莲雾低温胁迫下内参基因的引物及其应用，本发明是通过以下技术方案解决上述技术问题的：利用qrt-pcr技术对7个莲雾内参基因在低温胁迫条件下表达稳定性进行检测，通过genorm、normfinder、bestkeeper和reffinder共4个软件进行基因稳定性评价，综合软件分析结果，筛选出在低温胁迫下稳定表达的内参基因。获得稳定表达内参基因一个：cyp20-1，其引物对如下所示：

正向引物5'-cctggcctctatgatcttatcc-3'

反向引物5'-caggcatcatgtgctttg-3'

所述的内参基因引物在莲雾低温胁迫下实时荧光定量pcr时进行应用。

本发明的优点在于：

本发明提供了一个莲雾内参基因，同时揭露了利用该内参基因unigene序列为基础设计的实时荧光定量pcr引物，不仅解决了现有莲雾定量pcr检测中没有内参基因的现状；而且所设计的实时荧光定量pcr引物用于莲雾低温胁迫下基因表达分析时，能够提高莲雾基因表达分析研究的稳定性、可靠性和重复性；此外，所设计的实时荧光定量pcr引物特异性强，从而能够大大的提高了采用实时荧光定量检测莲雾基因时的检测效率，并提高了检测结果的可信度。

附图说明

图1rna检测电泳图，m：dl2000dnamarker；1~5：紫红莲雾果肉t1~t5；6~10：紫红莲雾果皮t1~t5；11~14：紫红l1~l4；15~18：黑珍珠l1~l4；19~22：翡翠l1~l4。

图2以紫红莲雾t5时期果肉cdna为模板7个内参基因rt-pcr扩增结果，m：dl2000dnamarker；1：act-7；2：gapdh；3：ubq；4：α-tub；5：cyp20-1；6：ef-2；7：aprt-5。

图3莲雾7个内参基因qrt-prc熔解曲线。

图47个内参基因ct值的箱形图。

图5莲雾7个内参基因的成对比较分析。

具体实施方式

实施例1

1材料及处理

供试莲雾〔syzygium.samarangense(bi.)merr.etperry〕果实来自于福建省漳州市东山县莲雾种植场，品种分别为‘紫红’（tubtingjiang）、‘黑珍珠’（heizhenzhu）和‘翡翠’（feicui）。于2016年6~7月采盛花后10d、20d、30d、40d和50d的莲雾果实，不同采样时期记为t1~t5。每株树4个方向各采果实5个，共20个果，单株为1处理，3次重复。清洁果实后，用刮皮刀分离果皮和果肉，分别迅速投入液氮中速冻，后置于-80℃超低温冰箱保存备用。

所用‘紫红’、‘黑珍珠’和‘翡翠’莲雾幼苗来自厦门亚热带植物研究所。选择长势较一致的一年生莲雾扦插苗，置于gxa-0288光照培养箱（宁波江南仪器厂）内，湿度60%，无光照，试验设25℃、4℃、1℃和-2℃共4个温度处理，不同温度处理记为l1~l4。每个温度处理3h，单株为1重复，3次重复。之后取嫩叶经液氮速冻后置于-80℃超低温冰箱保存备用。

2方法

2.1总rna的提取和cdna第1链的合成

样品总rna提取均使用百泰克（bioteke）通用植物总rna提取试剂盒，具体操作依照产品说明书进行。1.5%的琼脂糖凝胶电泳检测总rna的完整性，使用nanodrop2000c分光光度计（thermo）测定总rna的浓度和纯度。cdna第1链的合成使用primescrip1ststrandcdnasynthesiskit试剂盒（takara），具体操作按照产品说明书进行。

2.2内参基因的选择和引物设计

本研究从前期构建的莲雾转录组数据库中取肌动蛋白基因（act-7）、3-磷酸甘油醛脱氢酶基因（gapdh）、多聚泛素酶基因（ubq）、微管蛋白基因（α-tub）、亲环蛋白基因（cyp20-1）、转录延伸因子基因（ef-2）和腺嘌呤磷酸核糖转化酶基因（aprt-5）7个表达量较为稳定的基因作为候选的内参基因（基因序列分别如seqidno.15-22所示）。另选取黄烷酮-3-羟化酶基因（f3h）进行验证研究。按照定量引物设计要求，利用primer3.0设计8对引物（表1），所有引物序列均由上海英骏公司合成。

表1内参基因和f3h基因的引物序列

2.3荧光定量pcr对目的基因的检测

使用7500reattimepcrsystem（appliedbiosystems），以提取的果皮、果肉和叶片样品cdna第1链为模板进行定量分析。pcr反应体系为：总体积为25μｌ，25ngcdna，0.4μmol•l^-1正/反向引物，0.15mmol•l^-1dntp、1utaqdna聚合酶、1.5mmol•l^-1mgcl2的10×pcr缓冲液各2.5μｌ，超纯水补足至25μｌ。pcr扩增程序为：94℃预变性3min；94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s，40个循环；最后72℃延伸7min，于4℃下保存。每个样品设3个重复，并设阴性对照。

