流感病毒核酸分子及由其制备的疫苗的制作方法

文档序号：13818065阅读：531来源：国知局

发明领域

本发明涉及改进的流感病毒疫苗、用于诱导抗流感的免疫反应的改进的方法、用于诊断已接种了和感染了流感病毒的哺乳动物宿主及用于预防性和/或治疗性免疫个体以对抗流感病毒的改进的方法。

发明背景

流感，通常称为流行性感冒，是由正粘病毒科(familyorthomyxoviridae)的rna病毒引起的传染病。流感或流行性感冒病毒感染鸟类和哺乳动物。正粘病毒科的5个属中的3个属是流感病毒：甲型流感病毒、乙型流感病毒和丙型流感病毒。在这些流感病毒中，甲型流感病毒最常见。

流感病毒通常以咳嗽或打喷嚏产生的气雾形式通过空气传播或通过与含有病毒的体液或已污染的表面直接接触传播。流感的季节性流行在世界范围发生并且导致每年数十万人的死亡。在一些年份，大范围流行病发生并且导致数百人死亡。此外，家畜，特别是禽类和猪也对每年一次的流行病和引起大量动物死亡和金钱损失的偶然的大范围流行病易感。

在结构上，流感病毒是相似的，通常具有约80-120nm的由相似分子组分组成的球状或丝状病毒颗粒。包含病毒蛋白质和病毒rna的中心核心被由两种不同糖蛋白构成的病毒包膜和来源于其中产生病毒颗粒的细胞的脂质包衣(lipidcoat)覆盖。两种额外的不同糖蛋白锚定在病毒包膜内并且包括在表面上向外突出的部分。

流感病毒rna基因组通常提供为8个不同的单链负义rna区段，它们一起组成基因组的编码11种蛋白质(ha、na、np、m1、m2、ns1、nep、pa、pb1、pb1-f2、pb2)的11个病毒基因。8个rna区段为：1)ha，其编码血凝素(产生一个病毒体需要约500个血凝素分子)；2)na，其编码神经氨酸酶(产生一个病毒体需要约100个神经氨酸酶分子)；3)np，其编码核蛋白；4)m，其通过使用来自相同rna区段的不同读框编码2种基质蛋白(m1和m2)(产生一个病毒体需要约3000个基质蛋白分子)；5)ns，其通过使用来自相同rna区段的不同读框编码两种不同的非结构蛋白(ns1和nep)；6)pa，其编码rna聚合酶；7)pb1，其通过使用来自相同rna区段的不同读框编码rna聚合酶和pb1-f2蛋白(诱导细胞凋亡)；和8)pb2，其编码rna聚合酶。

在这11种蛋白质中，血凝素(ha)和神经氨酸酶(na)是锚定在病毒包膜中并且存在于病毒颗粒的外表面上的两种大糖蛋白。此类蛋白质用作针对流感病毒的免疫反应的免疫原。ha(其编码介导病毒与靶细胞的结合和病毒基因组进入靶细胞的凝集素)表达为单个基因产物ha0，随后被宿主蛋白酶加工，从而产生两个亚基ha1和ha2，它们一起在流感病毒颗粒的表面上形成复合物。na参与在感染的细胞中产生的新产生的成熟病毒颗粒的释放。

存在16个已知的ha血清型和9个已知的针对甲型流感病毒的na血清型。存在病毒颗粒中的不同血清型的鉴定通常用于描述病毒。例如，h1n1是具有ha血清型h1和na血清型n1的流感病毒；h5n1是具有ha血清型h5和na血清型n1的流感病毒。只有h1、h2和h3血清型以及n1和n2血清型通常感染人。

流感病毒株通常具有种或属特异性；即可感染猪(猪流感病毒)的流感病毒株通常不感染人或鸟类；可感染鸟类(禽流感病毒)的流感病毒株不感人或猪；以及可感染人(人流感病毒)的流感病毒株不感染鸟类或猪。然而，流感病毒株可突变并且使对于一个物种的感染性变成对于另一个物种的感染性。例如，仅感染猪的病毒株(猪流感病毒)可突变或重组变成可以仅感染人或感染猪和人的病毒株。通常称为“猪流感病毒”的流感病毒为流感病毒株，例如h1n1株，其可感染人并且来源于先前对于猪是特异性的病毒株(即猪流感病毒是猪来源的人流感病毒或猪源性人流感病毒)。通常称为“鸟流感病毒”的流感病毒是流感病毒株，例如h5n1株，其可感染人并且来源于先前对于鸟类是特异性的病毒株(即禽流感病毒是禽类来源人流感病毒或禽类源性人流感病毒)。

季节性地给发达国家的许多人以及有时给家畜接种针对流感的疫苗。使用的疫苗在其保护结果上是有限的，因为由疫苗诱导的免疫反应对于病毒的某些亚型是特异性的。每年基于哪种类型和病毒株的病毒将在给定的年份传播的国际监测和科学家的估计来开发和施用不同的流感疫苗。病毒通过区段的突变、重组和再分布产生显著的改变。因此，一年中提供的疫苗被认为不具有抗下一年广泛传播的季节性病毒株的保护作用。

通常由美国疾病控制和预防中心推广的“流感疫苗注射(flushot)”通常包括三种杀死的/灭活的流感病毒：一种甲型(h3n2)病毒、一种甲型(h1n1)病毒和一种乙型病毒。因此，很明显接种受限于亚型的预测以及针对该该亚型的特异性疫苗的可获得性(availability)。

直接施用核酸序列以接种抗动物和人疾病的疫苗一直已来都在进行研究并且许多努力集中在核酸递送的有效和高效方式以产生期望抗原的必要表达，从而导致免疫源应答和最终获得该技术的成功。

dna疫苗具有许多优于更常规的接种方法例如基于活减毒病毒和重组蛋白的疫苗的概念性优势。dna疫苗是安全、稳定、容易产生的并且在人中能被良好耐受，临床前试验显示几乎无质粒整合的证据[martin，t.，等人，质粒dna疟疾疫苗：肌内注射后用于基因组整合的潜能(plasmiddnamalariavaccine：thepotentialforgenomicintegrationafterintramuscularinjection).humgenether，1999.10(5)：p.759-68；nichols，w.w.，等人，整合入宿主细胞基因组的潜在dna疫苗(potentialdnavaccineintegrationintohostcellgenome).annnyacadsci，1995.772：p.30-9]。此外，dna疫苗因疫苗的功效不受针对载体的预先存在的抗体滴度影响的事实而十分适合用于重复施用[chattergoon，m.，j.boyer和d.b.weiner，基因免疫：疫苗和免疫治疗的新领域(geneticimmunization：anewerainvaccinesandimmunetherapeutics).fasebj，1997.11(10)：p.753-63]。然而，dna疫苗的临床采用的一个主要障碍一直以来是当移至更大的动物时平台的免疫原性的减弱[liu，m.a.和j.b.ulmer，质粒dna疫苗的人临床性状(humanclinicaltrialsofplasmiddnavaccines).advgenet，2005.55：p.25-40]。dna疫苗免疫原的工程的最近技术进展，例如密码子最优化、rna最优化和免疫球蛋白前导序列的添加[andre，s.，等人，利用具有最优化密码子选择的合成gp120序列的dna接种引发的增强的免疫反应(increasedimmuneresponseelicitedbydnavaccinationwithasyntheticgp120sequencewithoptimizedcodonusage).jvirol，1998.72(2)：p.1497-503；deml，l.，等人，密码子选择最优化对编码1型人免疫缺陷病毒gag蛋白的dna候选疫苗的表达和免疫原性的多个影响(multipleeffectsofcodonusageoptimizationonexpressionandimmunogenicityofdnacandidatevaccinesencodingthehumanimmunodeficiencyvirustype1gagprotein).jvirol，2001.75(22)：p.10991-1001；laddy，d.j.，等人，抗禽流感的基于共有序列的新型dna疫苗的免疫原性(immunogenicityofnovelconsensus-baseddnavaccinesagainstavianinfluenza).vaccine，2007.25(16)：p.2984-9；frelin，l.，等人，密码子最优化和mrna扩增有效地增强丙型肝炎病毒非结构3/4基因的免疫原性(codonoptimizationandmrnaamplificationeffectivelyenhancestheimmunogenicityofthehepatitiscvirusnonstructural3/4agene).genether，2004.11(6)：p.522-33]以及质粒递送技术的最近开发的技术例如电穿孔[hirao，l.a.，等人，利用电穿孔的真皮内/皮下免疫增进了质粒疫苗在猪和恒河猕猴中的递送和潜能(intradermal/subcutaneousimmunizationbyelectroporationimprovesplasmidvaccinedeliveryandpotencyinpigsandrhesusmacaques).vaccine，2008.26(3)：p.440-8；luckay，a.，等人，质粒dna疫苗的设计和体内电穿孔对恒河猕猴的所产生的疫苗特异性免疫反应的效应(effectofplasmiddnavaccinedesignandinvivoelectroporationontheresultingvaccine-specificimmuneresponsesinrhesusmacaques).jvirol，2007.81(10)：p.5257-69；ahlen，g.，等人，体内电穿孔通过增加的局部dna摄取、蛋白质表达、炎症和cd3+t细胞的浸润增强丙型肝炎病毒非结构3/4adna的免疫原性(invivoelectroporationenhancestheimmunogenicityofhepatitiscvirusnonstructural3/4adnabyincreasedlocaldnauptake，proteinexpression，inflammation，andinfiltrationofcd3+tcells).jimmunol，2007.179(7)：p.4741-53]已提高了dna疫苗的表达和免疫原性。此外，研究已表明共有免疫原的使用与单独的天然抗原相比较能够增加细胞免疫反应的广度[yan，j.，等人，由基于共有序列的工程hiv-1b亚型包膜dna疫苗引发的增强的细胞免疫反应(enhancedcellularimmuneresponseselicitedbyanengineeredhiv-1subtypebconsensus-basedenvelopednavaccine).molther，2007.15(2)：p.411-21；rolland，m.，等人，1型祖先树中心人免疫缺陷病毒蛋白的重建和功能(reconstructionandfunctionofancestralcenter-of-treehumanimmunodeficiencyvirustype1proteins).jvirol，2007.81(16)：p.8507-14]。

用于递送核酸序列例如质粒dna的一个方法是电穿孔(ep)技术。所述技术已在人临床试验中被用于递送抗癌药物例如博来霉素以及用于关于许多动物物种的临床前研究。

仍然存在对免疫原性流感病毒共有血凝素蛋白，对编码这样的蛋白质的核酸构建体和对用于诱导抗多株流感病毒的免疫反应的组合物的需要。仍然存在对用于治疗个体的跨许多流感病毒亚型的经济有效的抗流感病毒的有效疫苗的需要。

发明概述

本文中提供的是包含核酸序列的分离的核酸分子，所述核酸序列选自：seqidno：1；与seqidno：1具有95％同源性的核酸序列；seqidno：1的片段；与seqidno：1的片段具有95％同源性的核酸序列；seqidno：3；与seqidno：3具有95％同源性的核酸序列；seqidno：3的片段；与seqidno：3的片段具有95％同源性的核酸序列；seqidno：6；与seqidno：6具有95％同源性的核酸序列；seqidno：6的片段；与seqidno：6的片段具有95％同源性的核酸序列；seqidno：9；与seqidno：9具有95％同源性的核酸序列；seqidno：9的片段；与seqidno：9的片段具有95％同源性的核酸序列；seqidno：11；与seqidno：11具有95％同源性的核酸序列；seqidno：11的片段；与seqidno：11的片段具有95％同源性的核酸序列；seqidno：13；与seqidno：13具有95％同源性的核酸序列；seqidno：13的片段；与seqidno：13的片段具有95％同源性的核酸序列；和seqidno：15；与seqidno：15具有95％同源性的核酸序列；seqidno：15的片段；与seqidno：15的片段具有95％同源性的核酸序列。

