一株乳酸菌及其应用的制作方法

本发明涉及微生物
技术领域：
，特别是涉及一株乳酸菌及其应用。
背景技术：
：在水产养殖过程中，饲养水质调控的优劣程度直接决定着养殖的成败。随着水产养殖业向集约化方向不断发展，水产养殖业中潜在的问题也日益显现出来，其中最为突出的问题就是因为饲养池水水质恶化和各种传染性疾病的频繁发生。微生态制剂利用有益微生物菌群的各种生理生化作用，分解、合成或转化水中的有害物质，从而达到调节和净化水质的目的。因此，开发高效、无毒、安全的鱼饲料微生态制剂势在必行。技术实现要素：本发明的目的在于提供一株乳酸菌及其应用。本发明主要是为了提供一株净化水质、增强免疫机能的无毒无害的乳酸菌，为开发高效、无毒、安全的鱼饲料微生态制提供参考。实现本发明的技术方案如下：本发明所述的具有净化水质、增强免疫机能的乳酸菌，是从健康黄颡鱼消化道中分离制备获得。本发明所述乳酸菌命名为乳酸片球菌yd-01(pediococcusacidilacticiyd-01)。已保存在国家知识产权局指定的保藏单位保藏，保藏单位是中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2017年6月26日，保藏编号为cctccno：m2017382，保藏单位地赴中国武汉武汉大学。以下是对乳酸片球菌yd-01菌株的形态特征、生理生化特征以及16srrna基因序列的说明：(1)菌株的形态特征：菌体呈球状，如图2所示；革兰氏染色呈阳性，无芽孢，如图1所示。mrs平板培养基上菌落呈圆形，边缘整齐，凸起，呈乳白色，不透明，表面光滑；(2)菌株的生理生化特征：能使淀粉水解，能够利用葡萄糖、半乳糖、蔗糖、果糖、甘露糖、阿拉伯糖、d-木糖、l-鼠李糖、麦芽糖、甘油，但不能利用l-木糖、肌醇、乳糖、棉子糖、木糖醇、山梨醇和d-甘露醇；运动性实验、v-p实验、明胶液化实验和过氧化氢酶实验均呈阴性；(3)菌株的16srrna基因序列：乳酸片球菌yd-01与ncbi中genbank的乳酸片球菌sk2a32(id：ky433797.1)、乳酸片球菌lab2(id：jn039348.1)16srrna的同源性均达99％。本发明的有益效果：(1)本发明提供的乳酸片球菌yd-01具有净化水质的功能，其净化水质效果显著；(2)本发明提供的乳酸片球菌yd-01具有增强鱼体免疫能力的功能，其增强鱼体免疫能力效果显著。附图说明图1乳酸片球菌yd-01革兰氏染色图。图2乳酸片球菌yd-01显微结构图。具体实施方式下面结合实施实例对本发明作进一步的说明。实施例1菌株的筛选与鉴定(1)菌株的分离与纯化首先采用75.0％的酒精棉球对黄颡鱼体表进行消毒，在无菌条件下打开腹腔，用酒精棉球擦试肠管外壁，用无菌棉绳结扎胃、肛门及各肠道交界处，再用无菌剪刀分离各肠段，用无菌水冲洗数遍后，剪碎、匀浆。准确称取0.5g各肠段的匀浆物，加4.5ml无菌生理水，制备混悬液。梯度稀释，将10-2、10-3混悬液分别涂布于含1.5％caco3的mrs固体培养基中，37℃条件下厌氧培养48h，待菌落长出后，挑选出明显具有碳酸钙溶解圈的单个菌落于mrs固体培养基上进行3次划线纯化，把碳酸钙溶解圈最大的菌落挑选出来并保存其菌种。(2)菌株的鉴定通过形态、生理生化和分子鉴定相结合的方法对上述保存菌种的形态特征、生理生化特征以及16srrna基因序列的进行鉴定。菌株的形态特征：菌株菌体呈球状，如图2所示；革兰氏染色呈阳性，无芽孢，如图1所示。mrs平板培养基上菌落呈圆形，边缘整齐，凸起，呈乳白色，不透明，表面光滑。菌株的生理生化特征：能使淀粉水解，能够利用葡萄糖、半乳糖、蔗糖、果糖、甘露糖、阿拉伯糖、d-木糖、l-鼠李糖、麦芽糖、甘油，但不能利用l-木糖、肌醇、乳糖、棉子糖、木糖醇、山梨醇和d-甘露醇；运动性实验、v-p实验、明胶液化实验和过氧化氢酶实验均呈阴性。菌株的16srrna基因序列：该菌株与ncbi中genbank的乳酸片球菌sk2a32(id：ky433797.1)、乳酸片球菌lab2(id：jn039348.1)16srrna的同源性均达99％。结果显示该菌种为乳酸片球菌，命名为乳酸片球菌yd-01。实施例2乳酸片球菌yd-01鱼饲料的制备(1)乳酸片球菌yd-01的制备首先将乳酸片球菌yd-01以5％的接种量接种于mrs培养基中，28℃条件下培养24h，完成第一次活化。然后将乳酸片球菌yd-01再以5％的接种量接种于mrs液体培养基中，在200r/min、28℃条件下培养24h，培养物经5000r/min离心10min，去上清液得菌体，并用无菌生理水冲洗2～3次，获得可用来制备鱼饲料的乳酸片球菌yd-01。(2)乳酸片球菌yd-01鱼饲料的研制将购买的普通鱼饲料粉碎，加入适量的上述制备得到的乳酸片球菌yd-01，充分拌匀，使乳酸片球菌yd-01在饲料含量为5.0×1011cfu/kg，并用小型制粒机加工成直径为2.5mm的颗粒，置于40℃干燥箱中烘干，保存备用。实施例3乳酸片球菌yd-01对水质的影响在平均面积为25.0m2饲养池中饲养70尾体格健壮、平均体重80g的壮年期鲤鱼，池水采用普通湖泊水，分别泼洒乳酸片球菌yd-01，使池水中乳酸片球菌yd-01的含量分别达到0.3mg/l、0.4mg/l、0.5mg/l和0.6mg/l(水池中乳酸片球菌yd-01菌体质量与池水体积之比)，每种剂量2个饲养池，隔天泼洒1次，连续2次，未泼洒乳酸片球菌yd-01的饲养池为对照。测定水体中氨态氮、bod和cod指标，分析乳酸片球菌yd-01对水质的净化的效果。水体中乳酸片球菌yd-01含量为0.6mg/l的饲养池，如上所述处理7天后，实验组处理水体中和对照组水体中氨态氮、bod和cod数据如表1，水体中氨态氮、bod和cod去除率分别为40.2％，45.5％和35.6％。