miR‑339‑5p在抑制前列腺癌骨转移及TGF‑β信号通路中的应用的制作方法

本发明属于分子生物学领域，更具体地涉及mir-339-5p在抑制前列腺癌骨转移及tgf-β信号通路中的应用。

背景技术：

前列腺癌(prostatecancer、pca)是男性泌尿生殖系统最常见的恶性肿瘤之一。癌症转移会大大增加前列腺癌患者的死亡率，骨是癌症转移的第二最常见部位，在我国超过80％的前列腺癌患者在确诊时已经发生骨转移，而骨转移是导致前列腺癌患者死亡的重要原因，因此，对骨转移的早期诊断，是临床诊疗和预后的关键。此外，对于中晚期前列腺癌患者，手术治疗的效果差，大多数采用药物治疗。根据不同的病情可以采用化学药物治疗、外放射治疗、放射性核素内放射治疗以及各种疗法的综合应用等。然而，放化疗药物不仅作用于肿瘤，还可以作用于肿瘤周围健康的组织，因而在杀伤肿瘤的同时，也给机体带来了很大的副作用，最终影响对肿瘤的治疗效果。因此，本领域迫切需要开发早期判断前列腺癌骨转移的特异性标志物，并开发前列腺癌骨转移的靶向药物。

tgf-β信号通路在癌症中常表现出复杂甚至矛盾的作用，如癌症早期，tgf-β信号通路能抑制癌细胞生长，而在癌症后期，却能促进癌细胞的转移和侵袭，特别是骨转移，现有研究已经证实tgf-β信号通路的激活能促进前列腺癌细胞的骨转移。mirna是具有18～24个核苷酸的非编码rna，其结合信使rna的3’未翻译区域中的互补性位点且抑制它们的翻译。单一mirna能够靶向若干mrna且调控细胞通路和细胞命运。已有研究表明，一些mirna会促进肿瘤细胞转移，如脑癌中的mir-10b、结肠直肠癌中的mir-21、前列腺癌中的mir-184。也有发现抑制前列腺癌骨转移的一些mirna，如mir-143、mir-145和mir-203。目前尚没有mir-339-5p与前列腺癌骨转移及tgf-β信号通路之间的研究报道。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供mir-339-5p在制备前列腺癌骨转移诊断试剂、抑制骨转移药物、tgf-β/smad抑制剂、smad2抑制剂、smad3抑制剂及tgfbri抑制剂中的应用。

本发明所采取的技术方案是：

mir-339-5p在制备前列腺癌骨转移诊断试剂和/或抑制前列腺癌骨转移药物中的应用。

作为上述应用的优选，所述前列腺癌骨转移诊断试剂含有能定量检测mir-339-5p和/或其编码基因的试剂。

作为上述应用的优选，所述前列腺癌骨转移诊断试剂含有mir-339-5p的特异性引物、探针及芯片中的一种或多种。

作为上述应用的优选，所述抑制前列腺癌骨转移药物含有以下物质中的一种或多种：1)能促进mir-339-5p表达的物质；2)能增强mir-339-5p活性的物质；3)能增长mir-339-5p有效作用时间的物质；4)能增强mir-339-5p稳定性的物质；5)模拟mir-339-5p结构的物质。

作为上述应用的优选，所述抑制前列腺癌骨转移药物含有以下物质中的一种或多种：1)mir-339-5p分子；2)mir-339-5p修饰物；3)mir-339-5p模拟物；4)编码mir-339-5p的dna；5)表达mir-339-5p的载体或病毒。

作为上述应用的优选，所述mir-339-5p选自pri-mirna、pre-mirna、成熟mirna、dsmirna及其片段或变体中的一种或几种。

mir-339-5p在制备抑制剂中的应用，所述抑制剂选自tgf-β/smad抑制剂、smad2抑制剂、smad3抑制剂、tgfbri抑制剂中的一种或多种。

作为上述应用的优选，所述抑制剂含有以下物质中的一种或多种：1)能促进mir-339-5p表达的物质；2)能增强mir-339-5p活性的物质；3)能增长mir-339-5p有效作用时间的物质；4)能增强mir-339-5p稳定性的物质；5)模拟mir-339-5p结构的物质。

作为上述应用的优选，所述抑制剂含有以下物质中的一种或多种：1)mir-339-5p分子；2)mir-339-5p修饰物；3)mir-339-5p模拟物；4)编码mir-339-5p的dna；5)表达mir-339-5p的载体或病毒。

作为上述应用的优选，所述mir-339-5p选自pri-mirna、pre-mirna、成熟mirna、dsmirna及其片段或变体中的一种或几种。

本发明的有益效果是：

本发明研究发现mir-339-5p在前列腺癌骨转移中低表达，进一步研究发现，mir-339-5p通过靶向tgf-β信号通路中smad2、smad3和tgfbri，抑制tgf-β信号通路活性，从而抑制骨转移前例腺癌细胞的迁移和侵袭，因此，mir-339-5p有望应用于制备前列腺癌骨转移诊断试剂、抑制骨转移药物、tgf-β/smad抑制剂、smad2抑制剂、smad3抑制剂及tgfbri抑制剂。