还提供了组合物，其包含：a)选自：seqidno：1；与seqidno：1具有95％同源性的核酸序列；seqidno：1的片段；与seqidno：1的片段具有95％同源性的核酸序列；seqidno：3；与seqidno：3具有95％同源性的核酸序列；seqidno：3的片段；与seqidno：3的片段具有95％同源性的核酸序列；seqidno：6；与seqidno：6具有95％同源性的核酸序列；seqidno：6的片段；与seqidno：6的片段具有95％同源性的核酸序列；seqidno：9；与seqidno：9具有95％同源性的核酸序列；seqidno：9的片段；与seqidno：9的片段具有95％同源性的核酸序列；seqidno：11；与seqidno：11具有95％同源性的核酸序列；seqidno：11的片段；与seqidno：11的片段具有95％同源性的核酸序列；seqidno：13；与seqidno：13具有95％同源性的核酸序列；seqidno：13的片段；与seqidno：13的片段具有95％同源性的核酸序列；seqidno：15；与seqidno：15具有95％同源性的核酸序列；seqidno：15的片段；与seqidno：15的片段具有95％同源性的核酸序列中的一种或多种的第一核酸序列；和b)编码蛋白质的第二核酸序列，所述蛋白质选自：甲型流感病毒h1、h2、h3、h4、h5、h6、h7、h8、h9、h10、h11、h12、h13、h14、h15、h16、n1、n2、n3、n4、n5、n6、n7、n8、n9、乙型流感病毒血凝素、神经氨酸酶及其片段中的一种或多种。

本发明的一些方面提供了诱导免疫反应的方法，其包括步骤：给个体施用此类核酸分子和/或组合物。

本发明的其它方面提供了保护个体免受感染的方法。所述方法包括步骤：给所述个体施用预防有效量的包含此类核酸序列或组合物的核酸分子；其中所述核酸序列在所述个体的细胞中表达并且针对由所述核酸序列编码的蛋白质的保护性免疫反应被诱导。在一些实施方案中，免疫反应是抗猪来源的人流感病毒的保护性免疫反应。

在本发明的一些方面，提供了用于治疗已被流感病毒感染的个体的方法。所述方法包括给所述个体施用治疗有效量的此类核酸分子和/或组合物的步骤。在一些实施方案中，免疫反应是抗猪来源的人流感病毒的免疫反应。

附图简述

图1是2999碱基对主链载体质粒pvax1(茵维特罗根(invitrogen)，卡尔斯巴德(carlsbad)加利福尼亚州(ca))的图谱。cmv启动子位于碱基137-724。t7启动子/引发位点位于碱基664-683。多克隆位点位于碱基696-811。牛gh多腺苷酸化信号位于碱基829-1053。卡那霉素抗性基因位于碱基1226-2020。puc来源位于碱基2320-2993。

基于可从茵维特罗根公司获得的pvax1的序列，在用作pgx2009的主链的pvax1的序列中发现下列突变：

c＞g241在cmv启动子中

c＞t1942主链，牛生长激素多腺苷酸化信号(bghpolya)的下游

a＞-2876主链，卡那霉素基因的下游

c＞t3277在puc复制起始区(ori)中，高拷贝数突变(参见nucleicacidresearch1985)

g＞c3753正好在pucori的末端，rnaseh位点的上游

碱基对2、3和4在主链中cmv启动子的上游被从act改变成ctg。

图2显示质粒pgx2009的两个图谱，所述质粒也称为ph1ha09。质粒pgx2009的核酸序列(seqidno：5)包括共有h1蛋白构建体的编码序列(由seqidno：3编码的氨基酸seqidno：4)，所述共有h1蛋白包括连接于共有h1氨基酸序列(由seqidno：1编码的氨基酸seqidno：2)的n末端的ige前导(氨基酸seqidno：17)，所述共有h1氨基酸序列在其c末端上连接于ha标签(seqidno：18)。共有h1蛋白(由seqidno：3编码的氨基酸seqidno：4)为标记的swihumconha和h1ha09。

图3显示质粒pgx2006的图谱。质粒pgx2006的核酸序列(seqidno：8)包括共有h2蛋白(由seqidno：6编码的氨基酸seqidno：7)的编码序列，所述共有h2蛋白为标记的h2ha。

图4显示来自利用经免疫的雪貂的血清进行的血凝抑制测定的数据。

图5显示利用新型h1n1株攻击经免疫的和未经免疫的雪貂的结果。

详述

提供了甲型h1和h2流感病毒的各自的共有氨基酸序列(在本文中分别称为“共有h1”(seqidno：2)和“共有h2”(seqidno：7))，以及新型合成杂交体共有甲型h1流感病毒血凝素氨基酸序列(在本文中称为“共有u2”(seqidno：10))和乙型流感病毒血凝素的共有氨基酸序列(在本文中称为“共有bha”(seqidno：13))，其可为哺乳动物提供抗流感病毒的保护作用。此外，提供了包含共有h1氨基酸序列、共有h2氨基酸序列、共有u2氨基酸序列和/或共有bha氨基酸序列的蛋白质。在一些方面，提供了核酸序列，所述核酸序列编码包含共有h1氨基酸序列(例如(seqidno：1)或(seqidno：3))、共有h2氨基酸序列(例如(seqidno：6))、共有u2氨基酸序列(例如(seqidno：9)或(seqidno：11))和/或共有bha氨基酸序列(例如(seqidno：13)或(seqidno：15))的蛋白质。

然而不受科学理论束缚，可用于引发广泛地抗多种流感病毒亚型的免疫反应(体液、细胞或两者)的疫苗可包括如下的一种或多种：1)编码包含共有h1氨基酸序列的蛋白质的核酸序列；2)包含共有h1氨基酸序列的蛋白质；3)编码包含共有h2氨基酸序列的蛋白质的核酸序列；4)包含共有h2氨基酸序列的蛋白质；5)编码包含共有u2氨基酸序列的蛋白质的核酸序列；6)包含共有u2氨基酸序列的蛋白质；7)编码包含共有bha氨基酸序列的蛋白质的核酸序列；和8)包含共有bha氨基酸序列的蛋白质。

可进行免疫方法以及可制备使用和/或组合下列组分的两种或更多种的疫苗：1)编码包含共有h1氨基酸序列的蛋白质的核酸序列；2)包含共有h1氨基酸序列的蛋白质；3)编码包含共有h2氨基酸序列的蛋白质的核酸序列，4)包含共有h2氨基酸序列的蛋白质；5)编码包含共有u2氨基酸序列的蛋白质的核酸序列，6)包含共有u2氨基酸序列的蛋白质，7)编码包含共有bha氨基酸序列的蛋白质的核酸序列，和8)包含共有bha氨基酸序列的蛋白质。对于基于更广泛的抗流感病毒的治疗，可进行免疫方法，并且可制备疫苗，所述疫苗使用和/或组合一种或多种其它流感病毒蛋白质例如甲型h1-h16流感病毒、甲型n1-n9流感病毒、乙型流感病毒血凝素、乙型流感病毒神经氨酸酶和/或编码此类蛋白质的基因以及如下组分的一种或多种：1)编码包含共有h1氨基酸序列的蛋白质的核酸序列；2)包含共有h1氨基酸序列的蛋白质；3)编码包含共有h2氨基酸序列的蛋白质的核酸序列，4)包含共有h2氨基酸序列的蛋白质；5)编码包含共有u2氨基酸序列的蛋白质的核酸序列，6)包含共有u2氨基酸序列的蛋白质，7)编码包含共有bha氨基酸序列的蛋白质的核酸序列，和8)包含共有bha氨基酸序列的蛋白质。

1.定义.

本文中使用的术语仅为了描述特定的实施方案并且不旨在限制。如本说明书中和所附权利要求中所用，除非上下文中另外明确指定，否则单数形式“一种/一个(a)”、“一种/一个(an)”和“该(the)”包括复数指示物。

对于本文的数字范围的引述，明确地包括具有相同精度的介于其间的每个介入数字。例如，对于6-9的范围，除了6和9外还包括数字7和8，对于范围6.0-7.0，明确地包括数字6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9和7.0。

a.佐剂

如本文中所用，“佐剂”意指添加至本文中描述的dna质粒疫苗以增强由所述dna质粒和下文中描述的编码核酸序列编码的抗原的免疫原性。

b.抗体

如本文中所用，″抗体″意指种类igg、igm、iga、igd或ige的抗体及其片段或衍生物，包括fab、f(ab′)2、fd和单链抗体、双链抗体(diabody)、双特异性抗体、双功能抗体及其衍生物。抗体可以是从哺乳动物的血清样品分离的抗体、多克隆抗体、亲和纯化的抗体或显示对于期望的表位或从其衍生的序列的充分结合特异性的其混合物。

c.编码序列

如本文中所用，“编码序列”或“编码核酸”意指包含编码蛋白质的核苷酸序列的核酸(rna或dna分子)。编码序列还可包括有效地连接于调控元件(包括能够在已对其施用了所述核酸的个体或哺乳动物的细胞中指导表达的启动子和多腺苷酸化信号)的起始和终止信号。

d.互补

如本文中所用，“互补”或“互补的”意指可进行核酸分子的核苷酸或核苷酸类似物之间的沃尔森-克里克(例如，a-t/u和c-g)或hoogsteen碱基配对的核酸。

e.共有区或共有序列

如本文中所用，“共有区”或“共有序列”意指基于多个亚型的特定流感病毒抗原的比对的分析的多肽序列。可制备编码共有多肽序列的核酸序列。包含含有共有序列的蛋白质和/或编码此类蛋白质的疫苗可用于诱导抗多个亚型或血清型的特定流感病毒抗原的广泛免疫。共有流感病毒抗原可包括甲型流感病毒共有血凝素氨基酸序列(包括例如共有h1、共有h2)或乙型流感病毒共有血凝素氨基酸序列。

f.恒定电流

如本文中所用，“恒定电流”意指由组织或定义所述组织的细胞在递送至相同组织的电脉冲的持续过程中接收或经历的电流。从本文中描述的电穿孔设备递送电脉冲。该电流在电流冲的寿命过程中在所述组织中保持恒定的安培数，因为本文中提供的电穿孔设备具有反馈元件(优选具有瞬时值反馈(instantaneousfeedback))。所述反馈元件可测量整个脉冲持续过程中组织(或细胞)的电阻并且引起电穿孔设备改变其电能输出(例如，升高电压)，以便相同组织中的电流在整个电泳冲(在微秒级上)中以及电脉冲之间保持恒定。在一些实施方案中，反馈元件包括控制器。

g.电流反馈或反馈

“电流反馈”或“反馈”可互换使用并且意指提供的电穿孔设备的主动反应，其包括测量电极之间的组织中的电流和相应地改变由ep设备递送的能量输出以使电流维持在恒定水平。该恒定水平是在起始脉冲序列或电处理之前由用户预先设定的。反馈可通过电穿孔组件例如电穿孔设备的控制器来实现，因为本文中的电路能够连续监测电极之间的组织中的电流并且将该监测的电流(或组织内的电流)与预设电流相比较，以及连续调整能量输出以将监测的电流维持在预设水平。反馈环可以是瞬时的，因为其是模拟闭环反馈。

h.分散电流

如本文中所用，“分散电流”意指来源于本文中描述的电穿孔设备的各种针电极阵列的电流的模式，其中所述模式最小化或优选消除电穿孔相关的热应激在被电穿孔的组织的任何区域上的发生。

i.电穿孔

如本文中可互换使用的，“电穿孔”、“电透化(electro-permeabilization)”或“电动力增强(electro-kineticenhancement)”(“ep”)意指跨膜电场脉冲在生物膜中诱导极微小通道(孔)的用途；它们的存在允许生物分子例如质粒、寡核苷酸、sirna、药物、离子和水从细胞膜的一侧通过至另一侧。