表1乳酸片球菌yd-01对水质的影响实施例4乳酸片球菌yd-01对鲤鱼免疫应答功能的影响首先选择体格健壮、平均体重80g的鲤鱼，共140尾，分别养于2个2m×2m×1m规格的水泥池中，每个水泥池中饲养70尾，池水采用普通湖泊水，驯养两周后；一个水泥池中投喂上述含有含量为5.0×1011cfu/kg的乳酸片球菌yd-01的鱼饲料，作为实验组；另一个水泥池中投喂等量不含乳酸片球菌yd-01的鱼饲料，作为对照组。两组鲤鱼在溶氧5-6mg/l，ph6.8左右条件下，每日喂食两次(8:30-9:00和16:00-16:30各一次)，每日鱼饲料量为鱼体重的3.0％-5.0％，投喂28d。采用心脏和断尾两种方式取鱼血液，断尾取血后，将尾鱼的血液分成2份，1份置室温1h，再置冰箱内4h，以2000r/min离心15min分离血清，供检测溶菌酶活性；另一份以肝素抗凝，供测定白细胞吞噬活性。心脏取血离心分离获得血液淋巴细胞液，测定的刺激指数作为表示淋巴细胞转化率的指标。测定鲤鱼白细胞吞噬活性、溶菌酶活性和刺激指数，数据如表2所示。表2乳酸片球菌yd-01对鲤鱼免疫应答功能的影响实验组对照组白细胞吞噬百分比(％)60.47％35.12％25.35％溶菌酶活性(u/ml)90.5447.8442.70刺激指数1.3710.547150.6％结果表明，投喂上述含有的乳酸片球菌yd-01的鱼饲料28d后，实验组相较于对照组鲤鱼的白细胞吞噬活性、溶菌酶活性分别提高25.35％、42.70u/ml，刺激指数提高150.6％，鲤鱼细胞免疫能力显著增强。序列表<110>盐城裕达饲料有限公司<120>一株乳酸菌及其应用<160>1<170>siposequencelisting1.0<210>2<211>1475<212>dna<213>乳酸片球菌yd-01(pediococcusacidilacticiyd-01)<400>2actcttgtccacttagacggtagctcctaaaggttaccccaccggctttgggtgttcaaa60ctctcatggtgtgacgggcggtgtgtacaaggcccgggaacgtattcaccgcggcatgct120gatccgcgattactagcgattccgacttcgtgtaggcgagttgcagcctacagtccgaac180tgagaatggttttaagagattagctaaacctcgcggtttcgcgactcgttgtaccatcca240ttgtagcacgtgtgtagcccaggtcataaggggcatgatgatttgacgtcgtccccacct300tcctccggtttgtcaccggcagtctcactagagtgcccaactgaatgctggcaactagta360ataagggttgcgctcgttgcgggacttaacccaacatctcacgacacgagctgacgacaa420ccatgcaccacctgtcattctgtccccgaagggaacgcctaatctcttaggttggcagaa480gatgtcaagacctggtaaggttcttcgcgtagcttcgaattaaaccacatgctccaccgc540ttgtgcgggcccccgtcaattcttttgagtttcaaccttgcggtcgtactccccaggcgg600attacttaatgcgttagctgcagcactgaagggcggaaaccctccaacacttagtaatca660tcgtttacggcatggactaccagggtatctaatcctgttcgctacccatgctttcgagcc720tcagcgtcagttacagaccagacagccgccttcgccactggtgttcttccatatatctac780gcatttcaccgctacacatggagttccactgtcctcttctgcactcaagtctcccagttt840ccaatgcacttcttcggttgagccgaaggctttcacattagacttaaaagaccgcctgcg900ctcgctttacgcccaataaatccggataacgcttgccacctacgtattaccgcggctgct960ggcacgtagttagccgtggctttctggttaaataccgtcactgggtgaacagttactctc1020acccacgttcttctttaacaacagagctttacgagccgaaacccttcttcactcacgcgg1080cgttgctccatcagacttgcgtccattgtggaagattccctactgctgcctcccgtagga1140gtctgggccgtgtctcagtcccaatgtggccgattaccctctcaggtcggctacgcatca1200tcgccttggtgagccgttacctcaccaactagctaatgcgccgcgggtccatccagaagt1260gatagcagagccatcttttaaaagaaaaccaggcggttttctctgttatacggtattagc1320atctgtttccaggtgttatcccctgcttctgggcaggttacccacgtgttactcacccgt1380ccgccactcacttcgtgttaaaatctcattcagtgcaagcacgtcctgatcaattaacgg1440aagttcgtcgactgcagttatagcaccgcgctcgc1475当前第1页12