附图说明

图1：tcga数据库中前列腺癌及癌旁组织/良性组织中mir-339-5p表达量，图a为tcga中前列腺癌与良性组织中mir-339-5p表达量；图b为tcga中前列腺癌与配对的癌旁组织中mir-339-5p表达量；

图2：临床样品及细胞系中mir-339-5p的表达情况；其中，图a为前列腺癌骨转移组织和无骨转移组织中mir-339-5p的表达情况；图b为mir-339-5p表达量与骨转移状态的病例统计图，图c为良性前列腺细胞及前列腺癌细胞中mir-339-5p的表达情况；图中，mir-339-5p-h为mir-339-5p高表达组，mir-339-5p-l为mir-339-5p低表达组；

图3：不同前列腺癌细胞中上调或下调mir-339-5p后mir-339-5p的表达量；

图4：不同前列腺癌细胞中上调或下调mir-339-5p后tgf-β/smad荧光酶素表达强度；

图5：不同前列腺癌细胞中上调或下调mir-339-5p后smad2、smad3和tgfbri的mrna表达量；

图6：不同前列腺癌细胞中上调或下调mir-339-5p后smad2、smad3和tgfbri的蛋白表达量；

图7：不同前列腺癌细胞中mir-339-5p靶向smad2、smad3和tgfbri验证结果，图a为vcap细胞情况，图b为pc-3细胞情况，图c为c4-2b细胞情况；

图8：不同前列腺癌细胞中上调或下调mir-339-5p对前列腺癌细胞迁移和侵袭能力的影响；

图9：前列腺癌vcap细胞中，anti-mir-339-5p与sd208共同处理对细胞迁移和侵袭能力的影响。

具体实施方式

现结合具体实验例进一步阐述本发明，但并不局限于此。下述实验例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法，具体条件未注明的，按常规操作或厂家所建议的条件，下述实验例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

本发明的人前列腺癌细胞系22rv1、pc-3、vcap、du145、lncap和正常的人前列腺上皮细胞rwpe-1由atcc细胞库提供；人前列腺癌细胞c4-2b购自md安德森癌症中心；以上细胞系培养方法按本领域常规操作；115例前列腺癌组织(包括73例无骨转移和42例骨转移)由广州市第一人民医院提供，以上临床标本均来自手术过程或穿刺活检，经临床病理学确诊。

实验例1、mir-339-5p在前列腺癌组织中高表达，而在骨转移前列腺癌组织中则低表达

发明人利用tcga数据库中的资料进行生物信息学分析，发现mir-339-5p在前列腺癌组织中高表达，如图1所示，与52例癌旁组织相比，498例前列腺癌组织中mir-339-5p表达量显著提高(图1a)，一致地，与配对的癌旁组织相比，52例配对的前列腺癌组织中mir-339-5p高表达(图1b)。然而出人意料是，发明人研究发现，mir-339-5p在骨转移前列腺癌组织中却低表达，研究方法如下：

rna提取、逆转录和实时定量rt-pcr检测mir-339-5p：采用trizol裂解液(lifetechnologies公司)说明书提取所有组织和细胞的总rna，按照revertaidfirststrandcdnasynthesiskit(thermofisher公司)说明书进行逆转录，选用2-ddct相对定量法进行荧光定量检测，以u6为内参，求算mir-339-5p的相对表达量。

结果：

临床标本和细胞系中mir-339-5p表达量结果如图2所示，图2a表明，相对于与非骨转移前列腺癌组织，骨转移前列腺癌组织中mir-339-5p表达量更低，按前列腺癌组织中mir-339-5p表达量的中位值将患者划分为mir-339-5p低表达组和mir-339-5p高表达组，统计mir-339-5p表达量与前列腺癌患者骨转移状态关系如图2b所示，mir-339-5p低表达与前列腺癌骨转移相关，进一步的，参照图2c，对比正常的人前列腺上皮细胞系rwpe-1，前列腺癌细胞系22rv1和淋巴结转移前列腺细胞系lncap中mir-339-5p高表达，而在脑转移前列腺癌细胞系du145和骨转移前列腺癌细胞系pc-3、c4-2b、vcap中mir-339-5p则低表达，以上结果一致表明，mir-339-5p在骨转移前列腺癌组织/细胞中低表达，因此，mir-339-5p可作为前列腺癌骨转移的生物标志物，可应用于制备前列腺癌骨转移的诊断试剂。

实验例2、mir-339-5p抑制前列腺癌骨转移的分子机制

实验方法：

(1)rna提取、逆转录及实时定量pcr

采用trizol裂解液(lifetechnologies公司)说明书提取所有组织和细胞的总rna，mrna和mirna按照revertaidfirststrandcdnasynthesiskit(thermofisher公司)说明书进行逆转录，选用2-ddct相对定量法进行荧光定量检测，mirna和mrna分别以u6和gapdh为内参，求算相对表达量。