j.反馈机制

如本文中所用，“反馈机制”意指通过软件或硬件(或固件)进行的过程，所述过程(在递送能量脉冲之前、期间和/或之后)接收期望组织的阻抗并且将其与预设值(优选电流)相比较，然后调整所递送的能量脉冲以达到预设值。可通过模拟闭合电路进行反馈机制。

k.片段

如本文中所用，关于核酸序列的“片段”意指核酸序列或其部分，所述核酸序列或其部分编码能够引起哺乳动物的免疫反应的多肽，所述多肽与全长野生型病毒株的流感病毒抗原(包括例如甲型h1流感病毒血凝素、甲型h2流感病毒血凝素或乙型流感病毒血凝素)交叉反应。片段可以是选自编码共有氨基酸序列的多个核苷酸序列中的至少一个和包含这样的序列(包括seqidno：1、3、6、9、11、13和15)的构建体的dna片段。dna片段可包括免疫球蛋白前导序列例如ige或igg前导序列的编码序列。dna片段在长度上可以为30或更多个核苷酸，45或更多个，60或更多个，75或更多个，90或更多个，120或更多个，150或更多个，180或更多个，210或更多个，240或更多个，270或更多个，300或更多个，360或更多个，420或更多个，480或更多个，540或更多个，600或更多个，660或更多个，720或更多个，780或更多个，840或更多个，900或更多个，960或更多个，1020或更多个，1080或更多个，1140或更多个，1200或更多个，1260或更多个，1320或更多个，1380或更多个，1440或更多个，1500或更多个，1560或更多个，1620或更多个，1680或更多个，1740或更多个，1800或更多个，1860或更多个，1820或更多个，1880或更多个，1940或更多个，2000或更多个，2600或更多个，2700或更多个，2800或更多个，2900或更多个，2910或更多个，2920或更多个，2930或更多个，2931或更多个，2932或更多个，2933或更多个，2934或更多个，2935或更多个，2936或更多个，2937或更多个或2938或更多个核苷酸。dna片段可少于10个核苷酸，少于20个，少于30个，少于40个，少于50个，少于60个，少于75个，少于90个，少于120个，少于150个，少于180个，少于210个，少于240个，少于270个，少于300个，少于360个，少于420个，少于480个，少于540个，少于600个，少于660个，少于720个，少于780个，少于840个，少于900个，少于960个，少于1020个，少于1080个，少于1140个，少于1200个，少于1260个，少于1320个，少于1380个，少于1440个，少于1500个，少于1560个，少于1620个，少于1680，或少于1740个核苷酸，少于1800，少于1860个，少于1820，少于1880个，少于1940个，少于2000个，少于2600个，少于2700个，少于2800个，少于2900个，少于2910个，少于2920个，少于2930个，少于2931个，少于2932个，少于2933个，少于2934个，少于2935个，少于2936个，少于2937个或少于2938个核苷酸。

关于多肽序列的“片段”意指能够引发哺乳动物的免疫反应的多肽，所述多肽与全长野生型病毒株流感病毒抗原例如甲型h1流感病毒血凝素、甲型h2流感病毒血凝素或乙型流感病毒血凝素交叉反应。片段可以是选自本发明的多个多肽序列(包括seqidno：2、4、7、10、12、14和16)中的至少一个的多肽片段。可分析多肽片段以接触至少一个由公共可获得的数据库例如洛斯阿拉莫斯国家实验室的ha(losalamosnationallaboratory’sha)序列数据库提供的抗原表位。多肽ha片段还可包含免疫球蛋白前导序列(例如ige或igg前导序列)的氨基酸序列。多肽片段在长度上可以为30或更多个氨基酸，在长度上为45或更多个，60或更多个，75或更多个，90或更多个，120或更多个，150或更多个，180或更多个，210或更多个，240或更多个，270或更多个，300或更多个，360或更多个，420或更多个，480或更多个，540或更多个，600或更多个，660或更多个或710个氨基酸或更多个氨基酸。多肽片段在长度上可少于10个氨基酸，少于20个，少于30个，少于40个，少于50个，少于60个，少于75个，少于90个，少于120个，少于150个，少于180个，少于210个，少于240个，少于270个，少于300个，少于360个，少于420个，少于480个，少于540个，少于600个，少于660个，少于700个，少于701个，少于702个，少于703个，少于704个，少于705个，少于706个，少于707个，少于708个，少于709个或少于710个氨基酸。

l.基因构建体

如本中所用，术语“基因构建体”是指包含编码蛋白质的核苷酸序列的dna或rna分子。编码序列包括有效地连接于调控元件(包括能够在已对其施用了核酸分子的个体的细胞中指导表达的启动子和多腺苷酸化信号)的起始和终止信号。如本文中所用，术语“可表达形式”是指基因构建体，所述基因构建体包含有效地连接于编码蛋白质的编码序列的必需调控元件，以便当存在于个体的细胞中时编码序列可被表达。

m.同一的

如本文中所用，在两个或更多个核酸或多肽序列的上下文中，″同一的″或″同一性″意指序列具有指定的在指定的区域范围中为相同的残基的百分比。可如下计算百分比：最佳地对齐两个序列，在指定的区域范围内比较两个序列，确定在其上相同残基存在于两个序列中的位置的数目以产生匹配位置的数目，将匹配位置的数目除以指定区域中位置的总数，将结果乘以100以产生序列同一性的百分比。在其中两个序列具有不同长度或比对产生一个或多个交错末端并且指定的比较区域只包括单个序列的情况下，单个序列的残基包括在计算的分母中而非分子中。当比较dna与rna时，胸腺嘧啶(t)和尿嘧啶(u)可以被认为是等同的。可人工或通过使用计算机序列算法例如blast或blast2.0进行同一性。

n.阻抗

当讨论反馈机制时可使用“阻抗”，其可按照欧姆定律被转化成电流值，从而使得能够与预设电流相比较。

o.免疫反应

如本文中所用，“免疫反应”意指宿主的免疫系统，例如哺乳动物的免疫系统响应抗原例如流感病毒血凝素共有抗原的引入的激活。免疫反应可以以细胞反应或体液反应或两者的形式存在。

p.核酸

本文中所用的“核酸”或“寡核苷酸”或“多核苷酸”意指共价连接在一起的至少两种核苷酸。单链的描述也确定互补的链的序列。因此，核酸还包括描述的单链的互补链。核酸的许多变体可用于与给定的核酸相同的目的。因此，核酸还可包括大体上相同的核酸和其互补序列。单链提供了可在严格杂交条件下与靶序列杂交的探针。因此，核酸还包括在严格杂交条件下杂交的探针。

核酸可以是单链或双链的，或可包含双链和单链序列的部分。核酸可以是dna，基因组和edna、rna或杂交体，其中核酸可包含脱氧核糖和核糖-核酸苷酸的组合以及碱基(包括尿嘧啶、腺嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶、鸟嘌呤、肌苷、黄嘌呤、次黄嘌呤、异胞嘧啶和异鸟嘌呤)的组合。核酸可通过化学合成法或通过重组法获得。

q.有效连接的

如本文中所用，“有效连接的”意指基因的表达处于与其空间上连接的启动子的控制之下。启动子可定位在处于其控制之下的基因的5′(上游)或3′(下游)。启动子与基因之间的距离可与在该启动子所源自的基因中该启动子与其控制的基因之间的距离大致相同。如本领域中是已知的，该距离的变化可被容纳而不丧失启动子功能。

r.启动子

如本文中所用“启动子”意指能够在细胞中赋予核酸的表达、激活或增强所述表达的合成或天然来源的分子。启动子可以包括一个或多个特异性转录调控序列以进一步增强所述基因的表达和/或改变所述基因的空间表达和/或时间表达。启动子还可包括远端增强子或阻遏物元件，所述元件可位于远离转录起始位点多达数千个碱基对。启动子可来源于包括病毒、细菌、真菌、植物、昆虫和动物的来源。启动子对于其中表达发生的组织或器官，对于表达发生所处的发育阶段或响应外部刺激例如生理应激、病原体、金属离子或诱导剂，可组成型地或差异地调控基因组件的表达。启动子的代表性实例包括噬菌体t7启动子、噬菌体t3启动子、sp6启动子、lac操纵子-启动子、tac启动子、sv40晚期启动子、sv40早期启动子、rsv-ltr启动子，cmvie启动子、sv40早期启动子或sv40晚期启动子和cmvie启动子。

s.严格杂交条件

如本文中所用，“严格杂交条件”意指在其下第一核酸序列(例如，探针)将与第二核酸序列(例如，靶)例如在核酸的复杂混合物中杂交的条件下。严格条件是序列依赖性的并且在不同的环境中是不同的。严格条件可经选择比特定离子强度ph下特定序列的热解链温度(thermalmeltingpoint)(tm)低约5-10℃。tm可以是(在确定的离子强度、ph和核酸浓度下)50％的与靶互补的探针与靶序列平衡杂交时所处的温度(当靶序列过量存在时，在tm下，50％的探针被平衡地占据)。严格条件可以是这样的条件，其中在ph7.0至8.3下盐浓度低于约1.0m钠离子，例如约0.01-1.0m的钠离子浓度(或其它盐)并且温度为至少约30℃(对于短探针，例如约10-50个核苷酸)和至少约60℃(对于长探针，例如大于至少约50个核苷酸)。严格条件还可通过添加去稳定剂例如甲酰胺来获得。对于选择性或特异性杂交，阳性信号可为本底杂交的至少2至10倍。示例性严格杂交条件包括下列条件：在42℃下于50％甲酰胺、5xssc和1％sds中温育，或在65℃下于5xssc，1％sds中温育，和在65℃下于0.2xssc和0.1％sds中洗涤。

t.大体上互补

如本文中所用，“大体上互补”意指第一序列与第二序列的互补序列在8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、180、270、360、450、540、630、720、810、900、990、1080、1170、1260、1350、1440、1530、1620、1710、1800、1890、1980、2070或更多个核苷酸或氨基酸的区域范围内具有至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％的同一性，或两个序列在严格杂交条件下杂交。

u.大体同一的

如本文中所用，“大体上同一的”意指第一序列与第二序列在8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、180、270、360、450、540、630、720、810、900、990、1080、1170、1260、1350、1440、1530、1620、1710、1800、1890、1980、2070或更多个核苷酸或氨基酸的区域范围内具有至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％的同一性，或就核酸而言，如果第一序列与第二序列的互补序列大体上互补，则第一序列与第二序列大体上同一。

v.亚型或血清型

“亚型”或“血清型”：如本文中所用，可互换，并且当提及流感病毒时，意指流感病毒的遗传性变型(geneticvariant)，以便一个亚型免疫系统识别而与不同亚型相区分。

w.变体

如本文中所用，关于核酸的“变体”意指(i)参照核苷酸序列的部分或片段；(ii)参照核苷酸序列或其部分的互补序列；(iii)与参照核酸或其互补序列大体上同一的核酸；或(iv)在严格条件下与参照核酸、其互补序列或与其大体上同一的序列杂交的核酸。

