海马神经干细胞、神经元分离培养方法与流程

本发明涉及神经细胞培养领域，尤其是涉及一种海马神经干细胞、神经元分离培养方法。

背景技术：

神经细胞培养是研究神经科学的基本技术，尤其是原代细胞培养，对无菌技术/分离技术等非常严格，由于神经元的不可增殖性(终末分化细胞)，使得神经元的体外培养需要消耗大量的实验动物。神经干细胞是当前神经科学研究的另一热点，神经干细胞的取材多来源于新生鼠或胚胎，由于神经干细胞培育条件的特殊性(无血清培养，否则将会分化)，使得一个实验动物往往只能单纯用于神经干细胞的提取，造成极大的浪费。

技术实现要素：

本发明的目的在于：针对现有技术存在的问题，提供一种海马神经干细胞、神经元分离培养方法，解决现有神经细胞培养方法会造成极大浪费的问题。

本发明的发明目的通过以下技术方案来实现：

一种海马神经干细胞、神经元分离培养方法，该方法包括：

先用多聚赖氨酸铺板，结束后用双蒸水冲洗，再自然晾干；

处死出生当天或第一天的小鼠，用酒精喷洒小鼠，将小鼠大脑收集于盛有培养液+青霉素/链霉素溶液的离心管中，置于冰上；

在显微镜下去除脑膜，分离完整的海马组织，将收集好的组织转移至盛有培养液+青霉素/链霉素溶液的离心管中，置于冰上；

进行离心，弃掉上清，加入胰蛋白酶进行消化；

离心结束，加胎牛血清中止消化；用经抛光处理的玻璃移液管进行吹打；

离心，弃掉上清，加入神经干细胞培养基重悬组织并吹匀；

将重悬液经滤器过滤；

对过滤后液体进行细胞计数，种板；

种板后，吸出神经干细胞培养基转移至培养瓶；

孔板中换成神经元培养基。

优选的，提前2h用50ug/ml多聚赖氨酸铺板，结束后双蒸水冲洗3次，自然晾干。

优选的，处死出生当天或第一天的小鼠，用70％酒精喷洒小鼠，将小鼠大脑收集于盛有培养液+2％青霉素/链霉素溶液的50ml离心管中，置于冰上。

优选的，在显微镜下去除脑膜，分离完整的海马组织，将收集好的组织转移至盛有培养液+2％青霉素/链霉素溶液的15ml离心管中，置于冰上。

优选的，600～800rpmx4～6min离心，弃掉上清，加入0.05％胰蛋白酶消化7min，温度为37℃。

优选的，离心结束，加10％胎牛血清中止消化；用经抛光处理的玻璃移液管吹打10-15次。

优选的，600～800rpmx4～6min离心，弃掉上清，加入2ml神经干细胞培养基重悬组织并吹匀。

优选的，将2ml重悬液经70um滤器过滤。

优选的，种板24h后，吸出神经干细胞培养基转移至t25培养瓶，每3天半换液。

优选的，孔板中换成神经元培养基，每3天半换液。

与现有技术相比，本发明具有以下优点：

1、可在处死一次动物基础上同时完成稳定的神经干细胞和神经元培养，节约实验动物。

2、能够培养密度及形态均较好的神经元，可用于神经元的相关体外实验体系构建。

3、培养出的神经干细胞增殖性良好，传代稳定，分化潜能保持较好。

附图说明

图1为神经元培养第1天的形态图；

图2为神经元培养第3天的形态图；

图3为神经元培养第4天的形态图；

图4为神经干细胞培养第1天的形态图；

图5为神经干细胞培养第3天的形态图；

图6为神经干细胞形成的神经球细胞核染色图；

图7为神经干细胞形成的神经球表达神经干细胞特异性标记nestin染色图；

图8为神经干细胞形成的神经球中向神经元方向分化表达神经元特异性标志物tuj-1染色图；

图9为神经干细胞形成的神经球3种染色合并的图片；

图10为是神经元细胞核染色图；

图11为神经元特异性标志物tuj-1染色图；

图12为神经元2种染色合并的图片。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。

实施例1

本实施例提供一种海马神经干细胞、神经元分离培养方法，该方法使用改良新生鼠神经培育流程，使用改良培养基，对新生鼠海马组织进行原代培养，并可直接制作细胞爬片，24小时后提取细胞培养上清转移至另一培养体系可直接进行神经干细胞培养，原体系内贴壁细胞更换改良神经元培养基可进行神经元培养。本发明具体步骤如下：