(2)质粒构建、sirna以人基因组为模板，扩增人mir-339-5p(mirbase编号mimat0000764)基因，并克隆到pmscv-puro逆转录病毒载体(clontech公司)中，获得mir-339-5p表达质粒，用于上调细胞中mir-339-5p的表达量；将人mir-339-5p的反义核苷酸克隆到载体上，获得anti-mir-339-5p表达质粒(promega公司设计和合成)，用于下调mir-339-5p的表达量。用于定量检测tgf-β信号通路组分转录活性的tgf-β/smad荧光酶素报告质粒购自clontech公司；以人基因组为模板，扩增smad2-3`utr、smad2-3`utr和tgfbri-3`utr序列，分别克隆到pmirglo荧光酶素报告质粒(promega公司)上，构建成pmirglo-smad2-3′utr、pmirglo–smad3-3′utr和pmirglo–tgfbr1-3′utr这3个荧光酶素报告质粒，针对构建好的以上3个质粒，分别将mir-339-5p的结合位点进行突变处理，得到对应的3个突变质粒pmirglo-smad2-3`utr-mut、pmirglo-smad2-3`utr-mut和pmirglo-tgfbri-3`utr-mut，用于荧光酶素靶向验证试验。

(3)采用transwell小室法进行迁移和侵袭实验，实验方法按本领域常规操作。

(4)荧光酶素检测

将目标前列腺癌细胞(4×10⁴)接种到24孔板中培养24h，将pmirglo-smad2-3′utr、pmirglo–smad3-3′utr和pmirglo–tgfbr1-3′utr荧光酶素报告质粒或突变质粒pmirglo-smad2-3`utr-mut、pmirglo-smad2-3`utr-mut和pmirglo-tgfbri-3`utr-mut与mir-339-5p表达质粒或anti-mir-339-5p表达质粒共转染到目标前列腺癌细胞中，进行荧光酶素靶向验证试验，将mir-339-5p表达质粒或anti-mir-339-5p表达质粒和tgf-β/smad荧光酶素报告质粒共转染到目标前列腺癌细胞中，用于检测tgf-β/smad转录活性，转染36h后，检测各组细胞的荧光强度，统计荧光强度值，计算出相对荧光强度值。

(5)westernblotting检测

抗smad2、smad3、tgfbri的抗体购自cst公司，抗α-tubulin抗体为内参，检测方法按本领域常规操作。

实验结果：

(1)mir-339-5p抑制tgf-β信号通路活性

根据实验例1的研究结果，在骨转移前列腺癌细胞pc-3、c4-2b、vcap中作进一步研究，通过上调低表达mir-339-5p的pc-3和c4-2b细胞，上调或下调中表达mir-339-5p的vcap细胞来研究mir-339-5p对tgf-β信号通路的作用，各组细胞mir-339-5p的表达量如图3所示，tgf-β/smad荧光酶素报告检测结果如图4所示，在pc-3、c4-2b、vcap细胞中，上调mir-339-5p抑制tgf-β/smad转录活性，而下调mir-339-5p促进tgf-β/smad转录活性。

(2)mir-339-5p靶向tgf-β信号通路中smad2、smad3和tgfbri

将mir-339-5p表达质粒或anti-mir-339-5p表达质粒分别转染到骨转移前列腺癌细胞pc-3、c4-2b、vcap中，实时定量pcr和westernblotting分析结果如图5和图6显示，上调mir-339-5p减少了smad2、smad3和tgfbri的mrna和蛋白表达量；荧光酶素靶向验证显示(如图7)，上调mir-339-5p降低了smad2、smad3和tgfbri的活性，对突变的smad2、smad3和tgfbri的3’-utr没有影响，证实了mir-339-5p靶向tgf-β信号通路中smad2、smad3和tgfbri。

(3)mir-339-5p过表达能在抑制前列腺癌迁移和侵袭

将mir-339-5p表达质粒或anti-mir-339-5p表达质粒分别转染到骨转移前列腺癌细胞pc-3、c4-2b、vcap中，迁移和侵袭情况如图8所示，可见mir-339-5p过表达能在抑制前列腺癌迁移和侵袭。

(4)mir-339-5p通过抑制tgf-β信号通路抑制前例腺癌迁移和侵袭

sd208是剂量依赖的tgf-β信号通路抑制剂，通过转染sd208和anti-mir-339-5p表达质粒，验证mir-339-5p是否通过抑制tgf-β信号通路抑制前例腺癌迁移和侵袭，结果如图9所示，sd208也能抑制anti-mir-339-5p促进的前例腺癌迁移和侵袭，因此，可以说明mir-339-5p通过抑制tgf-β信号通路抑制前例腺癌迁移和侵袭。

以上结果表明，mir-339-5p可应用于前列腺癌骨转移的诊断和治疗，通过定量检测mir-339-5p或其编码基因，可以实现前列腺癌骨转移的诊断，此外，上调mir-339-5p能抑制tgf-β信号通路的活化，并且靶向抑制smad2、smad3和tgfbri的表达，从而抑制前列腺癌骨转移，可应用于制备tgf-β/smad抑制剂、smad2抑制剂、smad3抑制剂及tgfbri抑制剂，更进一步的，可应用于制备抑制前列腺癌骨转移的药物。

以上所述仅是用于解释本发明，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。