“变体”是指在氨基酸序列上相异在于氨基酸的插入、缺失或保守置换但保持至少一种生物活性的肽或多肽。变体还可以指其氨基酸序列与参考的蛋白质的氨基酸序列大体上同一的蛋白质，其保留至少一种生物活性。氨基酸的保守置换，即用具有相似性质(例如，亲水性、带电荷区域的程度和分布)的不同氨基酸替代氨基酸，在本领域通常被认为包括小的变化。这些小的变化可部分地通过考虑氨基酸的亲水指数来鉴定，如本领域中所理解的。kyte等人，j.mol.biol.157：105-132(1982)。氨基酸的亲水指数基于其疏水性和电荷的考虑。在本领域中已知具有相似亲水指数的氨基酸可被置换并且仍然保留蛋白质功能。在一个方面，具有±2的亲水指数的氨基酸被置换。氨基酸的亲水性还可用于揭示可产生保留生物功能的蛋白质的置换。在肽的上下文中氨基酸的亲水性的考虑允许计算该肽的最大局部平均亲水性，已报道与抗原性和免疫原性相关的有用的测量。美国专利no.4,554,101，通过引用完全并入本文。具有相似亲水性值的氨基酸的置换可产生保留生物活性例如免疫源性的肽，这在本领域中是被理解的。可利用具有在±2内的亲水性值的氨基酸彼此进行置换。氨基酸的疏水性指数和亲水性值受该氨基酸的具体侧链影响。与该观察一致，应理解与生物功能相容的氨基酸置换依赖于氨基酸的相似性，特别地所述氨基酸的侧链的相似性，如通过疏水性、亲水性、电荷、大小和其它性质显示的。

x.载体

如本文中所用，″载体″意指包含复制起始位点的核酸序列。载体可以是载体、噬菌体、细菌人工染色体或酵母人工染色体。载体可以是dna或rna载体。载体可以自主复制的染色体外载体，优选地为dna质粒。

2.流感病毒抗原

本文中提供的是能够在引发哺乳动物中的抗一个或多个流感病毒血清型的免疫反应的抗原。所述抗原能够引发哺乳动物中的抗一个或多个流感病毒血清型的免疫反应，包括抗一个或多个大范围流行病的病毒株，例如2009h1n1猪源的流感病毒。所述抗原能够引发哺乳动物中的抗一个或多个流感病毒血清型的免疫反应，包括抗猪来源的人流感病毒的一个或多个病毒株。抗原可包含表位，所述表位可使它们成为可针对其诱导抗流感病毒的免疫反应的特别有效的免疫原。

抗原可包括全长翻译产物ha0、亚基ha1、亚基ha2、其变体、其片段或其组合。流感病毒血凝素抗原可以是来源于甲型流感病毒血清型h1的多个病毒株的共有序列，来源于甲型流感病毒血清型h2的多个病毒株的共有序列，包含来源于不同组的甲型流感病毒血清型h1的多个病毒株的两个不同共有序列的部分的杂交体序列或来源于乙型流感病毒的多个病毒株的共有序列。流感病毒血凝素抗原可来自乙型流感病毒。抗原可包含至少一个抗原性表位，所述表位对于可针对其诱导免疫反应的特定流感病毒免疫原是有效的。抗原可提供存在于完整流感病毒中的免疫原性位置和表位的完全库。抗原可以是共有血凝素抗原序列，所述序列可来源于来自一个血清型的多个甲型流感病毒株例如血清型h1或血清型h2的多个甲型流感病毒株的血凝素抗原序列。抗原可以是杂交共有血凝素抗原序列，其可通过组合两个不同的共有血凝素抗原序列或其部分衍生而来。两个不同共有血凝素抗原序列的每一个可来源于不同组的一个血清型的多个甲型流感病毒株例如血清型h1的多个甲型流感病毒株。抗原可以是可来源于来自多个乙型流感病毒株的血凝素抗原序列的共有血凝素抗原序列。

共有血凝素抗原可以是包含seqidno：2(共有h1氨基酸序列)的蛋白质，其中氨基酸1-343相应于前体ha0共有h1氨基酸序列的ha1亚基并且氨基酸344-566相应于ha0共有h1氨基酸序列的ha2亚基。共有血凝素抗原可以是包含seqidno：7(共有h2氨基酸序列)的蛋白质。共有血凝素抗原可以是合成杂交共有h1序列，其包含各自来源于彼此不同的组的序列的两个不同共有h1序列。作为合成杂交共有h1蛋白的共有ha抗原的实例是包含seqidno：10(u2氨基酸序列)的蛋白质。共有血凝素抗原可以是来源于乙型流感病毒株的血凝素序列的共有血凝素蛋白，例如包含seqidno：14(共有bha氨基酸序列)的蛋白质。

共有血凝素抗原还可包含一种或多种额外的氨基酸序列元件。共有血凝素抗原还可在其n末端上包含ige或igg的前导氨基酸序列。ige前导氨基酸序列可以是seqidno：17。共有血凝素抗原还可包含作为可通过容易获得的抗体检测的独特免疫原性表位的免疫原性标签。这样的免疫原性标签的实例为9个氨基酸的流感病毒ha标签，其可连接于共有血凝素的c端。ha标签氨基酸序列可以是seqidno：18。在一些实施方案中，共有血凝素抗原还可在其n末端上包含ige或igg前导氨基酸序列并且其c末端上包含ha标签。

共有血凝素抗原可以是由共有流感病毒氨基酸序列或其片段和变体组成的共有血凝素蛋白。共有血凝素抗原可以是包含非-流感病毒蛋白质序列和流感病毒蛋白质序列或其片段和变体的共有血凝素蛋白。

共有h1蛋白的实例包括可由共有h1氨基酸序列(seqidno：2)组成的所述蛋白质或还包含额外元件例如ige前导序列或ha标签或ige前导序列和ha标签两者的所述蛋白质。包括ige前导序列和ha标签的共有h1蛋白的实例为seqidno：4，其包含在其n末端连接于ige前导氨基酸序列(seqidno：17)并且在其c末端连接于ha标签(seqidno：18)的共有h1氨基酸编码序列(seqidno：2)。

共有h2蛋白的实例包括可由共有h2氨基酸序列(seqidno：7)组成的所述蛋白质或还包含ige前导序列或ha标签或ige前导序列和ha标签的所述蛋白质。

杂交共有h1蛋白的实例包括可由共有u2氨基酸序列(seqidno：10)组成的所述蛋白质或还包含ige前导序列、ha标签或ige前导序列和ha标签的所述蛋白质。共有u2蛋白的实例为seqidno：12，其包含在其n末端连接于ige前导氨基酸序列(seqidno：17)和在其c末端连接于ha标签(seqidno：18)的共有u2氨基酸序列(seqidno：10)。

杂交共有b型流感病毒凝血素蛋白的实例包括可由共有bha氨基酸序列(seqidno：14)组成的所述蛋白质，或其可包含ige前导序列或ha标签或ige前导序列和ha标签。共有bha蛋白的实例为seqidno：16，其包含在其n末端连接于ige前导氨基酸序列(seqidno：17)和在其c末端连接于ha标签(seqidno：18)的共有bha氨基酸序列(seqidno：14)。

共有血凝素蛋白可由共有血凝素核酸、其变体或片段编码。与可以是来源于来自不同株和变体的多个不同的血凝素序列的共有序列的共有血凝素蛋白不同，共有血凝素核酸是指编码共有蛋白质序列的核酸序列，并且所使用的编码序列可与用于编码所述共有血凝素蛋白序列所源自的多个不同血凝素序列中特定氨基酸序列的编码序列不同。共有核酸序列可以进行密码最优化和/或rna最优化。共有血凝素核酸序列可在5’非翻译区中包含kozak’s序列。共有血凝素核酸序列可包含编码前导序列的核酸序列。n末端前导序列的编码序列为血凝素编码序列的5’。n末端前导序列可促进分泌。n前导序列可以是ige前导序列或igg前导序列。共有血凝素核酸序列可包含编码免疫原性标签的核酸序列。免疫原性标签可在蛋白质的c端上并且编码其的序列为ha编码序列的3’。免疫原性标签提供了可容易获得针对其的抗体的独特表位，以便此类抗体可用于检测和确认蛋白质的表达的测定。免疫原性标签可以是蛋白质的c端上的h标签。

共有血凝素核酸可具有编码包含seqidno：2、seqidno：7、seqidno：10或seqidno：14的氨基酸序列的多核苷酸序列。编码seqidno：2、seqidno：7、seqidno：10或seqidno：14的共有血凝素核酸可以分别为seqidno：1、seqidno：6、seqidno：9或seqidno：13。共有血凝素核酸还可包含编码ige前导氨基酸序列的多核苷酸或编码ha标签氨基酸序列的多核苷酸或两者。seqidno：17为ige前导多肽序列。seqidno：18为ha标签多肽序列。还包含编码ige前导序列和ha标签的多核苷酸序列的血凝素共有核酸的实例包括核酸分子，所述核酸分子编码包括seqidno：4、seqidno：12或seqidno：16的氨基酸序列的蛋白质。编码seqidno：4、seqidno：12或seqidno：16的共有血凝素核酸可以分别为seqidno：3、seqidno：11或seqidno：15。

3.基因构建体和质粒

本文中提供的是可包含编码血凝素抗原的核酸序列的基因构建体。基因构建体可以以包含编码血凝素抗原的核酸的功能性染色体外分子的形式存在于细胞中。包含编码血凝素抗原的核酸的基因构建体可以是包含着丝粒、端粒的线性微型染色体或质粒或粘粒。

基因构建体还可以重组病毒载体(包括重组腺病毒、重组腺病毒相关病毒和重组牛痘)的基因组的部分。基因构建体可以是存在于细胞中的减毒活微生物的遗传物质或重组微生物载体的部分。

基因构建体可包含用于血凝素核酸的基因表达的调控元件。调控元件可以是启动子、增强子、起始密码子、终止密码子或多腺苷酸化信号。

组合物可包含第一核酸序列(其编码选自：甲型流感病毒共有血凝素h1抗原、甲型流感病毒共有血凝素h2抗原、甲型流感病毒共有血凝素u2抗原和乙型流感病毒共有血凝素蛋白bha中的一种或多种的血凝素共有抗原)，并且还可包含一种或多种额外的核酸序列(所述核酸序列编码选自：甲型流感病毒血凝素蛋白h1、h2、h3、h4、h5、h6、h7、h8、h9、h10、h11、h12、h13、h14、h15、h16、甲型流感病毒神经氨酸酶n1、n2、n3、n4、n5、n6、n7、n8、n9、乙型流感病毒血凝素(bha)和乙型流感病毒神经氨酸酶(bna)中的一种或多种蛋白质)。第一和额外的核酸序列可存在于相同核酸分子或不同核酸分子上。第一和额外的核酸序列可处于在人细胞中起作用的调控元件的控制之下。额外的编码序列可编码一种或多种来自一个或多个流感病毒株的h1、h2、h3、h4、h5、h6、h7、h8、h9、h10、h11、h12、h13、h14、h15、h16、n1、n2、n3、n4、n5、n6、n7、n8、n9、bha和bna，或为来源于具有相同血清型的多个病毒株的共有序列，或为包括来自两种或更多种共有序列的序列的杂交体。

核酸序列可组成可以是载体的基因构建体。载体可以能够在哺乳动物的细胞中以有效地引发哺乳动物的免疫反应的量表达共有血凝素抗原。载体可以是重组的。载体可包含编码共有血凝素抗原的异源核酸。载体可以是质粒。载体对于用编码共有血凝素抗原的核酸转染细胞是有用的，将所述转染的宿主细胞在其中共有血凝素抗原的表达发生的条件下进行培养和维持。

载体包含编码共有血凝素抗原的异源核酸并且还可包含起始密码子(其可位于共有血凝素编码序列的上游)和终止密码子(其可位于共有血凝素编码序列的下游)。起始和终止密码子可以与共有血凝素编码序列存在于读框中。载体还可包含有效地连接于共有血凝素编码序列的启动子。有效地连接于共有血凝素编码序列的启动子可以是来自猴病毒40(sv40)的启动子、小鼠乳房肿瘤病毒(mmtv)启动子、人免疫缺陷病毒(hiv)启动子例如牛免疫缺陷病毒(biv)长末端重复(ltr)启动子、莫洛尼病毒启动子、禽类自血病病毒(alv)启动子、巨细胞病毒(cmv)启动子例如cmv立即早期启动子、eb病毒(epsteinbarrvirus)(ebv)启动子或rous肉瘤病毒(rsv)启动子。启动子还可以是来自人基因例如人肌动蛋白、人肌球蛋白、人血红蛋白、人肌肉肌酸或人金属硫蛋白的启动子。启动子还可以是组织特异性启动子，例如肌肉或皮肤特异性启动子，天然或合成的。此类启动子的实例描述于美国专利申请公布no.us20040175727(将其内容通过引用整体并入本文)中。