2.4数据分析

荧光定量pcr分析后，根据仪器自动得出的样品的ct值计算2^-δct，用genorm和normfinder软件（sinara等2010）比较内参基因稳定值大小及适宜选定的内参基因的数量，直接使用样品的ct值通过bestkeeper软件（deng等2013）分析候选内参基因稳定性，并在最终采用reffinder（xie等2011）软件进行综合评定。

3实验结果

3.1rna和引物质量检测

各样品rna的od260/280及od260/230均在1.97~2.20；1.5%琼脂糖凝胶电泳检测显示28s和18s亚基条带清晰，其灰度比约为2.0，而5s亚基条带亮度低，无其他杂带，满足荧光定量pcr要求（图1）。

7对引物在紫红、黑珍珠和翡翠的5个果肉和果皮发育时期，4个低温胁迫处理中的熔解曲线均只有明显的单一峰，且电泳检测也只有单一条带（图2），说明所用引物可特异扩增各内参基因的相应产物，无引物二聚体，且每个待测样品pcr扩增曲线的重复性好，模板能特异性扩增，实时荧光定量pcr结果准确可信（图3）。

3.2内参基因ct值分析

对这7个内参基因的ct值分析发现，每个内参基因在莲雾不同组织及不同低温条件下的表达水平不同，各基因的ct值从18.88至31.59不等。用ct值高低反映内参基因的表达丰度，值越低表达丰度越高，反之表达丰度越低。总体而言，各基因在莲雾叶片中的表达丰度高于果实，如图4所示，各基因在莲雾叶片中的ct值在18.88~29.87之间，而在果肉和果皮中的ct值在25.44~31.53。此外，内参基因ef-2的表达丰度较其他基因高，α-tub的表达丰度低于其他基因。7个内参基因的ct值变化在0.96~4.52之间，其中α-tub的ct值在莲雾叶片中变化较大，在果肉和果皮中变化较小；cyp20-1与之相反。但7个内参基因在这3组处理样品中的表达变化均没有一定的规律。

3内参基因的表达稳定性评价

3.1genorm软件分析

genorm软件以平均变异度m值作为衡量内参基因稳定性的指标，m值越大，表明稳定度越低；反之，则越高。genorm软件默认的取舍值为m=1.5。由表2可知，7个内参基因在不同处理组中，最稳定的内参基因是有差异的。在果肉发育过程的中，表达最稳定的内参基因为act-7；在果皮中α-tub的稳定性表现最好；在低温胁迫下，cyp20-1是表达最稳定的内参基因。

表2genorm数据分析的稳定值（m）和排名

genorm软件可以通过候选内参基因的配对差异值vn/n+1来确定合适的内参基因数，其默认阈值为v＜1.5。如图5所示，在莲雾果肉不同发育时期v4/5=0.13，表明最适内参基因数为4个，即act-7、α-tub、gapdh和ubq；而莲雾果皮不同发育时期v2/3=0.135，表明α-tub和act-7为其最适内参基因；在低温胁迫条件下v2/3=0.141，表明其最适内参基因数也是2个，为cyp20-1和act-7。

3.2normfinder软件分析

normfinder软件通过计算候选内参基因的稳定值进行基因评价，稳定值与内参基因的稳定性成负相关。因此，如表3所示，act-7在莲雾果肉不同发育时期表达稳定，为最适的内参基因，而在果皮中则为α-tub；在低温胁迫下cyp20-1为最稳定的内参基因，其次是act-7。

表3normfinder数据分析的稳定值和排名

3.3对7个内参基因表达稳定性的综合评价

根据reffinder软件综合评定，莲雾果实发育过程中，果肉不同发育时期候选内参基因稳定性由高到低为act-7＞gapdh＞ubq＞α-tub＞cyp20-1＞aprt-5＞ef-2，结合genorm软件分析结果，可选择act-7、gapdh、ubq和α-tub等4个最适内参基因；果皮不同发育时期α-tub＞ubq＞act-7＞ef-2＞gapdh＞cyp20-1＞aprt-5，由于genorm推荐最适内参基因为2个，因此可使用α-tub和ubq为内参基因；低温胁迫下cyp20-1＞ubq＞act-7＞aprt-5＞ef-2＞gapdh＞α-tub，可选择2个最适内参为cyp20-1和ubq。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

sequencelisting

<110>福建省农业科学院果树研究所

<120>用于筛选莲雾低温胁迫下内参基因的引物及其应用

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