1、先用多聚赖氨酸铺板，结束后用双蒸水冲洗，再自然晾干；

2、处死出生当天或第一天的小鼠，用酒精喷洒小鼠，将小鼠大脑收集于盛有培养液+青霉素/链霉素溶液的离心管中，置于冰上；

3、在显微镜下去除脑膜，分离完整的海马组织，将收集好的组织转移至盛有培养液+青霉素/链霉素溶液的离心管中，置于冰上；

4、进行离心，弃掉上清，加入胰蛋白酶进行消化；

5、离心结束，加胎牛血清中止消化；用经抛光处理的玻璃移液管进行吹打；

6、离心，弃掉上清，加入神经干细胞培养基重悬组织并吹匀；

7、将重悬液经滤器过滤；

8、对过滤后液体进行细胞计数，种板；

9、种板后，吸出神经干细胞培养基转移至培养瓶；

10、孔板中换成神经元培养基。

图1～图12所示，是基于本方法培养神经元、神经干细胞中的中间状态图。由各状态图可看出，本发明可在处死一次动物基础上同时完成稳定的神经干细胞和神经元培养，节约实验动物；能够培养密度及形态均较好的神经元，可用于神经元的相关体外实验体系构建；培养出的神经干细胞增殖性良好，传代稳定，分化潜能保持较好。

实施例2

本实施例提供一种海马神经干细胞、神经元分离培养方法，该方法使用改良新生鼠神经培育流程，使用改良培养基，对新生鼠海马组织进行原代培养，并可直接制作细胞爬片，24小时后提取细胞培养上清转移至另一培养体系可直接进行神经干细胞培养，原体系内贴壁细胞更换改良神经元培养基可进行神经元培养。本发明具体步骤如下：

1、提前2h用50ug/ml多聚赖氨酸铺板，结束后双蒸水冲洗3次，自然晾干。

2、处死出生当天或第一天的小鼠，用70％酒精喷洒小鼠，将小鼠大脑收集于盛有培养液+2％青霉素/链霉素溶液的50ml离心管中，置于冰上。

3、在显微镜下去除脑膜，分离完整的海马组织，将收集好的组织转移至盛有培养液+2％青霉素/链霉素溶液的15ml离心管中，置于冰上。

4、600～800rpmx4～6min离心，弃掉上清，加入0.05％胰蛋白酶消化7min，温度为37℃。

5、离心结束，加10％胎牛血清中止消化；用经抛光处理的玻璃移液管吹打10-15次。

6、600～800rpmx4～6min离心，弃掉上清，加入2ml神经干细胞培养基重悬组织并吹匀。

7、将2ml重悬液经70um滤器过滤。

8、对过滤后液体进行细胞计数，种板。

9、种板24h后，吸出神经干细胞培养基转移至t25培养瓶，每3天半换液。

10、孔板中换成神经元培养基，每3天半换液。

图1～图12所示，是基于本方法培养神经元、神经干细胞中的中间状态图。由各状态图可看出，本发明可在处死一次动物基础上同时完成稳定的神经干细胞和神经元培养，节约实验动物；能够培养密度及形态均较好的神经元，可用于神经元的相关体外实验体系构建；培养出的神经干细胞增殖性良好，传代稳定，分化潜能保持较好。

实施例3

材料准备：

c57blmouse(c57bl/6小鼠)p0-1，；icedmem+p/s30ml(dmem培养液(gibco)+1％青霉素/链霉素溶液30ml置于冰中)；灭菌的刀片，剪刀，镊子；显微镜；神经干细胞培养基(neurobasalmedium(neurobasal培养液(gibco))+2％b27(b-27细胞培养添加剂)+1％n2(n2细胞培养添加剂)+20ng/mlegf(表皮生长因子)+20ng/mlbfgf(碱性成纤维细胞生长因子)+1％p/s(青霉素/链霉素溶液))；神经元培养基(neurobasalmedium+2％b27+1％l-g+1％p/s)；0.05％trypsin(胰蛋白酶)；fbs(胎牛血清)；pdl(多聚赖氨酸)50ug/ml；15mmcoverslips(盖玻片)。

步骤：

1.提前2h用50ug/ml多聚赖氨酸铺板，结束后双蒸水冲洗3次，自然晾干。其中：6孔板每孔1ml；24孔板每孔0.5ml。

2.处死p0-1小鼠(出生当天及第一天的幼鼠)，用70％酒精喷洒小鼠，将小鼠大脑收集于50ml离心管(dmem+2％p/s)中，置于冰上。dmem+2％p/s：dmem培养液+2％青霉素/链霉素溶液。

3.在显微镜下去除脑膜，分离完整的海马组织，将收集好的组织转移至15ml离心管(dmem+2％p/s)，置于冰上。

4.700rpmx5min离心，弃掉上清，加入0.05％trypsin消化7min(37℃)。

5.离心结束加10％fbs中止消化；用fire-polishedposteurpipette(经抛光处理的玻璃移液管)吹打10-15次。

6.700rpmx5min离心，弃掉上清，加入2ml神经干细胞培养基重悬组织并吹匀。

7.将2ml重悬液经70um滤器过滤。

8.对过滤后液体进行细胞计数，种板(10x10⁵cells/wellin6-wellplate)。

9.种板24h后，吸出神经干细胞培养基转移至t25培养瓶(每3天半换液)

10.6孔板中换成神经元培养基(每3天半换液)。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，应当指出的是，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。