载体还可包含多腺苷酸化信号，其可位于ha编码序列的下游。多腺苷酸化信号可以为sv40多原苷酸信号、ltr多腺苷酸信号、牛生长激素(bgh)多腺苷酸化信号或人β-珠蛋白多腺苷酸化信号。sv40多腺苷酸化信号可以是来自pcep4载体(茵维特罗根公司，圣地亚哥市，加利福尼亚州)的多腺苷酸化信号。

载体还可在共有血凝素编码序列的上游包含增强子。增强子可以是dna表达所必需的。增强子可以是人肌动蛋白、人肌球蛋白、人血红蛋白、人肌肉肌酸或病毒增强子例如来自cmv、ha、rsv或ebv的增强子。多腺苷酸功能增强描述于美国专利no.5,593,972、5,962,428和wo94/016737，将所述专利和申请的每一个的内容通过引用整体并入本文。

载体还可包含哺乳动物复制起始位点以在染色体外维持载体并且在细胞中产生多个拷贝的载体。载体可以是来自茵维特罗根公司(圣地亚哥市，加利福尼亚州)的pvax1(图1)、pcep4或prep4，其可包含eb病毒复制起始位点和核抗原ebna-1编码区，其可产生高拷贝附加型复制而无整合。载体可以是具有变化例如参考上文中附图简述部分的图1的段落中描述的变化的pvax1。载体的主链可以是pav0242。载体可以是复制缺陷型腺病毒5型(ad5)载体。

载体还可包含调控序列，其可以非常适用于在已将载体施入其中的哺乳动物或人细胞中进行基因表达。共有血凝素编码序列可包含密码子，所述密码子可允许编码序列在宿主细胞中的更高效转录。

载体可以是pse420(茵维特罗根公司，圣地亚哥市，加利福尼亚州)，其可用于在大肠杆菌(escherichiacoli)(e.coli)中产生蛋白质。载体还可以是pyes2(茵维特罗根)，圣地亚哥市，加利福尼亚州)，其可用于在酵母的酿酒酵母(saccharomycescerevisiae)菌株中产生蛋白质。载体还可具有maxbac^tm完全杆状病毒表达系统(茵维特罗根，圣地亚哥市，加利福尼亚州)，其可用于在昆虫细胞中产生蛋白质。载体还可以是pcdnai或pcdna3(茵维特罗根，圣地亚哥市，加利福尼亚州)，其可用于在哺乳动物细胞例如中国仓鼠卵巢(cho)细胞中产生蛋白质。载体可以是利用常规技术和可容易获得的起始材料(包括sambrook等人，分子克隆和实验室手册，第2版，冷泉港(coldspringharbor)(1989)(将其通过引用并入本文))来产生蛋白质的表达载体或系统。

载体可以是pgx2009或pgx2006，其可用于表达共有血凝素抗原。载体pgx2009(4739bp，图2；seqidno：5)为经修饰的pvax1质粒，其具有编码共有h1蛋白(由seqidno：3编码的氨基酸seqidno：4)酸的核酸序列，所述共有h1蛋白包含连接于共有h1氨基酸序列(由seqidno：1编码的氨基酸seqidno：2)的ige前导序列(由seqidno：11编码的氨基酸seqidno：12)。载体pgx2006(4628bp；图3，seqidno：8)为pvax1质粒，其具有编码共有h2蛋白(由seqidno：6编码的氨基酸seqidno：7)的核酸序列的质粒。

本文中公开的包括共有血凝素编码序列的基因构建体和组分可用于表达其它流感病毒蛋白质例如甲型流感病毒h1、h2、h3、h4、h5、h6、h7、h8、h9、h10、h11、h12、h13、h14、h15、h16、n1、n2、n3、n4、n5、n6、n7、n8、n9、乙型流感病毒血凝素或神经氨酸酶蛋白，由此包括替代共有血凝素编码序列的甲型流感病毒蛋白h1、h2、h3、h4、h5、h6、h7、h8、h9、h10、h11、h12、h13、h14、h15、h16、n1、n2、n3、n4、n5、n6、n7、n8、n9、乙型流感病毒血凝素或神经氨酸酶蛋白的编码序列。

4.药物组合物

本文中提供的是根据本发明的药物组合物，其包含约1纳克至约10mg的dna。在一些实施方案中，根据本发明的药物组合物包含：1)至少10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100纳克，或至少1、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110、115、120、125、130、135、140、145、150、155、160、165、170、175、180、185、190、195、200、205、210、215、220、225、230、235、240、245、250、255、260、265、270、275、280、285、290、295、300、305、310、315、320、325、330、335、340、345、350、355、360、365、370、375、380、385、390、395、400、405、410、415、420、425、430、435、440、445、450、455、460、465、470、475、480、485、490、495、500、605、610、615、620、625、630、635、640、645、650、655、660、665、670、675、680、685、690、695、700、705、710、715、720、725、730、735、740、745、750、755、760、765、770、775、780、785、790、795、800、805、810、815、820、825、830、835、840、845、850、855、860、865、870、875、880、885、890、895.900、905、910、915、920、925、930、935、940、945、950、955、960、965、970、975、980、985、990、995或1000微克，或至少1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5或10mg或更多；和2)达到并且包括15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100纳克，或达到并且包括1、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95，100、105、110、115、120、125、130、135、140、145、150、155、160、165、170、175、180、185、190、195、200、205、210、215、220、225、230、235、240、245、250、255、260、265、270、275、280、285、290、295、300、305、310、315、320、325、330、335、340、345、350、355、360、365、370、375、380、385、390、395、400、405、410、415、420、425、430、435、440、445、450、455、460、465、470、475、480、485、490、495、500、605、610、615、620、625、630、635、640、645、650、655、660、665、670、675、680、685、690、695、700、705、710、715、720、725、730、735、740、745、750、755、760、765、770、775、780、785、790、795、800、805、810、815、820、825、830、835、840、845、850、855、860、865、870、875、880、885、890、895.900、905、910、915、920、925、930、935、940、945、950、955、960、965、970、975、980、985、990、995或1000微克，或达到并且包括1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5或10mg。在一些实施方案中，根据本发明的药物组合物包含约5纳克至约10mg的dna。在一些实施方案中，根据本发明的药物组合物包含约25纳克至约5mg的dna。在一些实施方案中，药物组合物包含约50纳克至约1mg的dna。在一些实施方案中，药物组合物包含约0.1至约500微克的dna。在一些实施方案中，药物组合物包含约1至约350微克的dna。在一些实施方案中，药物组合物包含约5至约250微克的dna。在一些实施方案中，药物组合物包含约10至约200微克的dna。在一些实施方案中，药物组合物包含约15至约150微克的dna。在一些实施方案中，药物组合物包含约20至约100微克的dna。在一些实施方案中，药物组合物包含约25至约75微克的dna。在一些实施方案中，药物组合物包含约30至约50微克的dna。在一些实施方案中，药物组合物包含约35至约40微克的dna。在一些实施方案中，药物组合物包含约100至约200微克dna。在一些实施方案中，药物组合物包含约10微克至约100微克的dna。在一些实施方案中，药物组合物包含约20微克至约80微克的dna。在一些实施方案中，药物组合物包含约25微克至约60微克的dna。在一些实施方案中，药物组合物包含约30纳克至约50微克的dna。在一些实施方案中，药物组合物包含约35纳克至约45微克的dna。在一些优选实施方案中，药物组合物包含约0.1至约500微克的dna。在一些优选实施方案中，药物组合物包含约1至约350微克的dna。在一些优选实施方案中，药物组合物包含约25至约250微克的dna。在一些优选实施方案中，药物组合物包含约100至约200微克dna.

根据待使用的施用模式配制根据本发明的药物组合物。在其中药物组合物是可注射的药物组合物的情况下，它们是无菌、无热原和无颗粒的。优选使用等渗制剂。通常，用于等渗性的添加剂可包括氯化钠、葡萄糖、甘露糖、山梨醇和乳糖。在一些情况下，等渗溶液例如磷酸缓冲盐溶液是优选的。稳定剂包括明胶和白蛋白。在一些实施方案中，将血管添加剂添加至制剂。

优选药物组合物是疫苗，更优选是dna疫苗。

本文中提供的是能够在哺乳动物中产生抗一种或多种流感病毒血清型的免疫反应。疫苗可包含上述的基因构建体。疫苗可包含多种载体，所述载体各自针对一种或多种甲型流感病毒血清型例如h1-h16乙型流感病毒血凝素或其组合。疫苗可包含编码一种或多种共有血凝素抗原的一个或多个核酸序列。当疫苗包含超过一种共有血凝素核酸序列时，所有此类序列可存在于单个核酸分子上或每一种这样的序列可存在于不同的核酸分子上。或者，包含超过一个的共有血凝素核酸序列的疫苗可包含具有单个共有血凝素核酸序列的核酸分子和具有超过一个的共有血凝素核酸序列的核酸分子。此外，包含一个或多个共有血凝素核酸序列的疫苗还可包含一种或多种选自h1、h2、h3、h4、h5、h6、h7、h8、h9、h10、h11、h12、h13、h14、h15、h16、n1、n2、n3、n4、n5、n6、n7、n8、n9和乙型流感病毒神经氨酸酶的蛋白质的编码序列。

在一些实施方案中，疫苗可包含蛋白质。一些疫苗可包含一种或多种共有血凝素抗原例如h1、h2、u2和bha。疫苗可包含一种或多种选自hi、h2、h3、h4、h5、h6、h7、h8、h9、h10、h11、h12、h13、h14、h15、h16、n1、n2、n3、n4、n5、n6、n7、n8、n9和乙型流感病毒神经氨酸酶的其它蛋白质。疫苗可包含与一种或多种其它蛋白质组合的一种或多种共有血凝素抗原，所述其它蛋白质选自h1、h2、h3、h4、h5、h6、h7、h8、h9、h10、h11、h12、h13、h14、h15、h16、n1、n2、n3、n4、n5、n6、n7、n8、n9、乙型流感病毒血凝素和神经氨酸酶。

疫苗可以是dna疫苗。dna疫苗可包含多个相同或不同的包含一个或多个共有血凝素核酸序列的质粒。dna疫苗可包含一个或多个编码一种或多种共有血凝素抗原的核酸序列。当dna疫苗包含超过一个的共有血凝素核酸序列时，所有此类序列可存在于单个质粒上，或每一个此类序列可存在于不同质粒上，或一些质粒可包含单个共有血凝素核酸序列，然而其它质粒具有超过一个的共有血凝素核酸序列。此外，dna疫苗还可包含一种或多种蛋白质的一个或多个共有编码序列，所述蛋白质选自甲型流感病毒h1、h2、h3、h4、h5、h6、h7、h8、h9、h10、h11、h12、h13、h14、h15、h16、n1、n2、n3、n4、n5、n6、n7、n8、n9、乙型流感病毒血凝素和神经氨酸酶。此类额外的编码序列彼此可存在于相同或不同的质粒上和来自包含一种或多种共有血凝素核酸序列的质粒。

在一些实施方案中，疫苗可包含编码与流感病毒抗原组合的流感病毒抗原的核酸序列。在一些实施方案中，核酸序列编码一种或多种共有血凝素抗原例如h1、h2、u2和bha。在一些实施方案中，核酸序列编码一种或多种选自甲型流感病毒h1、h2、h3、h4、h5、h6、h7、h8、h9、h10、h11、h12、h13、h14、h15、h16、n1、n2、n3、n4、n5、n6、n7、n8、n9、乙型流感病毒血凝素和神经氨酸酶的蛋白质。在一些实施方案中，疫苗包含一种或多种共有血凝素抗原例如h1、h2、u2和bha。在一些实施方案中，疫苗包含一种或多种选自甲型流感病毒h1、h2、h3、h4、h5、h6、h7、h8、h9、h10、h11、h12、h13、h14、h15、h16、n1、n2、n3、n4、n5、n6、n7、n8、n9、乙型流感病毒血凝素和神经氨酸酶的其它蛋白质。

在一些实施方案中，疫苗包含3个或更多个共有血凝素核酸序列(包括编码h1、h2、u2和bha中的一种或多种的核酸序列)的组合。在一些实施方案中，疫苗包含3个或更多个血凝素核酸序列(包括编码共有u2、共有bha和h3血凝素的核酸序列)的组合。在一些实施方案中，疫苗包含3个或更多个血凝素核酸序列(包括编码共有bha、h1血凝素和h3血凝素的核酸序列)的组合。在一些实施方案中，疫苗包含一个或更多个编码美国系列no.12/375,518(将所述美国系列申请通过引用并入本文)和/或美国系列no.12/269,824(将所述美国系列申请通过引用并入本文)中公开的一种或多种流感病毒抗原的核酸序列。在一些实施方案中，疫苗包含编码疫苗包含编码seqidno：20(其为美国系列no.12/375,518中公开的h1血凝素，在该美国系列申请中分别为seqidno：36和seqidno：37)的核酸序列seqidno：19和/或编码seqidno：22(其为在美国系列no.12/269,824中公开的h1血凝素，在该美国系列申请中分别为seqidno：9和seqidno：10)的核酸序列seqidno：21。在一些实施方案中，疫苗包含编码seqidno：24(其为美国系列no.12/269，824中公开的h3血凝素，在该美国系列申请中分别为seqidno：11和seqidno：12)的核酸序列seqidno：23。

在一些实施方案中，疫苗包含3种或更多种共有血凝素蛋白(包括h1、h2、u2和bha的一种或多种)的组合。在一些实施方案中，疫苗包含3种或更多种血凝素蛋白(包括共有u2、共有bha和h3血凝素)的组合。在一些实施方案中，疫苗包含3种或更多种血凝素蛋白(包括共有bha、h1血凝素和h3血凝素)的组合。在一些实施方案中，疫苗包含1种或更多种来自美国系列no.12/375,518和/或美国系列no.12/269,824的抗原。在一些实施方案中，疫苗包含seqidno：20和/或seqidno：22和/或seqidno：24。

在一些实施方案中，疫苗包含1)共有血凝素u2蛋白和/或编码所述共有血凝素u2蛋白的核酸序列，2)共有血凝素bha蛋白和/或编码所述共有血凝素bha蛋白的核酸序列，和3)seqidno：24中公开的血凝素h3蛋白的组合。

在一些实施方案中，疫苗包含1)共有血凝素bha蛋白和/或编码所述共有血凝素bha蛋白的核酸序列，2)具有seqidno：20和/或seqidno：22的血凝素h1蛋白和/或血凝素h1蛋白编码核酸序列seqidno19和/或seqidno：21，和3)具有seqidno：24的血凝素h3蛋白和/或编码在其中的核酸序列seqidno：23的血凝素h3蛋白的组合。

dna疫苗公开于美国专利no.5,593,972、5,739,118、5,817,637、5,830,876、5,962,428、5,981,505、5,580,859、5,703,055和5,676,594(将所述专利通过引用整体并入本文)中。dna疫苗还可包含抑制其整合入染色体的元件或试剂。疫苗可以是血凝素抗原的rna。可将rna疫苗引入细胞。

疫苗可以是包含上述的基因构建体或抗原的重组疫苗。疫苗还可包含以一种或多种蛋白质亚基的形式存在的一种或多种共有血凝素抗原，包含一种或多种共有血凝素抗原的一种或多种杀死的流感病毒颗粒或包含一种或多种共有血凝素抗原的一种或多种减毒的流感病毒颗粒。减毒的疫苗可以是减毒的活疫苗、杀死的疫苗和使用重组载体递送编码一种或多种共有血凝素抗原的外源基因的疫苗，以及亚基和糖蛋白疫苗。减毒的活疫苗、使用重组载体递送外来抗原的疫苗、亚基疫苗和糖蛋白疫苗描述于美国专利no.：4,510,245；4,797,368；4,722,848；4,790,987；4,920,209；5,017,487；5,077,044；5,110,587；5,112,749；5,174,993；5,223,424；5,225,336；5,240,703；5,242,829；5,294,441；5,294,548；5,310,668；5,387,744；5,389,368；5,424,065；5,451,499；5,453,364；5,462,734；5,470,734；5,474,935；5,482,713；5,591,439；5,643,579；5,650,309；5,698,202；5,955,088；6,034,298；6,042,836；6,156,319和6,589,529(将所述专利各自通过引用并入本文)中。

疫苗可包含针对来自世界特定地区例如亚洲的甲型流感病毒血清型的载体和/或蛋白质。疫苗还可抗目前感染人的猪来源的甲型流感病毒血清型。疫苗可包含针对来自世界特定地区的乙型流感病毒的载体和/或蛋白质。疫苗还可抗感染人的乙型流感病毒。疫苗可包含针对甲型和/或乙型流感病毒的一个或多个病毒株的一种或多种载体和/或一种或多种蛋白质。

提供的疫苗还可用于诱导免疫反应，包括治疗性或预防性免疫反应。可产生针对共有血凝素抗原，并且还广泛地跨多个亚型的流感病毒的抗体和/或杀伤t细胞。可分离此类抗体和细胞。

疫苗还可包含药学上可接受的赋形剂。药学上可接受的赋形剂可以是功能性分子如媒介物、佐剂、载体或稀释剂。药学上可接受的赋形剂可以是转染促进剂(transfectionfacilitatingagent)，其可包括表面活性剂例如免疫刺激复合物(iscoms)、弗氏不完全佐剂、lps类似物(包括单磷酰脂质a、胞壁酰肽、醌类似物、囊泡例如角鲨烯和角鲨烯、透明质酸)、脂质、脂质体、钙离子、病毒蛋白质、聚阴离子、聚阳离子或纳米颗粒或其它已知的转染促进剂。

转染促进剂为聚阴离子、聚阳离子，包括聚-l-谷氨酸盐(lgs)或脂质。转染促进剂为聚-l-谷氨酸，和更优选，聚-l-谷氨酸以低于6mg/ml的浓度存在于疫苗中。转染促进剂还可包括表面活性剂例如免疫刺激复合物(iscoms)、弗氏不完全佐剂、lps类似物(包括单磷酰脂质a、胞壁酰肽、醌类似物及囊泡例如角鲨烯和角鲨烯和透明质酸)，还可将所转染促进剂与基因构建体结合施用。在一些实施方案中，dna载体疫苗还可包括转染促进剂例如脂质、脂质体(包括卵磷脂脂质体或本领域内已知的其它脂质体，如dna-脂质体混合物(参见例如w09324640))、钙离子、病毒蛋白质、聚阴离子、聚阳离子或纳米颗粒或其它已知的转染促进剂。优选，转染促进剂为聚阴离子、聚阳离子(包括聚-l-谷氨酸盐(lgs)或脂质)。疫苗中转染剂的浓度低于4mg/ml，低于2mg/ml，低于1mg/ml，低于0.750mg/ml，低于0.500mg/ml，低于0.250mg/ml，低于0.100mg/ml，低于0.050mg/ml或低于0.010mg/ml。

药学上可接受的赋形剂可以是佐剂。佐剂可以是在替代性质粒中表达的或以蛋白质形式与疫苗中的上述质粒组合地递送的其它基因。佐剂可选自：α-干扰素(ifn-α)、β-干扰素(ifn-β)、γ-干扰素、血小板衍生生长因子pdgf)、tnfα、tnfβ、gm-csf、表皮生长因子(egf)、皮肤t细胞吸引趋化因子(ctack)、上皮胸腺表达趋化因子(teck)、粘膜相关上皮趋化因子(mec)、il-12、il-15、mhc、cd80、cd86(包括缺失信号序列和任选地包括来自ige的信号肽的il-15)。佐剂可以是il-12、il-15、il-28、ctack、teck、血小板衍生生长因子(pdgf)、tnfα、tnfβ、gm-csf、表皮生长因子(egf)、il-1、il-2、il-4、il-5、il-6、il-10、il-12、il-18或其组合。

可以是有用的佐剂的其它基因包括编码如下物质的基因：mcp-1、mip-1a、mip-1p、il-8、rantes、l-选择蛋白、p-选择蛋白、e-选择蛋白、cd34、glycam-1、madcam-1、lfa-1、vla-1、mac-1、p150.95、pecam、icam-1、icam-2、icam-3、cd2、lfa-3、m-csf、g-csf、il-4、il-18的突变体形式、cd40、cd40l、血管生长因子、成纤维细胞生长因子、il-7、神经生长因子、血管内皮生长因子、fas、tnf受体、flt、apo-1、p55、wsl-1、dr3、tramp、apo-3、air、lard、ngrf、dr4、dr5、killer、trail-r2、trick2、dr6、天胱蛋白酶ice、fos、c-jun、sp-1、ap-1、ap-2、p38、p65rel、myd88、irak、traf6、ikb、灭活的nik、sapk、sap-1、jnk、干扰素反应基因、nfkb、bax、trail、trailrec、trailrecdrc5、trail-r3、trail-r4、rank、rankligand、ox40、ox40ligand、nkg2d、mica、micb、nkg2a、nkg2b、nkg2c、nkg2e、nkg2f、tap1、tap2及其功能片段。

疫苗还可包含1994年4月1日提交的美国系列no.021，579(将其通过引用并入本文)中描述的基因疫苗促进剂。

5.递送的方法

本文中提供的是用于递送药物制剂(优选疫苗)，以用来提供包含表位的血凝素抗原的基因构建体和蛋白质的方法，所述表位使得所述血凝素抗原成为可对其诱导针对流感病毒感染的免疫反应的特别有效的免疫原。可提供递送疫苗或接种的方法以诱导治疗和/或预防性免疫反应。接种方法可在哺乳动物中产生抗多个流感病毒亚型(包括h1n1血清型例如2009猪源的h1n1)或其它季节性和/或大范围流行病的变种的免疫反应。可将疫苗递送至个体以调节哺乳动物的免疫系统的活性和增强免疫反应。疫苗的递送可以转染以核酸分子的形式在细胞中表达并且被递送至细胞表面的ha抗原，免疫系统可识别所述ha抗原并且诱导细胞、体液或细胞及体液反应。疫苗的递送可用于通过给哺乳动物施用本文中论述的疫苗来诱导或引发哺乳动物中的抗多种流感病毒的免疫反应。

在将疫苗递送至哺乳动物，从而将载体递送入哺乳动物的细胞后，转染的细胞将表达和分泌相应的流感病毒蛋白质，包括共有抗原中的至少一种，优选地h1、h2、u2和bha。此类分泌的蛋白质或合成抗原将被免疫系统识别为外来物，其将引发免疫反应，包括：针对抗原产生的抗体和特异性针对抗原的t细胞反应。在一些实例中，用本文中论述的疫苗接种的哺乳动物将有已接触抗原的免疫系统并且当用流感病毒株攻击时，已接触抗原的免疫系统将使得能够快速消除随后的流感病毒，无论是通过体液、细胞还是通过两者。可将疫苗递送至个体以调节个体的免疫系统的活性，从而增强免疫反应。

可以dna疫苗的形式递送疫苗，递送dna疫苗的方法描述于美国专利no.4,945,050和5,036,006(将所述两个专利通过引用整体并入本文)中。

可给哺乳动物施用疫苗以引发哺乳动物中的免疫反应。哺乳动物可以为人、非人灵长类动物、牛、猪、绵羊、山羊、羚羊、野牛、水牛、牛科动物、鹿、刺猬、象、骆马、羊驼、小鼠、大鼠或鸡、并且优选地为人、牛、猪或鸡。

a.联合治疗

可将药物组合物(优选疫苗)与一种或多种其它流感病毒蛋白质或编码甲型流感病毒h1、h2、h3、h4、h5、h6、h7、h8、h9、h10、h11、h12、h13、h14、h15、h16、n1、n2、n3、n4、n5、n6、n7、n8、n9、乙型流感病毒血凝素和神经氨酸酶的基因联合施用。可将疫苗与蛋白质或编码佐剂的基因联合施用，所述佐剂包括：α-干扰素(ifn-α)、β-干扰素(ifn-β)、γ-干扰素、il-12、il-15、il-28、ctack、teck、血小板衍生生长因子(pdgf)、tnfα、tnfβ、gm-csf、表皮生长因子(egf)、il-1、il-2、il-4、il-5、il-6、il-10、il-12、il-18、mcp-1、mip-1a、mip-1p、il-8、rantes、l-选择蛋白、p-选择蛋白、e-选择蛋白、cd34、glycam-1、madcam-1、lfa-1、vla-1、mac-1、p150.95、pecam、icam-1、icam-2、icam-3、cd2、lfa-3、m-csf、g-csf、il-4、il-18的突变体形式、cd40、cd40l、血管生长因子、成纤维细胞生长因子、il-7、神经生长因子、血管内皮生长因子、fas、tnf受体、flt、apo-1、p55、wsl-1、dr3、tramp、apo-3、air、lard、ngrf、dr4、dr5、killer、trail-r2、trick2、dr6、天胱蛋白酶ice、fos、c-jun、sp-1、ap-1、ap-2、p38、p65re1、myd88、irak、traf6、ikb、灭活的nik、sapk、sap-1、jnk、干扰素反应基因、nfkb、bax、trail、trailrec、trailrecdrc5、trail-r3、trail-r4、rank、rankligand、ox40、ox40ligand、nkg2d、mica、micb、nkg2a、nkg2b、nkg2c、nkg2e、nkg2f、tap1或tap2或其功能片段。

b.施用途径

可通过不同途径包括口服、胃肠外、舌下、经皮肤、经直肠、经粘膜、局部、通过吸入、通过颊部施用、胸膜内、静脉内、动脉内、腹膜内、皮下、肌内、鼻内、鞘内以及关节内或其组合施用疫苗。对于兽医学使用，可按照正常的兽医学操作将组合物作为适当地可接受的制剂施用。兽医可容易地确定最适合于特定动物的给药方案和施用途径。可利用常规注射器、无针注射设备、″微粒轰击基因枪(microprojectilebombardmentgonegun)″或其它物理方法例如电穿孔(“ep”)、“水动力学法”或超声施用疫苗。

可利用几种公知的技术包括dna注射(也称为dna接种)(利用和不利用体内电穿孔)、脂质体介导的、纳米颗粒促进的、重组载体例如重组腺病毒、重组腺病毒相关病毒和重组牛痘将疫苗的载体递送至哺乳动物。可通过dna注射连同体内电穿孔一起递送ha抗原。

c.电穿孔

可使用电穿孔设备来实现通过疫苗的质粒的电穿孔施用疫苗，所述电穿孔设备可被构造成将有效地引起可逆的孔在细胞膜上形成的能量脉冲递送至哺乳动物的期望的组织，并且优选地能量脉冲是与由用户预设的电流输入相似的恒定电流。电穿孔设备可包括电穿孔组件和电极部件或操作部件(handleassembly)。电穿孔组件可包括和整合电穿孔设备的各种元件中的一个或多个元件，包括：控制器、电流波形发生器、阻抗检测器、波形记录器、输入元件、状态报告元件、通信端口、存储器组件(memorycomponent)、电源和电源开关。电穿孔可使用体内电穿孔设备例如ep系统(vgx制药公司(vgxpharmaceuticals)，布鲁贝尔市(bluebell)，宾夕法尼亚州)或elgen电穿孔仪(electroporator)(genetronics，圣地亚哥市，加利福尼亚州)来实现以有利于质粒对细胞的转染。

电穿孔组件可用作电穿孔设备的一个元件，并且其它元件是与电穿孔组件是与与穿孔组件连通的独立元件(或组件)。电穿孔组件可用作电穿孔设备的超过一个的元件，其可与电穿孔设备的与电穿孔组件分开的其它元件连通。作为一个电机或机器设备的部件存在的电穿孔设备的元件可以不受限制，因为所述元件可用作一个设备或用作彼此连通的独立元件。电穿孔组件可以能够将递送在期望的组织中产生恒定电流并且包括反馈机制的能量脉冲。电极部件可包括在空间排列中具有多个电极的电极阵列，其中电极装配件接收来自电穿孔组件的能量脉冲并且将所述能量脉冲通过电极递送至期望的组织。多个电极的至少一个在能量脉冲的递送过程中是中性的并且测量期望组织的阻抗，将阻抗通信传送至电穿孔组件。反馈机制可接收测量的阻抗并且可调整通过电穿孔组件递送的能量脉冲以维持恒定电流。

多个电极可以以分散模式递送能量脉冲。多个电极可通过在编程序列(programmedsequence)下控制电极来以分散模式递送能量脉冲，并且所述编程序列由用户输入至电穿孔组件。编程序列可包括多个按顺序递送的泳冲，其中利用至少两个有源电极(具有一个测量阻抗的中性电极)递送多个脉冲的每一个脉冲，并且其中利用至少两个有源电极(具有一个测量阻抗的中性电极)中的不同电极递送多个脉冲的后续脉冲。

反馈机制可利用硬件或软件来进行。反馈机制可通过模拟闭环电路来进行。反馈每50μs、20μs、10μs或1μs发生一次，但优选实时反馈或瞬时反馈(即，大体上同时，如通过用于测定反应时间的可获得的技术测量的)。中性电极可测量期望的组织中的阻抗和将阻抗通信传送至反馈机制，并且反馈机制对阻抗作出反应并且调节能量脉冲以将恒定电流维持在与预设电流相似的值上。反馈机制可在能量脉冲的递送过程中连续和即时地维持恒定电流。

可帮助本发明的dna疫苗递送的电穿孔设备和电穿孔方法的实例包括draghia-akli等人的美国专利no.7,245,963、由smith等人提交的美国专利公布2005/0052630(将所述专利和专利公布的公开内容通过引用整体并入本文)中描述的电穿孔设备和方法。可用于帮助dna疫苗的递送的其它电穿孔设备和电穿孔方法包括2007年10月17日提交的共同未决和共同拥有的美国专利申请系列no.11/874072(其根据35usc119(e)要求2006年10月17日提交的美国专利申请系列no.60/852,149和2007年10月10日提交的美国专利申请系列no.60/978,982的利益)(将所述申请均通过引用整体并入本文)中提供的电穿孔设备和电穿孔方法。

draghia-akli等人的美国专利no.7,245,963描述了标准电极系统及它们用于帮助将生物分子引入身体或植物中的选定组织的细胞的用途。标准电极系统可包括多个针电极；皮下针头；提供从可编程的恒定电流脉冲控制器至多个针电极的导电油墨的电接插件(electricalconnector)；和电源。操作者可抓住安装在支持结构上的多个针电极，并且将它们牢固地插入身体或植物的选定组织。随后通过皮下针头将生物分子递送入选定组织。激活可编程的恒定电流脉冲控制器，并且将恒定电流电脉冲施加至多个针电极。施加的恒定电流电脉冲帮助将生物分子引入多个电极之间的细胞。将美国专利no.7,245,963的全部内容通过引用并入本文。

由smith等人提交的美国专利公布2005/0052630描述了可用于有效地帮助将生物分子引入身体或植物的选定组织的细胞内的电穿孔设备。电穿孔设备包括其操作由软件或固件指定的电动设备(″ekd设备″)。ekd设备基于用户控制和脉冲参数的输入在阵列中的电极之间产生一系列可编程的恒定电流脉冲模式，并且允许贮存和获取电流波形数据。电穿孔设备还包括具有针电极的阵列的可替换电极盘、用于注射针头的中央注射通道和可移动的导盘。将美国专利公布2005/0052630的全部内容通过引用并入本文。

可将美国专利no.7,245,963和美国专利公布2005/0052630中描述的电极阵列和方法改造以适用于不仅深入穿透组织例如肌肉，而且还深入穿透其它组织或器官。由于电极阵列的构型的原因，因此也将注射针(递送选择的生物样品)完全插入靶器官，并且在用电极预先界定的区域中垂直于靶组织进行注射。美国专利no.7,245,963和美国专利公布2005/005263中描述的电极优选为20mm长并且为21规。

此外，在一些实施方案中涉及整合电穿孔设备及其用途，存在为下列专利中描述的设备的电穿孔设备：1993年12月28日发布的美国专利5,273,525、2000年8月29日发布的美国专利6,110,161、2001年7月17日发布的6,261,281以及2005年10月25日发布的6,958,060和2005年9月6日发布的美国专利6,939,862。此外，在本文中涉及覆盖2004年2月24日发布的美国专利6,697,669(其涉及使用多种设备的任一设备递送dna)和2008年2月5日提交的美国专利7,328,064(涉及注射dna的方法)中提供的主题的专利。将上述专利通过引用整体并入本文。

d.制备疫苗的方法

本文中提供的是用于制备包含本文中论述的dna疫苗的dna质粒的方法。在最终亚克隆入哺乳动物表达质粒的步骤后，可使用本领域已知的方法将dna质粒用于在大规模发酵罐中接种细胞培养物。

可使用已知设备和技术的组合配制或制备与本发明的ep设备一起使用的dna质粒，但优选使用在2007年5月23日提交的批准的共同未决的美国临时申请美国系列no.60/939,792中描述的最优化质粒制备技术制备它们。在一些实施例中，可以以大于或等于10mg/ml的浓度配制这些研究中使用的dna质粒。除了美国系列no.60/939792中描述的设备和方案(包括在2007年7月3日发布的批准的专利美国专利no.7,238,522中描述的设备和方案)外，制备技术还包括或整合对于本领域技术人员来说通常是已知的各种设备和方案。通过将上述申请和专利(分别地美国系列no.60/939,792和美国专利no.7,238,522)通过引用整体并入本文。

实施例

还在下列实施例中对本发明进行了举例说明。应当理解，这些实施例虽然表示本发明的优选实施方案，但仅以举例说明的方式给出。根据上文中的论述和这些实施例，本领域技术人员可确定本发明的基本特征，并且在不背离其精神和范围下，可对本发明进行任何改变和变动以使之适合于各种用法和条件。因此，根据上述说明，除了本文中显示和描述的变动外的本发明的各种变动对于本领域技术人员来说是很显然的。此类变动也意欲落在所附权利要求的范围内。

实施例1

pgx2009(ph1ha09)-编码2009h1n1流感病毒(猪流感病毒)血凝素抗原的质粒

pgx2009(h1ha09)的主链为处于巨细胞病毒立即早期(cmv)启动子控制之下的经修饰的表达载体pvax1(茵维特罗根公司，卡尔斯巴德，加利福尼亚州)。原始pvax1购自茵维特罗根公司(目录编号v260-20)并且于-20℃下维持。如上文中所指出的，序列分析显示用作pgx2009的主链的pvax1的序列与可从茵维特罗根公司获得的pvax1序列之间的差异。差异示于上文中。

质粒pgx2009(也称为phlha09)包含编码共有2009h1n1流感病毒(猪流感病毒)血凝素分子的核酸序列。用于产生共有序列的79个基本序列选自流感病毒序列数据库。

编码各种甲型流感病毒血凝素h1蛋白的核苷酸序列以及由所述核苷酸序列编码的氨基酸序列的登录号在genbank数据库中相应于下列登录号。不在括号中的登录号公开了核苷酸序列和由它们编码的额外列的氨基酸序列。括号内的登录号表示genbank的蛋白质数据库中的相应氨基酸序列的条目。

登录号如下：gq323579.1(acs72657.1)、gq323564.1(acs72654.1)、gq323551.1(acs72652.1)、gq323530.1(acs72651.1)、gq323520.1(acs72650.1)、gq323495.1(acs72648.1)、gq323489.1(acs72647.1)、gq323486.1(acs72646.1)、gq323483.1(acs72645.1)、gq323455.1(acs72641.1)、gq323451.1(acs72640.1)、gq323443.1(acs72638.1)、gq293077.1(acs68822.1)、gq288372.1(acs54301.1)、gq287625.1(acs54262.1)、gq287627.1(acs54263.1)、gq287623.1(acs54261.1)、gq287621.1(acs54260.1)、gq286175.1(acs54258.1)、gq283488.1(acs50088.1)、gq280797.1(acs45035.1)、gq280624.1(acs45017.1)、gq280121.1(acs45189.1)、gq261277.1(acs34968.1)、gq253498.1(acs27787.1)、gq323470.1(acs72643.1)、gq253492.1(acs27780.1)、fj981613.1(acq55359.1)、fj971076.1(acp52565.1)、fj969540.1(acp44189.1)、fj969511.1(acp44150.1)、fj969509.1(acp44147.1)、gq255900.1(acs27774.1)、gq255901.1(acs27775.1)、fj966974.1(acp41953.1)、gq261275.1(acs34967.1)、fj966960.1(acp41935.1)、fj966952.1(acp41926.1)、fj966082.1(acp41105.1)、gq255897.1(acs27770.1)、cy041645.1(acs27249.1)、cy041637.1(acs27239.1)、cy041629(acs27229.1)、gq323446.1(acs72639.1)、cy041597.1(acs27189.1)、cy041581.1(acs14726.1)、cy040653.1(acs14666.1)、cy041573.1(acs14716.1)、cy041565.1(acs14706.1)、cy041541.1(acs14676.1)、gq258462.1(acs34667.1)、cy041557.1(acs14696.1)、cy041549.1(acs14686.1)、gq283484.1(acs50084.1)、gq283493.1(acs50095.1)、gq303340.1(acs71656.1)、gq287619.1(acs54259.1)、gq267839.1(acs36632.1)、gq268003.1(acs36645.1)、cy041621.1(acs27219.1)、cy041613.1(acs27209.1)、cy041605.1(acs27199.1)、fj966959.1(acp41934.1)、fj966982.1(acp41963.1)、cy039527.2(acq45338.1)、fj981612.1(acq55358.1)、fj981615.1(acq55361.1)、fj982430.1(acq59195.1)、fj998208.1(acq73386.1)、gq259909.1(acs34705.1)、gq261272.1(acs34966.1)、gq287621.1(acs54260.1)、gq290059.1(acs66821.1)、gq323464.1(acs72642.1)、gq323473.1(acs72644.1)、gq323509.1(acs72649.1)、gq323560.1(acs72653.1)、gq323574.1(acs72655.1)和gq323576.1(acs72656.1)。从ncbi序列数据库下载氨基酸序列，使用clustalx产生比对和共有序列。将高效前导序列(ige前导序列)在读框内融合至起始密码子的上游以帮助表达。为了具有高水平的表达，使该融合基因的密码子使用(codonusage)适合于智人基因的密码子偏性。此外，也进行rna最优化：避免具有极高(＞80％)或极低(＜30％)gc含量的区域和顺式作用序列基序例如内部tata盒、chi位点和核糖进入位点的区域。在geneart(雷根斯堡市(regensburg)，德国)合成产生完整序列。合成的工程化h1ha09基因在长度上为1818bp(seqidno：1)并且由geneart将其在bamhi和xhoi位点克隆入pvax1(图2)。

实施例2

利用a/mexico/indre4487/2009攻击流感病毒pgx2009免疫的雪貂

使用雪貂(优选的流感模型)进行攻击实验。使用质粒pgx2009免疫雪貂。

动物：4组x5只动物/组+一个具有4只动物的对照组＝总共24只雪貂(雄性)

持续时间：18周(包括攻击)

剂量：2mg质粒

方案概述：将雪貂随机分配至dna疫苗组中。在研究的第0天、第28天和第56天免疫动物。按照批准的麻醉方案用氯胺酮/咪达唑仑混合物、异氟醚或等同物麻醉动物，利用流感病毒dna疫苗组合进行im接种。使用适应性恒定电流电穿孔(ep)设备以0.5amp，52毫秒的脉冲，脉冲之间0.2秒，4秒的点火延迟(firingdelay)，总共3个脉冲，对组1和2立即进行电穿孔。对照动物是首次接触实验的对照(无质粒，无ep)。使雪貂在它们的笼中从麻醉恢复，密切监控其24小时以确保完全恢复。

在整个实验期间食物和水可随意获得。在第84天，通过利用1mlmx10(a/mexico/indre4487/2009；5x105pfu/ml)的鼻内感染攻击动物。使用已建立和批准的评分表每天监测动物的临床体征(体重、温度等)。在转染后第1、3、6、9和15天进行鼻洗涤，收集直肠拭子。在第15天收集肺。将样品贮存在rnalater中(以在进行实时pcr时，用于病毒上样)，贮存在培养基中(用于感染性病毒(tcdi50))和贮存在福尔马林中(以当适当时进行组织学分析)。

图4显示利用经免疫的雪貂(3次免疫)的血清进行的血凝抑制测定。大于1∶40的滴度被认为是“阳性的”。虚线表示1∶40标志。所有动物在3次免疫后高于1∶40标志。图5显示利用新型h1n1株mx10(a/mexico/indre4487/2009)攻击经免疫的和未经免疫的雪貂的结果。全部经免疫的雪貂都存活，然而75％的首次接触实验的雪貂在15天的时间内死亡。

序列表

<110>宾夕法尼亚大学托管会(thetrusteesoftheuniversityofpennsylvania)

d.b.韦纳（david,weinerb.）

严健（yan,jian）

m.p.莫罗（morrow,matthewp.）

<120>流感病毒核酸分子及由其制备的疫苗

<130>133172.03002

<150>12/694,238

<151>2010-01-26

<160>24

<170>patentin3.5版

<210>1

<211>1695

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<220>

<223>流感病毒h1dna序列

<400>1

atgaaggctatcctcgtcgtgctgctgtacaccttcgccaccgccaacgccgataccctg60

tgcatcggctaccacgccaacaacagcaccgacaccgtggataccgtgctggaaaagaac120

gtgaccgtgacccacagcgtgaacctgctggaagataagcacaacggcaagctgtgcaag180

ctgagaggcgtggcccctctgcacctgggcaagtgcaatatcgccggctggattctgggc240

aaccccgagtgcgagagcctgtctaccgctagctcctggtcctacatcgtggagacaagc300

agcagcgacaacggcacctgttaccccggcgacttcatcgactacgaggaactgcgggag360

cagctgagcagcgtgtccagcttcgagcggttcgagatcttccccaagaccagctcctgg420

cccaaccacgacagcaacaagggcgtgaccgccgcctgtcctcacgctggcgccaagagc480

ttctacaagaacctgatctggctggtcaagaagggcaacagctaccccaagctgagcaag540

agctacatcaacgacaagggcaaagaggtcctcgtcctctggggcatccaccaccctagc600

accagcgccgaccagcagagcctgtaccagaacgccgacgcctacgtgttcgtgggctca660

tctcggtacagcaagaagttcaagcccgagatcgccatcagacccaaagtgcgggaccag720

gaaggccggatgaactactactggaccctggtggagcccggcgacaagatcaccttcgag780

gccaccggcaatctggtggtgcccagatacgccttcgccatggaaagaaacgccggcagc840

ggcatcatcatcagcgacacccccgtgcacgactgcaacaccacctgtcagacccccaag900

ggcgccatcaacaccagcctgcccttccagaacatccaccccatcaccatcggcaagtgc960

cctaagtacgtgaagtccactaagctcagactggccaccggcctgagaaacgtgcccagc1020

atccagagcagaggcctgtttggcgccattgccggctttatcgagggcggctggaccgga1080

atggtggacgggtggtacggctaccaccaccagaatgagcagggcagcggctacgccgcc1140

gacctgaagtccacacagaacgccatcgacgagatcaccaacaaagtgaacagcgtgatc1200

gagaagatgaacacccagttcaccgccgtgggcaaagagttcaaccacctggaaaagcgg1260

atcgagaacctgaacaagaaggtggacgacggcttcctggacatctggacctacaacgcc1320

gagctgctggtgctgctggaaaacgagcggaccctggactaccacgactccaacgtgaag1380

aatctgtacgagaaagtgcggagccagctgaagaacaacgccaaagagatcggcaacggc1440

tgcttcgagttctaccacaagtgcgacaacacctgtatggaaagcgtgaagaacggcacc1500

tacgactaccccaagtacagcgaggaagccaagctgaaccgggaagagatcgacggcgtg1560

aagctggaaagcacccggatctaccagatcctggccatctactctactgtggccagctca1620

ctggtgctggtggtgtccctgggcgccatctccttttggatgtgctccaacggcagcctg1680

cagtgccggatctgc1695

<210>2

<211>566

<212>prt

<213>人工序列(artificialsequence)

<220>

<223>流感病毒蛋白h1序列

<400>2

metlysalaileleuvalvalleuleutyrthrphealathralaasn

151015

alaaspthrleucysileglytyrhisalaasnasnserthraspthr

202530

valaspthrvalleuglulysasnvalthrvalthrhisservalasn

354045

leuleugluasplyshisasnglylysleucyslysleuargglyval

505560

alaproleuhisleuglylyscysasnilealaglytrpileleugly

65707580

asnproglucysgluserleuserthralasersertrpsertyrile

859095

valgluthrserserseraspasnglythrcystyrproglyaspphe

100105110

ileasptyrglugluleuarggluglnleuserservalserserphe

115120125

gluargphegluilepheprolysthrsersertrpproasnhisasp

130135140

serasnlysglyvalthralaalacysprohisalaglyalalysser

145150155160

phetyrlysasnleuiletrpleuvallyslysglyasnsertyrpro

165170175

lysleuserlyssertyrileasnasplysglylysgluvalleuval

180185190

leutrpglyilehishisproserthrseralaaspglnglnserleu

195200205

tyrglnasnalaaspalatyrvalphevalglyserserargtyrser

210215220

lyslysphelysprogluilealaileargprolysvalargaspgln

225230235240

gluglyargmetasntyrtyrtrpthrleuvalgluproglyasplys

245250255

ilethrpheglualathrglyasnleuvalvalproargtyralaphe

260265270

alametgluargasnalaglyserglyileileileseraspthrpro

275280285

valhisaspcysasnthrthrcysglnthrprolysglyalaileasn

290295300

thrserleupropheglnasnilehisproilethrileglylyscys

305310315320

prolystyrvallysserthrlysleuargleualathrglyleuarg

325330335

asnvalproserileglnserargglyleupheglyalailealagly

340345350

pheilegluglyglytrpthrglymetvalaspglytrptyrglytyr

355360365

hishisglnasngluglnglyserglytyralaalaaspleulysser

370375380

thrglnasnalaileaspgluilethrasnlysvalasnservalile

385390395400

glulysmetasnthrglnphethralavalglylysglupheasnhis

405410415

leuglulysargilegluasnleuasnlyslysvalaspaspglyphe

420425430

leuaspiletrpthrtyrasnalagluleuleuvalleuleugluasn

435440445

gluargthrleuasptyrhisaspserasnvallysasnleutyrglu

450455460

lysvalargserglnleulysasnasnalalysgluileglyasngly

465470475480

cysphegluphetyrhislyscysaspasnthrcysmetgluserval

485490495

lysasnglythrtyrasptyrprolystyrsergluglualalysleu

500505510

asnargglugluileaspglyvallysleugluserthrargiletyr

515520525

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